（生态学专业论文）荧光分析测试试剂的合成研究.pdf

摘要 胺类化合物主要来源于工业排放、蛋白质和氨基酸降解，该类化 合物对生物体有较大的危害，甚至会导致癌症。由于大部分胺类化合 物本身没有荧光，应用气象色谱对痕量的胺类化合物进行检测比较困 难；若用荧光检测方法进行分析，需要使用荧光衍生试剂对这些胺类 物质衍生化，或使用荧光检测试剂；若检测痕量手性胺类化合物则需 要使用手性荧光检测试剂。 近年来，化学工作者在荧光衍生试剂的合成工作方面大量的工 作，但是以吖啶环和蒽环为荧光母体的荧光衍生试剂报道得不是很 多，而关于手性碳原子衍生试剂的研究更是鲜有报道，本论文对这一 类型试剂的合成工作进行了相关研究探讨。 本论文以荧光衍生试剂的合成为目标，设计合成了几种分析测试 试剂。主要进行了以下工作：1 n 吖啶基甘氨酸和n 吖啶基天冬氨 酸的合成；2 n 蒽甲酰基甘氨酸乙酯和n 蒽甲酰基天冬氨酸乙酯的 合成。对这四种化学物经过拉曼光谱仪和核磁共振仪分析进行了结构 的确定，荧光光谱表明这些试剂具有良好的荧光性能。同时对合成路 线和反应条件的优化选择进行了研究探索。 关键词：荧光，荧光试剂，衍生试剂，吖啶，蒽 中央民族大学硕仁研究生论丈 a b s t r a c t t h es o b r c co fa m i n e ，w h i c hi sv e r yh a r m f u lt ot h eo r g a n i s m ，i st h e d i s c h a r g eo fi n d u s t r ya n dt h ed e c o m p o s i t i o no ft h ea m i n o - a c i d t h eg a s c h r o m a t o g r a p h yc a n td e t e c tt r a c ea m o u n to fa m i n eb e c a u s et h em o s to f a m i n e sa r en o tf l u o r e s c e n t t h ea m i n em u s tb ed e r i v e db yf l u o r e s c e n t r e a g e n ti nt h ef l u o r e s c e n td e t e c t i o n ，o nt h eo t h e rh a n d ，w em u s tu s ec h i r a l d e r i v a t i v er e a g e n ti nt h ed e t e c t i o no ft r a c ea m o u n to fc h i r a la m i n e c h e m i s t sh a v eh a v e d o n eav a s ta m o u n to fh a r dw o r ko ns y n t h e s i z i n g t h ef l u o r e s c e n tr e a g e n t si nr e c e n t l yy e a r s ，b u tt h er e s e a r c ho ff l u o r e s c e n t r e a g e n t sw i t hm a t r i xo fa c r i d i n eo ra n t h r a c e n ei sl i t t l ei n v o l v e da n dt h e r e p o r ta b o u tt h es t u d yo ff l u o r e s c e n tr e a g e n t sw i t hc h i r a lc a r b o na t o m s c a nh a r d l yb es e e n ，a n dt h i sa r t i c l ef o c u s e s0 1 1t h es y n t h e s i so ft h i st y p e o f r e a g e n t t h em a j o rw o r ko ft h i st h e s i si n c l u d e s ：t h es y n t h e s i so fn - a c r i d i n y l g l y c i n e ，n a c r i d i n y la s p a r t i ca c i d ，n - a n t h r a c a r b o n y lg l y c i n ee t h y le s t e r a n dn - a n t h r a c a r b o n y la s p a r t i ca c i de t h y le s t e r t h ec o n f i g u r a t i o nw e r e c o n f i r m e db yr a m a n - s p e c t r u ma n dn m r ，a n dt h ef l u o r e s c e n tp r o p e r t i e s o ft h er e a g e n t sw e r ea l s ot e s t e d m e a n w h i l e ，t h eo p t i m i z a t i o no fs y n t h e s i s r o u t e sa n dr e a c t i o nc o n d i t i o n si ss t u d i e d k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c e ，d e r i v a t i v e r e a g e n t ，s y n t h e s i s ，a c r i d i n e ， a n t h r a c e n e 2 中央民族大学硕b 研究生论文 第一章前言 荧光是一种常见的现象，利用这一现象可以进行荧光检测。由于荧光检测具 有高选择性和高灵敏度的特点，所以这一分析方法在化学检测中应用十分广泛。 近年来由于各种各样的荧光试剂的发展，使荧光分析检测的应用范围变得更为广 泛。因此有必要对荧光试剂及相关知识作一些介绍，本章依据目前有关荧光产生 的原理、荧光衍生试剂及荧光检测的文献，从荧光检测试剂发展简介、荧光检测 的基本理论等方面介绍荧光和荧光衍生试剂。 第一节荧光及荧光分析简介 荧光是指某些物质在经过紫外或可见光照射时发出的波长和强度各不相同 的光线，当停止照射时，这种光线马上或逐渐消失。而荧光检测正是运用了荧光 这一特殊的光现象，高灵敏度、高选择地检测待测物质。 荧光现象的发现已有四百多年的历史，自m o n a r d e s 于1 5 7 5 年从被称为 “l i g n u mn e p h r i t i c u m ”的切片水溶液发现荧光现象以来，荧光现象的解释一直 没有多大进展，直至1 8 5 2 年s t o k e s 在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观 察到其荧光波长比入射光的波长稍微长些，才判明这些物质在吸收光能后重新发 射出不同波长的光，从而引入荧光这一概念。自1 8 6 4 年s t o k e s 提出应用荧光作 为分析手段和1 9 2 8 年j e t t e 和w e s t 推出第一台光电荧光计之后，经过近一百年 的发展，特别是现代激光、微处理机和电子学等一些新兴科学技术的引入，大大 地推动了荧光分析法在理论方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测 定、时间分辨荧光测定、荧光免疫测定、低温荧光测定【1 l 和荧光光纤化学传感器 等荧光分析方面的一些新方法，同时新技术的发展，相应加速了各种新型荧光分 析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展， 方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工 业、农业、医药卫生、环境保护和科学研究的各个领域中，使荧光检测成为分析 化学中一种重要有效的痕量组分分析方法。 由于具有高灵敏度和高选择性，荧光分析法被广泛应用于化学、生物、医学 等多个领域【盈。比如在生物工程中，应用荧光法进行氨基酸的序列分析、碱基序 ! 叁垦塞盔兰堡墅塞竺堡壅 列的分析，又如b p e s p os i t o l 等人1 3 l 报道了一种检测金属的离子探针，其能灵 敏高效地检测生物体内的一些金属离子。在医学领域，利用荧光分析法进行病毒 的检测，如黄飚等人1 4 嘲用荧光试剂，采用分辨荧光分析法检测了乙肝e 抗原 h b e a g 荧光试剂分类依据很多，根据荧光产生的方式可把荧光试剂分为两类：一类 是荧光本源试剂，即本身具有荧光的试剂，如水杨基荧光酮和罗丹明b 等；另 一类是荧光生成试剂，这类试剂本身没有荧光，它们与被测物质反应生成具有荧 光的化合物。如邻苯二甲醛在碱和巯醇同时存在的条件下和氨基酸反应生成异吲 哚类具有荧光的化合物。 第二节荧光及荧光衍生试剂 上节主要简单介绍了荧光及其荧光分析发展简介，本节将阐述荧光产生的原 理、荧光量子效率及影响荧光量子效率的因素，同时介绍荧光衍生试剂的相关知 识 一、荧光产生的原理 每种物质分子中的电子都具有一系列紧密相隔的不同能级，称为电子能级， 电子处于不同能级中，且每个电子能级中又包含一系列的振动能级和转动能级。 ( 如图1 - 1 所示) 。 在图1 - 1 中，符号s o ，s l 和s 2 分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单 重态，t l 和t 2 ，则分别表示第一和第二电子激发三重态。当分子中的电子吸收 光子的能量后，发生各个能级之间的跃迁，处于激发态，当电子吸收能量跃迁到 s 1 能级，由于处于高能级的电子处于不稳定状态，当电子从s l 能级返回到s o 能 级时，这时多余的能量就以光的形式释放，产生的光就是荧光。根据物质吸收激 发光以后发射荧光的时间，把荧光分为瞬时荧光和滞后荧光。但是在分析化学上 普遍采用的是瞬时荧光，滞后荧光应用得相当少在荧光分析中，有两个重要的 概念，就是荧光激发光谱和发射光谱。一般用 怯表示荧光激发光谱，所谓激 发光谱就是当激发光谱连续变化时，表示某一波长荧光强度变化的曲线，测定激 发光谱时，把具有荧光的物质试液放于荧光光度计中，固定荧光发射波长和狭缝 宽度，扫描，得到的荧光激发波长和相应荧光强度的曲线。固定激发波长和狭缝 2 叁墨堕查兰夔主曼塞生堡兰 宽度，扫描，得到荧光发射波长和相应荧光强度的关系曲线，就是荧光发射光谱， 简称荧光光谱。一般用 c m 表示发射光谱，一般来说 c m e x ，两者之差称 为斯托克斯( s t o k e s ) 位移，这个值越大越有利于选择性，但有时在高温的稀薄 气体中可能发生相反的现象，这时的荧光称为反斯托克斯荧光。 盘 s ， o v ， 暑i 、，2 0 3 s ： v 娜 i lv r ： i 2 - 1 卜 p 警f ；。川 i 7 1 一 ， t l 1 图1 - 1 分子内的光物理过程 a i a 2 光吸收过程；e 荧光；p 嶙光；i c 内转化；i 蛾体系间窜跃；、能振动松驰 二、荧光量子效率 荧光量子产率也称作荧光效率，是物质的固有属性，理论上定义为荧光物质 吸收光后所发射的荧光光子数与吸收的激发光光子数之比，即： ，h 发射荧光光子数 吸收激发光光子数 在荧光检测中，有分析应用价值的荧光试剂或其他荧光物质的中f 应为0 1 以上中f 首先与试剂的分子结构相关，在荧光分析过程中，荧光物质的口f 也不 是固定数值，其还受介质、酸度、温度等环境因素的影响( 如表1 - 1 所示) 表1 1 一些常见荧光物质的荧光量子产牟嘲 化合物溶剂 a r i i m 。细中f 萘乙醇2 5 43 2 1o 1 2 己烷2 5 4 0 1 0 蒽乙醇 2 5 44 0 20 3 0 己烷3 6 5 4 0 0o 3 l 3 中央民族大学硕士研究生论文 荧光素n a o h 水溶液 3 6 64 2 50 9 7 曙红n a o h 水溶液3 6 6 4 0 4 0 1 9 罗丹明b乙醇5 3 55 6 8 0 9 7 叶绿素a乙醇 6 4 46 7 8o 2 3 叶绿素b乙醇 6 4 4 7 8 5 o 1 0 三、影响荧光强度的因素 ( 一) 分子结构与荧光量子效率的关系 1 共轭靠键体系 发生荧光的物质，其分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。荧光团 必须含有共轭双链( 键) 体系，共轭体系越大，离域“电子越易激发，荧光越易 产生，大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光波长越易向长波方 向移动，并且荧光强度往往随之增强。同一共轭体系的芳族化合物，线性环结构 的荧光波长比非线性者要长。但芳香环或共轭体系增加到一定程度时，只是荧光 发射波长向红移动，荧光量子产率不但没有增加，反而下降，这一现象涉及共轭 大玎键共平面及其刚性的影响( 如表1 - 2 所示) 。 表1 2 典型芳香烃化合物共轭结构及其荧光性能嘲 化合物 x a 刖h m由f介质 2 8 63 2 1o 2 9环己烷 0 湖 3 9 04 8 00 6 0环己烷 母 3 4 03 9 5 o 2 9环己烷 4 中央民族大学硕k 研究生论文 h 0 复幻 3 6 6 4 0 2o 8 7 环己烷 0 a 工妁 5 8 06 4 0o 5 2环己烷 2 刚性平面结构 对于具有强荧光的有机化合物和荧光试剂，仅有大的共轭体系还不够，分子 的共轭体系必须具备共平面性并且还要有一定程度的刚性。例如芴和联苯，前者 荧光效率接近1 ，而后者仅为0 2 ，这就是芴的分子中有了亚甲基的加入，使两 个苯环固定在一个平面上，不能发生扭曲或转动，其共平面性比联苯大，刚性增 强，导致荧光量子产率增大。 叙幻 芴联苯 3 取代基的影响 取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响，一般说来，有以下 规律： 1 、推电子取代基增强荧光，属于这类基团的有- n i t 2 、n h r 、一n r 2 、- o h 、 - 0 r 、c n 。 2 、吸电子取代基使荧光强度减弱，属于这类取代基的有c = o 、c o o h 、 - c h o 、- n 0 2 和- n = n - 基等。 3 、重原予的取代也使荧光减弱，重原子一般指的是卤素a 、b r 和l 。 4 、饱和烷烃对荧光体的荧光强度影响不大。 取代基对荧光体的激发和发射光谱以及荧光效率的影响规律和机理，是人们 甚为关注的领域，但是人们对激发态分子的性质了解还不是很充分，这些规律也 仅仅是来自一些实验经验的总结。而且有时也有特殊情况和这些总结的规律不相 符，比如说氰基是不饱和取代基，它应使取代的化合物荧光减弱，但实际结果是 表现为推电子的效果，使荧光增强。它的取代物如9 ，1 0 - - 氰基蒽的m f 不但大 于蒽，而且9 氯1 0 - 氰基葸的中f 也高达0 9 5 ，远大于9 氯代蒽的中f ( o 1 1 ) 1 7 1 。 另外，取代基数量及其所处位置也会影响荧光强度，比如说2 氨基蒽的荧光 ! 墨垦堕盔兰堡圭堑塞兰堡塞 量子产率是0 6 7 ，而1 氨基蒽在同样的溶剂中荧光量子产率则为0 6 1 。芳香环中 杂原子也是影响荧光强度的一个因素，比如喹啉的荧光量子产率比萘要高。有关 这方面的影响列于表1 3 中。 以上讨论的是影响荧光量子效率的内因，也可以说是决定荧光量子效率的主 要因素，但是外因对荧光量子效率的影响也是不可忽略的，因为在实验过程总是 在一定的环境条件下进行分析测试工作，把握外因的影响对于做好分析工作是很 有帮助的。 表1 - 3 不同取代基或是不同取代位置对荧光量子效率的影响 化合物 巾f 化合物 中f 渤毗 0 6 7 咖 0 6 l 渤 o 1 1 渤 0 0 1 0 8 0 4 6 o 2 1 o 3 0 渤 0 2 9 ( 二) 环境因素对荧光量子效率的影响 环境因素可对荧光产生较大的影响，了解和利用这一些重要因素，可以帮助 提高荧光分析的灵敏度和选择性。以下讨论了一些比较重要的影响荧光量子效率 的环境因素。 1 。溶剂的影响 同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的 差别。随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，结果，荧 光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移动。至于荧光强度随溶剂的变化的具体 规律，情况更为复杂，规律发生并不那么明显，有些作者认为，荧光强度一般随 着溶剂极性的增大而增强，但也有些相反的实验结果。e l l i o t t 掣8 】曾对某些醇类 及甲酰胺类溶剂与硼安息香配合物的荧光强度的关系进行过试验，认为溶剂对 于荧光强度的影响主要决定于溶剂的分子结构，而不在于溶剂的极性。 实际上，对于荧光量子产率随溶剂极性和氢键强度变化的本质，在很大程度 6 盎垦鉴盔堂堡主里塞兰堡塞 上还是一个谜，有些情况下只随溶剂的氢键能力而改变，有些情况下却只随溶剂 的极性而改变，但在另一些情况下却与溶剂的氢键能力及极性均有关系。另外， 溶剂的黏度也会影响荧光强度，黏度减小，可经增加分予之问碰撞机会，将消耗 掉部分能量，从而使荧光强度减弱，反之，使荧光强度增强，例如，在分析中恰 当地利用环糊精则会提高荧光效率。 2 温度的影响 温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随温度的降低，荧光物质 的量子产率和荧光强度将增大。这是由于温度升高后，待测物质分子运动速度加 快，有效碰撞增加，将消耗掉部分能量，从而降低了荧光效率；同时温度也会影 响溶液的黏度，进而影响荧光强度。一般来说，温度升高，黏度降低，有利于荧 光量子产率的提高，反之，则使荧光量子产率下降。 3 溶液p h 值的影响 如果待测物质的溶液p h 值发生改变，从而改变了待测物质的电离状态，这 样会影响待测物质的荧光强度。每一种物质都有其最适宜的发射荧光的存在形 式，即最适宜的p h 值范围。如苯胺在p h = 7 1 2 的范围内主要以分子形式存在， 由于氨基是提高荧光效率的取代基，所以苯胺分子会发出蓝色的荧光；但p h 不 在这一个范围内时，溶液中的苯胺以离子形式存在，故不显荧光。特别值得一提 的是溶液的p h 影响对于测试是特别重要的，故在很多的分析工作中，这是一个 要十分注意的问题。 4 散射光的影响 当一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于 光子与分子的碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光就是 散射光。这些散射光进入到发射出的荧光中，这将影响荧光强度的测量。 5 荧光熄灭产生的影响 当待测物质分子受到溶剂或是其它溶质分子的影响，发生分子有效碰撞增加 或是电子转移后，荧光强度降低的现象就是荧光熄灭，或说是荧光猝灭。比如说 钙黄绿素合腙与c a 生成稳定的具有强的黄绿荧光络合物，当加入二价铜或是二 价镍离子时，其荧光消失 总之，影响荧光强度的因素很多，它们都会影响到测定结果的准确度和精密 度，在实验的过程中，要充分考虑各种因素，从而得到最好的检测效果。有关这 一方面的知识，会在下一章节中得到进一步的阐述。 7 中央民族犬学硕卜研究生论文 四、有机荧光衍生试剂 ( 一) 衍生及荧光衍生试剂 一种物质在一定条件下不能被检测，通过一定的化学反应使之转化为能被检 测的物质，这一过程就是衍生。比如说要利用气相色谱检测有机酸类物质，由于 这类物质的极性很大，在气相色谱中不能气化，当然不能检测，但是当利用酯化 反应把待检测的酸转化成酯以后，这样极性降低，则可以利用气相色谱进行分析 检测。 荧光衍生试剂，顾名思义，则是通过衍生反应后，可以与待测物反应生成具 有荧光物质的有机试剂。这些试剂种类很多，从被检测的对象来分类有羧酸类、 胺类及氨基酸类、醇类、酚类等种类的衍生试剂。从产生荧光的方式有荧光本源 试剂和荧光生成试剂。荧光本源试剂就是本身就有荧光的衍生试剂，而荧光生成 试剂是试剂本身没有荧光，但是在和待检测物发生衍生反应后，产生具有荧光的 物质。 ( - - ) 荧光衍生检测 荧光衍生检测说通俗一点就是把非荧光化合物经过一定的反应转变为荧光 化合物，例如吩噻嗪类化合物通过氧化反应使之转变为荧光化合物进行荧光测定 i 引。也可经过一定的化学反应脱去分子中部分功能团后转变为发荧光的分子，此 外也可进行加热处理使非荧光物质转变为荧光物质，例如皮质醇( 氢化可的松) 【1 0 i 和毛地黄剖1 1 j 可分别在乙醇硫酸溶液和较浓的盐酸中加热使分子发生重排转变 为强荧光组分而被测定。 高效液相色谱中的分离对象仅有少部分可直接用于荧光检测，但是大部分的 分离对象如高级脂肪酸、氨基酸、生物胺、甾族化合物和生物碱等本身不发荧光， 不能直接用于荧光检测，通常情况下需将这些弱荧光或非荧光化合物转变成相应 的荧光衍生物后进行h p l c 分离和测定，分离过程中洗脱剂的组成、缓冲液类型、 p h 值、离子强度，氧含量及温度等对荧光检测灵敏度具有重要的影响。 一种可能的荧光检测方法是在流动相体系内加入一定含量的荧光化合物，使 之具有恒定的荧光背景吸收，被测组分的加入将显著改变这一基线背景，从而进 行组分的测定文献【1 2 1 利用这一原理描述了i - i p i c 法对类脂化合物的测定，即 在流动相中加入一定量的荧光组分1 苯胺基萘8 磺酸( a n s ) ，被测类脂使a n s 的荧光强度增强，改变背景吸收，从而达到预期目的。其原因为类脂在水溶液中 8 ! 壅垦堕盔竺堡主堕塞生堡兰 以胶束的形式存在，这种胶束捕集部分a n s 分子使之处于疏水性环境，导致了 相对荧光增强。此外流动相中加入一定量b 环糊精可使一些被测化合物荧光强 度增强，从而提高对它们的检测灵敏度。一些荧光衍生物的荧光强度随溶剂 介电常数的增加而降低且伴有衍生物的激发和发射光谱的红移，在低p h 下衍生 物的荧光强度显著降低1 1 4 1 ，了解到衍生物的这些性质，对提高检测灵敏度有很 大的帮助。 目前，荧光衍生试剂在高效液相色谱和毛细管电泳中应用很广泛，主要应用 于对一些生物活性物质和环境污染物的分离检测，并且还可以对一些手性化合物 进行拆分和检测。有关于这些物质的检测将在第二章中得到阐述。 9 中央民族丈学硕士研究生论文 第二章国内外研究现状及本课题研究的意义 由于胺广泛存在于生态系统中，其对生态环境的影响是很大的，所以胺类物 质一直是环境分析的对象。胺类物质对人体产生不同的危害，有轻微刺激性的， 如对皮肤的刺激，也有严重的，如致畸、致癌、致突变。所以胺类物质也一直是 环境毒理学家们研究的热点物质。本章简单介绍了胺类物质的危害、检测方法及 国内外检测胺类物质试剂研究进展，并在此基础上阐明了进行这一项研究的目的 和意义。 第一节胺类物质的来源、危害及检测方法 一、胺类物质的来源和危害 胺类物质主要包括脂肪胺类、芳香胺类和杂环胺类化合物。脂肪胺类、芳香 胺类化合物主要来源于工业生产中废弃物的排放，还有一些蛋白质、氨基酸等含 氮的有机物会分解产生一些胺类物质，另外在微生物、动物和植物的代谢过程中 也会产生一些胺类化合物 l s - 1 6 1 。短链的脂肪胺在工业中应用广泛，是环境中的主 要污染物，而且也是有机物或是氨基酸降解产物。同时它们也在生态系统和食品 中广泛存在，一些食品因此也会受到脂肪胺的污染i 协1 9 1 。 环境中的胺是一类很重要的污染物。在橡胶、塑料、染料、防腐剂等工业中 广泛应用的一些小分子量脂肪胺和在分析化学中用作螯合剂的一些胺类物质，具 有挥发性，往往会扩散到环境中造成环境污染，对生态环境带来不利的影响 2 0 1 。 这些胺类物质不仅对动物产生危害，也对人的眼睛、呼吸道、皮肤都产生毒害作 用 2 1 - 2 2 1 。有研究表明，住房里即使存在低浓度的胺类物质也会对人的身体产生 较大的影响 2 3 1 ，比如会导致膀胱癌。 另外有一些含有杂原子的胺类物质具有致畸作用，而且这些物质在通常条件 下就能接触到，通过a m e s 和s a m m o n e l l a 试验证明这类胺中有一些的致畸作用 比黄曲霉素和苯并芘还高【嬲l 。杂环胺主要是来源于食品的加工过程中，由于食 品中的蛋白质会在高温下产生复杂反应，产生具有环境毒性的杂环胺类化合物。 还有一些杂环胺类物质具有很大的毒性，并和环境中的氮氧化合物、环境中的活 泼羟基反应，产生一些具有致癌作用的物质【硐，又比如说腐胺、尸胺与亚硝酸 中央民族大学硕士研究生论文 盐反应，生成一些亚硝胺类的强致癌物质1 2 7 。2 8 1 。 二、胺类物质的检测方法 由于胺类物质广泛存在于生态环境中，对人体、动物、和植物都易产生重大 危害，所以胺类物质成为环境、卫生监测的重要对象。文献中有许多经典的检测 方法，在这些检测方法中，主要有气相色谱法1 2 9 - 3 0 1 、电化学分析法p 1 1 、毛细管 电泳法【3 2 1 、薄层色谱法1 3 3 1 和高效液相色谱法 3 4 - 3 7 1 。这些检测法各有优点和缺点， 比如说，气相色谱的重现性好，但是对于一些极性大的胺类化合物，由于它们不 能气化不能用g c 检测。又如，薄层色谱法操作简单，仪器设备较便宜，但是灵 敏度较低。现在新发展起来的液质联机分析效果好，但是设备昂贵。其中高效液 相色谱较为常用，高效液相色谱利用高效液相的荧光检测器，可以高灵敏度、高 选择性、快速地检测待测物质。 由于脂肪胺没有荧光，要利用高效液相对其进行荧光检测，就必须首先对其 进行衍生化反应，即使其和具有荧光团的化学试剂发生反应，从而使之转化为具 有荧光的化学物质。 对于氨基酸来说，在正常的光谱范围内，除开少量的几种氨基酸( 如色氨酸) 以外，大多数氨基酸都没有荧光，而且极性很大，难以在气相色谱中气化，使其 检测受到了限制。另一方面，氨基酸是组成蛋白质的基本单位，是一类很重要的 化合物，对其进行分析检测是生物学领域的热点。特别是在有些情况下还要对其 进行痕量分析，这就要求对其衍生化处理，才能通过高效液相色谱进行荧光检测。 另外疏水性胺往往不具备紫外吸收( 或者仅有弱的紫外吸收) ，本身也不具有荧 光，因而对它们的分析通常采用化学衍生化的方法，使其转变为有紫外吸收或具 有荧光的化学衍生物。有关它们的分析方法较多，如：电泳以及分光光度法等， 但灵敏度都不高，且分析时间长，而荧光分析法具有方便、灵敏的特点。为了提 高胺和氨基酸的检测灵敏度，人们己发展了许多检测氨基酸的荧光试剂 3 8 4 6 1 。总 观这些荧光衍生试剂，各有利弊，但总的来说，o p a , d n s c i 和f m o c _ c i l 4 7 j - - - 种衍生试剂应用较广，而a q c 则是近几年内应用最为广泛的衍生化试剂之一 4 8 - 4 9 。 环境中的胺类化合物由于其毒性以及反应活性，已成为在环境检测中倍受关 注的一类化合物，食品中胺的含量测定也越来越受到人们的重视。众所周知，大 中央民族丈学硕上研冤生论文 多数胺类化合物包括脂肪胺和芳香胺是由蛋白质、氨基酸和其它含氮类有机化合 物通过生物降解而成的。许多脂肪胺和芳香胺又是工业生产中的重要化工原料， 挥发性有机胺与亚硝化试剂作用，易形成强致癌性的n 亚硝基化合物，因此对 该类化合物的高灵敏测定对于环境化学、生物学、毒理学和临床医学具有重要的 意义 目前，在有机化学、生物化学、环境化学等学科中，氨基酸和胺类化合物的 手性检测和拆分都是研究的热点。而要实现对它们的手性检测，具有优良性能的 手性检测试剂是必不可少的。由于这些试剂的高灵敏度、高选择性和相对稳定的 等特点，从2 0 世纪9 0 年代开始，这些手性荧光检测试剂被应用到各种新型的检 测方法中，如h p l c i 螂3 1 和c e 州，这样使得氨基酸和胺类物质的痕量检测取得 了较为理想的结果。但是大部分手性检测试剂的检测波长在4 0 0 n m 以下，会受 到芳香胺或其它在这个区域有荧光吸收的化合物的干扰，使得分析的灵敏度很难 得到提高，不能满足对细胞内痕量氨基酸进行分析的要求。另一方面，大多数的 荧光衍生试剂s t o k e s 位移较小，不利于提高荧光检测的选择性。 第二节胺类荧光衍生试剂研究进展及本课题的研究意义 含有氨基的物质主要有胺类物质及氨基酸，前者是环境中的一类主要污染 物，一直是环境工作者关注的对象，后者也是生物工作者研究的热门领域。为了 衍生检测这些物质，化学工作者们合成了许多的衍生试剂，其数日很多，但是总 的说来，主要有以下几类： 一、非手性衍生试剂 1 芳香邻二醛类( o p a ) 哎q x 邻苯二甲醛萘- 2 ，3 - - 甲醛 早在1 9 7 1 年r o t h 5 5 首次报道了o p a 与氨基酸的衍生反应。经过多年的改 进，已经转化成为了化学衍生测定氨基酸的主要试剂。s i m o n i s s 详细研究了o p a 与氨基衍生反应的机理和衍生物的结构。 ! 墨垦鉴盔兰堡：竺堕塑兰丝苎 这一类试剂是荧光生成试剂，衍生机理是在碱性条件下，并有巯基乙酸存在 时，同一级胺反应生成具有荧光的异吲哚类化合物。其优点是自身没有荧光，衍 生物有荧光，对于荧光分析是有利的。但是其缺点主要是衍生产物稳定性不好， 而且不能与二级胺衍生反应，同时衍生检测胱氨酸效果也不是很好 2 酰氯类 a 磺酰氯类 丹磺酰氯的化学名为5 二甲氨基萘磺酰氯( d n s c i ) ，d n s c l 其与一级二 级氨都可以反应。f u 墙t p 刀把这一试剂用于柱前衍生，二元梯度淋洗，h p l c 分离、 检测2 2 种氨基酸。h i r o f u m ii n o u e l 5 8 i 等合成了4 - ( 5 ，6 - d i m e t h o x y - 2 - p h t h a l i m i d i n y l ) - 2 - m e t h o x y p h e n y l s u l f o n y lc h l o r i d e ( d m s c i ) ，并利用其做了检测胺和氨基酸 的工作。 s 0 2 c i：奋 d n s - c id m s - c i 此外，还有同一系列的酰氯类检测试剂。如：5 ，5 二丁氨基1 萘磺酰氯， 4 萘1 偶氮( 4 二氨基苯) 磺酰氯【硎。 这类试剂的优点是其可与一级、二级胺反应，衍生机理简单，就是利用活性 氯原子与胺基上的氢产生缩合反应。产物有很强的荧光，有利于检测，但是衍生 物对于光不稳定，要避光保存，这在实际工作中对于分析工作带来了不便。 b 碳酰氯类 ls h i m j 掣删合成了此类的衍生试剂，并把此类试剂用于h p l c 进行了分析 检测工作。 9 够0 c i 双0 囝0 了一 a r c - c in o a c i t s a i - h u id u b ，h s i n - l u n gw u l 6 1 】等合成了另一种酰氯类试剂萘氧乙酰 氯( n o a - c i ) ，并利用这一试剂对含有氨基官能团的物质进行了分析检测。国 中央民族大学硕：t 研究生论文 内兰州大学的尤进茂旧肄人合成了吖啶类的酰氯类衍生试剂a c r i d o n e n a c e t y i c h l o r i d e ( a r c - a ) ，e a r b a z o l e - 9 - a c e t y lc h l o r i d e ( c a a - o ) 和e a r b a z o l e - 9 - p r o - p i o n y lc h l o r i d e ( c r p a ) ，并分析检测了含有氨基的化合物进行了分析检测。 此类试剂的主要优点也是可以与一级、二级胺反应，其衍生机理就是活泼氯 原子与胺类物质上的氨基发生缩合反应，生成肽类的物质。但是其水解产物具有 和衍生物相似的荧光强度，故在上柱前要除去水解产物，这给操作带来不便。 3 活性卤类 一b d 这一试剂最先是在1 9 6 8 年g h o s h l 6 3 报道的。此类试剂用于衍生脂肪胺及氨基 酸，并证明是一个良好的衍生试剂，具有较高的选择性。后来，i m a i 6 4 l 比较了 n b d i f 、n b d - - - c i 、n b d b r 的性能，发现了n b d f 获得良好的检测限。 a l l 八e l e m a m 嘟1 也合成了一系列的n b d 衍生试剂。在国内，曹秋娥，尤进茂 等人 两, - 6 7 1 也做了这一方面的工作，合成了香豆素类的活性氯类衍生试剂。 这一类试剂的优点是选择性好，衍生反应时间短，但是应用范围不是很广。 4 n 羟基琥珀酰亚胺活性脂类 1 9 9 3 年有人报道了其合成和应用。在国内，张华山等l 删也报道了如下一检 测试剂( a q c ) 的检测和应用。 咿呻 a q c 武汉大学的刘勋、徐国良【叫等人也合成了这一类的试剂，另外尤进茂等人 7 0 - 7 1 1 报道了同一类型的检测试剂。 这类试剂的优点是与脂肪胺有很强的反应活性，有良好的选择性，但是一般 l ! 墨垦鉴查兰堡：! 堕塑圭堡兰 只有在碱性条件下进行衍生反应。 5 异硫氰酸酯类( p n ) 这一类试剂又称为e d m a l l 试剂，能与n 末端进行衍生化反应，从而对肽或 蛋白质进行序列分析。这类试剂具有良好的衍生反应性能，为了利用这种良好的 衍生反应性能以及提高灵敏度，又产生了一系列的e d a m n 试剂。如：香豆素类 的异硫氰酸酯类，二茂铁异硫氰酸酯判明等。 这类试剂的最大的优点就是衍生物稳定，分析时间短，试剂的副产物可以用 高效旋蒸除去，但是除去副产物用干扰物较麻烦。 6 羧酸类 2 0 0 4 年j u nz h cm i n 等人p 3 1 报道了新的羧酸类的衍生试；f l i ： s 0 2 n ( c h 3 ) 2s o l c 呦2 这两种试剂可以较好地检测胺类物质，但主要缺点是其必须借助催化剂才能 和胺类物质发生衍生化反应。 二、手性衍生试剂 日本的t o s h i m a s a t o y o o k a 等人【7 椰1 合成了一系列的n b d 类的手性衍生试 剂，并用这试剂来分离检测了d 、l 型的氨基酸。 y i m i n gl i u 等【7 研也合成了类似的衍生试剂，并分离了一些氨基酸。这一类 试剂有较好的选择性，可以分离检测有手性的物质 手性衍生试剂最大的优点就是不仅可以分离检测有手性的物质，也可以检测 没有手性的物质。但是手性衍生试剂合成起来相对复杂。 ，o 、 伽謇 中央民族大学硕士研究生论文 三、本课题的研究意义 环境中有些胺类物质存在剂量很小的情况下也可以对人体造成不利的影响， 这些影响是多方面的，所以胺类物质是环境监测中一大类值得注意的化合物。也 正因为这些化合物对人体的健康造成了不利的影响，在环境监测中应查觉其蛛丝 马迹，这就要求在检测限上取得突破，通过第一章知道荧光分析方法具有灵敏度 高、选择性好的特点，但环境中大多数胺类物质没有荧光，因此要把这一检测方 法应用于环境中胺类物质的检测，必须对胺类物质进行衍生，使其转化成具有荧 光的物质，使之可用高效液相色谱进行高灵敏度、快速的检测。 近年来，国内外学者在胺类物质的衍生试剂方面做了很多研究，包括各种胺 类物质衍生试剂的合成研究及胺类物质检测方法研究等等，但有关以葸环、吖啶 环为荧光母体的衍生试剂研究报道不是很多，尤其是蒽环、吖啶环和氨基酸加合 物鲜见报道，另外一方面，这些荧光母体的手性衍生试剂研究几乎没有，我们则 想在这一方面进行一些合成研究工作。这一类试剂不仅可应用于环境中胺类物质 的检测，还可以用来检测生物活性物质氨基酸。 本课题中设计的荧光试剂都以蒽环( a n t h r a c e n e ，简写为a n t h ) 和吖啶环 ( a c r i d i n e ，简写为a c t ) 作为荧光母体。蒽环、吖啶环具有刚性平面结构，荧 光性能极强，但是葸作为荧光母体合成的荧光试剂目前以测定羧酸类的居多，如 n ( 9 蒽甲基) 1 ，4 ，8 ，1 1 四氮杂环四乙二胺【明、2 ( 2 ，3 蒽基马来酰亚胺基) 乙基三氟 甲烷磺酸酯1 7 8 】、对一( 9 葸酸) 一溴苯乙酮【7 9 1 、9 蒽醛 s o l 、9 - 蒽基甲基三甲基氯化铵 盐【8 l j 、9 - 蒽重氮甲烷嗍、9 氯甲基葸嘲等。用于测定胺类和氨基酸的以葸环和吖 啶环为荧光母体的手性试剂鲜见报道。 另一个方面，对于胺类与氨基酸类物质的检测有许多的方法，化学工作者合 成了许多的检测试剂，这些试剂各有优缺点，但是主要的缺点在于发射波长偏小， 许多同类物质对其检测有一定的干扰，鉴于此，在通过对前述大量文献的分析和 总结的基础上，我们设计了一系列的新型荧光试剂。这些试剂由于以蒽环和吖啶 环作为荧光母体，发射波长较长，对于分析检测有利。这种有利表现在以下几个 方面：一、可以进一步提高检测灵敏度，避免生物基体物质的干扰；二、长波长 的光学探针在检测时以减少对生物活性物质的损伤；三、手性光学探针，以分离、 分析手性物质。而且合成的目标产物含有葸环或吖啶环，由于与之相连的氮原子 的电子效应，会引起荧光强度或者吸收波长的改变，使合成的荧光试剂的荧光波 1 6 中央民族大学硕e 研究生论文 长红移，从而避免基体干扰，提高灵敏度；另一方面，合成的荧光试剂具有手性 特征，可以提高检测胺类和氨基酸的选择性，可应用天于生化领域中一些活性物 质的分离分析，特别是一些有手性的物质的分离检测。 1 7 中央民族大学硕士研究生论文 第三章荧光试剂的合成及实验结果讨论 由于新的手性荧光试剂在生物、化学、环境和医学方面的应用有很好的发展 前景，新的手性荧光试剂的合成研究成为我们的合成工作重点。在本章中主要对 合成实验结果进行讨论。 第一节以吖啶环为母体的荧光试剂的合成结果与讨论 一、n 吖啶基甘氨酸和n - 吖啶基甘氨酰氯的合成结果与讨论 节h 睁w c o 囝o h 。 ” l h q 幻n , c h 2 c o aq 幻n h c h 2 c o o hq 如 a 、，i s c h e m e l 2 n - 吖啶基乙酰氯的合成结果与讨论 吖啶环是一个较好的荧光母体，当氨基酸与吖啶环形成加合物以后，由于氨 基酸上n 原子的孤对电子与吖啶环共轭，从而增加吖啶环上的电子密度，使荧 光增强，这一个试验过程中，主要是合成以吖啶环为荧光母体的荧光试剂，现将 这一个过程讨论如下： 1 8 中央民族大学硕上研究生论文 在吖啶基甘氨酸的合成过程中，主要是探讨了不同温度、不同溶剂及不同的 反应起始物对反应的影响，其结果见表3 1 。 表3 - 1 不同反应条件对反应结果的影响 溶剂反应起始物温度产率 甲醇9 氯吖啶+ 甘氨酸 6 5 甲醇( 无水)9 - 氯吖啶+ 甘氨酸 6 5 乙醇( 无水)9 - 氯吖啶+ 甘氨酸 7 8 二氧六环( 无水) 9 - 氯吖啶+ 甘氨酸 8 0 二氧六环( 无水) 9 - 氯吖啶+ 甘氨酸钠 8 0 二氧六环( 无水) 9 - 氯吖啶+ 甘氨酸钠( p 1 陀) 8 0 苯酚( 新蒸)9 - 氯吖啶+ 甘氨酸1 1 0 苯酚( 新蒸)9 - 氯吖啶+ 甘氨酸乙酯1 1 0 2 0 1 4 8 1 5 5 5 6 5 5 1 0 1 6 9 2 7 2 8 7 8 8 以甲醇作为溶剂，回流反应，同时t l c 监测反应进度，当反应结束时，分 离得到的混合物，得到的产物大部分是吖啶酮，另外得到的目标产物的收率仅为 2 0 1 。 核磁共振谱证明副产物是吖啶酮，其原因可能是由于市售的无水甲醇中含水 较多，在反应过程中，温度的升高，9 氯吖啶与水作用形成的9 羟基吖啶不稳定， 重排得到了吖啶酮，过程如下： q 幻一 一q 扔 qq hf 考虑到市售的试剂中水份对于最后目标产物收率的影响，我们采用无水试剂 重复了以上试验，获得较好的效果，9 氯吖啶和甘氨酸反应以甲醇作溶剂时的收 率提高为4 8 1 ，另外考虑到温度也是影响此反应的重要因素，我们采用了沸点 高的乙醇作为溶剂进行实验，目标产物的收率提高到5 5 5 。这样的产率仍不理 想，其主要原因是9 氯吖啶上的氯原子很活泼，可以与醇类的羟基氢发生反应， 这样使得产率下降。 于是改变溶剂为无水二氧六环作为反应溶剂进行实验，在相似的反应条件 中央民族人学硕七研究生论文 下，9 氯吖啶与甘氨酸反应，产物n 吖啶基甘氨酸的产率得到了较大提高，为 6 5 5 。另外，在实验过程中改变起始反应物为9 一氯吖啶和甘氨酸钠，以无水二 氧六环作为溶剂，得到的目标产物的产率为1 0 1 ，其原因主要是由于氨基酸钠 盐在二氧六环中溶解度不好，这样反应体系为非均相反应，从而使产率下降。考 虑到非均相反应中，反应不是很充分，于是向体系中加入相转移催化剂四甲基溴 化氨进行这一实验，上标产物的产率提高到6 9 2 。 另外，我们还采用了苯酚作溶剂进行了这一反应，实验结果表明，苯酚作溶 剂反应可以提高产率，分析原因主要是由于在这一个反应中，9 氯吖啶和反应溶 剂苯酚作用产生中间体9 苯氧基吖啶，而9 - 苯氧基吖啶更易发生亲核反应，使 得反应易于进行。 在这一反应中主要有两种产物生成：吖啶酮( 1 ) ，n 吖啶基甘氨酸( i i ) ：两 种产物的结构由核磁证明，吖啶酮的核磁谱图见附录图1 ，n 吖啶基甘氨酸的核 磁谱图见附录图2 ： 中o n h c h 2 c o 洲 产物i产物i i 吖啶酮n - 吖啶基甘氨酸 在进行以上的合成路线以后，我们还尝试了另一种合成方法：以9 氨基吖啶 和一氯乙酸作为反应起始物，在碱性条件下，控制不同的温度和溶剂进行实验， 得到的结果不很理想，主要表现在产率较低。分析产生这种现象的原因主要在于， 9 氨基吖啶由于氨基氮上的孤对电子与吖啶环产生了共轭作用，使和n 上的电子 云密度大大的降低，这样一氯乙酸作为亲电试剂，对n 的进攻受到影响，从而 目标产物产率下降。 在得到后，我们尝试用二氯亚砜作为酰化试剂和产物反应得到活性更 高的酰氯试剂，但是这一反应失败。分析原因可能是由于生成的酰氯活性较高， 在后处理遇水分解生成了酸。 另外，n 吖啶基甘氨酸的荧光测试结果表明其荧光激发波长为3 7