（发育生物学专业论文）利用remi法建立尖孢镰刀菌甜瓜专化型的遗传转化系统.pdf

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生质体的数量和质量直接影响到转化的效果。通过实验发现，把溶壁酶配置成2 的浓度，酶解尖孢镰刀菌菌丝的细胞壁时以3 2 。c 的温度，摇床轻轻晃动3 h 左右可 获得大量的高质量原生质体。 3 、分别提取原始尖孢镰刀菌和转化子的基因组d n a ，经过1 8 sr d n a 基因序 列测定，证明了转化前后的菌株为尖孢镰刀菌。设计特定的引物扩增潮霉素基因 片段，原始的尖孢镰刀菌无潮霉素基因片段，而三个转化予均扩出了潮霉素基因 片段。 4 、转化子表型分析发现，同样的培养条件下三个转化子及原始尖孢镰刀菌 的产孢量分别为1 1 9 1 0 4 个m l 、0 4 8 1 0 4 个m l 、0 5 9 1 0 4 个r n l 、2 6 3 1 0 4 个m l ，三个转化子的产孢量比原始尖孢镰刀菌少，但生长速度确比原始尖孢镰 刀菌快。 5 、三个转化子及原始尖孢镰刀菌分别回接甜瓜盆栽苗，1 0 d 后回接的甜瓜盆 栽苗均发病，其中转化子l 1 2 8 t 1 回接的盆栽苗每株中只有少数叶片开始变黄， 摘要 发病速度慢，而清水处理的笳栽苗无发病现象。 关键词：尖孢镰刀菌；枯萎病；甜瓜；r e m i 2 a b s t r a c t a b s t r a c t f u s a r i u m ox y s p o r u mi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tp l a n tp a t h o g e n i cf u n g is p r e a d a l lo v e rt h ew o r l da n di t sh o s t sa r ee x t e n s i v e i tc a nc a u s eo v e r10 0k i n d so fp l a n t s v a s c u l a rb u n d l et ow i t h e r i ti si m p o r t a n tf o ru st of i n dt h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mb y c o n s t r u c t i n gt h ee x p r e s sp l a s m i dv e c t o r , p r o c e s s i n gt h et r a n s f o r m a t i o no ff u s a r i u m o x y s p o r u m ，c a r r y i n gt h eb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rs u r v e yo ft h et r a n s f o r m a n t s r e s t r i c t i o ne n z y m e m e d i a t e di n t e g r a t i o n ( r e m i ) ，w h i c hh a sh i g ht r a n s f o r mf r e q u e n c y a n dm o r ec o n f o r m i t i e ds i n g l ec o p y ，i sa p p l i e di n s i g n i n ga n dc l o n i n gg e n e sa b o u t n o s o g e n e s i so fm y c e l i a lf u n g im o r ea n dm o r e t h i ss t u d ym a n a g e st oe x p l o r ea n do p t i m i z et h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，a n a l y z e t h ep h e n o t y p e so fs e v e r a lt r a n s f o r m a n t sa sw e l la se s t a b l i s has e to fi n t e g r a t e da n d e f f e c t i v ef u s a r i u m o x y s p o r u mt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m m a i nr e s u l t sa r ef o l l o w e d ： 1 m a s t e rt h ec u l t u r ec o n d i t i o no fm y c e l i u mo ff u s a r i u m ox y s p o r u m ，w a y so f c o l l e c t i n gc o n i d i o p h o r e sa n dt h er e c u l t u r eo fs p o r e sb e f o r et h et r a n s f o r m a t i o n i n o r d e rt og e tt h et e n d e rm y c e l i u m ，t h eo p t i m u m sa r e ，c o n c e n t r a t i o no fc o n i d i o p h o r e s 10 p e r5 0 m lp dc u l t u r em e d i u m ，c u l t u r et e m p e r a t u r e2 8 c ，r o t a t es p e e do ft h es h a k e r 8 0 r m i n ，c u l t u r et i m elo 12 h 2 t h ep r e p a r a t i o no ff u s a r i u m o p r o t o p l a s t i st h ek e ys t e p d u r i n gt h e t r a n s f o r m a t i o n t h eq u a n t i t ya n dq u a l i t yo ft h ep r o t o p l a s td i g e s t e db ye n z y m ew i l l d i r e c t l yi n f l u e n c et h ee f f e c to ft r a n s f o r m a t i o n t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tw ef i n dt h a t l a r g e rn u m b e r so fh i 9 1 l q u a l i t yp r o t o p l a s t sc a nb ea c q u i r e db yc o n t r o l l i n gt h e l y w a l l z y m ec o n c e n t r a t i o ni n2 d i g e s tt e m p e r a t u r ei n3 2 ct h e ns h a k i n gs o f t l yf o r3 h o u r s 3 e x t r a c tt h e g e n o m e o ft h eo r i g i n a lf u s a r i u m ox y s p o r u ma n dt h e t r a n s f o r m a n t s ，b ys e q u e n c i n gt h e18 sr d n a ，i ti sp r o v e dt h a tt h et r a n s f o r m a n t ss t i l l b e l o n g t of u s a r i u m ox y s p o r u m c e r t a i np r i m e r sw e r e d e s i g n e dt oa m p l i f y h y g r o m y c i ng e n e t h eh y g r o m y c i n - r e s i s t a n c eo fp r i m a lf u s a r i u m ox y s p o r u mi s n e g a t i v ew h i l et h et r a n s f o r m a n t si sp o s i t i v e 4 t h ea n a l y s i so ft h ep h e n o t y p e so ft h et r a n s f o r m a n t ss u g g e s t st h a tu n d e rt h e 3 a b s t r a c t s a m ec o n d i t i o nt h es p o r e sn u m b e ro ft h r e et r a n s f o r m a n t sa n dt h ep r i m a lf u s a r i u m o x y s p o r u m a r e1 1 9x1 0 4 m l 、0 4 8 1 0 4 m l 、0 5 9 1 0 4 m l 、2 6 3 1 0 4 m l a l t h o u g ht h es p o r e sn u m b e ro ft h r e et r a n s f o r m a n t si sl e s st h a nt h ep r i m a lf u s a r i u m o x y s p o r u m ，t h eg r o w t hs p e e di sm u c hf a s t e r 5 t h r e et r a n s f o r m a n t sa n dt h ep r i m a lf u s a r i u m ox y s p o r u mw e r ei n o c u l a t e dt o t h es w e e tm e l o n ，a f t e r10d a y s ，a l ls w e e tm e l o nt o o ko nm o r b i d i t y t h es p e e do fs w e e t m e l o ni n o c u l a t e db yl 1 2 8 一t 1w a ss l o w e rt h a nt h a to fo t h e r s a n dt h es p o t t e d s e e d l i n gd e a l e d w i t hw a t e rh a dr l os y m p t o m k e y w o r d s ：f u s a r i u m ox y s p o r u m ；w i l td i s e a s e ：s w e e tm e l o n ；r e m i 4 前言 l 前言 1 1 农作物枯萎病的发生与危害 1 1 1 枯萎病原 枯萎病是一类植物病害的总称，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫。枯萎 病有细菌性病原( 如香蕉细菌性枯萎病等) 和真菌性病原两种。本文所指的枯萎病 为真菌性病原，是由镰刀菌属真菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，其中 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h l ) 是主要病菌种类之一。尖孢镰刀菌属半知 菌类( f u n g i i m p e r f e c t i ) 、梗孢目( m o n i l i a l e s ) 、痤孢科( t u b e r c u l a r ) 、镰刀菌属 ( 鼢a n u m ) 。自从s n y d e r 和h a n s e n ( 1 9 4 0 ) 把镰刀菌属美丽组内的种合并为1 个，成 为尖孢镰刀菌( f o x y s p o r u m ) n 1 。 1 1 2 寄主范围 ( 1 ) 经济作物：棉花、油桐、蓖麻、亚麻等。( 2 ) 茄科作物：番茄、胡椒、 茄子、烟草、马铃薯等。( 3 ) 瓜类作物：黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫 芦、甜瓜、丝瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜等。( 4 ) 豆科作物：大豆、 四季豆、豇豆、猪屎豆、豌豆等。( 5 ) 花卉植物：康乃馨、郁金香、鱼尾菊、非 洲菊、鸢尾、水仙、翠菊、合欢、百合、仙人掌、穿心莲、一品红、草坪草等。 ( 6 ) 林果植物：松树、相思树、柑桔、沙棘、水杉、铁线莲属植物、梨树等。( 7 ) 其它植物：莴苣、小麦、大蒜、荸荠、芦笋、姜、香蕉等。 1 1 3 危害症状 植株被尖孢镰刀菌侵染后，发病症状多种多样，一般导致维管束枯萎、植株 枯黄、球茎和根腐烂，植株生长衰弱。植株发病后，最初的症状表现嫩叶上出现 轻微的褪绿，而后老叶开始下垂。苗期植株发病后迅速死亡；成株期产生叶脉失 绿和叶片下垂，植株生长缓慢、下部叶片黄化、不定根形成、叶片和嫩茎萎蔫、 落叶、剩余叶片边缘坏死，最终导致全株死亡。维管束组织的褐变是尖孢镰刀菌 引起的枯萎病最明显的特征，在较老的植株上，从盛花期到果实成熟期，症状会 变得更明显嗍驯，如图1 1 所示。 前言 ab 图1 1 农作物枯萎病 a 西瓜枯萎病：b 黄瓜枯萎病 f i g 1 1f u s a r i u mw i l td i s e a s ei na g r i c u l t u r a lc r o p s 1 1 4 侵染方式 尖孢镰刀菌在土壤中营兼性寄生，它的腐生能力使得它可在土壤中长期生 存，在植株残株上也可以生存。这些真菌以菌丝体或3 种孢子( 小型分生孢子、大 型分生孢子、厚垣孢子) 中的任何一种存活h 1 。尖孢镰刀菌的孢子萌发或菌丝体 的侵入部位为植物根部，可直接从根洒、根部伤口或是在侧根生长点进入植株体。 一旦进入植株体内，菌丝体就在根皮层细胞间生长，当菌丝体到达木质部后，通 过木质部的纹孔侵入导管，而后在导管中向上生长，至植株的茎和顶部。病原菌 丝体生长过程会产生分枝、生成小型分生孢子，小型分生孢子顺着导管从下往上 移动，当小型分生孢子萌发时，菌丝体会穿透木质部上层壁，在相邻的导管中产 生更多的小型分生孢子。同时，尖孢镰刀菌也会通过木质部的纹孔横向进行进一 步扩展。由于病原菌在植株维管组织内的生长，植株的营养和水分供应受到了很 大的影响，导致叶片气孔的关闭、萎蔫和植株的整体死亡畸1 。这时，病原菌侵入 植株的软组织，直至最终到达死亡组织的表面，在那里大量地产生孢子，这些孢 子又成为病原菌进一步扩散的接种体1 。 1 1 5 传播途径 枯萎病原以菌丝体、分生孢子、厚垣孢子在土壤及未腐熟的带菌绿肥中越冬， 种子也可带菌。尖孢镰刀菌的短距离传播主要是通过灌溉水和带茵的农用器具。 长距离传播是通过带菌的种苗和土壤，也可以通过风进行孢子传播。尽管病原菌 囝 刖舌 有时也会侵染果实和种子，但通过种子传播的可能性很小盯1 。 1 1 6 病害流行 在我国南方，作物枯萎病中以瓜类枯萎病发生最为严重：在我国北方，以棉 花枯萎病发生最为严重。枯萎病在植株的全生育期均可以生，一旦发病，就难以 根除，随着连作年份的增加，发病率越发严重阳1 。2 0 世纪9 0 年代以来，我国设施 蔬菜瓜类作物面积不断增加；由于在相对封闭的设施内形成的特殊小气候有利于 蔬菜生长，也可为各种病虫害滋生的温床，加之长年连作，使土壤中病原菌的数 量不断增加，设施栽培蔬菜的枯萎病发生越来越重。作物枯萎病一般导致减产 2 0 - - , 3 0 ，严重田块可达5 0 - - 一8 0 ，甚至绝产，已成为限制着我国作物生产发展重 要因素隋3 。 1 2 甜瓜枯萎病的防治措施 甜瓜枯萎病发病高峰期在植株开花至坐果期。发病初期，植株叶片从基部向 顶端逐渐萎蔫，中午尤其明显，早晚尚可恢复，数日后植株全部叶片萎蔫下垂， 不再恢复。茎蔓基部稍缢缩，表皮粗糙，常有纵裂。病部在潮湿时，根茎部呈水 渍状腐烂，表面常产生白色或粉红色霉状物。有的病株根褐色，易拔起，皮层与 木质部易剥离，其维管束变褐色。苗期至成熟期都可发病，苗期造成子叶或全株 萎蔫茎基部变褐缢缩，呈猝倒状。其防治措施有： 选用抗病品种。一般薄皮甜瓜比厚皮甜瓜抗病。 与非瓜类作物实行五年以上轮作，最好是水旱轮作。 播种前种子消毒。( 1 ) 浸种，用7 0 甲基托布津5 0 0 倍液或5 0 多菌灵可 湿性粉剂1 0 0 0 倍液浸种4 0 分钟，捞出后用水冲洗干净，催芽，播种。( 2 ) 拌种， 刚种播种时，将种子用水浸后捞出，以种子重量的0 2 - - 一0 3 的5 0 多菌灵粉剂 拌种，然后再播种。 嫁接育苗。用南瓜、瓠瓜作砧木进行嫁接栽培。 加强栽培管理，增强植株抗病性。 药剂防治。重病田可穴使药土，药土的比例为1 ：1 0 0 ，在穴内下铺、上 盖，然后覆土。可选择的药剂有7 0 甲基托布津、5 0 多菌灵等。田间发病初期 7 前言 可选用2 5 溶菌灵可湿性粉剂，或5 0 多菌灵可湿性粉剂5 0 0 - - 一8 0 0 倍液在植株根 部浇灌，每株灌药液2 5 0 毫升，每5 7 天1 次，连灌3 次。用“绿享一号 、“绿 享二号 、“绿享五号 进行土壤处理苗床，每平方米1 克对枯萎病防治效果较好 1 0 】 1 1 0 1 3 丝状真菌的转化 1 3 1 研究概况 丝状真菌作为低等的真核生物，对人类生命活动的各个方面均产生了深远的 影响，为了控制真菌对人类不利的一面，充分利用其有益的特性服务于人类，就 必须深入的了解其生理、遗传以及分子生物学方面的信息，并通过分子生物学手 段对其进行有效改造n2 。真菌是一类具有独特的形态学、生理学特征的真核生物， 诸如生长形态丝状或酵母状；具有坚硬的几丁质细胞壁；具顶端生长特性；营腐 生或寄生生活；孢子繁殖；基因组相对较小；多余d n a 含量少等特点。由于丝 状真菌能将现代分子生物学技术与经典的遗传学技术很好的结合在一起，使得丝 状真菌成为进行分子遗传学理论研究极好的模式生物口引。 分子遗传学研究的一个关键因素在于遗传转化系统的研究和发展。遗传转化 技术的发展对于人们进一步分离基因和分析基因的功能提供了强有力的工具，目 前遗传转化技术已经广泛的应用于原核生物和真核生物。自1 9 7 3 年t a t u m 和 m i s h r a 首次报道粗糙链孢霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 的转化以来，丝状真菌遗传转化 系统研究发展非常迅速，尤其是近几年来相关的文献报道剧增n 4 1 。 1 3 2 选择标记和转化载体 通常真菌转化通过营养缺陷互补，表型互补或显性标记选择转化子。一般真 菌基因启动子有较广泛的宿主范围，因此以一个已鉴定的某种丝状真菌的营养缺 陷型突变体为受体，不但可克隆到野生型的同源基因，还可能克隆到野生型的异 源基因。但分离特异的营养缺陷型，尤其从具有工业意义的丝状真菌中分离比较 困难，因此很快发展了多种抗生素抗性标记并且应用于很多的病原菌转化中。目 前在丝状真菌转化中常用的一些抗性选择标记包括： 潮霉素b 抗性( h y g r o m y c i nbr e s i s t a n c e ) 潮霉素b 是一种氨基糖普类抗生素。 匍舌 它可以通过抑制蛋白质的合成阻碍原核生物、真核生物和哺乳动物细胞的生长。 尽管一些真菌种类需要较高的潮霉素b 的浓度来抑制其生长，但在浓度5 0 - - 2 5 0 # g m l 的范围内可以抑制大多数真菌的生长。从大肠杆菌中获得的潮霉素抗 性基因( 助乃) 已经被广泛地应用在真菌的d n a 转化中。其最常用的载体是p a n 7 1 、 p c b l 0 0 4 、p c b l5 3 5 等。 腐草霉素抗性( p h l e o m y c i nr e s i s t a n c e ) 腐草霉素抑制d n a 的合成。腐草霉素 和放线菌素一样在其与d n a 结合时，似乎具有自己的选择特异性。它似乎对富 含a t 碱基对的多核苷酸具有亲和力，并且在不妨碍r n a 聚合酶活性的浓度下抑 $ 1 j d n a 聚合酶活性。尽管腐草酶素在浓度为1 0 0 - - 一2 5 0 # g m l 的范围内可以抑制大 多数真菌的生长，但是对于一些种类的真菌则需要更高的浓度去抑制。最普通的 腐草霉素的抗性载体是p a n 8 1 n 引。 除草剂抗性( b i a l o p h o sr e s i s t a n c e ) b i a l o p h o s 是一种除草剂的活性成分，是由 s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s 自然产生的三肽物质。它经过分解后形成膦丝菌素一 一种可以抑制谷氨酞胺合成的物质。一种编码麟丝菌素乙酞转移酶的基因从s h y g r o s c o p i c u s 的分离出来，并且作为一种选择标记被广泛地应用在高等植物和一 些真菌( 例如：m a g n a p o r t h eg r i s e a ，n e u r o s p o r ac r a s s a ，c o c h h o b o l u ss a t i v a 和 c o l l e t o t r i c h u m 的几个小种) 的转化中( p a l le ta 1 ，1 9 9 4 ；a v a l o se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。许 多载体含有这种抗性基因，其中包括p c b l 5 3 4 和i p b a r g e m 系列n 7 1 。 磺酞脉抗性( s u l f o n y l u r e ar e s i s t a n c e ) m a g n a p o r t h eg r i s e ai l v l 的磺酞脉抗性 等位基因已经被克隆。这个基因编码乙酞乳酸合成酶。乙酞乳酸合成酶参与异亮 氨酸和撷氨酸的合成。磺酞脉在浓度1 0 0 # g m l 时抑制乙酞乳酸的合成。现今， p c b l 5 3 6 是应用最广的产生真菌磺酞脉抗性的载体n 8 1 。 苯菌灵抗性( b e n o m y lr e s i s t a n c e ) b e n o m y l 是一种杀菌剂，它可以结合俨微管 蛋白引起微管的分解。这种物质可以在浓度1 1 0 # g m l 的范围内抑制很多子囊 菌纲和担子菌纲的真菌。粗糙脉抱菌中的俨微管蛋白基因的表达可以对b e n o m y l 产生抗性n 9 1 。 乙酞胺酶( a c e t a m i d a s ea m d s ) 乙酞胺酶基因并不是一个抗生素抗性标记， 它编码乙酞胺酶。乙酞胺酶可以使生物在以乙酞胺为唯一碳源的条件下生存啪1 。 9 前言 1 3 3 丝状真菌的转化方法 真菌的遗传转化包括两个方面：一是将遗传因子转化到受体细胞之中；二是 分离获得外源遗传因子的受体细胞。大部分的转化方法都能够使受体细胞接受到 目标片段，而有效的选择目的转化子往往是遗传转化技术发展的限制因素。丝状 真菌坚硬的细胞壁是遗传转化的主要障碍，所以丝状真菌的转化一般以原生质体 作为受体细胞，制备原生质体的材料包括幼嫩菌丝、分生孢子和担孢子险。 ( 1 ) 原生质体- p e g 转化法( p r o t o p l a s t s p e g t r a n s f o r m a t i o n ) 原生质体- p e g 转化法是通过在培养物中加入p e g 等多聚物协助基因转移， 以促使原生质体融合的方法。与p e g 类似的多聚物还有多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸 等，这些多聚物和二价阳离子( m 9 2 + 、c a + 、m n 2 + ) 以及外源在原生质体表面形成 沉淀颗粒，由于内吸作用，原生质体能将吸附着表面的d n a 吸收到细胞内，实现 转化2 2 3 2 引。 ( 2 ) 醋酸锂转化法( l i t h i u ma c e t a t e t r a n s f o r m a t i o n ) 高浓度的l i + 可以诱导并增强细胞的渗透性，使细胞壁吸收外源d n a ，不用 制备原生质体。这个方法最早应用于酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，随后， 在粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) ，白绒鬼伞( c o p r i n u sl a g o p u s ) ，以及花药黑粉 菌( u s t i l a g ov i o l a c e a ) 的转化也获得了成功。但这种方法的使用仅仅局限于少数种 类的丝状真菌他。 ( 3 ) 电击转化法( e l e c t r o p o r a t i o n t r a n s f o r m a t i o n ) 电击转化法是以原生质体或者完整的细胞为受体的转化方法。其原理是利用 短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜或细胞膜形成可逆的瞬间通道，使外源d n a 进入细胞。由于电击转化步骤简单，转化效率较高，目前已经应用于不同物种的 完整细胞和原生质体，包括细菌，哺乳动物以及丝状真菌口钔。 ( 4 ) 基因枪转化法( b i o l i s t i c s t r a n s f o r m a t i o n ) 基因枪法是2 0 世纪8 0 年代末逐步发展起来的，其原理是加入c a 2 + 的亚精胺等 使外源d n a 吸附在微小的金粒或钨粒表面制成d n a 微弹，在基因枪激发的瞬间 力量作用下，将外源基因直接导入受体细胞中。目前该法已成功地应用于高等植 物( 被子植物和裸子植物) 、蓝藻、细菌、真菌、动物离体细胞和活体细胞组织。 基因枪法突出的优点是转化受体操作迅速、简单以及受体材料广泛，这种方 l o 前言 法将来可能成为一种“万能”基因转化法。另一个优点是外源d n a 可以直接导入 可再生的组织或细胞，因此不需要培养原生质体。但由于价格昂贵、嵌合体不易 排除、不易选择转化体、转化频率低以及转化受体细胞再生困难等原因使其在实 践应用中受到一定的限制引。 ( 5 ) 农杆菌介导转化法( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ， a t m t ) 根癌农杆菌a t u m e f a c i e n s 是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能 在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，这是一个有趣的天然 转化的例子。细菌通过类似结合的过程把t i 质粒中的t d n a 转移到植物细胞基因 组中矧。 近来的研究表明，通：i 勘t u m e f a c i e n s 介导的方法，不仅可以转化植物而且可 以转化细菌、动物和真菌。在真菌中，对酵母菌的a t u m e f a c i e n s 介导转化首先获 得成功，随后转化技术又扩展到其它的丝状真菌。1 9 9 8 年，g r o o t 等利用a t m t 成功转化了泡盛曲霉( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) ，双孢蘑菇( a g a r i c u s6 卸o r u s ) 等多种 丝状真菌，并证明异源的a t u m e f a c i e n st d n a 可以单拷贝地随机插入到丝状真 菌染色体中，他们的研究不仅为丝状真菌的转化提供了新途径，而且显示t d n a 转化在丝状真菌的插入突变、基因标记等方面具有相当的潜力，拓宽了t d n a 转化技术的应用领域硷7 1 。 1 3 4 限制性内切酶介导转化法( r e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e di n t e g r a t i o n r e m i ) 1 3 4 1 限制性内切酶介导转化法及其优缺点 r e m i 是在限制酶介导下用质粒转化真菌，通过质粒d n a 的异源随机插入而 使外源基因整合到受体菌染色体上，从而直接获得基因标记菌株的新方法。现在 对r e m i 的机理仍然没有完全研究清楚。可能是限制酶进入细胞后，真菌染色体 d n a 的相应限制酶位点被切开，尽管大多数切点没有整合外源d n a 而重新连接， 但也有可能外源d n a 的粘性末端与染色体d n a 的粘性末端连接而插入切口由 d n a 连接酶连接后形成转化子。外源d n a 可造成插入点基因的失活，通过对转 化子的表型筛选可获得目标转化子。有人认为限制酶通过结合在其识别位点上， 前言 给转化体系带来了反应物，并通过其弱性、非专一性d n a 的结合，对转化d n a 的摄取起到介导的作用；也有人认为限制酶启动了降解一连接循环，带有亲和末 端的线性质粒可以与染色体d n a 的自由末端结合从而抑制完全修复。外源d n a 整合的位点一般是限制酶的酶切位点，如对s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 而言，用 b a m h i 切割的载体进行转化时，整合发生在b a m h i 位点的占8 0 9 0 乜引。质粒d n a 在插入过程中也可能会受到修饰，如长度变短、某些酶切位点消失等。s c h i e s t l 和m a n i v a s a k a m ( 1 9 9 8 ) 证实：不同的限制性内切酶介导片段整合到酵母基因组中 的能力是不同的，他们同时还观察到，只有几种限制酶可以提高转化频率。在 d i c t y o s t e l i u m 中，在线性质粒末端和限制性内切酶产生的末端序列匹配的条件下， r e m i 可大大提高转化率。大多数突变子被标记，整合显然发生在随机位点上， 大约4 0 0 个突变子中有1 个表现出发育上的缺陷。k u s p a 和l o o m i s 进一步报道了 r e m i 随机插入的随机性，使用称为r e m i r f l p 技术，发现r e m i 插入位点遍及 整个基因组，对特定区域没有选择性啪3c a o 。 r e m i 转化技术已成功地应用于一些丝状真菌的转化和一些植物病原真菌致 病相关基因的分离鉴定，尽管对一些丝状真菌的基因标记和克隆十分有效但有时 会产生非标记突变的转化子，这种非标记突变产生的原因可能是在转化过程中限 制酶切割染色体随后染色体d n a 没有完全修补所致。r e m i 转化技术操作简单， 转化效率高，单拷贝插入概率大，转化程序与一般真菌转化相似，对大多数已实 现转化的真菌均适用。 1 3 4 2 转化d n a 在受体中的命运 d n a 被转化进真菌中后既可整合在真菌染色体中还可作为自主复制质粒单 独存在。对于丝状真菌，很少发现有自主复制质粒的转化。自主复制质粒要求在 细胞质或细胞核中含有自主复制序列或负责修护的端粒酶。在真菌转化中常常出 现夭折的转化子，这是由于不稳定的标记整合短暂表达的缘故。 在d n a 转化中有三种整合方式，分别是同源整合，非同源整合和同源取代。 当转化的d n a 与基因组中的d n a 同源时就会发生同源整合。同源整合的频率因 被转化生物的不同或在相同生物上转化的同源d n a 片段的不同而变化。通常， 同源的片段越长越容易发生同源整合。非同源整合也称作随机整合，即转化的 1 2 前言 d n a 在基因组非同源位点发生的整合。有时尽管转化d n a 片段与基因组同源， 也可能发生随机整合。同源基因取代，即转化d n a 中的基因取代了受体染色体 基因组的同源基因，这是载体与受体d n a 间发生双交换的结果。基因的同源整 合和同源取代可以通过s o u t h e r n 杂交茅i p c r 检测出来。同源基因取代可以被用来 敲除基因和基因功能的研究。例如：一个基因编码区可以通过基因取代被选择性 标记取代或者被报告基因所取代。 用质粒进行转化时质粒常常被完整地整合到真菌基因组中。选择适当的限制 性内切酶进行酶切和连接，并转化到大肠杆菌，就有可能将质粒以及部分位于质 粒两端的基因组d n a 片段从基因组中拯救出来，同时获得目的基因d n a 片段。 质粒拯救是一项非常有用的技术，尤其在获得插入表型突变体的情况下，它可以 帮助快速克隆基因片段口引。 1 3 4 3 国内外r e m i 法介导整合转化的研究现状 迄今，r e m i 转化方法由于其操作简单，转化效率高，单拷贝整合多的特点， 已越来越普遍地应用于各种丝状真菌的突变、致病( 或发育) 相关基因标记，如 a l t e r n a r i aa l t e r n a t e 3 劓、a s p e r g i l l u s f u m i g a m s 3 钔、a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 、a s p e r g i l l u s n i g e r 驯、c o p r i n u sc i n e r e u s 3 7 1 、c o c h l i o b o l u sh e t e r o s t r o p h u s 圳、c o l l e w t r i c h u m l i n d e m u t h i a n u m 3 9 1 、g i b b e r e l l a f u f i k u r o i 柏1 、m a g n a p o r t h eg r i s e a 4 1 ，m y c o s p h a e r e l l a z e a e m a y d i s 4 2 1 、n e u r o s p o m c r a s s a 4 3 3 、p e n i c i l l i u mp a x i l l i 4 4 3 、u s t i l a g om a y d i s 4 5 1 、 稻瘟病菌m 1 、链格孢菌h 7 1 、灵芝瞳朝、绿色木霉m 1 、苏云金杆菌h 钔等。 很明显地，应用r e m i 进行真菌致病性基因的分离方法将会进一步得到改进， 结合细胞学、蛋白质定位、相互作用因子的鉴定以及生物测定分析等手段将加深 人们对植物病原真菌相互作用的理解，从而最终能够区分植物病原真菌侵染植物 的普通侵染和特殊侵染的策略。 随着科技进步，r e m i 将得到不断完善，并将和其它技术结合而运用于科研 中，例如在转基因动物研究中使用s m g ( s p e r m m e d i a t e dg e n e t r a n s f e r ) + r e m i ，能 显著地提高转化率，再如t e r m i n a t o r - r e m i ，在回收d n a 时比质粒拯救更有效， 并能对插入转化进行定量研究，而其中的一些新技术，女i t e r m i n a t o r - r e m i 将被方 便地运用于丝状真菌的基因克隆中嘞1 。 前言 1 4 本研究的目的和意义 为了实现尖孢镰刀菌的遗传转化，本研究利用限制性酶介导整合转化的方 法，从转化前尖孢镰刀菌分生孢子的获得及再培养，镰刀菌原生质体的制作条件 的摸索和优化，原生质体的转化方法的研究到尖孢镰刀菌转化子的筛选、鉴定， 建立起一套完整的尖孢镰刀菌遗传转化体系。 植物枯萎病是由镰刀菌寄生引起的一种世界性真菌土传病害，其主要的致病 菌是尖孢镰刀菌，病原菌从根部为害植物，引起维管束病害，造成植株枯死，在 植株的全生育期均可发生。通过构建表达载体质粒，进行尖孢镰刀菌的遗传转化， 对所转化的尖孢镰刀菌进行生物化学与分子生物学检测，这对于了解尖孢镰刀菌 的致病机理及植物维管束萎蔫病害的有效防治具有重要意义，为进行进一步的生 防研究奠定基础。 1 4 材料和方法 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌株与质粒 尖孢镰刀菌甜瓜专化型强致病力菌株l 1 2 8 由福建省农科院生物技术中心提 供。转化质粒p c s n 4 3 由美国宾夕法尼亚州州立大学植物病理学系s k a n g 教授惠 赠，质粒上的潮霉素( h y 伊o m y c i n ) 抗性基因( h p h ) d d a s p e r g i l l u s ，z f 幽肠刀5 的p 即，c 启 动子调控，并去除了该潮霉素磷酸转移酶基因的大部分常见限制性位点( 见图 2 1 ) 。 图2 1 质粒p c s n 4 3 谱 f i g 2 1t h ep l a s m i do f p c s n 4 3 2 1 2 试验作物 “新白玉”甜瓜种子，购买自厦门市文兴蔬菜种苗有限公司。 2 1 3 试剂及配方 ( 1 ) 培养基 l b 培养基：1 蛋白胨、0 5 酵母粉、0 5 n a c l 、2 琼脂粉，p h7 0 。 材料和方法 p d a 培养基：2 0 马铃薯、2 葡萄糖、2 琼脂粉。 p d 培养基：2 0 马铃薯、2 葡萄糖。 原生质体再生培养基：0 2 n a n 0 3 、0 1 k ：h p o 。、0 0 5 k c l 、0 0 5 m g s o 。、 0 0 0 1 f e s o 。、0 6 m o l l 蔗糖、0 7 琼脂、7 0 # g m l 潮霉素b ，p h7 5 5 1 1 。 筛选培养基：2 0 马铃薯、2 葡萄糖、2 琼脂粉、8 0 # g m l 潮霉素b 。 琼脂粉、潮霉素b 购自上海生工。 ( 2 ) 缓冲液 渗透压稳定剂( d m ) ：1 2 m o l l 山梨醇、2 0 m m o l l c a c l ：、1 0 m m o l l t r i s h c l ， p h7 0 。 转化缓冲液( t m ) ：1 0 m o l l 山梨醇、2 0 m m o l l c a c l ：、1 0 m m o l l t r i s h c l ， p h7 5 4 9 】。 再生缓冲液( r m ) ：1 2 m o l l 山梨醇、1 0 m m o l l c a c l 。、1 0 m m o l l t f i s h c l 、 0 i k 2 h p o 。、0 0 5 m g s 0 4 、0 3 n a n o 。，p h7 5 。 ( 3 ) p e g 与溶壁酶 p e g 6 0 0 0 购自上海生工，用转化缓冲液配制成6 0 浓度( w v ) 。 溶壁酶购自广东微生物研究所，用渗透压稳定剂配制成2 的浓度( w v ) 。 ( 4 ) p c r 试剂 d n t p s 、t a q d n a 聚合酶、琼脂糖、p c r 产物纯化试剂盒购自上海生工。引 物由宝生物工程有限公司合成。1 0 0 b pd n a l a d d e r m 破e r 购自宝生物工程有限 公司。 ( 5 ) 质粒提取试剂盒 p l a s m i dm i n ik i ti ( 1 0 0 ) 购买自厦门泰京生物技术有限公司。 2 1 4 仪器 b e c k m a n 冷冻离心机，b i o r a d 电泳仪，b i o r a d 凝胶成像仪，o l y m p u s 光学显微镜，u n oi ip c r 仪，q i u j i n gx b k - 2 5 血细胞计数板，国华企业s h z 8 2 a 恒温震荡器，z h u j i a n gl r h 2 5 0 g 光照培养箱，l e i c