（分析化学专业论文）dna与有机试剂的共振光散射光谱研究与应用.pdf

摘要 本沦文在奄阅大量文献的基础上，结合实验室的实验条件，选 择共振光散射光谱法研究了d n a 与一些有机小分子之间相互作用 的共振光散射光谱特征，并根据共振光散射光谱信号改变值与 d n a 浓度呈正比的特点，建立了四种测定d n a 的新方法。这些方 法具有快速、灵敏等特点，应用于鱼精及酵母d n a 含量的测定， 结果令人满意。 本论文共分为四章。 第一章研究了甲基绿与脱氧核糖核酸在碱性条件下的共振光 散射光谱特征，考察了影响因素和最佳反应条件。研究表明，甲基 绿在p h = 1 0 0 的三羟甲基氨基甲烷盐酸( t r i s h c l ) 缓冲溶液中与 鱼精d n a 反应后在3 3 9 n m 处其共振光散射强度显著增强，且共振 光散射强度增加值与加入的d n a 的浓度呈良好的线性关系，据此 建立了一种测定d n a 的新方法。在p h = 1 0 0 的三羟甲基氨基甲烷 盐酸( r i f f s h c l ) 缓冲溶液中，线性范围为4 0 0 1 8 0 0 9 9 l ，线性回 归方程为：i 一2 2 6 6 0 2 + 5 6 1 9 6 6 c ( c ：扯g m l ) ，相关系数为o 9 9 9 0 ， 最低检出限可达2 0 6 9 9 l ，应用于鱼精d n a 的测定结果令人满意。 第二章研究了p 氯化蔷薇苯胺与脱氧核糖核酸的最佳反应条 件，研究了它们之间相互作用的共振光散射特征，考察了体系的影 响因素，建立了一种测定d n a 的新方法。研究表明，在p h = 7 。0 的三羟甲基氨基甲烷一盐酸( 瓢s h c l ) 缓冲溶液中，在5 9 4 n m 处 p 一氯化蔷薇苯胺与脱氧核糖核酸相互作用后产生共振光散射强度 增强，共振光散射强度增强值与加入的d n a 的浓度呈良好的线性 关系，线性范围为2 0 0 1 6 0 0 9 9 l ，线性回归方程为： 卢2 1 9 9 + 2 3 6 5 c ( c ：i i t g m l ) ，相关系数为0 9 9 9 7 ，检出 限为2 6 5 “g ，l ，应用于酵母d n a 的测定，结果令人满意。 第三章研究了混合有机染料天青i 与脱氧核糖核酸的最佳反 应条件，探索了体系在p h = 1 0 0 的三羟甲基氨基甲烷一盐酸 ( t r i s h c l ) 缓冲溶液中的共振光散射特征，并考察了体系的影响 因素，建立了一种测定d n a 的新方法。方法的线性范围为2 0 0 6 0 0 1 - t g l ，线性回归方程为卢。9 6 6 2 + 6 0 6 6 c ( c ：l l g m l ) ，相关 系数为0 9 9 9 8 ，检出限为1 1 2 1 a g l ，应用于酵母d n a 的测定结果 令人满意。 第四章研究了阴离子染料茜素红s ( a r s ) 一十六烷基三甲基漠 化铵( c t m a b ) 脱氧核糖核酸( d n a ) 体系的共振光散射( r l s ) 及其分析应用。研究了体系r l s 的光谱特征、影响因素和最佳反 应条件，同时讨沦了a r s c t m a b d n a 相互作用的可能机理。 在六次甲基四铵( h m t a ) h c l 缓冲溶液( p h = 8 ，0 ) 中，a r s 通 过c t m a b 的桥梁协同作用与d n a 反应形成了大的分子聚集体， 使体系的r i b s 增强。在最佳条件下，体系的i r l s 与y d n a 在 2 5 8 0 0 9 9 l 范围内呈线性关系，其线性回归方程为 i = 5 7 6 3 2 + 4 1 2 7 6 c ( c ：e d m l ) ，相关系数1 - = 0 9 9 9 1 ，d n a 检测限 为l 1 3 p g l 。该方法简便、快速、具有较高的灵敏度和准确度，应 用于合成样品中d n a 的测定，结果令人满意。 关键词：脱氧核糖核酸，共振光散射光谱，甲基绿，p 氯化蔷薇 苯胺，天青i ，十六烷基三甲基溴化铵( c t m a b ) ，茜素红s ( a r s ) 。 a b s t r a c t t h er e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n g ( r l s ) s p e c t r ac h a r a c t e r i s t i c so f s m a l l o r g a n i cm o l e c u l e sa n dd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) s y s t e m s h a v eb e e ns t u d i e do nt h ef o u n d a t i o no fn u m e r o u sr e f e r e n c e sa n d c o n d i t i o n so ft h el a b o r a t o r y o nt h eb a s i so ft h es t u d i e s ，w eh a v e e s t a b l i s h e df o u rn e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fd n a b ym e a n so f r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n g ( r l s ) t e c h n i q u ei nt h i sp a p e r , t h i s p a p e rc o n s i s t so f f o u rc h a p t e r s 。 i nt h ef i r s t c h a p t e r ，t h es p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c so fr l s t h e e f f e c t i v ef a c t o r s ，t h em e c h a n i s t i ca n do p t i m u mc o n d i t i o n so ft h e r e a c t i o ns y s t e mo fm e t h y lg r e e n ( m g ) 一f i s hs p e r md n a ( f s d n a ) h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d i n t h eb u f f e ro ft r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e h c l ( t r i s h c l ) a tp h10 0 ，m e t h y lg r e e ne x h i b i t e df i v er e s o n a n c e s c a t t e r i n gp e a k sa t2 9 2 ，3 3 9 ，3 8 9 ，4 6 8 ，5 3 4n m ，w i t ht h ea d d i t i o no f f s d n at h e i n t e n s i t y w a s g r e a t l y e n h a n c e d t h e r ew a s1 i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ee n h a n c e d i n t e n s i t y a n df i s h s p e r m d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d sc o n c e n t r a t i o na t3 3 9 n m l i n e a re q u a t i o no f f i s h s p e r md e o x y r i b o n u c l e i c a c i dw a sai = 一2 2 6 6 0 2 + 5 6 19 6 6 c ( c ： l a g , m l ) b a s e do i lt h ea b o v er e s u l t sas e n s i t i v ea n ds i m p l em e t h o dw a s e s t a b l i s h e df o rd e t e r m i n a t i o no fd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d t h el i n e a r r a n g e o ft h ec a l i b r a t i o n g r a p h i s4 0 0 - 1 8 0 0 p g l w i t hac o r r e l a t i o n c o e m c i e n to f0 9 9 9 0 t h ed e t e c t i o n1 i m i ti s 2 0 6 9 9 l t h i s m e t h o di s s i m p l e ，r a p i d a n dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fd n ai n m i x e ds a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i nt h es e c o n dc h a p t e r , t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c so fr l s ，t h e e f f e ：c t i v e f a c t o r s ，t h e m e c h a n i s t i ca n do p t i m u mc o n d i t i o n so ft h e r e a c t i o n s y s t e m o ff u c h s i n b a s i c d n a ( f b - - d n a ) h a v e b e e n i n v e s t i g a t e da n dan e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fy d n a w a s e s t a b l i s h e db yr l s t e c h n i q u e t h er e s o n a n c el i g h t - s c a t t e r i n g ( r l s ) o f f u c h s i nb a s i ci s g r e a t l y e n h a n c e d b yy e a s td e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( y d n a ) i n t h ep h r a n g eo f 6 ，7 5 7 2 5i nt h eb u f f e ro f t r i s h c i t h e e n h a n c e d i n t e n s i t y o fr l sa t5 9 4 n mi s p r o p o r t i o n a l t ot h e c o n c e n t r a t i o no fy d n ai nt h e r a n g e o f2 0 07 、。16 0 0 p g lw i t ha c o r r e l a t i o nco e f f i c i e n tof0 9 9 9 7 t h el i n e a re q u a t i o nof y d n ais ， = 一2 1 9 9 + 2 3 6 5 c ( c ：l a g m l ) t h ed e t e c t i o n l i m i ti s 2 6 5 p g l t h i s m e t h o di s s i m p l e ，r a p i da n dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f d n ai ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i nt h et h i r dc h a p t e r ，t h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s p e c t r ao f a z u i eia n dy e a s td e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( y d n a ) h a sb e e ns t u d i e d t h er l so fa z u r e1w a s g r e a t l y e n h a n c e d b yy e a s td e o x y r i b o n u c l e i ca c i di np h r a n g e o f9 5 1 0 5i nt h eb u f 艳ro ft r i s h c i t h e r e a r er e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n gp e a k sa t2 9 9 n m ，3 5 5 n m ，4 0 0 n m ，5 7 0 n m ， a n d6 3 0 n m ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo fr l sa t3 5 5 n mw a s p r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t i o no f d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d s oam e t h o do fr l sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fd e o x y r i b o n u c l e i ca c i dw a se s t a b l i s h e d t h el i n e a r e q u a t i o no fy d n ai s _ - 一9 6 6 2 + 6 0 6 6 c ( c ：g g m l ) t h el i n e a rr a n g e o ft h ec a l i b r a t i o n g r a p h i s 2 0 0 6 0 0 社g l t h e d e t e c t i o nl i m i ti s 11 2 “j l t h i sm e t h o di s s i m p l e ，r a p i da n dh a sb e e na p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no fd n ai nm i x e d s a m p l e s w i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s i nt h ef o u r t hc h a p t e r ，an e wm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fn u c l e i c a c i dh a sb e e ne s t a b l i s h e d i nh e x a m e t h y l e n et e t r a m i n e ( h m t a ) b u f f e r ( p h 6 7 5 ) ，a l i z a r i nr e ds ( a r s ) a n dy e a s td e o x y r i b o n u c l e i ca c i d s ( d n a ) r e a c tw i t hc e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t m a b ) a n df o r m l a r g e p a r t i c l e s ，w h i c hr e s u l t si ns i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to f r l si n t e n s i t i e s t h e s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c so fr l s ，t h ee f f e c t i v ef a c t o r sa n do p t i m u m c o n d i t i o n s ，m e c h a n i s t i co f t h er e a c t i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d u n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o n st h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a s p r o p o r t i o n a l t oth ec o n c e n t r a t i o no fd n ai nt h er a n g e2 5to8 0 0 1 x g m lf o ry e a s t d n a ( y d n a ) t h e l i n e a re q u a t i o n i s a 仁5 7 6 3 2 + 4 1 2 7 6 c ( c ：肛g m l ) ， t h ec o r r e l a t i o nc o c f 矗c i e n t i s0 9 9 9 1 ，t h ed e t e c t i o nl i m i t s i s 11 3 g l t 1 1 i sm e t h o d i s s i m p l e ，r a p i d a n dh a sb e e n a p p l i e d s a t i s f a c t o r i l yt od e t e r m i n a t i o no f y d n a i ns y n t h e t i cs a m p l e s k e y w o r d s ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) ，r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n g f r t ，s 、，m e t h y lo r e e n ( m g ) ，f u c h s i n b a s i c ，a z u r ei ，c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t m a b ) ；a l i z a r i n r e ds ( a r s ) 翌叁翌：璺塑皇! 型签壁燮i 垡堂壁垄堂丝塞型壁 引言 核酸是由数十至亿个核苷酸通过3 ，5 一磷酸二酯键连接而 成的一类生物大分子，主要包括脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核 酸( r n a ) 两大类，其基本组成单位是核苜酸。它是q i 命现象中 不可缺少的物质，也是生物遗传信息的载体，并控制着蛋白质的 合成和有机细胞的机能。1 8 6 8 年瑞二l 年轻的科学家m i e s c h e r 从脓 细胞中分离出核酸物质。1 9 4 4 年a v e r y ，m a c l e o d 和m c c r e r t y 以 肺炎球菌转化实验证明了核酸( d n a ) 是遗传物质而不是蛋白质， 从此核酸的重要性得到广泛的关注。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出 了d n a 的双螺旋结构，并对d n a 的复制和d n a 怎样传递生物 的遗传信息作出了合理的解释。这个d n a 双螺旋结构模型为现 代分子生物学奠定了坚实的基础，并且大大推进了核酸的研究进 展，从而被称为核酸研究进程的第一个里程碑i l j 。随后发展起来 的d n a 重组技术和基因工程学科则成为了进一步揭示生命奥秘 的有力武器，并在工业、农业、医学、药物研制等领域展示出臣 大的应用前景。核酸大分子与药物小分子或蛋白质大分子的相互 作用已成为研究生物大分子识剐和药物合理设计的基础，人类基 因组计划的进行正逐步揭开生命的奥秘并造福于人类。核酸的组 成、排列顺序、结构特征和生物功能以及核酸与小分子的作用机 理是核酸研究的重要内容，而核酸的定量测定是核酸研究的基础， 所以核酸的定量研究具有重要的理论和实际意义。现将核酸的研 究内容及研究方法简要说明如下： 一、核酸与小分子的相互作用机理研究： 小分子与核酸的作用主要分为二种，一种是共价作用，这种 作用是不可逆的，二是非共价结合，这种作用是可逆的。 1 共价作用： 小分子与核酸的各种碱基之间发生的化学反应，如亲核反应、 亲电取代反应等主要是通过荚价键发生结合，这种作用称共价作 鬯金样：d n as 奄机试韵钓共振光散射光谱研究与赢嘲 用。如临床上使用的烷化试剂类抗癌药物，它们主要是将d n a 碱基进行烷基化，干扰d n a 的复制或r n a 的合成，从而起治疗 作用【舶。 2 非共价作用 这科i 杏日互作用有静电作用、沟槽作用、插入作用、远程组装 与外围结合等几种作用方式。这些作用受介质的酸度、离子强度、 小分子与d n a 的摩尔比等条件的影响，当条件改变时，作用方 式也可能发生变化，因此又称为可逆相互作用。 2 1 静电作用 d n a 在溶液中其磷酸根会发生水解电离而带多个负电荷，此 时阳离子小分子就能与d n a 发生作用，这种作用称静电作用。 阳离子型小分子与d n a 的这种相互作用可根据离子强度对测定 体系的影响进行判断p 4 | 。 2 2 沟槽作用 d n a 的特殊双螺旋结构含有大沟区和小沟区，其中大沟区和 小沟区在电场、空间效应、氢键、水化作用方面有很大的不同。 小分子如h o e c h s t3 3 2 5 8 t 5 1 、d a p i 6 】等因其体积小，主要同d n a 的小沟区发生作用 _ ”。 2 3 插入作用 d n a 的双螺旋结构的配对碱基层之间有一定的距离，小分子 如溴化乙啶( e b ) 等可插入其问。这种作用称插入作用，它可导 致d n a 的熔点提高【8 ，9 1 和粘度的改变【加】。 2 4 远程组装与外围结合 远程组装与外围结合亦称长距离组装，是p a s t e m a c k 在研究 卟啉与d n a 作用时提出的，它们之间的作用是以d n a 为模板， 卟啉在d n a 表面上进行长距组装，形成远程组装堆积结构，结 果是导致卟啉分子的s o r e t 带附近产生一定的共振光散射增强1 。 目前，对于d n a 与小分子的非共价结合作用的研究是d n a 与小分子的作用机理的研究热点。常见的有光谱法【8 , 9 , 1 2 - 15 1 ，质谱 法6 1 、电化学法 1 6 、电色谱法【1 7 】、线性二色谱法 1 8 , 1 9 、熔点法【9 】、 曾金撑：d n as 寿祝试裁的共振毙教射光谱弭究与廊埘 粘度法【2o 。光谱法中常采用的方法有：紫外可见( u v ) 光谱法、 荧光光谱法、r l s 光谱法、c d 光谱法等。在紫外一可见( u v ) 光谱法中，根据小分子的最大吸收峰的吸收位置和吸收强度的变 化情况可判断小分子与d n a 的作用方式。如果发生吸收强度的 减小并伴随最大吸收峰位置的红移，则小分子与d n a 之间存在 插入键合作用 9 , 2 0 l ；根据作用后是否出现共振光散射增强可以判断 d n a 与小分子是否存在远程组装与外围结合，如果出现共振光散 射增强现象则存在远程组装与外围结合；根据d n a 与小分子作 用前后熔点的变化情况可以判断d n a 与小分子之间是否存在插 入键合作用，如果小分子的加入导致d n a 熔点的升高则可判断 d n a 与小分子之间存在插入键合作用【8 ，9 】；通过测定小分子与 d n a 作用前后粘度的变化亦可判断d n a 与， 、分子之间是否存在 插入键合作用，如果小分子的加入导致体系的粘度增大则说明 d n a 与小分子之闯存在插入键合作用1 2 0 1 ；通过测定小分子与变性 前后d n a 作用的变化，亦可判断d n a 与小分子之间是否存在插 入键合作用，如果变性前后小分子与d n a 作用存在较大的差剐 则d n a 与小分子之间存在插入键合作用：用荧光法研究小分子 与d n a 的作用机理时，广泛采用的是经典插入刹e b 探针 1 4 , 1 5 , 2 1 - 2 6 1 和s c a t c h a r d 方程： 即：r c = k ( n 。r ) 【2 4 1 式中r 是d n a 上平均每一个核苷酸结合的e b 分子数，n 是每个 核菅酸上的成键位点数，k 是每一位点的结合常数，c 是游离e b 浓度，以r c 对r 作图，得到的图形称为s c a t c h a r d 图，利用小 分子存在下的s c a t c h a r d 图，可以判别小分子与d n a 的作用方式， 当s c a t c h a r d 图中k 不变而n 变化时，小分子与d n a 的结合是非 插入结合；当n 不变而k 变化时，则小分子与d n a 的结合是插 入结合；当n 、k 都变化时，则小分子与d n a 存在多种结合方式。 由于e b 的不稳定性和致癌性，研究工作者开始采用其它的探针 分子。 由于抗癌药物与d n a 的作用机理在体内和体外具有致性， 3 曾金祥：d n as 有机试韵豹共振光散孵光谱矫究s 瘟磁 因此，研究小分子与d n a 的作用机理，有利于了解抗癌药物治 疗机理，同时可以简便、快速地筛选出抗癌药物。通过研究d n a 与小分子在不同配比下的作用机理，可为合理给药提供重要的指 导意义，因而受到许多工作者的重视。如俞汝勤使用荧光法对抗 癌药物进行了体外筛选 2 2 - 2 6 1 ，曾云鹗等使用荧光抑制法实现了对 抗癌药物的体外筛选【2 7 ，弱j 。 二、核酸的定量测定研究 核酸的测定方法有很多种，如分光光度法以及荧光光度法、 色谱法、显微光度法、探针技术法、免疫分析法等 2 9 - 4 8 ，其中以 分光光度法和荧光光度法使用较多。9 0 年代开始起步的共振光散 射法作为一种新兴的分析方法，因其灵敏度高，选择性好，且方 法简便，应用于核酸的测定显示出较好的优越性。 1 分光光度法 1 1 基于核酸的特征吸收进行测定。 核酸由于具有许多共轭双键，因此碱基、核苷、核管酸和核 酸在2 4 0 - - 2 9 0 n m 的紫外光区具有强烈的吸收，最大吸收峰位于 2 6 0 n m 附近，根据此性质可用分光光度法对核酸进行定性和定量 测定【2 9 】，同时由2 6 0 = 6 6 0 0 l t o o l 。cm - 1 ，只要测定体系在2 6 0 处 的吸光度a 值，根据比尔定律即可计算其浓度。该方法简便、快 速。由于蛋白质在存在时，由于蛋白质在2 8 0 r i m 处有强烈吸收， 故当有蛋白质存在时会产生较大的干扰，所以用这种方法测定先 要确定体系中是否存在蛋白质，当a 2 6 以2 8 0 1 8 时表明蛋白质的 影响可以忽略。 l ，2 测糖法 核酸的嘌呤核苷键易于水解断裂而生成含有戊糖醛基的水解 产物，这种产物在酸性介质下可转变成糖醛衍生物，生成的衍生 物可与一些试剂呈现颜色反应，根据这一特性可建立核酸的定量 测定方法，根据所用试剂不同可分为：二氨基苯甲酸法、硫代巴 比士酸法、二苯胺法等几种方法p 啦圮j 。 1 2 1 二氨基苯甲酸法 蛰金祥：d n a 与在钒试镝的共振光敬射光谱研究与惠瑚 将d n a 和二氨基苯甲酸混合液加热至6 0 摄氏度，3 0 分钟后 予4 2 0 r i m 处测定d n a 【j 。 1 2 2 硫代巴比士酸法 在硫酸中水解后的d n a ，再加入高碘酸和硫代巴比士酸，有 粉红色反应物生成，入。位于5 3 2 n m 处，用于d n a 的测定时， r n a 和蛋白质不干扰测定”。 1 2 3 二苯胺法 二苯胺法是测定核酸方法中较为古老且至今仍使用的一1 哥中方 法，1 9 3 0 年被d i s c h e 提出用于测定核酸，在强酸性条件下水解后 的d n a 能与二苯胺反应，并有兰色产物生成，入。= 6 0 0 n m ，由 此可测定核酸的含量p “。 1 3 测磷法 测磷法是基于先将核苷酸用强酸消化，使有机磷变成磷酸根， 再用测定磷酸根的方法测定d n a 中磷的含量。根据p 的含量即 可推测出核酸的含量p 川。 1 4 染料结合法 在分光光度分析中，除了以上几种测定核酸的方法外，染料 与核酸的结合，也是核酸光度分析中较为重要的一类方法，该方 法是基于多核苷酸中两个单核苷酸残基之间的电离具有较低的 p k 值( p k = 1 5 ) ，当溶液中的p h 值大于4 时，核酸会全部离解 呈多阴离子状态【3 4 1 ，这种结构具有与一些阳离子染料结合的能力， 染料结合法具有简便、快速、灵敏、准确等特点。但蛋白质对体 系的测定干扰严重，目前，作为标记物测定核酸的阳离子染料或 螫合阳离子有：甲基梨35 1 、甲苯胺蓝【3 6 】、乙基紫吲、甲基紫【3 8 】 等。 2 荧光法 荧光法是测定核酸的另一种常用方法，包括荧光增强和荧光 猝灭法，通常较分光光度法有更高的灵敏度，目前，用于测定核 酸的荧光试剂有以下四类： 2 1 有机染料荧光探针 鬯金祥：d n as 有机试韵的共振光敏鞋光谱研究与琅- 1 这类探针中较为经典的是溴化乙锭( e b ) 、碘丙锭( p i ) 、双 苯并眯唑染料( h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 、4 ，6 一二脒基2 一苯吲哚( d a p i ) 、 吖啶橙( a o ) 等。由于经典的荧光探针的一些缺陷( 如e b 不稳 定，且是强的诱变试剂和致癌试剂) ，因而寻找其它的使用较方便 的荧光探针的研究常有报道，如亚甲蓝( m b ) u t 、耐尔蓝( n b ) 【3 9 、藏红t ( s t ) 【4 0 4 、中性红 4 2 】等。 2 2 药物荧光探针： 许多抗癌药物本身可以作为测定核酸的荧光探针，已有报道 的药物荧光探针有：亚德里亚霉素、阿霉素 4 3 1 、光神霉素即】、竹 红菌甲烈4 5 1 、小檗剃4 6 1 、利凡诺 4 7 】、邻苯二胺过氧化氢过氧 化物酶体系【4 8 】、h a 4 9 1 等。 2 3 金属离子荧光探针： 由于稀离子特有的荧光性质，它们的共振能带与d n a 配 体在紫外光激发下的三重态相重叠，能发生从有机配体( d n a ) 到中心离子( 稀土离子) 的无辐射能量转移，使其荧光得以保持 并得到增强，成为d n a 结构研究中一类重要的离子探针，其中 研究最多的是t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) p 。 2 4 金属配合物荧光探针： 金属配合物荧光探针主要有喹噼、联毗啶及其衍生物与三价 金属离子的配合物，如钪( i i i ) 、钇( i i i ) 、铝( i i i ) 、镧( i i i ) 、铍( i i i ) - 一8 羟基喹啉的一些配合物 5 1 巧6 1 、铽( i i i ) 邻菲咯啉配合物【5 7 1 、钌( i i i ) 一 联吡啶配合物 5 9 - 6 1 】等。此外，其它配体，如二乙三氨五乙酸、4 ， 7 二氯磺基苯一l ，l o 邻菲咯啉一2 ，9 二羧酸( b c p d a ) 等与铖( i t i l 和铕( i i i ) 的配合物也有报道【6 们j ，它们可以探测d n a 的左右手螺 旋结构【删、应用于d n a 的含量测定 6 纠等。 3 共振光散射光谱法( r l s ) 1 9 9 3 年，p a s t e r m a r k 等【6 6 】使用普通荧光分光光度计，建立了 共振光散射技术，研究了卟啉分子的聚集。自李克安和黄承志等 将共振光散射法应用于核酸的定量测定以来，共振光谱散射法成 为继分光光度法、荧光法之后又一新的高灵敏度的核酸测定方法。 曾金群：d n as 有撬试鹚的共振先散射光港研究与应豫 共振光散射光谱法( r l s ) 是一种分子散射光谱法，它是指 当光子与分子发生相互作用时，光子与分子之问发生弹性碰撞且 没有能量的交换，作用的结果只使光子的运动方向发生改变但散 射前后波长相等( 即入。：又。) ，散射光强度与散射颗粒尺寸、溶 液浓度、溶液折射率的波动值以及入射波长等因素有关【6 6 再7 1 且与 波长倒数的四次方成正比。在一定的实验条件f ，r l s 强度测物 的浓度成【e 比，这是r l s 定量分析的基础。 自1 9 9 3 年以来，p a s t e m a c k 等使用普通荧光分光光度计建立 了共振光散射技术以来，除利用离子缔合反应产生强的r l s 信号 外，还用于痕量金属的测定，如汞( i i ) e 6 8 、铬( t i i ) 6 9 1 、铝( i v ) 7 0 , 7 1 、非金属( 硒( ) ) 【7 2 1 、和某些有机化合物以及药物的测定 外，主要用于生物大分子的测定。测定的原理是基于有机染料或 其它带电荷的小分子在生物大分子表面上进行堆积，导致强烈的 共振光散射强度增强，信号增强值与生物大分子的浓度呈现出良 好的线性关系。基于此建立了许多灵敏的测定生物大分子的新方 法 10 , 7 3 - 9 1 】，目前用于共振光散射法测定d n a 的试剂主要有以f 几 种：卟啉类化合物，如r u e s 一四( 对氨基苯基) 卟啉( t a p p ) p 引、 f l i e s 一四( 对羟基苯基) 卟啉( t h p p ) 【7 4 】等；金属配合物，如钴 ( i i ) 钴试剂【7 5 】等：金属离子，如铝( i i i ) 7 6 1 ；有机小分子，如 耐尔蓝【7 7 】、藏红t 【7 8 1 、酚藏花红【7 9 1 、中性红【8 0 】、乙基紫刚、罗丹 明b 1 82 1 、溴苯三酚红【8 3 】、亚甲蓝【8 4 】、吖啶红【8 5 】、詹母斯绿b 8 6 、 亮绿、罗丹明6 g 3 1 、灿烂甲酚蓝【8 7 】、结晶紫 8 8 】、小檗碱【8 9 】、玫 苯胺9 0 1 等。 近年来西南师范大学的刘绍璞和黄承志等在这方面做了很多 工作，如刘绍璞等研究了各种表面活性剂与d n a 的相互作用咿引， 对表面活性剂对环境的污染及致病机理进行了有益的探索；黄承 志则致力于提高共振光散射法的灵敏度，他通过对普通荧光分光 光度计的改造建立了液相界面共振光散射技术 9 9 旧日，从而使d n a 测定的灵敏度和抗干扰能力大大提高。 本研究工作则是在已有的研究阳离子型核酸探针实验成果的 萤金撵：d n a 与泰机试裁的共振党散钌l 慧谱磷究s 晦融 基础上，进一步致力将阴离子型有机小分子作为核酸探针的研究。 研究表明，引入阳离子表面活性剂c t m a b 作为桥连剂，可以使 体系的r l s 信号大大增强。这一研究使阴离子型有机小分子在核 酸测定中有了新的应用，同时也可为测定核酸和其它生物大分子 如多糖、蛋白质等的新方法提供了更广阔的选择范围。 总之，d n a 的研究领域非常广泛，在这些研究中，有机小分 子与d n a 作用的机理研究是其研究的重点之一，而d n a 的定量 测定是研究d n a 的基础。结合本实验室的条件，作者以共振光 散射光潜法对d n a 与有机试剂的作用机理进行了较深入的研究。 研究了d n a 与有机小分子之间的相互作用前后的共振光散射光 谱特征，根据共振光散射光谱信号的改变值与d n a 的浓度呈正 比的特点，建立r 四种测定d n a 的新方法，并对其作用机理进 行了初步的探讨。这些方法具有快速、灵敏等特点，能很好地应 用于d n a 含量的测定。本研究工作得到了湖南省自然科学基金 项目( 0 0 j j y 2 0 8 4 ) 和湖南省教育厅项目( 0 3 c 6 1 1 ) 的资助，在此 表示谢意。 鬯金祥：d n as 舂机试钠的共振光散射光谱研究s 赢瑚 第一章甲基绿共振光散射法测定d n a 甲基绿( m e t h y lg r e e n ，d o u b l eg r e e ns f ) 又称为r 。m “- ) r ，它以两 种形式存在，结构式如下： 盯m 邮o c p b 沁n ( c 1 1 3 ) 。2 ，1 长。麓 ac 2 6 h 3 3 c 1 2 n 3 = 4 5 8 - 4 9 bc2 7 h a 5 b r c i np 5 1 69 5 a 型为绿色结晶，带金黄色光泽或浅绿色粉末，溶于水，溶 液呈蓝色，微溶于醇，不溶于醚。b 型是绿色粉未，溶于水呈绿 蓝色。它们主要用于印染织物及生物体染色。本章研究了a 型的 甲基绿与脱氧核糖核酸在碱性条件下的共振光散射特征，考察了 影响因素和最佳反应条件，研究表明在p h = 1 0 0 的三羟甲基氨基 甲烷盐酸( t r i s h c l ) 缓冲溶液中，甲基绿与d n a 的作用导致 r l s 增强，且r l s 增强值与d n a 浓度成良好的线性关系，据此 建立了一种测定d n a 的新方法。 第一节实验部分 1 1 仪器和试剂 r f 5 3 0 1 p c 型荧光分光光度计( 日本岛津公司) ：u v - 2 6 5 型 紫外分光光度计( 日本岛津公司) ；p h s 3 c 型酸度计( 上海雷磁 仪器厂) 。 d n a ( f i s h s p e r md n a ，生化试剂，上海长阳制药厂) 溶液： 将一定量的鱼精脱氧核糖核酸于0 - 4 0 c 下缓慢溶于去离子水中， 并于低温保存，操作液浓度为2 5 m g l ； 甲基绿溶液：称取0 4 5 8 5 9 甲基绿( 北京化工厂，分析纯) ， 配制成浓度为1 0 x1 0 。m o l l 的操作液，于避光处保存待用； 缓冲溶液( p h = 1 0 0 ) ：含0 1 m o l l 三羟甲基氨基甲烷( t f i s ) ， 以1 t o o l l h c i 调节配成。 管金祥：d n as 舂机试翻的共摄光散射光谱研究s 应翔 所用水均为二次去离子水，其余试剂为分析纯。 1 2 实验方法 在2 5 m l 比色管中依次加入一定量的标准d n a 溶液和 2 0 m l t r i s h c l 缓冲溶液，轻摇，使之混合均匀；然后加入o 7 5 m l 甲基绿溶液，用二次去离子水稀释至刻度后摇匀，避光静置 1 5 r a i n 。将溶液于凡。= 入。处进行同步扫描，可得共振光散射光 谱，于最大共振光散射峰( 3 3 9 n m ) 处测量共振光散射r l s 强度 i 值，激发和发射狭缝宽度均为3 0 n m ；不加d n a ，按上叙步骤 做空白，读取r l s 强度i o 值。令i = i i o ，以i 作为测定d n a 的 信号响应值。实验均在2 0 2 5 下进行。 第二节结果与讨论 2 1 甲基绿d n a 光谱特征 按实验方法测得甲基绿d n a 体系的共振光散射( r l s ) 光谱 如图1 所示。由图l 可以看出，甲基绿本身的r l s 信号很微弱。 甲基绿在2 9 2 n m 、3 3 9 n m 、3 8 9 n m 、4 6 8 n m 、5 3 4 n m 附近均有略强 的共振光散射信号，而随着d n a 的加入，3 3 9 n m 、3 8 9 n m 、4 6 8 n m 、 5 3 4 n m 处的共振光散射强度都有较大的增加，但散射峰的峰形基 本无变化。与甲基绿本身的r l s 信号相比，3 3 9 n m 处r l s 信号 增强程度最大且峰形良好，故本实验选择3 3 9 n m 作为测量波长。 由图2 的吸收光谱可知，随着d n a 浓度的增大，甲基绿d n a 体系在6 1 7 8 r i m 处的吸收开始下降，不同浓度时甲基绿的吸收光 谱峰形无明显变化，且一直遵循朗伯比尔定律。故可认为在实验 测定的条件下，甲基绿本身不存在聚集 9 1 - 9 2 1 。文献 9 1 - 9 2 1 表明，本 身不能自聚的小分子与生物大分子反应时也能产生增强的共振光 散射信号，即在d n a 表面上发生堆积。 曾金掉：d n as 香规试劫的共振光散射光谱研究s 斑瑚 了人：”二一i ”。； ，l j l i j 、 l 图lm g d n a 体系共振散射光谱图 图2m g d n a 体系吸收光谱 f i g 1 r e s o n a n c e l i g h ts c a 仉e r i n g f i g 2 a b s o r p t i o n 5 p 。t 。8 o f m 。1 1 1 y l s p e c t r ao fm e t h y lg r e e n d n a ( m g g r e e n - d n as y 8 t 8 m d n a 、s v s t e m p h = 1 0 0 ，cq 1 董球= 3 。1 0 q m o l 几；c d n a ：1 、 p h ：1 0 ，0 ；c d n a = 5 0 0 口g l ；c _ 女镕o o ；2 、2 ：3 、4 ：4 、8 ：5 、2 0 ：6 、 ：3 1 0 5 m