（植物病理学专业论文）辣椒WRKY转录因子基因CaRKNIF1的克隆及表达分析.pdf

摘要 w r k y 蛋白是一类在植物中具有重要作用的转录调控因子，其成员参与了植物的生长、发育、 代谢，以及对生物或非生物胁迫应答的反应。为了研究w r k y 转录因子在辣椒上的功能，从辣 椒e d n a 中克隆了w r k y 转录因子c a r k n i f l 基因，并对其编码蛋白的氨基酸序列、基因组中 的拷贝数、内含子等基因结构特性，及其表达特性等进行了分析。主要研究结果如下： 1 以辣椒品种h d a l 4 9 为材料，接种南方根结线虫二龄幼虫，利用所设计的简并引物，通过同 源克隆法获得4 个辣椒w r k y 基因片段，采用r a c e 技术克隆了c a r k n i f l 基因的c d n a 全 长序列。c a r k n i f i 基因全长2 ，1 3 9b p ，包含1 , 4 7 3b p 的开放阅读框，编码一个含4 9 0 个氨基 酸残基的蛋白，预测蛋白分子量大约是5 3 6k d a ，等电点8 0 9 ，g e n b a n k 登录号为d q l 8 0 3 4 8 。 2 以辣椒基冈组为材料，设计c a r k n i f l 基因的全长引物，进行p c r 扩增，结果表明c a r k n i f l 基因无内含子存在。根据c a r k n i f l 基冈序列设计引物( 不含w r k y 保守区) ，p c r 扩增 产物进行地高辛标记，获得探针。辣椒基因组d n a 用e c o r i 、e c o r v 、b a m h i 三种限制性 内切酶消化，进行s o u t h e r n 杂交，结果表明c a r k n i f l 基因以多拷贝的形式存在于植物体内。 3 生物信息学分析表明，辣椒c a r k n i f l 转录因子的氨基酸序列含有两个保守的w r k y 结构 域，属于第1 组w r k y 转录因子；c a r k n i f l 蛋白可能定位于细胞核内；预测了该蛋白的二 级结构、三级结构特点；并推导出该蛋白具有转录、转录调控、信号转导、胁迫应答等功能。 4 对辣椒进行多种胁迫或诱导，提取叶片总r n a 进行n o r t h e r n 杂交。结果表明：水杨酸、南 方根结线虫和机械伤害处理辣椒后，c a r k n i f l 在不同时间点表达量不同；乙烯、n a c l 可以 诱导c a r k n i f l 的表达，茉莉酸没有诱导作用。据此推断c a r k n i f l 基因应与水杨酸、乙烯 信号转导途径有关。 关键词：辣椒，w r k y 转录因子，根结线虫，基因克隆，表达分析 a b s t r a c t w r k y p r o t e i n sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np l a n t t h e ya r ei n v o l v e di nd e v e l o p m e n t a la n dm e t a b o l i c p r o c e s s e s ，a sw e l la si nb i o t i ca n da b i o t i cs t r e s sr e s p o n s e s t os t u d yt h ef u n c t i o no fw r k yt r a n s c r i p t i o n f a c t o ri nh o tp e p p e r ，aw r k yg e n ec a r k n i f lw a sc l o n e d i t sa m i n oa c i d ss e q u e n c e ，c o p yn u m b e ri n g e n o m e ，i n t r o na n de x p r e s s i o np a t t e r n sw e r ea n a l y z e d m a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 u s i n gh o m o l o g y b a s e dc l o n i n ga p p r o a c h ，f o u rn e wh o tp e p p e r 豫k yg e n e sw e r ei s o l a t e df r o m p e p p e rh d a l 4 9a f t e rc h a l l e n g i n gi n o c u l a t i o nw i t hj 2r o o t - k n o tn e m a t o d e s u s i n gr a c et e c h n i q u e ， t h en e ww r k yg e n ec a r k n i f lw a sc l o n e d t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fc a r k n i f lc d n ai s 2 。13 9b pl o n g ，a n dc o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m e ( o r v 3o f1 , 4 7 3b pe n c o d i n gap u t a t i v e p o l y p e p t i d eo f4 9 0a m i n oa c i d s t h em o l e c u l a rm a s so ft h ep r e d i c t e dp r o t e i ni s5 3 6k d aa n dt h e i s o e l e c t r i cp o i n tw a sc a l c u l a t e dt ob e8 0 9 t h eg e n b a n kn u m b e ri sd q 18 0 3 4 8 2 t od e t e r m i n et h ei n t r o no fc a r k n i f lg e n e ，w ep e r f o r m e dap c ra m p l i f i c a t i o no ft h eh o tp e p p e r g e n o m i cd n au s i n gap a i ro ft h ef u l l l e n g t hc a r k n i f ie d n ap r i m e r t h er e s u l ts h o w e dt h a t c a r k n i f lg e n eh a sn oi n t r o n g e n o m i cd n as a m p l e sw e r ed i g e s t e dw i t he c o r i ，e c o rva n d b a m h i s o u t h e r nb l o tw a sp e r f o r m e dw i t hap a r t i a le d n af r a g m e n t ( n o tc o n t a i n i n gt h ec o n s e r v e d w r k yd o m a i n s ) l a b e l e dw i t hd i g h i g hp r i m ea sap r o b e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tc a r k n i f l l i k e l yp r e s e n t sa sm u l t i - c o p yg e n ei ng e n o m e 3 t h eb i o i n f o r m a t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fc a r k n i f lp r o t e i nc o n t a i n s t w oc o n s e r v e dw r k yd o m a i n sb e l o n g i n gt ot h eg r o u pio fw r k yp r o t e i n i ta l s os h o w e dt h a tt h e p r o t e i nl o c a l i z e si nt h en u c l e u s t h es e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r ew e r ep r e d i c t e d t h ep u t a t i v e f u n c t i o n sw e r ep r e d i c t e d ，e g i tm a yh a v et r a n s c r i p t i o n ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n ，s i g n a lt r a n s d u c e r a n ds t r e s sr e s p o n s ea c t i v i t y 4 t o t a lr n as a m p l e sw e r ei s o l a t e df r o mt h el e a ft i s s u e sa f t e rd i f f e r e n tt r e a t m e n t n o r t h e r nb l o t a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tc a r k n i f it r a n s c r i p t i o nf a c t o r i si n d u c e db ys a l i c y l i ca c i d ，r o o t - k n o t n e m a t o d e ，w o u n dt r e a t m e n t ，a n de x p r e s s e sd i f f e r e n t l ya tv a r i o u st i m ep o i n ta f t e rt r e a t m e n t t h e t r a n s c r i p t i o nf a c t o ri si n d u c e du p o ni n o c u l a t i o nw i t he t h e p h o na n dn a c l j a s m o n i ca c i dd o e s n t h a v ei n f l u e n c e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc a r k n i f lt r a n s c r i p t i o nf a c t o rs h o u l db ei n v o l v e di n s a l i c y l i ca c i da n de t h y l e n et r a n s d u c t i o np a t h w a y s k e yw o r d s ：c a p s i c u ma n n u u ml ，w r k yt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a ，g e n ec l o n i n g ， e x p r e s s i o na n a l y s i s 英文缩略表 英文缩写英文全称 a b aa b s c i s i ca c i d a m pa m p i c i h i n a r g 限)a r g i n i n e a s p ( d )a s p a r t i ca c i d a t a r a b i d o p s i s a v rg e n ea v i r u l e n c eg e n e b l a s tb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b pb a s e p a i r b z i pb a s i cd o m a i n l e u c i n ez i p p e r c a c a p s i c u ma n n u u m c a mc a l m o d u l i n c a m b d c a l m o d u l i n - b i n d i n gd o m a i n c a p s i c u ma n n u u m r o o t - k n o tn e m a t o d e i n d u c e d c a r k n i f l f a c t o r c d dc o n s e r v e dd o m a i nd a t e b a s e c y s ( c )c y s t e i n e d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ee x t e n d e d e b i e u r o p e a nb i o i n f o r m a t i c si n s t i t u t e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e m s a e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y e r f e t h y l e n e - r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gf a c t o r e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g e t h e t h e p h o n g 1 n ( q ) g l u t a m i n e g l u ( e ) g l u t a m i ca c i d g l y ( g )g l y c i n e v 中文名称 脱落酸 氨苄青霉素 精氨酸 天冬氨酸 拟南芥 无毒基因 局部基冈检索t 具 碱基对 碱性亮氨酸拉链 辣椒 钙调蛋白 钙调蛋白结合域 辣椒根结线虫诱导因子 蛋白保守结合域数据库 半胱氨酸 焦碳酸二乙脂 片状结构 欧洲生物信息研究生 乙二胺四乙酸 电泳迁移率变动分析 乙烯应答元件结合因子 表达序列标签 乙烯利 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 g s p h h r r i i g j a k 】d a k m l l y s ( k ) l z m a m a p k m e j a m 聊 m o p s n c b i n t o d o r f p c r p e g p m v p r p r o ( p ) p v y r a c e r g e n e g e n es p e c i f i cp r i m e r h e l 恢 h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e i s o p r o p y l 8 - 0 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e j a s m o n i ca c i d k i l o d a l t o n s k a n a m y c i ns u l f a t e l o o p l y s i n l e u c i n ez i p p e r m e l o i d o g y n ea r e n a r i a m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m e t h y lj a s m o n e t e m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a m e l o i d o g y n ej a v a n i c a p r o p a n e s u l f o n i ca c i d n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n n i c o t i a n at a b a c u m o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p o p l a rm o s a i cv i r u s p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n p r o l i n e p o t a t ov i i l l sy r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n a e n d s r e s i s t a n c eg e n e v i 基因特异引物 螺旋 过敏性反应 异丙基一p - d 硫代半乳糖苷 茉莉酸 千道尔顿 卡那霉素 环状结构 赖氨酸 亮氨酸拉链 花生根结线虫 促分裂原活化蛋白激酶 茉莉酮酸甲酯 爪哇根结线虫 南方根结线虫 丙磺酸 美国国家生物信息中心 烟草 光密度值 开放式阅读框 聚合酶链式扩增反应 聚乙二醇 杨树花叶病毒 病程相关蛋白 脯氨酸 马铃薯y 病毒 c d n a 末端快速扩增基因 全长法 抗病基冈 r p m r t - p c r s a s a r s d s s e r ( s ) s p f t e v t m v t r p ( w ) v a l ( v ) x c v r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n反转录聚合酶链式反应 s a l i c y l i ca c i d s y s t e ma c q u i r e dr e s i s t a n c e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e r i n e s w e e tp a t a t of a c t o r v a l i n e 水杨酸 系统获得抗性 十二烷基磺酸钠 丝氨酸 甘薯因子 烟草蚀纹病毒 烟草花叶病毒 色氨酸 缬氨酸 x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v v e s i c a t o r i a 细菌性斑点病原菌 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p - - d - g a l a c t o s i d e x g a l v 5 - 溴4 氯- 3 - 吲哚1 3d 半乳 糖苷 独创性：声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：各舡祆 时间：7 0 - o t 聋年 石月，7 e l 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：鲁氟狄 导师签名： 形毒听 i 时间：聊年多月7 日 时间：声功庐月，尹日 中国农业科学院硕卜学位论文第一章绪论 1 1 辣椒抗病相关基因概述 第一章绪论 辣椒( c a p s i c u ma n n u u ml ) ，茄科辣椒属，是一种重要的蔬菜作物，果实内含有丰富的维生 素c 、蛋白质和糖类等营养物质。另外，辣椒中的茄红素是人工提取红色素的主要原料，作为着 色剂被广泛地应用于食品和日用化妆品中。辣椒在贬洲、欧洲、中南美洲等地区广泛栽培，但是 在辣椒生产过程中，从播种到果实收获，无时无刻不受到病原物的侵害。 辣椒受到病原菌侵染时可以表现抗病反应，辣椒抗病相关基因按照其编码的因素在抗病反应 中的作用方式，可以分为抗病基因( r e s i s t a n c eg e n e ，rg e n e ) 、防卫反应基因( d e f e n s eg e n e ) 和 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 。抗病基因是抗病品种特有的，在辣椒生长的整个周期或其中的 某个阶段为组成型表达，而防卫基因是抗、感品种共有的，有的是组成型表达，有的则是诱导型 表达。转录因子，也称反式作用因子，是能与靶基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互 作用的d n a 结合蛋白，通过它们之间以及其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制靶标基因的 转录。抗病反应是一个极为复杂的过程，其一系列的反应源于植物抗病基因产物与病原菌中无毒 基因( a v i r u l e n c eg e n e ，a v rg e n e ) 相关产物的相互识别，并激活植物体内一系列的信号传导和反 应( h a m m o n d k o s a c ka n dj o n e s ，1 9 9 6 ) ，包括质膜离子通道开放、活性氧爆发、信号分子和转录 因子基因等活化、防卫基因激活、植物抗毒素产生与积累、过敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 出现等，最后表现出局部抗性或系统性抗病。揭示植物抗病相关基因的结构、功能和作用机制， 一直是植物病理学及植物抗病育种研究中的热点问题，在最近的几年中，辣椒抗病相关基因的研 究已经取得了重大进展。 1 1 1 辣椒抗病基因 植物识别病原物迅速产生过敏反应( h r ) ，h r 是局部的，引起感染部位的组织、器官产生坏 死，以避免感染病害，并避免进一步扩散( s t a s k a w i c ze ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这种局部的反应通常会引发 整株植物的非特异性抗性，称为系统获得抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) 。s a r 使植物在 数天内对多种病原菌具有抗性。h r 和s a r 的作用依赖于植物显性或半显性的抗性基因( 尺g e n e ) 的蛋白产物与病原菌的无毒基因( a v r g e n e ) 编码的蛋白质之间的相互作用，即1 9 5 6 年f i o r 提出的 基因对基因假说。在基因对基因的相互作用过程中，植物首先识别病原菌的特殊信号分子( 配体) ， 它是直接或间接由a ，基因编码的，尺基因则编码相应的受体，对配体的识别激活一系列的防御反 应，产生h r ，抑制病原菌的生长。抗病基因产物的主要作用是识别并结合无毒基因产物，启动 信号传导过程，最终引起防卫基因的表达，使植物表现抗病。 自1 9 9 2 年首次从玉米中成功克隆到抗圆斑病基因h m l ( j o h a la n db r i g g s ，1 9 9 2 ) ，至今已有 众多植物抗病基因被克隆，这些抗病基因分别控制对细菌、真菌、线虫、病毒的抗性。部分抗病 基因的结构、功能和抗病机制已经明确，有的抗病基因已在分子育种中得到应用，为在生产上有 效控制植物病害提供了一条新途径。 h o l m e s 最早发现的抗烟草花叶病毒的显性基冈l 来自灌木状辣椒，目前从辣椒中鉴定出4 个对 1 中国农业科学院硕十学位论文 第一币绪论 烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r u s ，t m v ) 具有抗性的基因、和( b e r z a l h e r r a n ze ta 1 ， 1 9 9 5 ；b o u k e m a ，1 9 8 2 ) ，侵染辣椒的t m v 根据与辣椒抗性基因的互作关系分为p 0 、p l 、p 1 2 和p l ，2 3 4 个致病型。1 9 7 3 年，z i t t e f 等发现抗马铃薯y 病毒( p v y ) 的基因p 尸，它与e f 是等位基因，比e f 具有更强的抗性，兼抗烟草蚀纹病毒( t e v - c ) 和p v y - n 豫两个株系。c o o k z e e t a 基因位点上发现 对p v y 免疫的单隐性基冈y 口，并认为p 尸与y 口是等位基因( c o o ke ta 1 ，1 9 8 2 ) 。1 9 8 6 年g r e e n i e a f 发现 和已厂2 两个基因对t e v - c 株系呈现出单基因隐性抗性。g r e 朗i e a f ：将抗p v y - c 、t e v - c 、杨树花叶 病毒( p m v ) 、1 e v - s 、p v y - n 和p v y - n 豫株系的抗性等位基因效应和显隐性关系概括为少 e t a p 尸术e f 。 2 区域，而e r e b p 亚家族仅含有 一个a p 2 区域。a p 2 亚家族主要在植物发育中起作用，e r e b p 亚家族主要在植物对生物和环境 的胁迫中起作用，包括c b f 类、d r e b 类、e 褂穹廷等。s a 、e t h ( e t h y l e n e ，乙烯) 和j a 在防卫信 号传递途径中起着重要的作用。大量证据表明，依赖于s a 、e t h 或j a 的信号传递途径之间存在 4 中国农、眦科学院硕卜学位论文第一章绪论 着一定的交义作用。它们之间可能是相互促进，也可能是相互拮抗，从而实现对防卫反应的精确 调控( f e y sa n dp a r k e r ，2 0 0 0 ；p i e t e r s ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而一些日盱基因常是上述信号途径交叉处的重 要成分，通过参与这些信号途径，调控下游基因的表达，从而提高植物的抗性和耐受性。在胁迫 信号途径中，e i 心转录因子通过各种各样的方式调控下游基因的表达，而且它们自身也处在复杂 的调控途径之下。大部分e r f 家族的成员都是诱导表达的，可以诱导其表达的因素有很多，包括 e t h 、j a 、a b a 、s a 、干早、盐碱、低温、病害以及机械伤害等。火部分e r f 家族的成员参与乙 烯信号转导途径，调控一系列含有g c c b o x 的抗病相关基因的表达。 1 1 3 4m y b 转录因子的特性及其功能 m y b 类转录因子是植物中数量最多、功能最多样化的一类转录因子，它是指含有m y b 结 构域的一类转录因子。m y b 结构域是一段约5 1 - - - 5 2 个氨基酸的多肽段，包含一系列高度保守的 氨基酸残基和间隔序列。首先是每隔约1 8 个氨基酸间隔的色氨酸( w ) 残基，它们参与空间结构 中疏水核心的形成，有时色氨酸残基会被芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代。其次，在每个保守 的色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的c 一末端通常是一簇酸性氨基 酸。正是上述这些保守的氨基酸残基使m y b 结构域折叠成螺旋一螺旋一转角一螺旋 ( h e l i x h e l i x t u m h e l i x ) 。通过对拟南芥干旱、高盐和a b a 诱导基因的启动子区域进行分析，鉴 定出了m y b 结合位点的核心序列为t a a c t g ，当m y b 类转录因子和下游靶基因启动子的 t a a c t c 核心序列结合后，即诱导抗胁迫基因的表达。m y b 转录因子有广泛的生理功能，几乎 参与植物发育和代谢的各个方面。 1 2 植物w r k y 转录因子研究进展 w r k y 是近年来发现的一类转录调控因子。1 9 9 4 年，i s h i g u r o 等从甘薯中克隆到第一个 w r k y 转录因子编码基因s p f i ( s p f i ：s w e e tp o t a t o f a c t o rj ) ，其产物特异地与甘薯s p o r a m i n 基 因和d 淀粉酶( 卢a m y l a s e ) 基因启动子区域的s p 8 序列结合，从而调控植物糖信号途径( i s h i g u r o a n dn a k a m u r a ，1 9 9 4 ) 。随后，人们相继在野燕麦( r u s h t o ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 、欧芹( r u s h t o ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 、 拟南芥( d ep a t e re ta 1 。1 9 9 6 ) 、烟草( w a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 、水稻( k i me ta 1 ，2 0 0 0 ) 、茄属植物( h u a n g a n dd u m a n ，2 0 0 2 ) 、鸭茅草( a l e x a n d r o v aa n dc o n g e r 2 0 0 2 ) 以及沙漠豆科植物( p n u e l ie ta 1 ， 2 0 0 2 ) 等植物基因组中克隆到w r k y 基因，并开展了较详细的分子生物学功能分析。目前，在 拟南芥中共发现了7 4 个w r k y 成员，而水稻中则发现了1 0 5 个完整的w r k y 成员。w r k y 转 录因子能与顺式作用元件w - b o x 发生特异性相互作用( y ue ta 1 ，2 0 0 1 ；s u ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而w - b o x 主要存在于与抗病、损伤、衰老相关基因和s a 诱导基冈的启动子区域，因此，w r k y 转录因子 与植物的生物与非生物胁迫应答密切相关( u k e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。此外，在果实成熟、种子表皮毛发 育、蔗糖信号传导及赤霉素信号传导等植物重要生理生化活动中也发现了w r k y 基因的表达 ( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；s u ne ta 1 ，2 0 0 3 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 2 1w r k y 转录因子的结构特征及其分类 1 2 1 1d n a 结合域 ( 1 ) w r k y 结构域 5 中囝农业科学院硕卜学位论文第一章绪论 w r k y 转录因子最主要的结构特征是d n a 结合域中都至少含有一个w r k y 结构域。w r k y 结构域是一段由大约6 0 个高度保守的氨基酸残基所组成的多肽序列，其n 端有保守的 w r k y g q k 核心序列，c 端是一个c 2 h 2 ( 氨基酸的组成模式为c x 0 5 一c x 2 2 - 2 3 h x 1 - h ) 或c 2 h c ( 氨基酸的组成模式为c x 7 c x 2 3 一h x l - c ) 的锌指结构( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) ，锌指结构也可能 发生一些变异。w r k y 转录因子另一个重要特征是绝大多数w r k y 域中都含有内含子，并且存 在的位置高度保守( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) ，其存在的意义不详，可能是参与调节转录后加上。 如 在t l r ( t o l l l i k er e c e p t o r ) 类信号分子中存在不同的内含子剪切机制，在信号转导中起重要作 用( j o r d a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在w r k y 域中共有两种类型的内含子：一种是位于编码r ( 精氨酸) 的位点，在密码子a g g 中的两个g g 之间剪接，称为r 型内含子；另一种内含子在编码v ( 缬 氨酸) 的位点前剪接，v 位于锌指结构c 2 h 2 的第2 个c ( 半胱氨酸) 之后的第6 个位点，称为v 型内含子( w ue ta 1 。2 0 0 5 ) 。 最近的研究表明，在水稻和拟南芥w r k y 家族中，有一些成员w r k y 结构域中的氨基酸发 生了变异。变异主要发生在r 、g ( 甘氨酸) 、q ( 谷氨酰胺) 和k ( 赖氨酸) 上，并且多数情况 是q 突变为e ( 谷氨酸) 和k 。水稻w r k y 成员中存在着1 9 个变异的w r k y 结构域，其中 w r k y g e k ( 7 个，全为第i 类) 和w r k y g k k ( 5 个，全为第1 ic 类) 是两个普通的变异体， 另外几个分别是w r i c g q k 、w r m c g q k 、w k k y g q k 、w i k y g q k 、w k r y g q k 、w s k y e q k 和w r k y s e k ，它们在水稻中均各只含有1 个( z h a n ga n dw a n g ，2 0 0 5 ) ，这可能是水稻中w r k y 转录因子的原始共同祖先在长期进化过程中产生变异的结果，且第类w r k y 转录因子的进化 活性比其他类型w r k y 转录因子的进化活性均要高。这些变异往往会导致w r k y 蛋白d n a 结 合活性的丧失或减弱( w ne ta 1 2 0 0 5 ) 。 ( 2 ) w r k y 结构域与w - b o x 的结合 许多体内和体外实验表明：w r k y 结构域能特异地与( t ) ( t ) t g a c ( c t ) 序列( w - b o x ) 相互 作用，其中t g a c 保守核心序列是固定不变的( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。通过凝胶电泳迁移率变动 分析( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ，e m s a ) 发现，w - b o x 保守核心序列中的t g a c 任一核 苷酸被替换，w r k y 转录因子与之结合的能力将人幅下降或完全消失，说明这种结合作用是高度 特异的。同时，w r k y 转录因子与w - b o x 的结合还需要z n 2 + 等金属离子的参与，用金属络合剂 如e d t a 或1 ，1 0 - o p h e n a t h r o l i n e 处理可阻断其结合。最有可能的金属离子是z n 2 + ( h a r ae ta 1 。 2 0 0 0 ；m a e oe ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这与w r k y 蛋白中含有锌指结构是一致的。另外，w r k y 蛋白的结合 还需磷酸化作用，因为用碱性磷酸酶预处理强烈抑制这种结合( y a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。y a n g 等( 1 9 9 9 ) 用碱性磷酸酶处理w r k y 蛋白后，它与w b o x 的结合能力会大大降低直至完全丧失，而当加入 磷酸酶抑制剂后，这种结合作用又会有所恢复。y a m a s a k i 等利用n m r 检测拟南芥w r k y 4 转录 因子c 端w r k y 结构域的空间结构，发现该结构域由4 条p 一折叠片和一个由c y s h i s 残基所形 成的z n 2 + 结合口袋所组成，因此w r k y 转录因子结构域有直接与d n a 和z n 2 + 结合的空间结构 特征( y a m a s a k ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。它们间的相互作用可受翻译后调节，w r k y 蛋白对w - b o x 的结合 活性可由碱性磷酸酶和蛋白激酶抑制剂所消除，如烟草的w r k y 蛋白核抽提物和提纯的w r k y 蛋白表现出d n a 结合特性，使用蛋白质解离剂一脱氧胆酸处理则失去d n a 结合活性。由于w r k y 蛋白对w - b o x 具有结合特性，那么启动子包含w - b o x 的基因可能就是w r k y 蛋白的靶标基因。 w - b o x 存在于许多与植物防卫反应相关基因的启动子中，如烟草中的c h n 5 0 基因和拟南芥中的 6 中国农业科学院硕卜学位论文 第章绪论 n p r l 基冈，在某些w r k y 转录因子基因的自身启动子中也存在w - b o x ( e u l g e m e ta 1 。2 0 0 0 ；t u r c k e t a l ，2 0 0 4 ) ，从欧芹中分离剑的p c w r k y l 基冈，其启动子含有3 个具有t r g a c c t 核心序列 的类w - b o x ，这说明w r k y 蛋白具有自我调节的功能。因此，w r k y 转录因子可能通过与功能 基因或其他调控因子基因启动子中的w - b o x 结合，调节下游功能基因的表达或调控因子基因的表 达，从而调节植物的防卫反应、生长发育等各种生理活动。w - b o x 常成簇存在，或同向或早回文 结构排列( e u l g e m e ta 1 ，1 9 9 9 ；m a l e c ke ta 1 ，2 0 0 0 ；c h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ，并能协同作用( r u s h t o ne ta 1 。 1 9 9 8 ) ，如皱叶欧芹的p c w r k y l 启动子中有3 个w - b o x ，位置靠近，其中2 个( w b 和w c ) 呈同文排列。这种排列方式明显有利于w r k y 蛋白的结合，使基因表达水平提高，表达时间提 早。另外，这3 个w - b o x 的作用具有协同效应，而不是简单的叠加( y o d ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。形成多 聚体形式的w - b o x 序列足够产生对多种病原激发子和伤害的反应( r u s h t o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。为了更 确切地研究w - b o x 在基冈表达调控方面的作用，r u s h t o n 等用人工合成的启动子，其中只含w - b o x 而排除其它可能的转录冈子结合元件，研究对病原体及其诱发因子或创伤的反应，结果表明 w - b o x 足以介导防卫或胁迫反应，且反应程度与w - b o x 的数量及位置有关( r u s h t o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 2 其他结构域 w r k y 转录因子一般是在细胞质中合成，经跨膜运输转运到细胞核，在转录水平上对基因表 达进行调控，因此在w r k y 转录因子的w r k y 结构域区域外都存在细胞核定位信号。 另外，某些w r k y 转录因子还含有转录因子中常见的某些结构域，如介导与其它转录因子 形成二聚体的亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r , l z ) ，还有丝氨酸一苏氨酸富集区、谷氨酸富集区、脯氨 酸富集区和酸性氨基酸区等( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ；u l k e ra n ds o m s s i c h ，2 0 0 4 ) 。亮氨酸拉链结构会 使蛋白二聚化，促进w r k y 蛋白与其它蛋白之间的结合，这种功能特性已在p c w r k y 4 ，5 的实 验中得到证明，当删除p c w r k y 4 、5 蛋白中的亮氨酸拉链结构，这些在酵母中进行表达的w r k y 蛋白，与其相连的报告基因的表达量将会大大降低( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在w r k y 转录因子中， 除了上述比较保守的区域外，其余氨基酸的序列相似性并不高( e u l g e me ta 1 ，1 9 9 9 ) 。拟南芥 w r k y 蛋白r r s l r 除具有上述共性外，还含有病原体抗性基因( 尺基因) 所具有的结构域：白 细胞介素1 受体( t o l la n di n t e r l e u k i n 1 - r e c e p t o r , t i r ) 、核苷酸结合位点( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e 。 n b s ) 和亮氨酸富含重复区( 1 e u c i n e - r i c hr e p e a t ，l r r ) ( d e s l a n d e se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，这是第一个发现 的含有w r k y 区的尺基因。除了r r s l r 外，拟南芥的另外2 个t i r n b s l r r 蛋白中也含有 w r k y 区( j e b a n a t h i r a j a h e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 3w r k y 转录因子的分类 根据w r k y 结构域的数目和锌指结构的特征，将w r k y 转录因子分为3 个大组8 个亚组 ( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) ：第1 组( 包括ia 和ib2 个亚组) 通常含有2 个w r k y 结构域，锌指结 构为c 2 h 2 型，如p c w r k y l 、a t z a p l 、n t w r k y l 、n t w r k y 2 和c s s e 7 1 等。位于c 末端的 w r k y 结构域具有d n a 结合活性，n 末端的w r k y 结构域不能单独与d n a 结合( i s h i g u r oa n d n a k a m u m ，1 9 9 4 ) ，其功能目前尚不清楚( e u