（植物学专业论文）黑芥子酶协助蛋白基因启动子370bp序列功能的缺失分析.pdf

摘要 十字花科植物中存在一个特殊的底物一酶系统，即硫苷一黑芥子酶系统 ( g l u c o s i n o l a t e m y r o s i n a s es y s t e m ) 。在植物体内，黑芥子酶往往与黑芥子酶 结合蛋白和黑芥子酶协助蛋白一起以复合体的形式存在。i m y a p 是一种存在于营 养器官中的诱导表达的蛋白。创伤、m e j a ，j a 等能诱导i m y a p 基因的表达。阮 颖等对黑芥子酶协助蛋白基因启动子进行缺失并将融合子转入模式植物拟南芥 中研究发现，全长序列中从一1 到一3 7 0 区段的3 7 0 b p 的长度就可以实现全长启动 子的启动功能。这一3 7 0 b p 长的核心启动子在正常生长条件下，能启动g u s 基 因在气孔器保卫细胞中特异表达，成为了一个典型的组织特异型启动子。但是， 目i ；i 已知的与器官组织特异性表达有关的基序，在3 7 0 b p 的范围之内尚未发现。 因此，我们对i m y a p 基因启动子的3 7 0 b p 启动子片段进行进一步的缺失分析， 以期找到新的与在保卫细胞特异表达有关的基序打下良好基础。 我们分别克隆了i m y a p 全长启动子中从一1 到一3 7 0 区段的3 7 0 b p 、一1 到一3 0 8 区段的3 0 8 b p 和一1 到一1 5 0 区段的1 5 0 b p 长的三段启动子序列片段，插到g u s 报告基因的| j 面，并将融合子转入模式植物拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i n a ) 基因 组中。在拟南芥的遗传背景下来剖析i m y a p 基因启动子的功能结构。我们成功 地将三个启动子片段分别转入拟南芥中。结果显示，在没有任何诱导的情况下， 这三个片段都能够启动g u s 基因在植物体中表达。m a 是转入了3 7 0 b p 片段的 植株，m b 是转入3 0 8 b p 的植株，m c 是转入了1 5 0 b p 的植株。m a 植株染色最 深，并且g u s 基因在保卫细胞中表现出特异性表达。根、茎部有染色，在根和 茎过渡区染色最深。m b 植株染色很浅，只在少数薄壁细胞中有表达，但不具备 保卫细胞表达的特异性。m c 植株也不具有保卫细胞表达特异性，不被染色。根 据试验结果，转入3 0 8 b p 的m b 植株中g u s 基因就已经不具备保卫细胞特异表 达的特点，我们初步推测与保卫细胞特异性表达有关的基序存在于一3 7 0 b p 3 0 8 b p 的序列上。这一结果为下一步找到新的保卫细胞特异表达的基序奠定了基 础。 关键词：启动子，黑芥子酶协助蛋白基因，保卫细胞，缺失分析 a b s t r a c t i nt h ec r u c i f e r a ep l a n tt h e r ei sas p e c i a ls u b s t r a t e e n z y m es y s t e m ，n a m e l y g l u c o s i n o l a t e m y r o s i n a s es y s t e m i nv i v o ，m y r o s i n a s e su s u a l l yo c c u ri nc o m p l e x e s w i t hm y r o s i n a s e b i n g i n gp r o t e i na n dm y r o s i n a s e a s s o c i a t e dp r o t e i n i m y a pi so n eo f m y r o s i n a s e a s s o c i a t e dp r o t e i n sp r e s e n ti nv e g e t a t i v eo r g a n , w h i c hc a nb ep r o m o t e d b yi m y a pp r o m o t e ri n d u c e db yw o u n d i n g ，m e j a ，j aa n dt h ea b a t r e a t m e n t t h e r e s u l ti n v e s t i g a t e db yy i n gr u a ns h o w e dt h a t3 7 0 b pf r a g m e n ti se n o u g hf o rf i n i s h i n g t h ei n d u c e df u n c t i o no fw h o l ep r o m o t e r t h es e e d l i n g sw i t h3 7 0 b pf r a g m e n tc a l ls t a r t u pt h eg u sg e n ee x p r e s s i o na f t e rb e i n gt r e a t e db yw o u n d i n ga n dm e t h y lj a s m o n i c a c i d i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h e3 7 0 b ps e q u e n c ew a st h ec o r ep r o m o t e ro fi m y a pg e n e p r o m o t e ra n dh a dt h eg u sg e n ee x p r e s ss p e c i f i c a l l yi nt h eg u a r dc e l l i no r d e r t ol a y g o o df o u n d a t i o nf o rf i n d i n go u tt h en e wg u a r d c e l ls p e c i f i cm o t i f , w ed i s s e c t e dt h e 3 7 0 b pf r a g m e n to f i m y a pg e n ep r o m o t e r w ec l o n e dt h r e ef r a g m e n t sf r o mt h ei m y a pp r o m o t e r t h ef i r s to n ei sf r o m - 3 7 0 b pt o l b p t h es e c o n di sf r o m - 3 0 8 b pt o - l b p a n dt h em i r di sf r o m - 1 5 0 b pt o lb p w ei n s e r t e dt h et h r e ef r a g m e n t sj u s tb e f o r eg u sg e n ea n dt r a n s f e r r e dt h e f u s i o n si n t oa r a b i d o p s i sg e n o m e t h e nt h ef u n c t i o n a ls t r u c t u r eo ft h i s3 7 0 b p f r a g m e n tw a sa n a l y z e do nt h ea r a b i d o p s 妇h e r e d i t yb a c k g r o u n d w eh a v et r a n s f e r r e d t h e s ef r a g m e n t si n t ot h ea r a b i d o p s i s t h er e s u l tr e v e a l st h a tt h e s et h r e ep r o m o t e r f r a g m e n t s c a l la l lp r o m o t et h eg u s g e n ee x p r e s s i o nw i t h o u ta n yi n d u c e m e n t m aa r et h es e e d l i n g sw i t h3 7 0 b pf r a g m e n t ，m ba r et h es e e d l i n g sw i t h3 0 8 b p f r a g m e n t ，a n dm c a r et h es e e d l i n g sw i t h15 0 b pf r a g m e n t m aa r et h ed y e dd e e p e s ti n t h e s et h r e et r a n s f e r r e ds e e d l i n g s a n dt h eg u sg e n ei ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nt h e g u a r dc e l lo fm a t h e r o o ta n ds t e mo fm aa r ea l s od y e d t h ej o i no fr o o ta n ds t e m i sd y e dd e e p e s ti nm a b u tt h e3 0 8 b pf r a g m e n tc a n n o tp r o m o t et h eg u sg e n e e x p r e s si nt h eg u a r dc e l l 15 0 b pf r a g m e n ta l s oc a n n o tp r o m o t et h eg u sg e n ee x p r e s s s p e c i f i c a l l yi nt h eg u a r dc e l l f r o mt h i sr e s u l t ，w ep r e s u m e dt h a tt h e r ei sa m o t i fi nt h e - 3 0 8 b pt o 一3 7 0 b p ，a n di ti sr e l a t e dw i t hg u a r dc e l ls p e c i f i c a l l ye x p r e s s i o n t h i sr e s u l t l a y sf o u n d a t i o nf o rf i n d i n gn e wm i t i f , a n dt h em o t i fi s r e l a t e dw i t ht h eg u a r dc e l l s p e c i f i c a l l ye x p r e s s i o n k e yw o r d s ：p r o m o t e r ，i m y a pg e n e ，g u a r dc e l l ，d i s s e c t i o na n a l y s i s s u s s m a n , m r ( 1 9 9 5 ) e x p r e s s i o no f a na r a b i d o p s i sp o t a s s i u mc h a n n e lg e n ei ng u a r d c e l l s 【j 】p l a n tp h y s i o lj = 1 0 9 ，3 7 1 3 7 4 8 4 k a l d e n h o i f , 1 l ，k o l l i n g ，a ，k a r m a n ，u ，r u p p e l ，ga n dr i c h t e r , g ( 1 9 9 5 ) t h eb l u e l i g h t r e s p o n s i v e a t h b 2g e n eo fa r a b i d o p s i st h a l i a n ai s p r i m a r i l ye x p r e s s e di n e x p a n d i n g a sw e l la si nd i f f e r e n t i a t i n gc e l l sa n de n c o d e sap u t a t i v ec h a n n e l p r o t e i no f t h ep l a s m a l e m m a j 】p l a n tj 7 ( 1 ) ：8 7 - 9 5 8 5 李军，龚喜明，林惠琼，宋全波，陈珈，王学臣d g p l ，一个受干旱诱导的保卫细胞特异 性启动子的构建与功能分析 j 】中国科学c 2 0 0 4 ，3 4 ( 4 ) ：2 9 9 3 0 3 缩略语表a b b r e v i a t i o n s 5 3 a b a a t p b p c t a b d a d m s 0 d n a d n t p e b e d l a e g l a g u s h r i p t g k a c j a k b l b m l n m o p s m s n t p c r p e g p m s f r n a r i s d s s d w s e c a b s c i s i ca c i d 脱落酸 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 腺苷三磷酸 b a s ep a i r 碱基对 c e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三乙酸溴化氨 d a l t o n 道尔顿 d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚枫 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e t h y l e n eg l y c o lt e t r aa c e t i ca c i d 乙二醇双乙胺醚四乙酸 1 3 g l u c o r o n i d a s e1 3 一葡糖苷酸酶 h o u rh i s o p r o p y l - b e t a - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基一1 3 硫代半乳糖苷 p o t a s s i u ma c e t a t e 乙酸钾 j a s m o n i ca c i d 茉莉酸 k i l o b a s ep a i r s 千碱基对 l u r i a - b e r t a n im e d i al b 培养基 m i n u t e 分钟 3 r n m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l p h o n i ca c i d m u r a s h i g ea n ds k o o gm s 培养基 n u c l e o t i d e 核苷酸 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p h e n y l m e t h y l s u l p h o n y l f l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s 发根农丰t 菌 s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e 十二烷基磺酸钠 s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r 灭菌蒸馏水 s e c o n d 秒 5 4 s s c s s p e t a e t b e t b s t - d n a t e 面 t e m e d t r i s u v x - g a l s o d i u mc h l o r i d e s o d i u mc i t r a t eb u f f e r 标准柠檬酸钠盐 s o d i u mc h l o r i d e s o d i u mp h o s p h a t e e d t ab u f f e r 标准柠檬酸钠盐一 乙二胺四乙酸 t r i s a c e t a t e e d t ab u f f e r i r i s b o r a t e - e d t a b u f f e r t r i s - 硼酸缓冲液 t r i sb u f f e r e ds a l i n e 标准t r i s 缓冲液 r e g i o no fp l a s m i dd n at r a n s f e r r e da n di n t e g r a t e di n t op l a n tw i t h a g r o b a c t e r i u mt u m e f a e t i o n s 在农杆菌转化植物过程中转移并整合 到植物中的质粒d n a 区段 t r i s e d t ab u f f e r i r i s e d t a 缓冲液 a g r o b a c t e r i u mt u m i f a c i e n s 土壤农杆菌 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h ) r l e n e d i u m i n e n n ，n ，n 一四甲基乙二胺 ( h y d r o x y m e t h y l ) p h e y l m e r c r r i ca m m o n i u ml a c t a t en 苯汞基乳酸铵 u l t r av i o l e t 紫外光 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y lb dg a l a e t o s i d e5 溴- 4 氯3 吲哚 b d 一半乳塘 x g l u e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y lg l u e u r o n i d e5 - 溴4 一氯3 一吲哚糖醛酸 一5 5 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 哆p 烩务 时间：石舯7 年月侈同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( i i 密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：儡 叁鸯时间：如夕年f 月7 ；只 导师签名：勺0 软 时间：刁年易月 闩 ， 第一章文献综述 l 黑芥子酶协助蛋白( i m y a p ) 基因 在十字花科( c r u c i f e r a e ) 植物中，有一个特殊的底物一酶系统，即硫苷一黑芥 子酶系统( g l u c o s i n o l a t e m y r o s i n a s es y s t e m ) 。该系统对植物的生长发育、次生代谢物 的产生、生长素微调、植物的防御反应等都有着很重要的意义。另外，该系统能够介 导植物与其它生物环境之间的相互作用，并且其次生代谢产物硫苷，还影响到很多重 要的十字花科的蔬菜、油料和饲料的风味和或健康特性。 硫苷的主要的生物学活性的获得需要黑芥子酶将其进行水解。硫苷分布于细胞的 液泡内( v a c u o l e s ) ，黑芥子酶以黑芥子酶蛋白颗粒( m y r o s i n a s eg r a i n s ) 的形式分布 于细胞基质中，这两者构成了大家熟知的“芥子油弹( m u s t a r d o i lb o m b ) ”，在植物防 御中起着重要作用。当植物组织被破坏后( 如创伤或昆虫取食) ，定位于细胞内不同 空间的硫苷与黑芥子酶直接接触，这种接触导致没有毒性的硫苷在黑芥子酶的水解作 用下，产生具有活性的降解产物。最常见的降解产物是异硫氰酸( i s o t h i o e y a n a n t e ) ， 也称芥子油( m u s t a r do i l ) ，它对非专一性的草食性昆虫和专一性的草食性昆虫都显 示出较高的生物学毒性【1 2 3 。 黑芥子酶最早是由b u s s y 4 1 在1 8 4 0 年报道的，他在研究黑芥( b r a s s i c a n i g r a k o c h ) 时发现了一种具有白蛋白性质的蛋白质，这种蛋白质能将黑芥子硫苷酸钾( 一种硫苷) 水解。人们通过研究发现，所有含有硫苷的植物同时都含有降解硫苷的酶类。并且在 含有硫苷的植物中检测到许多黑芥子酶的同工酶，甚至在某些真菌、细菌和昆虫中也 检测到有芥子酶活性。在植物中，不同种及同一植物不同器官之间的同工酶类型可以 不同【5 j - 其活性也不尽相同。黑芥子酶的活性取决于植物种、品种和器官的不同而有 所不同。通常情况下，黑芥子酶的晟高活性出现在种子和幼苗时期。 通过对甘蓝型油菜( 丑n a p u s ) 的c d n a 序列和基因杂交模式的分析显示黑芥子 酶是由一个基因家族编码的。这个基因家族可以分为三个亚类，即m a ( m y r o s i n a s e a ， o rm y r l ) 、m b ( m y r o s i n a s eb ，o rm y r 2 ) 和m c ( m y r o s i n a s ec ，o rm y r 3 ) 1 6 1 ”。从甘 蓝型油菜的种子提取蛋白质进行w e s t e r nb l o t 分析发现：在可溶和不使蛋白质变性的 条件下，m a 黑芥子酶以游离的二聚体形式存在，m b 黑芥子酶与m c 黑芥子酶是 与其它一些蛋白质结合，以黑芥子酶复合体( m y r o s i n a s ec o m p l e x ) 的形式而存在。 1 一 在复合体中，第一个被鉴定出的非黑芥子酶蛋白质是5 0 k d a 和5 2 k d a 黑芥子酶结合 蛋白( m y r o s i n a s e b i n d i n gp r o t e i n , m b p ) 。另一个被鉴定出来的非黑芥子酶蛋白质是 黑芥子酶协助蛋白( m y r o s i n a s e a s s o c i a t e dp r o t e i n ，m y a p ) 。m y a p 存在种子特异与营 养器官表达两种类型：种子黑芥子酶协助蛋白( s e e d m y a p ) ，是一种组成型的蛋白 质，特异地存在于种子中；另一种是在受创伤( w o u n d i n g ) 的情况下，或者是在脱落 酸( a b a ) 和甲基茉莉酸( m e j a ) 等因素诱导下表达的，存在于营养器官中，称为 i m y a p ( i n d u c i b l em y a p , i m y a p ) 。对用甲基茉莉酸处理过的叶片进行原位杂交分析， 结果显示i m y a p 在所有的薄壁细胞( p a r e n c h y m a lc e l l s ) 中都有表达。瑞典乌普萨拉 遗传研究中心的j o h a nm e i j e r 教授实验室成功地从苷蓝型油菜中克隆到了一个完整的 i m y a p 基因。他们利用n o r t h e r n 和s o u t h e r n 技术、引物延伸分析( p r i m e re x t e n s i o n a n a l y s i s ) 和r n a 酶保护分析( r n a s ep r o t e c t i o na n a l y s i s ) ，确定了该基因转录的起始 位点；发现创伤、m e j a ，j a 和a b a 等诱导因素能促进i m y a p 基因转录，而s a ( 水 杨酸) 则抑制i m y a p 基因转录；对用m e j a 处理过的叶片进行原位杂交分析，结果 显示在所有的叶片薄壁细胞中都有i m y a p 转录。从不同发育时期看，受诱导因素处 理后，新叶和老叶都有i m y a p 表达【8 9 1 。 2 启动子概述 植物的生长发育、遗传和对外环境的反应都是由不同的基因在特定的时问和空间 上协调表达的结果。基因在时自j 和空白j 上有序表达的过程中，启动子起到了相当重要 的作用。高等植物基因的调控，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。 植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5 端上游区的d n a 序列。 聚合酶识别并结合启动子序列，从而起始基因的转录。 植物基因启动子通常仅位于基因上游，能指导全酶与模板的j 下确结合，活化聚合 酶，并决定转录的方向和效率以及所使用的聚合酶类型，是植物基因转录调控的中心。 真核生物基因启动子的典型核心结构( c o r ep r o m o t e r ) ，即转录起始前复合物( i n i t i a t i o n c o m p l e x ) 结合的区域大约在转录起点附近的- - 4 0 b p + 5 0 b p 区域之i 、日j 。具有结合并控 制转录起始前复合物的装配、定位转录起始位点并控制转录的方向、对细胞内l 临近或 远处的激活子或抑制子做出响应的功能1 1 0 1 。真核生物中蛋白质编码基因的转录是由 r n a 聚合酶l i 束执行的。由r n a 聚合酶i i 指导转录的基冈核心启动子大多包含一 个t a t a 盒和( 或) 起始f ( 1 n r ) 。 - 2 真核生物r n a 聚合酶i i 起始包括蛋白编码基因在内的i i 类基因的转录。蛋白编 码基因中转录起始点的- - 3 0 b p - , + 3 0 b p 区域为核心启动子，含有一些重要元件，能介 导基因转录，是基因精确调控的基础【1 1 】。己鉴定的多种特定的启动子顺式作用元件 ( c i s a c t i n ge l e m e n t s ) ，常常在基因转录起始点5 近端的核苷酸序列上游一2 0 一 2 2 0 b p 区域。大部分植物基因多数情况下转录起始点为a ( 腺嘌呤) ，且两侧多为嘧 啶碱基 1 2 , 1 3 j 。 2 1 启动子的结构特征 一般在启动子的一2 0 一2 2 0 b p 区域内，一2 5 一3 0 b p 处含有1 ：a t a 盒，一7 0 - - 7 8 b p 处有c a a t 盒，一8 0 一1 l o b p 区含有g c 盒。为了表述方便，将大约一8 0 - - 2 2 0 b p 处存在的启动子顺式作用元件叫上游元件( u p s 仃e a me l e m e n e t s ) ，一l 一7 9 b p 处存在的启动子顺式作用元件叫下游元件( d o w n s t r e a me l e m e n e t s ) 。上游启动子元件 又分为一般上游元件( g e n e r a lu p s t r e a me l e m e n e t s ) 和特有的上游元件 ( p r o m o t e r - s p e c i f i cu p s t r e a me l e m e n t s ) b 4 】。 2 1 1 转录起始位点 高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子( a t g ) 上游- 4 0 b p 一 7 0 b p 处。j o s h i 通过对7 9 个高等植物基因启动子区d n a ) 顿序的比较研究推衍出，植物 a t g 密码旁侧的序列较为保守，常为t a a a c a a t g g c t ，基因转录起始的保守顺序为 c t c a t c a ，中间的a 为转录的起始点，编号+ 1 【】。从基因转录起始点到翻译起始密 码子之间的序列被称为5 端非翻译区，该区的5 端是m r n a 前体加帽的位点。5 端非 翻译区对翻译效率具有调控作用，此外在一些植物基因的5 端非翻译区中有内含子存 在，这些内含子有增强基因表达的作用。再者，转录起始位点发生变化或缺失都会影 响转录。 2 1 2 t a t a 盒 位于起始点上游2 5 3 0 b p 的t a t a 盒是最早被认识到的核心启动子元件，它也 是一些反式作用因子与d n a 相互作用的位点之一。植物启动子1 ：盯a 盒是位于转录 起始位点上游3 2 + _ _ 7 b p 处的一段富含a t 碱基对的序列，与动物启动子略有不同，其 保守序列为5 t c a c t a t a t a t a g 3 ，。t a t a 盒依靠与转录因子t f i i d 的口 别结合 而发挥功能，介导决定r n a 聚合酶起始转录的位点，以及介导前转录复合物的肜成 并启始转录：同时在一些启动f 中浚元件还决定转录的方向，或者介导上下游元件对 1 转录的调控作用。t a t a 盒是绝大多数植物启动子正确启动转录所必需的，不含t a t a 盒的基因的精确转录受起始因子( i n i t i a t o r ) 介导。 2 1 3i n r ( i n i t i a t o r ) 元件 将 i n i t i a t o r 与r n a 聚合酶i i 转录联系起来的是g - r o s s c h e d l 等人f m 。8 0 年代早 期，t a t a 类启动子中i n i t i a t o r 进行了一系列突变研究，突变的效果显示出高度的可 变性。在某些情况下，起始点突变对转录起始的效率和准确性几乎没有影响；在另外 的情况下，突变或者导致启动子强度急剧下降或者导致转录起始点位置移动。8 0 年 代末期，鼠末端脱氧核糖核苷酸转移酶基因( t d t ) 的核心启动子中发现了典型的 i n a t i a t o r 元件，它没有t a t a 盒或类似的a t 富含区域，而是富含g c 。这一发现丌创 了i n a t i a t o r 研究的新局面。 后来的统计分析显示，围绕着转录起始点的具有i n a t i a t o r 活性的序列保守性很低。 但是对部分功能性的i n a t i a t o r 元件进行突变和计算机分析仍然揭示出规律性的结果， i n a t i a t o r 偏好的是一段富含嘧啶的序列p y p y + n t a p y p y 。其中+ l 位a 、+ 3 位t 或a 以及一1 位嘧啶对i n a t i a t o r 活性最为关键i 埔1 。i n a t i a t o r 作为与t a t a 盒同等重要的 真核启动子核心元件，在真核基因转录起始中发挥着独特的作用。 2 1 4 一般上游启动子元件 在真核基因启动子中普遍存在着c a a t 盒和g c 盒两种元件，它们或者同时存在， 或者只存在其中之一，有时还是多拷贝的。但并非所有的真核基因的启动子都存在着 一般上游元件，例如在某些植物细胞中几乎不存在c a a t 盒1 1 9 1 。 c a a t 盒是位于t a t a 盒上游约5 0 b p 处的一段5 g c ( t c ) c a a t c t 3 顺序，其 转录激活因子是n f i 和c t f 成员等多种蛋白，从拟南芥克隆的n f y 新成员中大多 数具有单一的组织特异性，然而a t n f y 9 却是普遍存在的 2 0 l 。c a a t 框对基因转录 有较强的激活作用，对两个方向都可激活，而且作用距离不定。但有些基因无此框， 如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无c a a t 框而被c a t c 框代替。 g c 盒经常在转录起始位点上游- - 9 0 b p 左右处，最近位置的g c 框是在起始点上 游一4 0 - - 7 0 b p 处，它可以处于t a t a 框与c a a t 框之阳j ，也可位于c a a t 框上游， 位胃因不同摹冈而异。这种框的保守序列为5 g g g c g g 3 ，可有多个拷贝，并能以 任何方向存在而不影响其功能。g c 框仍需与另一种特异的转录因子( s p l ) 结合j 能促 进壁因转录。 2 1 5 特殊的上游元件 一4 一 植物启动子的顺式元件除了上述共有的保守碱基序列外，不同来源的启动子还通 常具有种属特异的或者仅局限于某种基因家族特有的调节基序，如g 框。g 框的共通 序列为5 c a c g t g 3 ，是高度保守而且也是研究最清楚的植物型转录元件之一。它需 要与另一个顺式作用元件( i i i ) 结合，在细胞接受外界信号时对转录起始的频度起调 节作用2 ”。这种机制可能是通过g 盒及其结合蛋白相互作用产生一个内部环境，使另 外的调节蛋白与启动子区域有效结合，允许细胞准确而有选择地起始转录。 2 2 植物基因启动子的分类 根据其作用方式及其功能，可将植物基因工程中常用的启动子分为3 类，即组成 型启动子( c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r ) 、组织特异性启动子( t i s s u e s p e c i f i cp r o m o t e r ) 和诱导型 启动子( i n d u c i b l ep r o m o t e r ) 。这种分类大体上反应了它们各自的特点，但在某些情况 下，一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。 2 2 1 组成型启动子 组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达。具有持续性，不表现时空特异 性；r n a 和蛋白质表达量也相对恒定等特点。从结构上看大多数组成型启动子转录 起始点上游几百个核苷酸处，都存在核苷酸序列t g a c t g ! 翻。目i j 使用最广泛的组 成型启动子是花椰菜花叶病毒的( c a m v ) 3 5 s 启动子、来自根癌农杆菌t i 质粒t - d n a 区域的胭脂碱合成酶基因( n o s ) 启动子和章鱼碱合成酶基因( o c s ) 启动子；来自水稻的 a e t i n l ( a c t i ) 启动子等。根癌农杆菌n 质粒t - d n a 区域的胭脂碱合成酶基因( n o s ) 启 动子虽然来自细菌，但具有植物启动子的特性。人们从植物自身克隆的组成型启动子， 在应用中也初见成效，像从水稻和玉米中分别克隆了肌动蛋白【2 3 1 和泛素阱1 基因的启 动子，并用这些启动子代替c a m v 3 5 s 启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外 源基因的表达。n a o m i 等分别从拟南芥的色氨酸合酶b 亚基基因和植物光敏色素基 因中克隆了相应的启动子，用其代替c a m v 3 5 s 启动子，在转基因烟草中也取得了很 好的表达效果1 2 5 】。 但是，组成型启动子在应用中也存在定的缺陷，它会使驱动的目的基因在植物 各组织中恒定而持续的表达，过度消耗细胞内的物质和能量，不能从时问和空间上有 效地调控目的肇凶的表达f ”i 。组成型启动子会使外源基因在整株植物中表达，产生的 大置异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，不利于产 量和品质的提高：有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长， 5 一 甚至导致死亡。另外，重复使用同一种组成型启动子驱动2 个或2 个以上的外源基 因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象o ”l 。因此，人们在寻找更为有效的组织、器 官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。 2 2 2 诱导型启动子 植物的生长发育受内外环境因素的复杂交互作用调控捌。诱导型启动子能使基因 对特定信号刺激做出响应，趋利弊害。诱导型启动子有天然存在的，也可进行人工构 建，物理因素( 如光照、温度、干旱) 、化学因素( 如离子、有机物、激素) 以及生物因 素( 如病菌、组织器官、发育阶段) 都可诱导诱导型启动子进行表达。 2 2 2 1 光诱导表达启动子 早在1 9 8 5 年l a m p p a 等【2 9 1 就把小麦的c a b 基因转入双子叶植物烟草，在烟草中 表现出了光调控器官特异性。c m a 5 为烟草r b c s8 b 启动子的5 2 b p 片段，该启动子 包含i - b o x 和g - b o x 顺式因子，c m a 5 是光响应的最小单元，能以依赖于光敏素和质 体等的方式激活异源最小启动子，而且c m a 5 的光诱导需要h y 5 和下游负调控因子 c o p d e t 调控它的活性【3 0 l 。王念捷等【3 1 l 将水稻r 4 c l 1 基因与g u s 基因融合导入烟 草基因组中，在紫外照射下r 4 c i , - i 启动子能在植物发育过程中指导g u s 报告基因 的组织特异性表达。z - b o x 是光诱导基因启动子中另一光响应因子( l r e s ) 。具有z b o x ( 一个或两个l r e ) 的启动子能响应很宽的光谱，响应主要是由p h y a 、p h y b 和c r y l 光接收器介导的f 捌。 2 2 2 2 创伤诱导表达的启动子 许多植物都能对人为创伤或害虫造成的机械损伤作出反应，使某些刨伤诱导基因 启动表达发挥抗性作用。这是自然界赋予植物的一种免疫机制，使植物能迅速调整伤 口周围细胞的生理反应。保证植物仍能正常生长。这些创伤诱导的基因编码多种蛋白 产物：包括几丁质酶和b 1 ，3 葡萄糖酶等水解酶类，木质素，蛋白酶抑制剂等。烟草 过氧化物酶基因t p o x n l 在叶受伤后l h 内即表达3 3 i ，但只在茎和叶柄中表达，不在叶 片中表达1 。为了解受伤诱导的植物氧化酶基因表达的分子机制，k a o t h i e n 分析了辣 根过氧化物酶c 2 基因( p r x c 2 ) 启动子。研究表明p a l b 序列是p r x c 2 启动子的基 本顺式因子，且在受伤胁迫时n t l i m l 独立地结合到p a l b o x 序列上【弘i 。1 2 5 k b 的伤 v i 诱导甘薯储藏蛋白( s p o r a m i n ) 启动子中有2 个类似响应的因子，g 盒类似因子和 g c c 核心类似序列f 3 们。 2 2 _ 2 3 热诱导表达的启动子 6 r a l f 等1 3 - q 分析了大豆的g m h s p l 7 3 一b 热诱导启动子在转基因烟草中的调节作用 并在转基因植物的种子上测得g u s 活性，并且发现该启动子具有一段热诱导因子 ( h s e ) 的同功序列。大豆热激蛋白基因g m h s p l 7 5 一e 的启动子，最主要的顺式因 子位于一2 4 4 一1 7 9 b p 处，包含保守的t a t a 二联体序列，一1 7 9 - - 4 0 b p 区域包含 近端t a t a 序列和两个热激因子( h s e s ) 【”1 。富含a t 序列对热诱导表达有适度影响， 而且c c a a t 盒与h s e s 共同作用增加h s p 启动子的活性【3 9 1 。m a r i a 等i 删从向同葵中 分离了编码小热激蛋白( s h s p s ) h a h s p l 8 6 g 2 和h a h s p l 7 7 g 4 的基因，发现 h a h s p l 8 6 g 2 m r n a s 只有热诱导活性，而h a h s p i 7 7 g 4 对高温( 4 2 ) 、脱落酸和水 分胁迫都有应答。 2 2 3 组织特异性启动子 组织特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，其特 异的顺式因子及一些特异的转录因子的不同使基因能够进行特异性表达，以适应植物 本身生长发育的需要，基因可以在植物特定的发育阶段，特定的组织器官( 根、茎、 叶、花、果实和种子) 中准确表达。 2 2 3 1 组织特异性启动子在营养器官中的研究和应用 蒋浩1 4 1 】等将笋瓜韧皮部蛋白通过农杆菌介导转化烟草，首次用转基因植物证明笋 瓜p p 2 基因启动子可驱动外源基因在异源植物韧皮部及分生组织中特异性表达。 n i t z 4 2 】等发现在拟南芥的y k l 0 基因启动子上存在许多与组织器官特异性表达和植物 激素应答等有关的特异顺式作用元件，如决定组织器官特异表达的转录因子结合位点 有关的a c g t ，c a n n t g ，g a t a 基序：植物激素应答a s 1 基序、生长素和脱落酸 应答元件43 】；与植物次生代谢、调节细胞形态建成有关的m y b 元件。近年来人们分 离出一些木质素生物合成途径中关键酶基因的启动子，如4 c l ，f 5 h 等【叫基因的启 动子，并且j 下在尝试利用这些特异性启动子柬调节木质素的生物合成。p p d k ( p y r u v a t e o r t h o p h o s p h a t ed i k i n a s e ) 是c 4 植物光合反应中的一个叶绿体酶，该酶基因p d k 具有一 个双元启动子系统( d u a lp r o m o t e rs y s t e m ) 【4 5 】。一个命名为c 4 p d k 启动子负责大的转