（微生物学专业论文）药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究.pdf

贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 中文摘要 内生真菌是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起 明显病害症状的真菌。近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物， 对相应的内生真菌及其代谢产物的研究已经成为寻找药物来源的一种新途经 本文以名贵药用植物石斛( d e n d r o b i u ms w ) 为实验材料，从8 种石斛的根、茎、 叶中分离得到9 2 株内生真菌，经过筛选，在流苏石斛茎、长苏石斛叶中得到两株炭角菌， 分别编号为l s j i 和c s y i ，并诱导两株菌产生有性繁殖结构；采用形态学和分子生物学结 合的方法对其进行鉴定，鉴定结果显示两株菌均为x y l a r i av e n o # u l a ；并测定了这两株菌的 发酵终点、胞内及胞外多糖含量、胞内及胞外水溶性蛋白含量、抑菌活性等 b 一谷甾醇是流苏石斛的重要活性成分，对1 2 株流苏石斛内生真菌进行p d 液体发酵 培养，采用高效液相色谱( h p l c ) 法从其中三株菌( l s j l 、l s j 5 、l s y 4 ) 的菌丝体中检测出b 一谷甾醇，含量依次为：7 9 4 u g g ，0 2 7 4 u g g ，1 1 5 1 u g g ；采用形态学和分子生物学结合的 方法对这三株菌进行鉴定，鉴定结果显示l s ji 为：x y l a r j av e n o s u l a ，l s j 5 属于y a l s a c e a e ， l s y 4 为：c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s 对多年生( 金钗) 石斛总d n a 的提取方法进行了优化，改进了提取液配方，提高了c t a b 的浓度( 2 5 ) 和n a c i 浓度( 1 4 t o o l l 1 ) ，并在酚氯仿抽提后的水相中加入0 5 倍体积的高浓 度n a c l ( s m o l l ) 除多糖，然后再加2 体积的无水乙醇沉淀d n a ，收到较好效果 关键词：石斛，内生真菌，炭角菌，活性成分，b 一谷甾醇，高效液相色谱 贵州史学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 a b s t r a c t e n d o p h y t e sr e f e r rt of u n g ic o l o n i z i n gh e a l t h yp l a n tt i s s u e sw i t h o u tc a u s i n gs y m p t o mo r a p p 玳n ti n j u r yt ot h eh o s t r e a s e a r c hr e s u l t si nr e c e n ty e a r ss h o wt h a te n d o p h y t i cf u n g i 伽 p r o d u c es o m es i m i l a rp h y s i o l o g i c a la c t i v ep r o d u c t st ot h eh o s tp l a n t s os t u d i e so nt h ee n d o p h y t i c f u n g ia n dt h e i rm e t a b o l i t e sh a v eb e e nan e ww a yt of i n dm e d i c a lr e s o u r c e s i nt h i sp a p e r , d e n d r o b i u ms w ，ac h i n e s ev a l u a b l em e d i c i n a lp l a n t , w a ss e l e c t e da sm a t e r i a l t o t a l l y9 2e n d o p h y t i cf u n g ih a sb e e ni s o l a t e df r o mr o o t , s t e m ，l e a fo f8s p e c i e sd e n d r o b i u m a t w o s t r a i n so fx y l a r i af r o mt h es t e mo fd e n d r o b i u m f i m b i r a t u ma n dt h el e a fb l a d eo fd e n d r o b i u m b r y m e r i a n u mw e r er e s p e c t i v e l yi s o l a t e da n dn u m b e r e da sl s j ia n dc s y l ，a n di n d u c et h e mt o g e n e r a t ef r u i t i n gb o d y 1 1 1 e yw e r ei d e n t i f i e dw i t hm o r p h o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d t h e r e s u l t sr e v e a l e dt h a tl s j1a n dc s y lw e r ex y l a r i av e n o s u l a t h er e s e a r c ha l s od e t e r m i n e dt h e i r f e r m e n t a t i o ne n d - p o i n t , t h e i rc o n t e n t so fp o l y s a c c h a r i d ea n dw a t e r - s o l u b l ep r o t e i n ，a sw e l la st h e a c t i v i t yo f a n t i - b a c t e r i a 1 3 - s i t o s t e r o li so n eo fi m p o r t a n ta c t i v ec o n s t i t u t o n t so fd e n d r o b i u mf i m b i r a t u m 12 e n d o p h y t i cf u n g io f d e n d r o b i u mw e r ef e r m e n t a t c do np dl i q u i dm e d i u m t h eh i g h l yp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w a se m p l o y e dt od e t e r m i n et h ev a l u eo fp - s i t o s t e r o lo fl s j1 ， l s j 5 ，l s y 4 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h em y c e l i u mo ft h e3s t r a i n sc o n t a i n1 3 一s i t o s t e r 0 1 t h e c o n t e n ti s7 9 4 u g g , 0 2 7 4 u g g , ii 51u g gr e s p e c t i v e l y 1 l l e yw e r ei d e n t i f i e dw i t hm o r p h o l o g ya n d m o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tl s j 1w a sx y l a r i av e n o s u l a , l s j 5w a s v a l s a c e a e , l s y 4w a sc o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s t h i sp a p e ro p t i m i z e dt h em e t h o df o rt h et o t a ld n ai s o l a t i o no fp e r e n n i a ld e n d r o b i u m s p e c i e s u p g r a d i n gf i l l i n go fe x t r a c ta n di m p r o v i n gc o n c e n t r a t i o no fc t a b ( 2 5 ) a n dn a c i ( i 4 m o l l - 1 ) 0 5 vn a c l ( 5 m o l l ) w a sa d d e dt ow a t e rp h a s ea f t e re x t r a c t e db yc h l o r o f o r m i s o a m y l a l c o h o lt or e m o v ep o l y s a c c h a r i d e a n da d d i n g2 va n h y d r o u se t h a n o la g a i nt op r e c i p i t a t ed n a ， t h er e s u l tw a ss a t i s f a c t o r y k e y w o r d s ：d e n d r o s i u ms w ，e n d o p h y t i cf u n g i ，x y l a r i a , a c t i v ee o n s t i t u t e n t , 1 3 - s i t o s t e r o i ，h p l c 2 - l t 种! 太学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，。本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：主查缝焦 日 期：至q q 翌生月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权贵州大学- j - 以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：狴垒整导师签名：e l 期：至q q 眭旦 贵州太学2 0 0 8 屈硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 第一章前言 1 内生真菌研究概况 植物内生菌( e n d o p h y t e ) 包括真菌、细菌、卵菌和放线菌( 黄宝康，2 0 0 6 ) 。现在普遍接受 内生菌的定义是p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 对c a r r o l l 的概念范畴进一步的扩展，指生活在植物组织内或生 活史中的某一段生活在植物组织内，不引起植物组织明显侵染及症状改变的一类菌，包括那 些生活史中某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原茵( l a t e n t p a t h o g e n s ) 和菌根菌。一般研究中所涉及到的内生菌都是指内生真菌。 对于内生真菌的研究已有一百多年的历史，但是直到二十世纪八十年代初才被重视起 来，且大多数研究工作集中在一些具有重要经济价值的植物。从八十年代后期开始，人们开 始研究内生真菌对植物影响的生理生化机制和内生真菌代谢活性物质的开发应用1 9 9 3 年， 美国科学家a s t i e r l e 从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉 t a x o m y c e sa n d r e a n a e ( s t i e r l ea ，1 9 9 3 ) ，从此掀起了人们对植物内生真菌及其活性物质开发 的热潮。从植物内生真菌中筛选获得的各种生理活性物质产生菌陆续见有报道。近年来，分 子生物学和基因工程技术也应用到内生真菌分类和进化的研究中 1 1 药用植物的内生真菌 药用植物是具有特殊的化学成分及生理功能，对人体疾患及动物病害具有保健、治疗作 用，或者在农业生产中，具有杀虫、杀菌、除草等功效的各类植物的总称，比中草药的概念 更为广泛药用植物是目前筛选天然活性成分的重要原料，但直接大量的从植物中提取有效 成分会破坏生态系统，而且植物生长周期长，不利于持续性大量获得目标产物。按照协同演 化( c o - e v o l u t i o n ) 的理论，宿主植物与其内生真菌长期共生，相互影响，内生真菌在进演过程 中发生了基因重组，获得了宿主植物的某些基因，能够产生与宿主植物相同或相似的活性代 谢产物( b a s h y a lb ，1 9 9 9 ) 迄今从内生真菌中得到的生物活性物质有5 1 是前所米知的这 比起从土壤微生物中得到的3 8 的活性物质是多之又多的。 目前，关于药用植物资源保护的研究中，药用植物的内生真菌已经成为药朋植物资源研 究的一个新热点药用植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，其次级代谢中产 生的生物活性物质具有很好的开发利用价值，而且某些药用植物内生真菌具备合成宿主某些 代谢产物的能力，说明利用药用植物内生真菌开发新药源具有极大的可能性 3 贵州史学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 近十多年来，人们从4 7 科8 l 属1 1 4 种3 变种药用植物中分离到的内生真菌达到1 7 1 属，涉及 到子囊菌、担子菌、接合菌、卵菌、有丝分裂孢子真菌( m i t os p o r i cf u n g i ) 及其无孢菌类( m y c e l i a s t e r i l e ) 等真菌类群，其中子囊菌4 0 属、担子菌3 属、接合菌3 属、卵菌3 属；其余i 2 2 属为有丝 分裂孢子真菌，包括丝孢菌( h y p h o m y c e t e s ) 8 2 属、腔孢菌( c o e l o m y c e t e s ) 3 2 属和其它类群 ( s t r o m a t i c 和s c l e r o t i a l ) 8 属，具有丰富的物种多样性( 孙剑秋，2 0 0 6 ) 已有的研究表明，不同 种类的植物中内生真菌的种类和数量不同。内生真菌的生物多样性决定了其代谢物质的多 样性研究表明从植物中分离出的内生真菌能代谢多种活性物质，其中一些是新物质，具有特 殊生物活性( 李能章，2 0 0 4 ) 1 2 药用真菌 表1 - 1 部分有开发前景的药用真菌 t a b l e l 一1 s o m ev a l u a b l em e d i c a t i v ef u n g if o re x p l o i t a t i o n 4 贵研史学2 0 0 8 屈硕士研究生学位论文 药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 据统计，全世界共有菌类2 5 万种( 不包括内生菌) ，中国已报道的食用菌近1 0 0 0 种，人 工栽培种类近7 0 种，有药用价值的真菌有3 0 0 多种，而迄今真正作为药物使用的只有2 0 3 0 种，是大型真菌种类中的极少部分。部分有代表性的药用真菌如表l l 所示( 黄年来2 0 0 5 ) 1 2 1 炭角菌的药用价值 在部分较重要的2 3 种药用菌中，乌灵参属于炭角菌的一种炭角菌属( x y l a r i ah i l le x g r e v ) 原中文名鹿角菌属，模式种是木内炭角菌( x h y p o x y l a ) ，属于子囊菌亚门( a s c o m y c o t i n a ) ， 炭角菌e l ( x y l a r i a l e s ) ，炭角菌科( x y l a r i a c e a e ) 这是一个大属，分布很广，世界各地均有发 现。邓叔群( 1 9 6 3 ) 在中国的真菌中描述了5 2 个种近年来国外对此类菌研究较多 j d r o g e r s ( 1 9 8 6 ) 对美洲大陆，b r e n d ae c o l l o n 等( 1 9 8 8 ) 对欧洲大陆，f e l i p es a n m a r t i n g o n z a l e z 等( 1 9 9 0 ) 对墨西哥等地的炭角菌进行了采集、鉴定和分类，发表了许多新种记录 炭角菌大多生于腐木或木材上，其成熟子囊果的大小、形状、子囊、子囊孢子的结构和自然 生态特性为分类的主要依据。 部分炭角菌具有很高的药用价值，其中关于黑柄炭角菌的研究报道最多黑柄炭角菌 ( x y l a r i an i g r i p e s ) ，其茵核是一种名贵的中药，称为乌灵参，鸡枞蛋，属子囊茵纲，是一传 统的药用真菌( 徐锦堂，1 9 9 7 ) 据四川中药志记载，乌苓( 灵) 参具有补气、固肾、健脾除 湿、镇静安神功效，属滋补性药用真菌。陈宛如等( 1 9 9 4 ) 曾对黑柄炭角菌的化学组成进行了分 析，对腺营、多糖、y 一氨基丁酸、维生素b 6 、甘露醇等一批活性物质进行了定性或定量 的测定；马志章等( 1 9 8 9 ) 就黑柄炭角菌及其多糖对贫血大鼠造血功能和小鼠巨噬细胞功能的 影响进行了免疫活性测定，从而对它的保健机理有了初步的了解；吴根福( 2 0 0 1 ) 利用 d p p h ( 1 ，l 一二苯一2 一苦胼基) 对黑柄炭角菌深层发酵制品中t l 由基的捕捉成分进行了分离 筛选。 由于其生长环境特殊，采掘困难，自然资源极为稀少，1 9 9 2 年杭州大学生物系陈宛如采 用液体发酵技术和杭州享达生物技术公司开发成营养食品，1 9 9 4 年又研制成保健药品“护龄 神胶囊一，乌灵参菌体含蛋白质3 0 5 ，构成蛋白质的2 0 种氨基酸在发酵菌丝体中就含1 7 种， 而其中有7 种必需的氨基酸占氨基酸总量的3 9 i ，半必需的氨基酸占总量7 2 ，人体必需 1 8 种矿物元素，在发酵菌丝体中含1 6 种，发酵菌丝体粗多糖的含量高达1 2 o ，含纯多糖为 3 o ，其多糖主要由甘露醇、葡萄糖、果糖、鼠李糖和乳糖构成的，深层发酵培养的菌丝 体，其多糖、氨基酸、微量元素、维生索，特别是必需氨基酸含量皆超过天然的乌灵参。乌 灵参菌丝体及其提取的粗多糖具有如下的药理功能：增强细胞免疫功能；对神经系统有保护 作用；对贫血动物有提高造血功能的作用，临床应用证明，乌灵参胶囊具有调节内分泌，平 5 贵州史学2 0 0 8 屈硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 衡、增强免疫功能和造血功能，特别对因性激素的变化引起的内分泌失调，出现的各种不适 症状都有扶正固本作用( 如更年期综合症等) 。 黑柄炭角菌的近似种也相继被发现有较高药用价值，如丛生炭角菌( x y l a r i ab i p i n d e n s i s ) 、 果生炭角菌( x y l a r i a c a r p o p h i t a ) 、鹿角炭角菌( x y l a r i a h y p o x g l o n ) ( 文庆洪，2 0 0 4 ) 、多型炭角菌 ( x y l a r i a p o l y m o r p h a x 箩p 晓岚，1 9 9 8 ) 等，但也有些种类为病原菌，如：叉状炭角菌( x y l a r i a f u r c a t af r ) ，其孢子可侵染食用菌一鸡腿蘑，导致其严重减产，甚至绝收( 熊鹰，1 9 9 8 ) 。 由于绝大部分有药用价值的炭角菌资源稀少，生境特殊，采集与分离困难，对其的研究报道 比较少 1 2 2 与药用植物共生的炭角菌的研究意义 炭角菌的药用活性成分主要为多糖类和蛋白质类物质( 陈宛如，1 9 9 0 ) 炭角菌是一种分 布较广的内生真菌，在苔类、被子植物、昆虫的巢穴甚至粪堆中均有发现( e c h r i s t i n ed a v i s ， 2 0 0 3 ) ，在与其共生的植物中有许多属于药刚植物，如竹类( 周德群，2 0 0 0 ) ，石斛( 张延威， 2 0 0 4 ) ，红树( 罗景慧，2 0 0 4 ) ，喜树( 刘蕴哲，2 0 0 5 ) 等。众多研究表明，内生真菌能产生与 其宿主植物相同或相似的生理活性物质( s t i e r l ea ，1 9 9 3 ) ，因此内生炭角菌不仅含有本身的 活性成分，还有可能产生与宿主植物相同的活性成分，所以药用植物内生炭角菌可能会有较 高的药用价值，有必要对其进行分离鉴定及活性成分的检测 2 石斛及其内生真菌 石斛属( d e n d r o b i u ms w ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 植物中的第二大属，全世界约有1 5 0 0 1 6 0 0 种，广泛分布于亚洲、欧洲和大洋洲等地，我国有7 4 种2 变种，分布于秦岭以南诸地区， 尤其以云南南部为多。石斛药材是石斛属多种植物的新鲜或干燥茎的统称，为传统名贵中药， 早在神农本草经中就有记载，在民间亦有。九大仙草之首”的称誉在本草纲目中 被列为上品，味甘，微寒，无毒，入胃、肾经，具有滋阴清热、生泮益胃、润肺止咳、明目 强身、镇痛消炎等功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、 扩张血管及抗血小板凝集等作用中华人民共和国药典( 2 0 0 0 版) 收载的石斛有铁皮石斛 ( d e n d r o b i u mc a n d i d u mw a l l e tl i n d l ) ，金钗石斛( d n o b i l el i n d l ) ，流苏石斛( d f i m b r i a t u m h o o k ) ( 或称马鞭石斛) ，黄草石斛c d - c h r y s a n t l a r mw a l l 或称束花石斛) ，环草石斛( 及 l o d d i g e s i ir o l f e ) ( 或称粉花石斛) 另外，石斛属植物约有四分之一可供观赏，称为石斛兰 ( d e n d r o b i u mo r c h i d s ) ，以花朵艳丽而著称。由于石斛自然分布较少，生长缓慢，繁殖率低， 以及过度的采伐利用，其野生资源已严重破坏，我国已将其部分品种列为濒于绝灭的受保护 的中药品种。 6 - l t 捌l 史学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 2 1 石斛内生真菌的研究概况 石斛在它的生活史中与内生真菌的关系非常密切，其种子萌发和植株的生长发育都需依 赖与之共生的内生真菌。对石斛内生真菌的分离主要集中于用石斛的根来分离与其共生的 菌根真菌( m y c o r r h i z a ) ，而且一般是在分离、研究兰科植物的内生真菌时，作为多种兰科植 物之一来进行的，专门系统地进行石斛内生真菌的分离鉴定很少。到目前已分离鉴定出的石 斛内生真菌( 主要是菌根真菌) ，主要属于担子菌亚门( b a s i d i o m y c o t i n a ) j f l l 半知菌皿门 ( d e u t e r o m y c o t i n a ) 两个亚门的1 7 个属( 郭顺星等，2 0 0 0 ) 。 对分离出的内生真菌的研究多集中于对石斛、天麻等某些兰科植物种子的萌发的促进作 用和幼苗的促生作用方向上( 郭顺星等，1 9 9 0 ) 。通过用这些内生真菌感染的培养材料去拌翻 石斛等种子或培养幼苗来确定这些内生真菌对种子的促萌发作用或促生长作用，并在人工栽 培天麻等兰科植物上得到应用。 此外，少部分研究主要集中在内生真菌的代谢产物、药理活性和化学成分等方面。如从 密花石斛c d d e n s i f l o r u m ) 根部分离得到一镰孢属菌株，经液体培养，在其菌丝抽提液和菌培 养液中明显检测到赤霉素( 吴静萍，1 9 9 4 ) ，但未有进一步研究的资料对石斛内生真菌药理 活性和化学成分研究比较多的，目前只有石斛小菇( m y c e n ad e n d r o b i if a ne tg u 0 ) 一种。石肼 小菇是野生铁皮石斛的菌根真菌，为一新种经液体发酵，进行了初步的药理活性测定( 王 春兰，2 0 00 ，发现其发酵液对小鼠中枢神经系统有兴奋作用，其菌丝体和发酵液的祖提物 具有与中药石斛相似的镇痛作用对石斛小菇的化学成分研究中，利用柱色谱法从中分离出 9 个化合物，并根据理化性质和光谱技术，对其中的7 个化合物进行了结构鉴定，分别为d 一 甘露醇、尿嘧啶、黄嘌呤、5 一羟甲基糠醛、狼毒甲索、正三十一烷和尿素，这7 个化合物中 除d 一甘露醇外，均系首次从小菇属真菌中分离出( 郭顺星，2 0 0 0 ) 。对石斛小菇菌丝体的甲 醇提取物，用硅胶柱色谱分离，得到了两种甾醇类化合物( 陈晓梅，2 0 0 0 ) ，用现代波谱学方 法进行结构鉴定，一种为1 3 一谷甾醇( 1 3 - - s i t o s t e r 0 1 ) ，另一种为一麦角甾烯氧化物( 已命名为 6 ，9 - - e p o x y e r g o s t a - - 7 ，2 2 一d i 铋一3 一o d ，此化合物为新化合物。 2 2 药用石斛的研究现状 包雪声等主编的中国药用石斛图志报道了中国石斛属植物有7 4 种2 变种，其中药 用石斛5 1 种几十年来，中外学者对多种石斛属植物的化学成分进行了研究，发现该属植 物所含的化学成分类型多样，除生物碱外，还有菲类、联苄类、芴酮类、倍半萜类、香豆索、 多糖、甾体及挥发油等。目前已作药用成分研究的石斛植物见表1 - 2 。 7 责州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 表l - 2 已作药用成分研究的石斛植物名录 t a b l e l * 2 l i s to f d e n d r o b u ms p e c i e ss t u d i e do nm e d i c i n a lc o n s t i t u e n t 2 21 重要石斛品种一流苏石斛化学成分的研究 流苏石斛( d e n d r o b i u mf i m b r i a t u mh o o k ) 为兰科石斛属植物，是中药石斛的主要来源之 一( 中国药典2 0 0 0 年版称为马鞭石斛d e n d r o b i u m f i m b r i a t u mh o o l v a t o c u l a t u mh o o k ) 国 外有关其化学成分的研究仅见肉桂酸酯和甾醇类化合物的报道，国内毕志明、李满飞等对其 研究相对较多，鉴定了流苏石解茎中的2 0 个成分，不同的提取流程可分离出不同的化学成 r 贵州史学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真茵的分离鉴定及活性成分初步研究 分： 乙醇提取：取流苏石斛干燥茎，切断粉碎，用9 5 e t o h 回流提取，减压回收e t o h 得浸膏， 加粗硅胶拌样，依次用石油醚、m e 2 c o 抽提，得石油醚浸膏和m e 2 c o 浸膏，经硅胶柱色谱 分离，分别用石油醚- - e t o a c 、石油醚一m e 2 c o 梯度洗脱，经反复分离纯化，得8 个化合物， 经波谱学方法分别鉴定为：流苏菲、毛兰菲、c r e p i d a t i n 、大黄索甲醚、大黄酸、泽兰内酯、 滨蒿内酯和n - o c t a c o s t y if e r u l a t e 其中，流苏菲为新化合物，大黄索甲醚和大黄酸为首次从 石斛属植物中分得，其余均为首次从该种植物中分得。 石油醚提取：流苏石斛干燥茎，切断打粉，用工业乙醇回流提取3 次，减压回收乙醇至干 得浸膏，加粗硅胶拌样，用石油醚抽提，得石油醚浸膏，经硅胶柱层析分离，石油醚一乙酸 乙酯梯度洗脱，经反复分离纯化。得到9 个化合物，鉴定出其中6 个，分别为大黄酚、三十 二烷酸、对羟基反式肉桂酸三十烷基酯、对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯、1 5 一谷甾醇和鼓槌 联苄且大黄酚为首次从石斛属植物中分得，鼓槌联苄为首次从该种植物中分离得到 丙酮提取：流苏石斛干燥茎，切断打粉，用9 5 乙醇回流提取，减压回收乙醇至干得浸 膏，加粗硅胶拌样，石油醚抽提后，再用丙酮抽提得浸膏，硅胶柱层析分离，石油醚一丙酮 梯度洗脱，经反复分离纯化，重结晶。得到6 个化合物，经波谱学方法鉴定，分别为大黄索、 芦荟大黄素、鼓槌石斛素、m o s c a t i l i n 、胡萝卜营和( 一) 一莽草酸。其中，大黄素和芦荟大黄 素为首次从石斛属植物中分得，其余均为首次从该种植物分得 李满飞等另分离得到豆甾醇类，薯蓣皂苷元，d e n f i g e n i n 等目前分离所得流苏石解的 药用成分见表l - 3 2 2 2 流苏石斛重要化学成分一p 一谷甾醇 甾醇因其呈固态又俗称固醇，如胆固醇、谷固醇等天然甾醇种类繁多，现已鉴别出的 有近1 6 0 种。分布很广，在各种生物体中几乎都有甾醇根据来源不同，可把甾醇分为植物 甾醇、动物甾醇和菌类甾醇三大类。植物甾醇主要有谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇，其他还包 括燕麦甾醇、菠菜甾醇、钝叶大戟甾醇、芦竹甾醇、环木菠萝烯醇和2 4 一亚甲基环_ 术菠萝醇 等动物甾醇主要有胆固醇菌类甾醇主要有麦角甾醇。近代研究表明，动物甾醇的主要代 表胆固醇在植物的根、茎、叶、花和种子中也普遍存在。同样，植物甾醇的主要代表谷甾醇， 在人类、动物、微生物、菌类的脂质中也广泛存在，甚至出现高比例。科学研究中，一般按 结构类型把甾醇分为4 一无甲基甾醇，4 一单甲基甾醇和4 ，4 一双甲基甾醇三大类。当今开发 应用的游离甾醇主要为无甲基甾醇，以谷甾醇为主，其中以p 一谷甾醇最为重要 9 贵州土学2 0 0 8 屈硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 表1 3 流苏石斛的药用成分及生理功能 t a b l e l - 3 t h em e d i c i n a lc o n s t i t u e n ta n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f t h ed f i m b r i a t u m b 一谷甾醇分子结构如下图所示： 鼻荐氆蓐 1 3 一谷甾醇分子的基本骨架( 甾核) 由三个六元环和一个五元环组成。c - - 3 位连有一个羟 基，c 1 7 位连有由7 个碳原子构成的侧链，c 一5 位为双键，谷甾醇的这种结构特点决定了 它的多方面的生理特性及其广泛用途。c 一3 位羟基是谷甾醇的重要活性基因，通过它谷甾 l o - t * q 大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 醇在自然界形成多种多样的衍生物工业上通过c 一3 位羟基，与环氧乙烷、环氧丙烷、环 氧乙烯等加成，生成多种表面活性各异的产品。c 一3 位羟基决定了谷甾醇的多方面表面活 性和生理活性功能。医药工业上通过微生物发酵，将c - - 1 7 位连有的侧链切断，制成重要的 甾体药物半合成的中间体。使谷甾醇成为当今甾体药物生产的重要原料。 b 一谷甾醇的药理作用及应用： 抗炎和退热： 谷甾醇对克服用角叉胶在鼠身上诱发的水肿和由棉籽粉移植引起的肉芽组织生成，表现 出强烈的抗炎作用口服也表现出类似的显著抗炎作用此外，谷甾醇的抗炎作用不受脑垂 体肾上腺系统制约，类似于羟基保泰松 谷甾醇具有类似阿斯匹林( 乙酰水杨酸) 的退热作用。临床应用的抗炎药物多具有致溃疡 性，应用时需十分小心如羟基保泰松使用剂量就与胃溃疡有关，在1 5 0 m g k gi p 剂量下， 8 0 的动物显示出胃溃疡。而谷甾醇服用量高至3 0 0 m g k gi p 也不会引起溃疡( 钟建华2 0 0 5 ) 。 因此，谷甾醇是一种抗炎和退热作用显著，应用安全的天然药物。 降胆固醇，防治高血压、冠心病作用： 人和动物体内本身不能合成植物甾醇，其均来自摄入的食物。植物甾醇的结构跟胆固醇 相似，在生物体内以和胆固醇同样的方式吸收。谷甾醇能阻碍胆固醇吸收，从而起到降低血 液中胆固醇含量的作用谷甾醇降胆固醇的作用机理是：i 抑制肠内对胆固醇的吸收i i 促 进胆固醇的异化i i i 在肝脏内抑制胆固醇的生物合成 谷甾醇对胆固醇的降低作用不仅表现在对游离态胆固醇，而且对胆固醇酯也显示出相同 的效果。游离型谷甾醇的脂肪酸酯亦显示降胆固醇作用，且谷甾醇酯与游离谷甾醇具有同等 程度的效果。临床研究表明谷甾醇能治疗高胆固醇、高甘油三酸酯血症，预防高脂血症发生， 从而降减动脉粥样硬化和冠心病等心血管病发病率。 皮肤健康和美容作用： 谷甾醇是一种w o 性的乳化剂，具有调节和控制反相膜流动性的能力，常被h j 作头发和 皮肤调节剂，皮肤再生细胞促进剂与头发生长促进剂，也可作为皮脂腺调节剂，抗老化因子， 伤口愈合剂和非离子乳化剂 由于谷甾醇有较强的生理活性和表面活性，以含谷甾醇的化妆品涂布于皮肤，可防止皮 肤干燥与硬化对已经硬化的皮肤可使其角质化较早地消失，并能恢复成柔软、润滑的皮肤。 用穿透型医学电子显微镜摄片表明；用含谷甾醇的化妆品涂布的足底部表皮组织与不含谷甾 醇的化妆品相比，细胞间的空胞现象明显减少，显示了谷甾醇对消除皮肤角质化的作j = i j 尤 l l 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石料内生真茵的分离鉴定及活性成分初步研究 其足、膝、肘和手掌等部位皮肤，使用谷甾醇化妆品后，其皮肤卫生保健与美容功效更为显 著 促进动物生长，增进健康作用： b 一谷甾醇和植物生长激素与能在水中形成分子膜的脂质结合，构成一种新型的动物生 长激素：植物激素一谷甾醇一核糖核蛋白这种含有谷甾醇的核糖核蛋白具有促进动物蛋白 质合成功能，有利于动物的生长与健康。将其添加到混合饲料中能显著促进家禽、鱼、蚕等 的生长速度和健康，并可降低禽、蛋等动物制品的胆甾醇含量 抗癌作用：i 临床治疗表明，谷甾醇栓剂对宫颈癌，皮肤癌症有显著效果 此外，尽一谷甾醇可以作为合成农业除草剂和杀虫剂原料，还可用于墨水、油漆、热塑 树脂的着色剂等，广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料、化工等行业 3 本文的研究内容，目的及意义 与植物相比，内生真菌具有生长周期短，易于人工驯化，易进行工业化生产，易诱变提 高有效产物的含量，发酵产物较植物成分单一，有效成分容易分离等优点从内生真菌中提 取单体代替以前的从植物中提取单体，有广阔的应用前景。可解决许多中药作为资源植物而 被大量采伐引起的资源和生态危机，对濒危药用植物的资源保护也起到了积极作朋。可见在 数量众多的中药中寻找能够产生与宿主具有相同和相似成分或具有相似药理作用成分的内 生真菌具有深远意义目前对内生真菌的研究仅有一百多年的历史，仍有广阔的研究空间 如果按照协同进化理论来选择研究内生真菌的宿主植物，我国的一万余种药刚植物，将是我 国学者研究内生真菌的宝贵资源库内生真菌在国内的研究才刚刚起步，所研究过的植物不 过数百种，相对于自然界的2 5 万种植物是微不足道的，这是一个极具发展潜力的研究领域。 对中药中的内生真菌进行系统研究，充分利用微生物和中药的优势将会使我们在中药资源保 护、中药材产量及中药有效成分含量的提高、中药农残问题的解决及新药开发等方面收益颇 丰，必将推动中药现代化的进程 内生真菌生活在植物体这一特殊的环境中，构成了植物体内的微生态系统，与宿主协同 进化，形成了互惠共生的关系它在吸收植物为自已提供的营养的同时，又对植物的生长发 育和系统演化起着重要作用石斛属内生高价值真菌( 炭角菌等) 是石斛微生物群落的重要成 员，与石斛之间存在密切的互利共生关系，在与宿主植物的协同演化过程中，除了本身特有 的化学成分外，可能还会产生与宿主相同的代谢产物 石斛为名贵中药，由于其自然分布较少，繁殖率低，以及过度的采集利用，其野生资源 已严重破坏，我国已将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之一。因此，如何合理利用和扩 1 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 大资源成为当前研究的焦点，而利用其内生真菌发酵开发药效相似的天然药物是一条可行的 新途径野生药用真菌( 炭角菌等) 由于生境特殊，数量稀少，极难采集，市场上供不应求， 如果通过分离纯化石斛内生药用真菌( 炭角菌等) 的方法进行人工培植，则极可能培育山既有 石斛药用化学成分，又兼有药用真菌( 炭角菌等) 活性成分的菌株，这将缓解对石斛植物资源 及药用真菌( 炭角菌等) 资源需求的压力，符合我国提出的经济可持续发展的战略要求。 因此本文主要对以下两部分内容进行研究： 对多种石斛进行内生真菌的分离纯化，利用形态学和分子生物学相结合的方法筛选出 石肼内生炭角菌，对分离出的炭角菌无性型进行诱导，以期产生有性繁殖结构，如子囊果、 子囊、子囊孢子等，并对其活性成分( 多糖，蛋白质等) 进行初步研究 利用高效液相的方法筛选含有流苏石斛活性成分( 1 3 一谷甾醇) 的内生真菌，并利心形 态学和分子生物学相结合的方法进行分类鉴定 研究石斛生态系中内生高价值真菌的物种多样性及其药化特性，对于人类认识共生体的 形态、结构及功能、行为和生活史等生物学本质，以及它们与人类生存环境的密切关系，科 学和有效地开发利用石斛和药用真菌资源具有十分重要的意义 1 3 贵州太学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究 第二章石斛内生炭角菌的分离鉴定及活性成分初步研究 1 材料 1 1 样品来源 分离所用石斛见表2 - 1 ，现均移栽至贵州大学南区苗圃，在采集后3 6 h 内进行分离，均 为新鲜材料 表2 - 1 分离用材料 t l b l e 2 1 m e t e r i a l s 1 2 仪器和试剂 1 2 1 用具 胶带，剪刀，镊子，解剖刀，纱布，滤纸，脱脂棉，三角瓶，9 或1 0 c m 培养皿，玻璃 棒，接种钩，接种环等 1 2 2 试剂 孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂 条，无菌水等 乳酸石炭酸棉蓝染色液：棉蓝( 苯胺蓝或甲基蓝) o 。0 2 5 9 ，乳酸( 比重1 2 0 ) 1 0 9 , 石炭酸( 结 晶) l o g ，甘油( 比重1 2 5 ) 2 0 9 ，蒸馏水1 0m l 消毒剂：7 0 y , 醇，0 1 升汞( h g c l 2 ) 1 2 3 主要设备 s a 1 4 8 0 2 水平层流沽净工作台 上海上净净化设备有限公司 p h s 3 c 糟密酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司 1 4 - t - * q 大学2 0 0 8 屈硕士研究生学位论文 药用石斛内生真茵的分离鉴定及活性成分初步研究 d h 5 0 0 0 a b 型电热恒温培养箱 m o t i c l3 0 0 光学显微镜 1 0 l 一2 a b 电热鼓风干燥箱 j a 2 0 0 3 电子天平 y x q s g 41 2 8 0 灭菌锅 j z - 1 0 0 - a 接种器具消毒器 1 3 培养基的配制 天津泰斯特仪器有限公司 厦门麦迪奥公司 天津泰斯特仪器有限公司 上海天平仪器厂 上海医用核子仪器厂 上海稼丰园艺1 = i j 品有限公司 马铃薯葡萄糖琼脂( p d a ) 培养基：称取去皮后马铃薯2 0 0 9 ，将其切成小块，加水煮沸 3 0 m i n ，八层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足至1 0 0 0 m l ，加葡萄糖2 0 9 ，琼脂18 9 灭菌条 件：1 2 1 c ，3 0 m i n ( 以下灭菌条件与此相同) 。 综合p d a 培养基：马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p o 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 01 5 9 ，维 生索b i 微量，p h 6 0 。 p d a r 培养基：灭菌p d a 培养基冷却至4 0 c 时添加微量链霉索( 4 0 u m l ) 和青霉素 o o u m l ) ，摇匀，倒板冷凝。 查氏固体培养基( c z a p e ka g a r ) ：n a n 0 32 9 ，k 2 h p 0 4l g ， k c l0 5 9 ，m 薛；0 40 5 9 ， f e s 0 4 0 o l g ，蔗糖3 0 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 m l p d 培养基：称取去皮后马铃薯2 0 0g ，将其切成小块，加水煮沸3 0m i n ，滤去马铃 薯块，将滤液补足至ll ，加葡萄糖2 0 9 液体培养基；葡萄糖2 ，蛋白胨l 营养肉汤培养基：蛋白胨l o g 、牛肉膏5 9 、n a c i5 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 、琼脂2 0 9 ，p h 7 2 - 7 4 2 方法 2 1 菌株的分离与筛选 2 l 1 内生真菌的分离 取新鲜石斛的根、茎、叶，经自来水冲洗干净后，7 0 的酒精消毒5 m i n ，无菌水冲洗4 次( 每次3m i n ) ，再用0 1 升汞消毒2m i n ，无菌水冲洗4 次( 每次3m i n ) ，将叶切成0 5c m x o 5 c m 大小；根每段l c m ；茎横切每段l