（光学专业论文）利用光镊研究生物细胞的力学行为.pdf

中国科学技术大学博士学位论文 摘要 摘要 生命科学是研究生命现象、生命活动的本质、特征和发展规律的自然科学， 与人类生存、人民健康以及社会发展有着密切的关系，是当今全球范围内最受关 注的基础自然科学。其中，细胞生物学是生命科学的基础学科之一，它是以细胞 为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平以及分子水平等三个层次，研究细 胞和细胞器的结构和功能。活细胞的新陈代谢、跨膜转运、信号转导等生命活动， 都是细胞与其他生物大分子( 如蛋白质、多糖、核酸等) 相互作用的结果，在这 些相互作用过程中，细胞和大分子的力学行为会发生不同的变化，换句话说，细 胞和大分子的力学行为变化可以反映其功能及活动规律。传统的细胞生物学和分 子生物学研究，大都是基于生物化学或药理学实验中的一些分子浓度变化而做出 的，是许多细胞或分子活动的一个平均结果，往往掩盖了各个分子的个性，因此 特别需要从单细胞、单分子的层次上研究其活动规律。 生物学研究不但依赖物理、化学知识，同时还依靠后者提供的实验仪器和研 究手段，例如蛋白质电泳仪、光学和电子显微镜、断层扫描仪等等。而在单细胞、 单分子层次上进行细胞生物学研究，光镊是一项非常适合的技术。事实上，光镊 自诞生起就和生物学紧密相连，由于其独特的技术特点，一直以来被生物学家所 青睐。目前，光镊已成为细胞生物学和分子生物学研究中重要的工具。 光镊可以捕获和操控几十纳米到几十微米大小的粒子，它还可以作为微小力 力的探针，测量皮牛亚皮牛量级的力，正好可以用来研究生物细胞的力学行为， 以及细胞与生物大分子如蛋白质等的相互作用等，进而从单细胞层次上揭示细胞 生命活动的基本规律。 在本文的工作中，将光镊技术应用于细胞生物学力学行为的研究领域，即利 用实验室的光镊技术平台，进行细胞力学性质的测量研究，主要研究了免疫细胞 对靶细胞的特异性识别，对细胞表面受体分子与抗体分子间的相互作用进行了测 量，从理论和实验两个方面研究了渗透压对红细胞变形性质的影响，另外，为了 更加方便的研究生物细胞的膜弹性行为，发展了新型的光镊技术。 免疫是人体的一种生理功能，人体依靠免疫细胞识别外来抗原，产生特异性 免疫应答，来维持机体健康。n k 细胞是免疫细胞的一种，自发现以来逐渐成为 v 中国科学技术大学博士学位论文摘要 免疫学领域的一个热点。n k 细胞活化过程的分子基础非常复杂，简单可以描述 为效应细胞与靶细胞相互作用，效应细胞表面分子识别靶细胞上的配体，形成免 疫突触，最终杀伤靶细胞。k 5 6 2 是n k 9 2 细胞的杀伤敏感细胞，然而对于这对细 胞的识别和杀伤机制一直不清楚，我们利用光镊捕获n k 细胞与靶细胞接触，实 时观察n k 细胞对靶细胞的杀伤作用，发现k 5 6 2 细胞发生形变，表面出现巨大囊 泡，但细胞膜没有破裂。研究结果可能有助于揭示n k 9 2 对k 5 6 2 的杀伤机制。 免疫细胞的活化与其表面受体分子有紧密的关系。淋巴细胞功能相关抗原一l 可能是n k 细胞识别杀伤的早期参与者，l f a 一1 是在c t l 介导靶细胞杀伤实验中 发现的，它与机体自身免疫疾病以及肿瘤复发等密切相关。我们利用光镊研究了 n k 细胞表面l a f 一1 的单分子行为，发现n k 细胞与包被了l f a l 抗体的小球之间 的结合力随二者接触时间的延长而增强，表明n k 细胞表面l f a 1 分子可能会受 l f a 1 抗体影响而发生局部聚集。我们的研究不仅提供了一种实时观察单细胞间 相互作用的方法，还建立了研究单分子对细胞活动影响的研究方法，推测存在一 种新的诱导l f a - 1 分子活化的信号传导模式。 人类的红细胞没有细胞核，有着相对简单的结构，同时具有轴对称的形状， 经常作为细胞力学模型而被研究。红细胞的变形对血液流动有着重要的影响，与 一些疾病也有着直接的关联。由于红细胞的变形受到周围环境如渗透压、p h 值 等因素的影响，因此我们利用光镊技术对不同渗透压下红细胞的形变特征进行了 研究，发现等渗条件下双凹形的红细胞形变能力最强，渗透压降低时，红细胞形 变能力下降，其主要是由于细胞形状的改变造成的，而在高渗条件下，细胞变形 能力同样减弱，主要原因是细胞内液粘度呈指数增加。另外，我们还利用 a b a q u s 有限元软件对不同形状的红细胞变形进行了模拟，模拟结果与实验结 果基本相符。 光镊研究细胞膜弹性常用的方法是利用小球做手柄来拉伸细胞，实际上， 细胞被光阱捕获时形状会发生微小变化，如果细胞处于阱位不断变化的光阱中， 其形变就会比较大而可以很容易的测量。根据这个思想，我们利用旋转玻片实现 了分时复用多光阱，利用该分时复用多光阱研究了红细胞的变形特点，同时还实 现了多粒子的捕获，并从理论和实验两方面研究了不同切换频率下的有效光阱刚 度。 v l 中国科学技术大学博士学位论文 摘要 本实验室一直以来以光镊技术研究为主，在生物学应用中，一直采取物理学 提供工具、生物学提供样品的合作方式，但由于受到样品条件的限制，很多研究 未能继续深入下去就草草结束。因此我们建立了自己的生物细胞培养室，创造生 物样品制备条件。目前已经可以成功的培养h e l a 细胞并进行相关实验。 本论文的创新点在于利用光镊技术在单细胞层次上研究生物细胞的力学行 为，包括细胞膜的变形规律、免疫细胞的特异性识别机制以及细胞表面分子和抗 体分子间的相互作用，研究结果可以为阐明细胞生命活动的基本规律提供帮助。 另外，还发展了新的产生多光阱的方法，可以在细胞力学行为研究中得到应用。 关镶涌：光镊、n k 细瞧、红细唿、力学幸亏为、多光阱 v i i 中国科学技术大学博士学位论文 摘要 a b s t r a c t l i f es c i e n c ef o c u s e so nt h ep h e n o m e n o no fl i f e ，t h en a t u r e ，c h a r a c t e r i s t i c sa n d d e v e l o p m e n t a lr u l e so fl i f ea c t i v i t i e s i th a sc l o s er e l a t i o nt oh u m a ne x i s t e n c e ，h e a l t h ， a n dd e v e l o p m e n to fs o c i e t y , a n da t t r a c t sm o s tw o r l d w i d ea t t e n t i o n si nb a s i cs c i e n c e s c e l lb i o l o g y , w h i c ha i m st os t u d yt h ec e l l s ，i so n eo ft h eb a s i ct o p i c si nl i f es c i e n c e s ， a n di tr e s e a r c h e so nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fc e l la n do r g a n e l l ef r o mt h ec e l l u l a r , s u b m i c r o na n dm o l e c u l a rl e v e l t h em e t a b o l i s m ，t r a n s - m e m b r a n et r a n s p o r ta n d s i g n a l i n go fl i v e c e l l sa r ea l lt h er e s u l t so ft h ei n t e r a c t i o no fc e l la n do t h e r m a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n ，p o l y s a c c h a r i d e s ，a n dn u c l e i ca c i d i nt h e s e i n t e r a c t i o n s ，t h em e c h a n i c a lp r o p e r t yo fc e l la n dm o l e c u l em a yc h a n g e ，a n dt h i s c h a n g er e f l e c t st h ef u n c t i o na n dr u l e so f c e l la c t i v i t i e s t r a d i t i o n a lc e l lb i o l o g i c a la n d m o l e c u l a rb i o l o g i c a lr e s e a r c h e s ，w h i c ha r eb a s e do nt h ev a r i a t i o no fc o n c e n t r a t i o no f s o m em o l e c u l e si nb i o c h e m i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a le x p e r i m e n t s ，a r et h ea v e r a g e r e s u l t so ft h ea c t i v i t i e so fm a n yc e l l sa n dm o l e c u l e s t h et r a d i t i o n a lr e s e a r c hc a n n o t r e v e a lt h ep e r f o r m a n c eo fas i n g l em o l e c u l e ；t h e r e f o r e ，s t u d yo fa c t i v i t i e so fas i n g l e m o l e c u l ei nc e l l u l a ra n dm o l e c u l a rl e v e li so fg r e a ti m p o r t a n c e b i o l o g yn o to n l yr e l i e so np h y s i c a la n dc h e m i c a lr u l e s ，b u ta l s or e l i e so nt h e e x p e r i m e n t a la p p a r a t u sa n dr e s e a r c hm e t h o d s ，s u c ha sp r o t e i ne l e c t r o p h o r e s i s ，o p t i c a l m i c r o s c o p y , e l e c t r o nm i c r o s c o p y , s e c t i o ns c a n n e re t c o p t i c a lt w e e z e r si sap r o p e r t e c h n i q u ei n c e l lb i o l o g i c a lr e s e a r c hi nc e l l u l a ra n dm o l e c u l a rl e v e l f a c t u a l l y , s i n c e i t si n v e n t i o n ，o p t i c a lt w e e z e r sh a sp l a y e di m p o r t a n tr o l e si nb i o l o g ya n db e c a u s eo fi t s t e c h n i c a lu n i q u e n e s s o p t i c a lt w e e z e r sh a sa t t r a c t e dw i d ea t t e n t i o nf r o mb i o l o g i s t s r e c e n t l y , o p t i c a lt w e e z e r sb e c o m e sa ni m p o r t a n tt o o li nc e l lb i o l o g i c a la n dm o l e c u l a r b i o l o g i c a lr e s e a r c h e s o p t i c a lt w e e z e r si sa b l e t o t r a p a n dm a n i p u l a t ep a r t i c l e sr a n g i n gi nt e n so f n a n o m e t e r st ot e n so fm i c r o n s ，a n dc a nb eu s e da sp r o b e st od e t e c tt h ef o r c e so f p r o t e i ni n t e r a c t i o no rc e l l u l a rf o r c e si nt h er a n g eo fp i c o - n e w t o nt os u b p l e o - n e w t o n f u r t h e r m o r e ，r e s u l t sf r o mo p t i c a lt w e e z e r sc a nb eu s e dt or e v e a ll i f ea c t i v i t yi n c e l l u l a rl e v e l v l l i 中国科学技术大学博士学位论文 摘要 i nt h i st h e s i s ，w ee x p a n dt h ea p p l i c a t i o no fo p t i c a lt w e e z e r si n t ot h ea r e a so fc e l l b i o l o g y t h ed e t a i l e dr e s e a r c h e sl i ei nt h em e a s u r e m e n t so ft h em e c h a n i c a lp r o p e r t y o fc e l l s ，s p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o no fi m m u n ec e l lt ot a r g e tc e l l ，i n t e r a c t i o no fa n t i g e na n d a n t i b o d y , t h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a lr e s e a r c ho nt h ei n f l u e n c eo fo s m o t i cp r e s s u r e t ot h ef o r m a t i o no fc e l lm e m b r a n e ，a n d d e v e l o p e dn o v e lo p t i c a lt w e e z e r s t e c h n i q u e t of u r t h e rs t u d yt h em e c h a n i c a lp r o p e r t yo fc e l lm e m b r a n e i m m u n ei sap h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no fh u m a nb o d y , w h i c hs u s t a i n sh e a l t h yb y i d e n t i f y i n gf o r e i g na n t i g e na n dg e n e r a t i n gs p e c i f i ci m m u n o l o g i c a lr e s p o n s e n a t u r a l k i l l e rc e l l s ( n kc e l l s ) a r eo n ek i n do fi m m u n o l o g i c a lc e l l s s i n c ei t sd i s c o v e r y , i t g r a d u a l l yb e c o m e sh o tt o p i ci ni m m u n o l o g y t h ea c t i v a t i o no fn kc e l li sv e r y c o m p l e x ，a n das i m p l ed e s c r i p t i o nm a yg o e sa sf o l l o w ss u r f a c em o l e c u l eo ne f f e c t i v e c e l li d e n t i f i e sl i g a n do nt a r g e tc e l l ，f o r m i n gi m m u n es y n a p s e ，a n df i n a l l yk i l lt a r g e t c e l l k 5 6 2e e l l i st h es e n s i t i v ec e l lo fn k 9 2 ，b u tt h em e c h a n i s mo fi d e n t i f i c a t i o na n d k i l lo ft h i sp a i ro fc e l l sh a s n tc l e a r w eu t i l i z eo p t i c a lt w e e z e r sm a n i p u l a t en kc e l l c o n t a c tt a r g e tc e l l ，o b s e r v i n gt h ek i l le f f e c to fn kc e l lt ot a r g e tc e l li nr e a lt i m e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tk 5 6 2c e l ld e f o r m sw i t hav e s i c l eo nt h es u r f a c e ，a n d t h ec e l lm e m b r a n eh a s n tb r o k e n o u rr e s u l t sh e l pt or e v e a lt h ek i l lm e c h a n i s mo f n k 9 2t ok 5 6 2 t h ea c t i v a t i o no fn kc e l l sh a sc l o s er e l a t i o nw i t ht h es u r f a c e r e c e p t o r s l y m p h o c y t ef u n c t i o na s s o c i a t e da n t i g e n - 1 ( c d 1la c d18 ，l f a 1 ) i sam e m b e ro ft h e i n t e g r i nf a m i l yo fc e l ls u r f a c er e c e p t o r s i ti sp o s s i b l eo n eo ft h ee a r l ya c t o r si n p r o c e s so ft h er e c o g n i t i o na n dk i l l i n go fn k c e l l s l f a - 1w a sf o u n di nt h ek i l l i n g e x p e r i m e n tm e d i a t e db y t h ec t l sa n dw a s l i k e l y t ob ei n v o l v e di ns o m e i m m u n o l o g i c a ld i s e a s e sa n dt u m o u rr e c u r r e n c e t os t u d yt h ea c t i v a t i o nm o d eo f l f a 一1o nt h en kc e l ls u r f u s e ，ap l a t f o r mb a s e do no p t i c a lt w e e z e r sw a sc o n s t r u c t e d t oo b s e r v et h em o l e c u l a rb e h a v i o ro fl f a 1 a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s ，t h ea d h e s i o n f o r c eb e t w e e na nn kc e l la n dap o l y s t y r e n em i c r o s p h e r ec o a t e dw i t ha n t i - l f a - - 1 a n t i b o d yw a sc o n f i r m e dt ob et i m e d e p e n d e n t a n dt h ef o r c ew a si n c r e a s e dw i t ht h e t i m eo fc o n t a c tb e t w e e nt h ec e l la n ds p h e r ew h i c hi n d i c a t e dt h el f a - 1o nc e l ls u r f a c e h a sc l u s t e r e di n d u c e db ya n t i - l f a 一1a n t i b o d y s o ，an e wm e t h o di sd e v e l o p e di no u r i x 中国科学技术大学博士学位论文摘要 w o r k st os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt w oc e l l si nr e a lt i m ea n dt oo b s e r v et h es i n g l e m o l e c u l a rb e h a v i o r o u rr e s u l t sm a yp r o v i d eac l u et oe x p l o r et h ea c t i v a t i o n m e c h a n i s mo fl f a 1o nn kc e l l s t h eh u m a nr e db l o o dc e l lh a sar e l a t i v e l ys i m p l es t r u c t u r e ，a n di td o e sn o t c o n t a i nan u c l e u s c o n s e q u e n t l y , i th a so f t e nb e e nr e g a r d e da s m o d e ls y s t e m i nt h e s t u d yo fs i n g l el i v i n gc e l l s t h ef o r m a t i o no fr b cg r e a t l yi n f l u e n c e st h ef l o wo f b l o o d ，a n dr e l a t e sw i t hs o m ed i s e a s e s n a t u r a l l y , t h er b ci si nas u r r o u n d i n g sw i t h m a n yp h y s i c a lp a r a m e t e r ss u c ha so s m o t i cp r e s s u r e ，p he t c w ea d o p to p t i c a l t w e e z e r st os t u d yt h ef o r m a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fr b cu n d e rd i f f e r e n to s m o t i c p r e s s u r e t h ec e l lh a sl a r g ed e f o r m a t i o na b i l i t yu n d e ri s o t o n i cp r e s s u r e ；w h i l et h ec e l l h a sl o wd e f o r m a t i o na b i l i t yu n d e rh y p o t o n i ce n v i r o n m e n tb e c a u s eo fc h a n g eo fc e l l s h a p e ；a n dt h ec e l la l s oh a sl o wd e f o r m a t i o na b i l i t yu n d e rh y p e r t o n i cp r e s s u r ed u et o t h ee x p o n e n t i a li n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no fi n t r a c e l l u l a rl i q u i d a d d i t i o n a l l y , a s i m u l a t i o na d o p t i n ga b a q u ss o f t w a r et os i m u l a t et h ed e f o r m a t i o no fr b cw i t h d i f f e r e n ts h a p e si sc o n d u c t e d ，a n dt h er e s u l t sa g r e ew e l lw i t ho u r e x p e r i m e n t a lr e s u l t s t r a d i t i o n a lm e t h o da d o p t i n go p t i c a lt w e e z e r st om e a s u r et h ee l a s t i c i t yo fc e l li s t ou s em i c r ob e a dh a n d l et os t r e t c hc e l l i nf a c t ，t h ef o r mo fc e l ls u f f e r st i n yc h a n g e s u n d e rt h et r a p 。w h e nac e l le x p o s e di naj u m p i n go p t i c a lt w e e z e r s , t h i sc h a n g em a yb e l a r g e rt h a tc a nb ee a s i l ym e a s u r e d w er e a l i z e dt i m e s h a r i n gm u l t i p l eo p t i c a lt w e e z e r s u t i l i z i n gt i l tr o t a t i n gg l a s sp l a t et of u r t h e rm a n i p u l a t em u l t i p l ep a r t i c l e sa n dt os t u d y t h ef o r m a t i o nc h a r a c t e r i s t i co fr e db l o o dc e l l s m e a n w h i l e ，w eu t i l i z et h i sn o v e l t e c h n i q u et oi n v e s t i g a t et h e e f f e c t i v es t i f f n e s su n d e rd i f f e r e n tt r a p s w i t c h i n g f r e q u e n c i e sb o t ht h e o r e t i c a l l ya n de x p e r i m e n t a l l y t h em a i nr e s e a r c h e so fo u rl a bf o c u so nt h eo p t i c a lt w e e z e r s t e c h n i q u e i n b i o l o g i c a la p p l i c a t i o n s ，w ea d o p tt h em e a n so fp r o v i d i n gi n s t r u m e n t sb yp h y s i c i s ta n d s a m p l ep r e p a r e db yb i o l o g i s t s i nm a n yo ft h ea p p l i c a t i o n s ，b e c a u s eo ft h el i m i t a t i o n o fs a m p l ep r e p a r a t i o n ，m a n yr e s e a r c h e sc a n n o tg oi nd e e p t h e r e f o r e ，w es e t u po u r o w 1c e l lc u l t i v a t i o nr o o mt oi n d e p e n d e n t l yc u l t i v a t ec e l l si no u rl a b r e c e n t l y , w ec a l l c u l t i v a t eh e l ac e l l sa n dp e r f o r mr e l a t i v ee x p e r i m e n t s t h eh i g h l i g h t so ft h i st h e s i sl i ei nr e s e a r c ho ft h em e c h a n i c a lp r o p e r t yo f x 中国科学技术大学博士学位论文摘要 b i o l o g i c a lc e l li nc e l l u l a rl e v e lu t i l i z i n go p t i c a lt w e e z e r s t h em a i nr e s u l t si n c l u d e f o r m a t i o no fc e l lm e m b r a n e ，s p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o no fi m m u n o l o g i c a lc e l l sa n d i n t e r a c t i o no fa n t i g e na n da n t i b o d yi nc e l lm e m b r a n e o u rr e s u l t sh e l pu su n d e r s t a n d t h eb a s i cr u l e so fl i f ea c t i v i t i e so fc e l l s a d d i t i o n a l l y , w ed e v e l o p e dn o v e lm e t h o d st o g e n e r a t em u l t i p l eo p t i c a lt w e e z e r s ，w h i c hw i l lf i n da p p l i c a t i o n si nt h er e s e a r c h e so f m e c h a n i c so fc e l l s k e y w o r d s ：o p t i c a lt w e e z e r s ，n kc e l i , r e db l o o dc e l l , m e c h a n i c a lb e h a v i o r , m 础i p t et r a p s x i 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：乏霆乞 2o 。罗年，。月j 日 中国科学技术大学博士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 在科学迅猛发展的今天，单一学科的研究已不能适应科学自身发展的逻辑和 满足生产发展的需求。数、理、化及生物等大学科间多学科、多角度的交叉联合 研究已成为当今自然科学发展的大趋势。尤其是，生命科学的发展不断向数学和 物理等学科提出更多、更深层次的新问题，要求发展新概念和开拓新研究领域。 生物学是目前国际上炙手可热的研究方向，它跟人类自身生存和整个世界的 生态系统都息息相关，它的许多研究成果逐渐地直接或间接地影响和应用到了医 学、化学和农业等方面。例如，重组d n a 技术和淋巴细胞杂家瘤技术的出现， 带动了生物技术的迅猛发展，并且对人类生活和经济活动产生了深刻的影。目前， 随着研究手段越来越先进，人们对生物学研究已经深入到了单细胞、单分子的层 次，不但研究生物细胞的结构，还研究在生命过程中生物分子的运动过程，生物 学研究正逐渐向小的方向发展。 传统的细胞生物学和分子生物学研究，大都是基于生物化学或药理学实验中 的一些分子浓度变化而做出的，是许多细胞或分子活动的一个平均结果，即系综 平均。系综平均的结果无疑是正确的，但它往往掩盖了各个分子的个性，因此很 需要从单细胞、单分子的层次上研究其活动规律。这样的现状又对研究工具和实 验方法提出了更高的要求，于是，开发新的实验技术、方法和手段成为一个重要 的研究方向，新的实验手段往往成为学科交叉的切入点，新研究方向的生长点。 而一种技术在另外一个学科领域得到实际的应用，不仅是对另外学科的贡献，更 能促进自身技术的不断发展。 物理学的发展，无疑给生物学研究提供了非常有力的帮助。目前，使用光学 的手段，例如荧光显微镜，可以观察生物大分子，不过不能分辨其结构，而利用 电子显微镜和扫描探针技术，人们甚至可以直接看到单个的生物大分子，利用原 子力显微镜可以直接或间接的操控一些大小合适的生物体，也可以进行拉伸和挤 压来研究生物体的力学特性【1 3 】。 而在进行活体单细胞研究时，以上技术还存在一些局限性，例如电镜或激光 共聚焦技术要求所研究的生物样品经过化学或物理处理固定后再进行观察，显 然，处理后的生物细胞将失去活性，研究得到的图像无法反映活细胞的活动特点。 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 而作为操控技术的原子力显微镜，由于对生物样品进行近距离直接接触操控，会 对研究对象产生干扰。随着激光技术的发展，一项新的研究手段光镊技术诞 生了，并且自诞生起就和生物学紧密相连，由于光镊独特的技术特点，一直以来 被生物学家所青睐。目前，光镊已成为细胞生物学和分子生物学研究中重要的工 具。 1 1 光镊技术简介 光镊是以激光的力学效应为基础的一种物理工具，是利用强会聚的光场与微 粒相互作用时形成的光学势阱来俘获粒子的【4 】。1 9 6 9 年，a a s h k i n 等首次实 现了激光驱动微米粒子的实验。此后他又发现微粒会在横向被吸入光束( 微粒的 折射率大于周围介质的折射率) 。在对这两种现象研究的基础上，a s h k i n 提出了 利用光压操纵微粒的思想，并用两束相向照射的激光，首次实现了对水溶液中玻 璃小球的捕获，建立了第一套利用光压操纵微粒的工具。1 9 8 6 年，a a s h k i n 等 人又发现，单独一束强聚焦的激光束就足以形成三维稳定的光学势阱，可以吸引 微粒并把它局限在焦点附近，于是第一台光镊装置就诞生了【5 ，6 】。也因此， 光镊的正式名称为“单光束梯度力势阱”( s i n g l e - b e a mo p t i c a lg r a d i e n tf o r c et r a p ) 。 由于使用光镊来捕获操纵样品具有非接触性、无机械损伤等优点，这使得光 镊在生物学领域表现出了突出的优势。这些年来，随着研究的深入和技术的不断 完善，光镊在生物学的应用对象由细胞和细胞器逐步扩展到了大分子和单分子 等。目前，光镊常被用来研究生物过程中的细胞和分子的运动过程1 7 1 0 l ，也 常被用来测量生物过程中的一些力学量【1 1 1 4 。 1 2 光镊的原理与特点 众所周知，光具有能量和动量，但是在实际应用中人们经常利用了光的能量， 却很少利用光的动量。究其原因，这主要是因为在生活中我们接触到的自然光和 照明光等的力学效应都很小，无法引起人们可以直接感受到或观察到的宏观效 应。而科学家们利用激光所具有的高亮度和优良的方向性，使得光的力学效应在 显微镜下显现了出来，在这里我们要介绍的光镊技术正是以这种光的力学效应为 基础发展起来的。 2 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 1 2 1 光压与单光束梯度力光阱 光与物质相互作用的过程中既有能量的传递，也有动量的传递，动量的传递 常常表现为压力，简称光压。1 9 8 7 年，麦克斯韦根据电磁波理论论证了光压的 存在，并推导出了光压力的计算公式。1 9 0 1 年，俄国人n h 列别捷夫用悬在细 丝下的悬体实现了光压的实验测量【1 5 】。此后，美国物理学家尼克尔、霍尔也 分别测量了光压【1 6 1 。2 0 世纪7 0 年代，人们开始研究激光的辐射压力，并发 展了原子束的激光偏转【 7 1 、激光冷却【1 8 】、光子粘团【1 9 等实验技术。在 宏观微粒的光压力研究方面，由光悬浮发展到光捕获、光致旋转等 2 0 1 。1 9 7 0 年，a a s h k i n 2 1 】首次实现了水溶液中的光悬浮。随后的一些研究 2 2 2 5 】 最终导致了光镊的发明。 通常光对物体的作用力都是推力。但是，在一定条件下光也可以对物体产生 拉力，或更一般的，产生束缚力。这就牵涉到光对物体作用的梯度力。 为了阐明梯度力的概念，以透明介质 小球为例说明。如图1 1 所示，一个透明 介质小球处于一个高斯分布的非均匀会聚 光场中，小球的折射率大于周围介质的折 射率。当会聚激光束照射到微粒上时，激 光发生折射和反射，也包括一部分吸收。 被微粒反射和吸收的光作用就是光辐射压 力，或者称散射力，其方向与光传播方向 一致，它趋向于使小球沿光束传播方向运 动。与此同时，光束经过微粒会发生多次 折射，有些会聚光线折射后传播方向更趋 向于光轴( 即光束传播方向) ，从而增大了 轴向动量，因而给与微粒与光传播方向相 反的作用力，表现为拉力，这就是轴向梯 图1 1 单光束梯度力光阱 度力的本质，由于此拉力的作用，导致粒子在轴向可以稳定在激光焦点附近。而 微粒在横向的偏离，由于光场的非均匀性，也会受到指向激光焦点的回复力，即 横向梯度力。在梯度力和散射力的共同作用下，微粒被稳定束缚在激光焦点附近。 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 这就是单光束梯度力光阱。 1 2 2 光镊技术的特点 光镊是对单光束梯度力光阱的形象的称呼，因为它与宏观的机械镊子具有相 似的操控物体的功能。但与宏观的机械镊子相比，或者与传统的操控微纳米粒子 的显微微针或原子力显微镜等相比，光镊具有不可比拟的优越性。光镊对微粒的 操控是非接触的遥控方式，不会给对象造成机械损伤。这使得光镊在生物学研究 特别是单细胞单分子研究领域应用非常合适。首先，光镊捕获微粒的尺度在几十 纳米到几十微米，正好是生物细胞、细胞器以及生物大分子的尺度范围。其次， 光镊的温和操控不会损失细胞，虽然激光会产生热，但可以通过选择合适的波长， 避开细胞对光的吸收波长，将热效应降到最低。另外，由于大部分细胞膜是透明 的，光可以穿过细胞膜操控细胞内部微粒，这是其他操控手段无法做到的。 光镊不仅可以操控微粒，还可以进行微小力的测量，粒子偏离捕获中心的距 离和其受到的回复力成正比，类似与弹簧，在操控过程中能实时感应俘获粒子的 微小负荷。因此，光镊是极其灵敏的力传感器，其作为微小力的探针，可以进行 细胞和生物大分子之间的相互作用的定量测量，进一步揭示细胞的功能以及活动 规律。 1 3 光镊技术在生物学中的应用 随着物理技术手段的不断进步，物理学和生物科学的结合使得对生命活动规 律的认识逐步深入。从原来器官、组织的层次逐渐发展到细胞、生物大分子的层 次。分子生物学概念、方法和技术的引入使得生物学取得了突破性进展，产生了 许多新的生长点，并逐步形成新的概念与新的领域。其中特别是人们对生命规律 的认知，从过去的对分子整体平均行为的宏观研究，发展到现在能对分子个体行 为进行微观研究，使人们的认知更深入、更本质，进而又促进了对生命宏观规律 的认识。生物大分子