（水产养殖专业论文）汞离子和高效氯氰菊酯暴露下草鱼磷酸酶活性变化及其免疫效应.pdf

捅要 草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 是我国重要的淡水养殖经济鱼类，研究环境化学品 对其生理和免疫的影响，对于理解环境污染对鱼类健康的影响和疾病发生原因有重要的 意义。本研究采用生物化学和免疫学方法，测定暴露于不同汞离子( o m g r l 、0 1 m g , l 、 o 3 m e c l 、o 5 m g l 和0 7 r a g l ) 或高效氯氰菊酯( 0 r t g l 、o 5 g l 、1 0 p e c l 、3 0 g l 和 5 o v g & ) 质量浓度下草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 血清、鳃、肝胰脏、脾和肾脏等 组织器官中碱性磷酸酶( 越( p ) 、酸性磷酸酶( a c p ) 、溶菌酶( l s z ) 的活性以及脾脏 和肾脏的脏器指数变化。结果显示：( 1 ) 与对照组相比，草鱼组织器官中a k p 、a c p 和l s z 活性在不同浓度汞离子暴露1 d 时活性升高；暴露2 1 d 时受到显著抑制。脾脏指 数在o 3 m g l 、o 5 m e , l 和o 。7 m g l 暴露l d 和5 d 时下降，1 2 d 时上升，2 1 d 时基本恢复 至正常水平；汞离子对肾脏指数无显著影响。( 2 ) 不同浓度高效氯氰菊酯暴露下，组 织器官a k p 活性在o 5j _ t g l 和1 o | l g l 暴露l d 时无显著变化，而血清有促进作用；高 浓度或暴露2 1 d 活性受抑制。而各浓度对鳃越 活性有显著抑制作用。a c p 活性在 0 5 腭几浓度下暴露1 d 时，鳃和脾脏中显著高于对照组，肝胰脏中低于对照组，而血清 和肾脏中无显著变化；暴露1 2 d 时肝胰脏中活性下降，血清变化不明显，5 0 i _ t g l 具有 显著的抑制作用。l s z 活性在0 5 和0 肛g r l 浓度下暴露1 d 时呈现促进作用，3 o p g ，l 和5 0 p g l 下呈现抑制作用；随暴露时问延长，在1 2 d 时，l s z 活性呈现出抑制作用。 脾脏的脏器指数未呈现显著影响；肾脏指数在3 o p g l 和5 o i _ t g l 浓度下暴露1 2 d 时增 加。结果表明汞离子和高效氯氰菊酯对草鱼的不同组织器官灿( p 、a c p 和l s z 活性有 较大的影响。由此产生的胁迫作用在一定程度下可通过生理调节的补偿代谢加以缓解； 如胁迫作用过大，超出机体生理代谢补偿调节能力，则显示毒害作用。脾脏和肾脏相比 较，汞离子对脾脏产生较大的影响；而高效氯氰菊酯的影响则呈现相反的作用。 草鱼直接暴露于高浓度汞离子( 0 7 r a g l ) 2 4 h 或高效氯氰菊酯( 7 0 p g l ) 5 h 进行 应激处理，解除胁迫作用后，草鱼各组织器官a k p 、a c p 、l s z 活性及脾和肾脏指数随 时间延长也呈现出不同的动态变化。( 1 ) 汞离子暴露后，血清和脾脏a k p 活性；除肝胰 脏外，其它组织器官的a c p 活性；血清、肝胰脏和脾的l s z 活性；以及脾和肾的脏器 指数在2 1 d 恢复至正常水平。( 2 ) 高效氯氰菊酯应激处理后，血清、肝胰脏的a k p 活性； 血清的l s z 活性在1 2 d 时恢复至正常水平；而各组织器官的a c p 活性及脾和肾的脏器 指数在1 2 d 仍与对照组之间有显著差异。本研究说明汞离子和高效氯氰菊酯对草鱼不同 组织器官的代谢酶活性有着不同的影响，但对鳃均呈现出较大毒性作用，这主要是由于 鳃是呼吸器官，担负氧气摄入和离子调节等重要的生理功能，并且与水体直接接触。 关键词：汞离子；高效氯氰菊酯；磷酸酶；溶菌酶；草鱼 a b s t r a c t g r a s sc a r p ，c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a , i sac o u n n e r c i a ls p e c i e s ，w h i c hi saf r e s h w a t e rf i s ho n l yl i v i n g i nc h i n a t h i ss t u d yw a sc a r r i e do u tt oe x p l o r ep h o s p h a t a s ea n dl y s o z y m ea c t i v i t yc h a n g e si nd i f f e r e n t o r g a n sa n dt i s s u e so fg r a s sc a r pe x p o s e da td i f f e r e n th 9 2 + c o n c e n t r a t i o n so r b e t a - c y p e r m c t h r i n c o n c e n t r a t i o n s , a n ds u p p l yr e f e r e n c ed a t af o rf i s h e r yp r o t e c ta n de n v i r o n m e n tm o n i t o r i nt h i ss t u d y , b i o c h e m i s t r ym e t h o d sa n di m m u n o l o g ym e t h o dw e r ea d o p t e dt od e t e r m i n et h ea c t i v i t y o fa l k a l i n i t yp h o s p h a t a s e ( a k p ) ，t h ea c i dp h o s p h a t a s e ( a c e ) a n dl y s o z y m e ( 1 ) e x p o s e dt od i f f e r e n t h 9 2 + c o n c e n t r a t i o n “0 1 m g l ，0 3 m g l ，o 5 m g la n do 1 m g n - ) ，姗，# l l ，l i v e r , s p l e e n ，a n dk i d n e yo f g r a s sc a r pw e r es a m p l e dt oa n a l y s eo nt h ef i r s td a y , 5 t hd a y , 1 2 t hd a ya n d2 1 t hd a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t u n d e rd i f f e r e n th 9 2 + c o n c e n t r a t i o n s ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，a c t i v i t yo f a k p , a c pa n dl s zi no r g a n s a n dt i s s u e se l e v a t e do nt h ef i r s td a y , b u td e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yo nt h e2 1 t hd a y t r e a t e dw i t ho 3 m g 几， o 5 m 班a n d0 7 m g lh 9 2 + , v i s c e r a li n d e xo f s p l e e nd e c r e a s e do l lt h ef i r s td a ya n d5 t hd a y , b u ti n c r e a s e d o nt h e1 2 t hd a y ；b a s i c a l l yr e s t o r e dt ot h en o r m a ll e v e l0 1 1t h e2 1 t hd a y ；v i s c e r a li n d e xo fk i d n e yd i d l l t r e m a r k a b l yc h a n g e ( 2 ) u n d e rd i f f e r e n tb c t a - c y p e r m e t h r i nc o n c e n t r a t i o n s ( o 5 眺1 , 0 g ，l ，3 0 g la n d 5 0 鹏，1 0 ，s e r u m , g i l l , f i v e r , s p l e e n , a n dk i d n e yo fg r a s sc a r pw e r es a m p l e dt oa n a l y s e0 l lt h ef i r s td a y , 5 t h d a ya n d1 2 t hd a y t r e a t e dw i t ho 5 耀几a n di o p e lb e t a - c y p e r m e t h r i n , a k pa c t i v i t yi no r g a n sa n dt i s s u e s d i d n tr e m a r k a b l yc h a n g eo i lt h ef i r s td a y a k pa c t i v i l yi ns e n mi n c r e a s e d , b u td c c r e s s e de x p o s e dt o 3 0 p g la n d5 o g n b e t a - c y p e r m c t h r i n a k pa c t i v i t yi nv a r i o u so r g a n sa n dt i s s u e sd e c r e a s e do i lt h e 2 1 t h d a y u n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s , a k pa c t i v i t yi ng i l lw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d t r e a t e dw i t h 0 5 峪，lb e t a - c y p e r m e t h r i n , a c pa c t i v i t yi ng i l la n ds p l e e ni sr a m a r k a b l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lo l l t h ef i r s td a y , b u tl o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o li nl i v e r a c pa c t i v i t yi ns e n 蛐a n dk i d n e yd i d n tr e m a r k a b l y c h a n g e a c t i v i t yo f a c pi nl i v e rd e c r e a s e do l lt h e1 2 t hd a y , b u tw a sn o to b v i o u sc h a n g ei ns 哪me x c e p t t h a tr e m a r k a b l yd e c r e a s i n gg x p o s e dt o5 0 峙，lb e t a - c y p e r m e t h r i n t r e a t e dw i t h0 5 i e d la n d1 0 t t g l b e t a - c y p e r m e t h r i n , a c t i v i t yo fl s zi n c r e a s e do l lt h ef i r s td a y , b md e c r e a s e de x p o s e dt o3 0 i i g la n d 5 o 腭几b c t a - c y p e r m e t h r i n l s za c t i v i t yd e c r e a s e do nt h e1 2 t hd a y v i s c e r a li n d e xo fs p l e e ns h o w e df l o r e m a r k a b l yc h a n g e ，b mt h a to fk i d n e yi n c r e a s e do nt h e1 2 t hd a y , e x p o s e dt o3 0 p g la n d5 0 i _ , g l b e t a - c y t m r m c t h r i n i nc o n c l u s i o n , a c t i v i t yo fa k 只a c pa n dl s zi nd i f f e r e n to r g a n sa n dt i s s u e so fg r a s sc a r pw e f e i i l i 1 1 f l u 朋c e ds i g n i f i c a n t l yb yh 9 2 + a n db e t a - c y p e r m e t h r i n c h a n g e so ft h e i ra c t i v i t yw e r ec o n t r i b u t e dt o m a m m i n m gt h ep h y s i o l o g i c a l f u n c t i o ni n c o p i n g w i t ht h e c h a n g e so fe n v i r o n m e n t a lh 9 2 + a n d b e t a - c y p e r m e t h r i nc o n c e n t r a t i o n a l lt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th 9 2 + a n db e t a - c y p e r m e t h r i np o s s e s s e d o b v i o u s l yt o x i c i t yt og r a s sc a r p a f t e rd i r e c t l ye x p o s e dg r a s sc a r p st oh i g m yd o s a g eh 9 2 + a tt h e2 4 1 1o rb e t a - c y p e r m c t h d na tt h e5 h , g r a s sc a r p sw e r er e l i e v e df o r c e sf r o mt h e m ，a c t i v i t yo f a k p , a c ta n dl s zi nd i f f e r e n to r g a n sa n dt i s s u e s o fg r a s sc a r pa n dv i s c e r a li n d e xo fs p l e e na n dk i d n e yp r e s e n t e dt h ed i f f e r e n td y n a m i cc h a n g e s ( 1 ) a t i e r g r a s sc a r p sw e r e l i e v e df o r c e sf r o mh ：9 2 + a k pa c t i v i t yi ns e r u ma n ds p l e e n , a c pa c t i v i t yi no t h e r o i g a l ba n dt i s s u e se x c e p tl i v e r , a c t i v i t yo fl s zi ns e r u m , l i v e ra n ds p l e e n , a sw e l la ss p l e e na n dk i d n e y v i s c e r a li n d e xw e r er e s t o r e dt ot h en o r m a ll e v e lo nt h e2 1 t hd a y ( 2 ) a f t e rg r a s sc a r p sw e r er e l i e v e df o r c e s f r o mb e t a - c y p e r m e t h r i n , a c t i v i t yo fa k pi ns 髓1 胍a n dl i v e r , l s za c t i v i t yi ns e 九j m 、e r e s t o r e dt ot h e n o r m a ll e v e lo i lt h e1 2 t hd a y ；c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p , a c ti nv a r i o u so r g a n sa n dt i s s u e sa n dv i s c e r a l i n d e xo fs p l e e na n dk i d n e yr e m a r k a b l yc h a n g e do nt h e1 2 t hd a y t h i sr e s e a r c hi n d i c a t e dt h em e t a b o l i s m e n z y m ea c t i v i t yi nd i f f e r e n to r g a n sa n dt i s s u e so f g r a s sc a r pw a si n f l u e n c e db yh 9 2 + a n db e t a - c y p e r m e t h r i n , a n dp r e s e n t e ds n o n gt o x i ce f f e c tt og i l l m a i n l yr e a s o ni st h a tg i l ld i r e c t l ye x p o s e di nw a t e ri sb r e a t i l i t l g a p p a r a t u s ，s h o u l d e r si m p o r t a n tp h y s i o l o g yf u n c t i o n , f o re x a m p l e ，i tc a nt a k ei no x y g e na n di o nf o r mw a t e r k e yw o r d ：h 9 2 + ，b e t a - c y p e r m e t h r i n , p h u s p h a t a s e , l y s o z y m e , g r a s sc a r p 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 签名：立灶日期：二苎斗l 尘一 论文使用授权说明 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：趋灶导师签名：捌。驽金日期：鲁埠：左：尘 引言 1 引言 伴随着工业的迅猛发展和菊酯类农药的广泛使用，使重金属元素和菊酯类杀虫剂等 污染物随工业废水及地表径流进入水生生态环境。这些污染物正在对水生生物和人类的 健康造成危害，因此探讨其生物效应和毒理机制是非常必要的。重金属和菊酯类农药在 水环境中含量很低，对生物的毒性为长效低毒。重金属元素和菊酯类杀虫剂对水生动物 致毒机制的研究尚处于探索阶段，而且目前人们的研究多集中于水生动物体内的富集和 对生物的毒理效应上，对水生生物生理生化指标的影响也有较多的报道，其中包括对在 水生生物体内广泛存在，且有着重要生理作用的碱性磷酸酶( 舢 ) 、酸性磷酸酶( a c p ) 和溶菌酶( l s z ) 的研究。但是，汞离子和高效氯氰菊酯对鱼类a k p 、a c p 和l s z 活 性的影响研究较少，国内这方面的研究报道更是罕见。 生态毒理学和生态化学的快速发展，越来越广泛地把生物体内各种酶的酶学指标， 作为生物学标志来评估受试化学药品对生物的生态毒理效应；环境污染物对鱼类的毒性 作用机制之一，就是造成生物体内酶的磷酸化、脱磷酸化以及机体的免疫能力下降，从 而影响到鱼体的健康。而a k p 、a c p 和l s z 在鱼体代谢和免疫能力方面有着重要的作 用，其活性的改变可以作为机体受到胁迫的指示。草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 是我 国重要的淡水养殖经济鱼类，对水环境变化较其它养殖种类更为敏感。因此，研究在汞 离子和高效氯氰菊酯作用下，草鱼不同组织器官中a k p 、a c p 和l s z 活性的变化，对 指导渔业生产有着理论和实践的意义。 1 1 环境中化学品对鱼类健康的影响 能够造成水环境污染，并对水生生物生长发育造成影响韵的化学物质很多，下面就 学者普遍关注的重金属和菊酯类农药的研究情况做一综述。 1 1 1 重金属对鱼类的毒性作用 1 1 1 1 鱼体对重金属的吸收及重金属在鱼体内的积累 鱼类在水体生态环境中的地位，决定了在水体重金属的分布和迁移过程中起着重要 作用。对于水环境中各种形态的重金属，鱼类可通过鳃、体表和滤食等途径摄入体内， 但鳃是主要的吸收器官，这可能与鱼鳃的特性有关。除了游离态外，鱼鳃对细胞颗粒态 引言 铜、铅和镉也具有吸收作用。鱼鳃表面覆盖一层由葡糖酸胺聚糖组成的成分复杂的富氧、 氮和硫等电子供体的粘液为金属离子提供结合位点，使得金属离子附着在鱼鳃表面或者 进入鱼鳃内部。研究表明，暴露在铅中的金鱼，其鳃粘液分泌量增加，在一定程度上减 少了对铅的吸收，但鳃分泌物浓度太低，不足以改变水相中重金属的浓度【。 重金属在多种鱼体内均有积累现象，国内外许多学者研究了重金属在鱼体内的积累 及其在组织内的分布规律【2 川。研究发现，鱼体内重金属的积累丰度与鱼的种类和食性 相关，并且在同种鱼的不同器官组织中的分布也是不均衡的【5 l 。重金属在鱼体组织中 的吸收和积累量，取决于暴露时间和暴露浓度，同时还与水温、鱼龄、重金属的种类和 状态有关，并受重金属离子的相互作用以及水化学性质和鱼的生理代谢活性等因子的影 响1 9 】。对主要经济鱼类体内c u 、p b 、z n 、c d 、c r 、n i 的含量的研究结果表明，鱼体 各组织、器官重金属含量呈不均匀分布，重金属在内脏中的含量较高，而肌肉中的含量 较低【l o 】。在鲤鱼、鲢鱼肉中的积累情况的研究结果表明，各种重金属元素在鱼肉中的积 累倍数变化很大，从l o 倍至1 3 6 倍【6 ，u 】。 重金属被吸收到鱼体内，经过代谢作用，一部分可转化成无毒物质排出体外，另一 部分随血液到达各组织器官，妨碍组织细胞代谢过程而出现组织学的超微损伤【1 2 1 ，对鱼 组织器官的结构、生理方面产生毒害影响d 3 。鳃作为主要的重金属的吸收器官，会出现 鳃小片增生，末端膨大，邻近鳃小片粘连，鳃丝空泡形成等损伤1 1 4 1 。肝脏和肾脏也是重 金属的主要富集器官f 1 5 j 阍。重金属对肝组织的损伤主要表现为肝组织脂肪化，肝细胞空 泡化，肝血管充血【1 - q 等；肾则会出现细胞及核回缩现象，并出现广泛坏死等1 8 1 。鱼鳃是 鱼呼吸和吸收水体中重金属离子的重要器官 1 9 1 ，肝脏是鱼代谢和积累重金属的重要器官 口o l ，肾脏则是排泄重金属离子的重要器官，重金属对这些器官细胞结构的破坏，无疑将 影响到鱼正常的呼吸、代谢、排泄和繁殖功能，从而导致鱼类的死亡【1 4 1 。 1 1 1 2 重金属对鱼类主要生态毒理指标酶类的影响 重金属污染物进入机体后，会导致机体一系列的生物化学变化，这些变化可分为两 种：一种是用来保护生物体抵抗污染物的伤害，称之为防护性生化反应；另一种不起保 护作用，称之为非防护性生化反应。防护性生化反应的机理是通过降低细胞中游离污染 物的浓度，从而防止或限制对细胞组成成分可能的有害反应，消除或减轻对机体的影响。 非防护性生化反应有多种多样，其作用机理也多样化，非防护性生化效应的结果之一是 产生对生物体有害的影响【2 1 1 。 2 引言 1 1 1 2 1 对机体内防护性生物反应的影响 ( 1 ) 对金属硫蛋白的诱导作用 金属硫蛋白( m e t a u o t h i o n e i n , 简称m t ) 是一种富含半胱氨酸的金属结合蛋白，多 存在于鱼类的肝、肾、鳃和肠细胞的胞浆内。m t 对二价金属有极强的亲合力，故在细 胞内起着贮存必需微量金属如z n 2 + 、c u 2 + ，结合有毒金属如c d 2 + 、h 9 2 + 的作用。 m t 可在转录水平上被环境中的重金属诱导，并且这种诱导与环境中的重金属浓度有相 关性，可以反映环境中的重金属水平，因而是一种重要的生态毒理指标。对鱼鳃、肝、 肾和消化道中的研究，较多集中在从细胞不同的调节水平上反映m t 被诱导的情况。如 重金属暴露或污染水中鱼体内监测到有m tm r n a l 2 2 2 3 1 和m t 蛋白含量的增加 2 4 ，明， 并且m t 对重金属的结合模式具器官特异性 2 6 矗7 】。目前对金属诱导水生生物m t 的机理 尚不清楚，但可以肯定m t 在参与必需元素的调节和非必需金属的解毒中的作用。 ( 2 ) 对鱼组织抗氧化防御系统的诱导作用 重金属离子污染对水生生物的毒性作用机制之一是其造成生物体内的过氧化胁迫， 即过量的重金属能导致体内产生大量的活性氧自由基，这些活性氧可引起d n a 断裂、 脂质过氧化和酶蛋白失活等，从而引起机体氧化应激，造成生物大分子和膜脂质氧化， 进而对机体诱发多种损害。机体利用自身的抗氧化系统来清除活性氧自由基，其中的酶 类主要包括谷胱甘肽过氧化酶( g p x ) ，超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化氢酶( c a t ) 等。目前的研究发现，暴露于可产生氧化还原循环的物质后，机体抗氧化防御系统中的 一些成分会改变，如s o d 、c a t 、g p x 等被诱导。实验条件下，c d 2 + 、z n 2 + 等使肝、 肾及鳃中的s o d 降低脚2 9 ，而使c a t 活性升高。水中一定浓度的c d 2 + ，能引起鲫鱼 肝胰脏、肾脏、鳃组织c a t 活性的显著增强。但体外条件下，c d 2 + 不能显著提高该酶 活性，可知，c d 2 + 中毒使鲫鱼组织c a t 活性的升高，不是由c d 2 + 本身引起的，而是由 c d 2 + 中毒的异常生理变化间接引起的o l 。有研究报道 2 8 】，c u 2 + 对真鲷幼鱼鳃c a t 的抑制作用大于肝脏c a t 的抑制，而z n 2 + 对鳃c a t 的抑制小于对肝脏c a t 的抑制， 这可能是不同离子在不同器官吸收的差异造成的。暴露于c d 2 + 中金鱼肝脏的s o d 和 c a t 的活力明显下降】；c d 2 + 还可抑制红细胞s o d 的活性，使体内活性氧自由基增加， 从而导致氧化应激现象嗍。 1 1 1 2 2 对非防护性生化反应酶类的毒性作用 重金属进入机体后，一方面在酶的催化下，进行代谢转化，另一方面也导致体内酶 引言 活性的改变，进而产生毒性作用。有毒金属与酶之间可能存在着两种作用形式：一是置 换酶活性中心的必需金属；二是结合到酶分子的咪唑基、巯基、羟基等功能基团而导致 酶失活田l 。因此，以酶指标考察重金属对生物代谢的影响得到许多学者的重视。 n a + - k + a t p a s e 是多种毒物作用的靶点，金属与有机物均被认为是n a + - k + a t p a s e 的强抑制剂。一般认为，重金属会抑制鱼n a + k + a t p a s e 活性 3 4 1 。如周新文等【3 5 】研究 表明，鱼鳃、脑和肝脏的n a + - k + a t p a s e 活性与铜、锌、镉、铅混合重金属的浓度呈显 著的负线性相关关系；3 种组织的n a + k + a t p a s e 活性的敏感顺序为脑 鳃 肝脏， 其原因与鱼脑的代偿能力低有关。同时，鱼鳃与重金属离子直接接触，对重金属离子的 吸收快。而肝脏一方面吸收重金属离子且速度较慢，另一方面又是解毒器官，自然对 n a + - k 十，a t p a s e 的影响相对要小一些。柏世军等【3 司研究发现，高浓度镉短期暴露抑制 黄颡鱼鳃n a + - k + a t p a s e 活性，影响鳃的能量供应和利用，最终降低鳃血浆渗透压和离 子浓度调节能力。方展强等 3 7 1 研究了h 9 2 + 对剑尾鱼( x i p h o p h o r u s h e l l e r ih e c k e l ) 鳃和肝脏 n a + - k + a t p a s e 活性的影响，证实h 鲒+ 处理对鳃和肝脏n a + k + a t p a s e 活性具有抑制 作用。a t p a s e 能被重金属离子抑制，是因为重金属离子可以与膜上蛋白质的结合位点 结合，引起蛋白质空间构象发生变化，从而阻止了底物与蛋白质的结合，抑制酶的正常 活性口& 3 9 1 。 碱性磷酸酶( a k p ) 是动物代谢过程中重要的调控酶。是一种非特异性的磷酸单酯 酶，在生物体内核酸、蛋白质和脂类等物质代谢中起重要作用，主要参与生物体对物质 的消化、吸收、转运，调节动物体内钙、磷吸收，维持钙、磷平衡方面起着重要作用， 是鱼类赖以生长、生存的重要酶类之一。凡物质交换，吸收转运旺盛的器官中，a k p 都显示高活性。a k p 是结合在膜上的金属酶1 4 0 1 ，其结构和活性的充分发挥均需金属离 子的维持。一旦水环境受到重金属离子的污染，引起a k p 构象发生变化，使a k p 的活 性受到影响【4 1 弗】。欧阳培等 4 4 1 的研究发现，h g2 + 、a 啦+ 、c u 2 + 、c d 2 + 等重金属对文 昌鱼a k p 有明显的抑制作用。重金属对a k p 活性的作用依重金属的种类，暴露时间， 组织器官的不同而有差异。在0 2 5 r t g l 和o 3 0 l x g l h g2 + 溶液中暴露3 6 周，对金鱼 ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 肝脏a k p 活性有促进作用 , 1 5 1 ，较高浓度c d 2 + 对鲻鱼( m u g i l c e p h a l u s ) 肝脏a k p 活性有显著抑制作用，而对鳃、肝和心脏中a k p 的抑制作用不明 显1 4 6 1 。在5 l _ , g l h g c l 2 中，7 、1 5 、3 0 d 处理后，a k p 活性表现出随时间的延长抑制作 用加强，酶活性的变化明显表现出时间效应关系1 4 7 1 。 4 引言 酸性磷酸酶( a c p ) 广泛存在于各种动物体内，是巨噬细胞溶酶体的标志酶，在体 内直接参与磷酯基团的转移和代谢，是生物磷代谢的重要酶类；陈素丽等【4 8 】的研究发现， c d 2 + 对a l p 活性稍有抑制，而z n 2 + 、a 9 2 + 、c u 2 + 、h 醇+ 对酶性有明显的抑制作用， 随着c u p + 、h 9 2 + 浓度增大而抑制作用加强，其抑制表现为竞争性类型。重金属对a c p 的影响依重金属的种类，暴露时间，组织器官的不同而有差异。g i l l 等【4 9 】使玫瑰刺鱼 ( p u n 舶c o n c h o n i u s ) 暴露于o 5 7m g l c u s 0 4 中4 8 h ，血清和鲤a c p 被激活，而肝脏 a c p 活性下降。s a s t r y 等【5 0 】的研究表明，将淡水硬骨鱼c 忸m mp u n c t a t u a 在0 3 m g l h g c l 2 溶液中暴露7 、1 5 、3 0 d ，消化道a c p 活性7 d 受到抑制，1 5 d 显著上升，3 0 d 略有下降，但整体活性高于对照。 溶菌酶( l s z ) 是生物体极为重要的非特异性免疫因子之一【5 1 5 2 1 ，在机体免疫过程 中不仅能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解死亡，还可诱导调节其他免疫因子的合成 与分泌【5 3 棚。水产动物血清中l s z 活性的高低既是衡量机体免疫状态的指标之一，又是 衡量养殖环境污染程度的重要指标【5 6 1 。f e v o l d e n 等5 刀认为l s z 活性可作为鱼类应激的 信号，其活性变化依胁迫的方法和强度而定。各种鱼组织或组织液中的l s z 含量存在着 种属差异，虹鳟( 8 a l m o g a i r d n e r i ) 和大西洋鲑( s a l m o s a l a r ) 的1 5 倍f 5 射，所以当用l s z 作为评估应激程度时，应当是针对同种鱼的。陈家长等 s g l 的研究发现，低浓度6 价铬对 鲤鱼血清l s z 活性无显著影响，而高浓度则显著下降。z c l i k o i 壑6 0 曾对暴露于同一镉浓 度( 2j j t g l ) 但时间不同( 8 、1 7 、3 0 d ) 的鳟鱼进行了研究，发现在各时间的鳟鱼血清 l s z 含量并无显著差异，而董书芸等【6 l 】的实验发现鲫鱼血清l s z 含量随镉浓度的升高 有增加的趋势，这可能是由于鱼的种属差异所至，也可能是实验条件的不同而引起。 1 1 2 氯氰菊酯对鱼类的毒性作用 i i 2 1 氯氰菊酯及其在水环境中的衰解 氯氰菊酯农药，是新一代广谱杀虫剂。由英国m e l l i o t 于1 9 7 4 年发现，后由美国、 英国和日本等多家公司生产，于1 9 7 7 年进入市场，2 0 世纪8 0 年代进入我国。其生产量 和用量在拟除虫菊酯类农药中占首位，是一种高效、广谱杀虫剂，具有触杀和胃毒作用， 在植物体内无内吸和传导作用。其作用范围广，对于棉花、果树和蔬菜等多种作物上的 各类害虫均有良好的防治效果，且持效期长，作用迅速，对害虫击倒速度快。 氯氰菊酯在水中溶解度非常低，2 0 时其溶解度为4 肛g r l ，吸咐于颗粒或沉淀于底 引言 泥是氯氰菊酯在水中存在的主要形式【6 2 】。在通常的水温和p h 值条件下，氯氰菊酯半水 解分解时间大于5 0 d ，溶解于纯净水中的氯氰菊酯，曝露在阳光下3 2 d 仅有l o 被光解， 半光解时间大于1 0 0 d | 6 3 1 。在实验室和池塘条件下，氯氰菊酯吸附于沉淀物，悬浮颗粒 或水生植物上能加快其光解速度。同时，微生物的降解也起一定的作用。据研究，氯氰 菊酯在浑浊的河水中或吸附于悬浮和沉淀颗粒，其分解的速度慢于水中或水面吸附的状 态，这意味着氯氰菊酯能储存于底泥中，较长时间的影响水体，但其对水生生物的毒性 作用会大大地降低 c 4 6 5 1 。 1 1 2 2 氯氰菊酯的毒性及作用机理 菊酯类杀虫剂虽然对害虫杀伤能力强，对哺乳类动物，鸟类及其它高等脊椎动物等 非靶生物的毒性不大，但对鱼类等水生动物的毒性却很高 6 6 6 7 1 。翟良安等嗍报道氯氰 菊酯对鲤、鲢幼鱼9 6 h 的半致死浓度分别为o 0 9 肛g l 和2 1 0 耀几；王嫒等 6 9 1 的研究发现， 氯氰菊酯对鲤鱼幼鱼的9 6 h 的半致死浓度分别为1 2 6 肛g l ，大于0 5 8 p g l 可导致鳃组织 发生病变；大于1 1 4 i j t g l 即对生长产生明显抑制。王朝晖【7 0 l 的研究也证明了氯氰菊酯对 鱼类的高毒性。如果使之进入水环境，将对水生生态及水产养殖造成很大危害。 氯氰菊酯的毒性机制目前仍不十分明确。c l a r k l 7 1 】曾经指出，之所以菊酯类杀虫剂 对鱼等水生动物毒性极大，而对哺乳类等非靶动物毒性不大，正是因为鱼类的鳃组织极 易从外界吸收此类物质。鳃小叶上皮细胞增生肥大，是生物体保护未受损伤的组织，对 外界刺激的一种反应，但是这样不仅减少了氧吸收的有效表面积，也增加了氧从水体到 血液之问的扩散距离，这必然影响鳃的呼吸、分泌、排泄功能，对鱼体内部的离子代谢、 渗透调节也有一定程度的影响 7 2 - 7 4 。王朝晖综合他人研究成果认为，鳃组织病理学损伤 破坏了鳃组织中n a + - k + a t p a s e ，使n a + - k + a t p a s e 活性下降，从而破坏了鱼体的离子 代谢和渗透平衡1 7 5 】。氯氰菊酯作为脂溶性物质，能在虹鳟体内富集超过其周围环境1 2 0 0 倍，进入鱼体内的拟除虫菊酯作用于神经膜钠通道，干扰神经传导功锹弼。氯氰菊酯还 能抑制膜上的a t p 酶，使膜逆浓度梯度转运离子产生障碍，这是对于昆虫、鱼及一些水 生动物来说氯氰菊酯对其毒性作用的主要因素之一。a t p a s e 提供物质主动运输所需的 能量，在氧气的气体交换过程也起到重要的作用。当a t p a s e 受到抑制，会使膜主动转 运受到破坏，进而影响膜的离子转运，离子平衡，破坏呼吸面。研究显示氯氰菊酯通过 以上的作用机制对水生生物产生了极强的毒性1 7 7 l 。 1 1 2 3 氯氰菊酯对鱼类生态毒性酶类的影响 6 引言 氯氰菊酯对鱼类具有极强的毒性。随着广泛的使用，科学全面地评价其对鱼类的毒 性具有重要的意义。一般在评价污染物对生物的毒性效应时，常用半致死浓度作为评价 指标【7 s 7 9 l ，但存在于环境中的污染物经常是以低浓度作用于生物体，因此需要寻求更灵 敏的评价指标。酶作为一种对周围环境变化相当敏感的生物活性物质之一，其活力和构 象等对各种污染物质作用的反应研究常见诸报道【舯乱l 。 王媛等 8 2 1 的研究发现，氯氰菊酯能使暴露于其溶液中的鲤鱼的谷丙转氨酶( g p t ) 和谷草转氨酶( g o t ) 的活力升高，表明此农药对鲫鱼机体产生了损伤。认为o p t 和 g o t 可以作为杀虫剂对环境安全性的一种评价标准。 动物血液的生化参数是动物体健康状况的主要指标，也是疾病诊断和测定的依据之 一。鱼类血液生化指标虽然受诸多因素的影响，但仍然反映该鱼类的健康状况和生理状 况。许阳光等i s 3 】的研究发现，在醚菊酯的作用下，鲤鱼血清k + 浓度升高，n a + 浓度降 低，浓度越高影响越显著，认为鲤鱼的肾功能受到影响，保钠排钾功能减弱，导致鱼体 内电解质平衡失调，从而表现出低血钠和高血钾的血液学变化。 超氧化物歧化酶( s o d ) 是生物体内一种重要的抗氧化防御酶。许多研究表明，当 鱼体受到轻度逆境胁迫时，s o d 活性被诱导，而受严重逆境胁迫时，其活性则被抑制； 在正常情况下鱼体内s o d 活性和超氧阴离子自由基含量达到一定的动态平衡，草鱼鱼 种处于氯氰菊酯环境胁迫初期，鱼体内产生过量的氧自由基，诱导s o d 活性提高使二 者达到一种新的平衡；但随着氯氰菊酯作用时间的延长，鱼体会产生大量的氧自由基， 以致s o d 酶活性被抑制，导致鳃、肝等组织的损伤1 v , 4 6 。 溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫物质之一，主要存在于鱼类的粘液、血清和巨噬细 胞内，它能杀死病原菌，使鱼类获得保护册。其活性的变化可用来估测鱼的非特异性免 能力 8 8 1 。靳晓敏等跏的研究发现，低浓度氯氰菊酯短时间处理鲤鱼，其溶菌酶活性显著 上升，但低浓度长时间及高浓度作用则活性显著下降。表明氯氰菊酯能够抑制鲤鱼的非 特异性免疫能力，对鲤鱼具有毒性作用。 1 2 研究目的和意义 很多的研究发现，进入水生生态环境的重金属元素和菊酯类杀虫剂等污染物会对水 生生物和人类的健康造成危害。重金属和菊酯类农药在水环境中含量很低，对生物的毒 性为长效低毒。重金属元素和菊酯类杀虫剂对水生动物毒性机制的研究尚处于探索阶 7 引言 段，目前人们的研究多集中于污染物在水生动物体内的富集和对生物的毒理效应上，对 水生生物生理生化指标的影响也有较多的报道，其中包括对在水生生物体内广泛存在， 有着重要生理作用的a k p 、a c p 和l s z 的研究。但是，汞离子和高效氯氰菊酯对鱼类 a k p 、a c p 和l s z 活性的影响研究较少，国内这方面的研究报道更是罕见。 研究重金属和菊酯类农药污染对草鱼代谢酶及其健康的影响，对水产养殖业有着重 要的实践意义。本研究以草鱼为研究对象，试图从a k p 、a c p 和l s z 活性的变化中， 发现汞离子和高效氯氰菊酯污染对草鱼生理和免疫力影响的规律，找到这些物质对水体 污染程度的指示物，旨在评价汞离子和高效氯氰菊酯对草鱼生理代谢和健康的环境效 应，为养殖水域水质污染监测和渔业生产管理提供指导。 8 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验用草鱼 实验所用草鱼来源于新乡市渔种场，为同批繁殖、同池培育、体色正常的健康草鱼 种。鱼种规格：体重为1 0 0 士1 5g ；体长为1 5 士2 咖。 2 2