（植物病理学专业论文）拟南芥抗葱链格孢侵染基因的差异表达.pdf

摘要 本文在对拟南芥不同生态型接利不同植物病原菌后的抗病反应基础上对抗感表 现不同的生态型的抗性机制及抗性相关基因的差异表达进行了研究，结果如下： 测定拟南芥1 1 个生态型接种8 种不同植物病原菌后发现。供试拟南芥对田璇花 白粉病菌、白菜黑斑病菌、玉米大斑病菌和棉花黄萎病菌均表现为非亲和反应。转基 因n a l g 和生态型c o l 、s h a l ( 1 1 d a r a 以及生态型n d 1 、w s 2 、k - a s 1 分别对丝瓜自粉 瘸菌、葱链格孢、葫芦白粉病菌和番茄早疫病菌表现为亲和反应；生态型l 盯对葱链 格孢和番茄早疫病菌表现亲和反应；而生态型c 2 4 、e s t 1 、w s o 和b a v 0 对丝瓜白 粉病菌、葱链格孢、葫芦白粉病菌和番茄早疫病菌均表现为非亲和反应。 转基因拟南芥n a l g 和生态型w s 2 、s h a l d l d a r a 接种葱链格孢后，细胞防御酶 系活性和非酶类物质丙二醛含量有规律性的变化，其中s o d 、e a t 、p p o 和m d a 含 量变化与拟南芥抗葱链格孢侵染密切相关；p o d 和p a l 活性变化与拟南芥抗葱链格 孢侵染的关系尚不明确。 利用改良的d d 赆p c r 差异显示技术，从接种葱链格孢的拟南芥c d n a 中分离 得至了1 3 5 条差异表达片段。反式n o n h e m 杂交表明，3 8 个差异表达片段的二次扩 增产物与对照或接种处理的c d n a 杂交有阳性反应，阳性率为2 8 ，1 。将获得的阳性 差异表达片段与特异于病程相关蛋白基因p r 一，、p r 2 、p 足一j 、尸曰一4 、p d 州2 的探针 进行反式n o n h e m 杂交检测，均没有产生阳性信号。对其中的8 条差异表达片段进行 克隆、测序、同源性分析后发现抗感拟南芥生态型受葱链格孢侵染后不仅诱导了呼 吸过程中有关基因的表达如舳刃三，同时还诱导了一些与细胞壁构建相关基因( 如 s 协) 、蛋白质或缩氨酸水解等有关基因的表达。 通过r a c e 技术获得了片段4 7 的5 端序列。同源性分析表明。该序列与烟曲 霉、粗糙脉孢菌和酿酒酵母菌、酵母的细胞骨架组装控制蛋白跏，的同源性分别为 7 7 和3 6 ；与红松o r f 6 4 c 、人类含有s h 3 域的蛋白s h 3 p 1 7 和海胆s r c 家族蛋白 酪氨酸激酶等的同源性分别为8 6 、3 2 和4 3 。 关键词：拟南芥：葱链格孢；防御酶；非酶类物质；差异表达：d d r l _ p c r ；r a c e d i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o no f _ ，疆6 蚴括a g a i n s ti n f e c t i o no f 4 据p ，拧口，纽； 甜一 a u i h o r ：w e n gq i a o - y u ” s u p e r v j s o r ：d o n gj i n g a o l i uy j n g - c h a 0 m a j o r ：p l a n tp a t h o i o g y a b s t r a c t r e s i s t a n c er c s p o n s e sw e r es t u d i e di nd i f f e r e n t 彳m 6 f 蛳括e c o t y p e sa r e rb e i n g i n o c u l a t e db ys o m ei m p o n a n tp l a n tp a t h o g e n s a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s ，m 0 1 e c u l a r m c c h a n i s m so fr c s i s t a n c e 姐de x p r e s s i o no ft h ed e f e n s e r e i a t e dg e n e si nr e s i s t a n c ea n d s u s c e p t i b l e r d 6 f 却j 括e c o t y p e sw e r es t u d i e d r e s u l t sf o l l o w e di nt h i sp a p e l a l lm e11 一r 口6 删呐打e c o t y p e st e s t e dw e r ci n c o m p a t i b l et o 鲫徊矗pc d 门v o ，v “，f ， a l t e r n q r i qb r n s s i c i c o l n ，s e t o s p h d e r i c it u r c c da n d r l i c i l ! i t l md q h n n e 1 t a n s g 刚沁? 吣吐心 a n dc o i ，s h a k h d a r a ，n d - l ，w s 2a n dk a s - 1e c o t y p e sw e r ea i ic o m p a t i b l et o 印 口口加晴p c 口 c u c t 肆b i t d e ，a i “ r n d r i qp o r r i 。e r y s i p h ec u c u r b i t q c e n r u ma ma t “! r n n r i ns o l d n i l e re c o q p e w a si n c o m p a t j b l et o 爿，f 口，1 日，妇p d fa n d 爿加m 辞r 蛔舳胁以c 2 4 ，e s t l ，w s 一0 蛐db a y o e c o t y p e sw e r ea l li n c o m p a t i b l et o 跏j 缸p m 旃p 阳c c z 旷6 f m e ，爿，把r 行口r 胁p o r r f ，上咖妇 c h c t t r b i t a c e 口r h ma n da l t e r n 6 咿i ns o l n n i c h a l l g e so fd e f e n s ee n z y m e sa c t i v i t i e sa j l dn o n e n z y m ec o m p o n e n ti nt h et r 明g e n i c n a h ga n dw s 2 ，s h a k h d a r ae c o t y p e sw c r ei d e n t i f i e da r e r b e i n gi n f e c t e db y 爿打p ，”d r 胁 p d ，r f c a l jp p o ，s o da c t i v j t i e sa n dm d ac o n t e n th a dn e a r i yr e l a t i o nt o 彳朋6 ，如脚西 a g a i n s ti n f e c t i o no f 爿，f e ，m ，蛔p o f t h er e l a t i o nb e t w e e np o d ，p a la c t i v i t i e sa 1 1 d 4 ，讼6 j d 唧捃a g a i n s ti n f e c t i o no f 爿妇r 竹n r 蛔p o fw a su i l l m o w n t h r o u 曲m o d 猿e dm e t h o do fd d r t - p c r ，13 5d i 氐r e n t i a l p 咒s s e df r a g m e n t sw e f e o b t a 抽e df b mc d n ao fd i 费宅r c n t 彳阳6 z 如括e e o t y p e sb e f o r ea n da r e ri n o c u j a t i o n a m o n g13 5d i f r e r e n t i a le x p r e s s e df r a g m e n t s ，3 8c d n af i a g m e n t sw e r eh y b r i d i z e dt o c d n af r o mi n o c u l a t i o na n du n i n o c u l a t i o np l a n t s a tt h es a m et i m e ，a l lt h ed i f r e r e n t i a l e x p f e s s e df r a g m e n t sw e r en o th y b r i d i z e dt om o l e c u l a rm a r k e r so fd e f e n s er e s p o n s e ( 删u d e d 豫，艘一2 ，瑚一j ，艄一事a n d 肋用2g c n e s ) i tc o n c l u d e dt h a t 朋7 ，朋一? ，舰。j ， 尸r 一4a 1 1 dp d f ，2g e n c sw e r en o te x p r e s s e di n 爿，曲f 面舻括a f t e ri n o c u l a t e db y 爿加聊，胁 p o f d f f b r e n t i a l l ye x p r e s s e df r a g m e n t sc l o n e da n ds e q u e n c e d h o m o i o g o u sr e s u i t s i n d i c a t e dt l l a tn o to i l l y g e n er e l a t e dt or e s p i r a t i o nw a si n d u c e db u tg e n e sr c l a t e dt o c ”o s k e i e t o na s s e m b l yc o m r o lp r o t e i n ( f o re x a m p l es 陆，) a n dp r o t e o l y s i so rp e p t i d o l y s i s w e r ea l s oi n d u c e d t h r o u g ht h em e t h o do fl 己a c e ，5 f u i ls e q u e n c eo fn o4 7f r a g m e n tw a so b t a i n e d i t p r o b a b j y h a s7 7 h o m o l o g o u st oa 驴p 馏f ，淞 盯f 幽，口 sa n dr 0 印d 阳c r 彻 c ”o s k e l e t o na s s e m b l yc o n t r o l p r o t e i n s l ai i ta l s oh a s3 6 h o m o l o u st o & 黜 口阳，u 啦已j 凹坩v 打曲ea n d 弦，s l al ，a tt h es a n l et i m e ，i th a s8 6 、3 2 a n d4 3 h o m o l o g o u st oo r f 6 4 co fp 跏甜s 七d ，口耙片s 括，s h 3d o m a i n c o n t a i n i n gp r o t e i ns h 3 p 1 7o f ，如卅dj 印f p ma 1 1 ds r c - f 如i l yp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s eo f & m 咖c p 雅，r d f 淞p “伊h r 口，姗 r e s p e c t i v e ly k e yw o r d ：“r 口6 脚s 括卅，f p r 阳，胁p d f ；d e f e n s ee n z y m e ；n o n e n z y m ec o m p o n e n t ；d i f r e 卜 e n t i a le x p r e s s i o n ；d d r - t _ p c r ；r a c e a e r a p b i s d d h 2 0 d n t p e b e d l a p c r r p m t e m e d t s n b t r a c e p a l p o d s o d c a t p p o 缩写词表 a c 哆1 a r n i d e a m m o n i u mp e r s u r f h c e n ，n - m e t h y i e n e - b i s - a c 叫l a m i d e d o u b l ed i s t | 1 1 e dw a t e r d e o x ”u c l e o t i d et r i p h o s p h a l e s e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d p o l y m e r a s ec h a j nr e a c t i o n r e v o l u t i o n sp c rm i n u t e n n ，n ，n 一r t r a m e t h y l e t h y l e n ed i a m i n e 1 1 r i s ( h y d r o x y m e m y l ) a m i n 。m e h a n e n i t r o b l u et e t r a z o i i u mc h j o r i d e r a p i da m p l i f l c a t i o ne n do fc i ) n a p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e p e r o x i d a s e s u p e m x i d ed i s m u t a s e c a t a l a s e p o l y p h e m o j o x i d a s e 丙烯酰胺 过硫酸胺 甲叉双丙烯酰胺 双蒸水 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 聚合酶链式反应 每分钟转数 n ，n ，n ，1 n 四甲基乙二胶 三( 羟甲基) 氨基甲烷 氮蓝四唑 c d n a 未端快速扩增 苯丙氪酸解氨酶 过氧化物酶 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 多酚氧化酶 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡垒些盘鲎或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：镐弓；1 签字日期：口。6年6 月w 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑i 堡垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：瓮弓三、 导师签名 签字同期：如o f 年f 月w 日签字目期：m 孑年 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 目矽镢_、月 拟南芥抗葱链格抱侵染基冈的著异袭达 l 引言 1 9 4 6 年，f l o r 根据对亚麻抗锈性的研究提出了基因对基因( g e n e f o 卜g e n e ) 学说。 该学说认为寄主体内分别含有感病基因( r ) 和抗病基因( r ) ，病原菌分别含有毒性 基因( v f r ) 和无毒基因( 彳v r ) ，只有当具有相应抗病基因的植物与具有无毒基因的病 原菌相遇时才会激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄主感病”l 。 抗病基因是植物。痫原菌相互关系中的一个关键因子，是抗病机制研究的基础。抗病 基因的克隆将有助于更快地揭示寄主与病原菌相互作用的分子机理，推动植物分子病 理学与分子生物学的发展。目前，人们已经从各种粮食、经济作物和其他植物中克隆 出4 8 个抗病基因。其中大部分基因从双子叶模式植物拟南芥( 爿r 口6 f 如w 括， d ，f 删a ) 和番茄( 伽印p 憎f c “肌p s c “膪h ，“卅) 中获得2 1 。 拟南芥( 爿，拍f 出舯括f 口妇n 日) 属十字花科芸薹属植物，在显花植物中，基因组 最小( 大小为1 2 5 m b ) ，体细胞中仅5 对染色体，被誉为植物中的果蝇p j 。2 0 世纪6 0 8 0 年代以来科学家对拟南芥进行了大量的化学诱变和辐射诱变，获得了大量的拟南芥突 变体f 4 。1 ”，并在此基础上绘制了拟南芥的遗传连锁图谱。2 0 世纪8 0 年代中期对拟南 芥的研究进入了新的时代，1 9 9 6 年启动拟南芥基因组计划，美国、欧洲、只本共同 合作对拟南芥全基因组的测序工作全面丌始。2 0 0 0 年1 2 月1 6 闩，拟南芥5 条染 色体的基因组序列已测序完成i j ”。目前，国际上捌有大量的拟南芥生念型和突变体， 其中数百个突变体已被鉴定，它们几乎包含拟南芥生长发育的各个方面。此外，还有 覆盖率宽的多个基因组文库和c d n a 文库，其中有1 0 0 0 多个c d n a 克隆已被分析测 序，这些拟南芥资源和信息均为全世界所共享。因此，对拟南芥的遗传信息和基因资 源的利用，已成为生物学领域研究的热点。 1 9 9 2 年，c r i r a u d a t 和a r o n d e i 等两个研究小组首先采用图位克隆技术从拟南芥中 成功分离了爿脚( 脱落酸信号传导基因) 【1 4 】和刷d ? ( ，3 脂肪酸去饱和酶基因) 。 迄今为止，人们主要利用图位克隆技术( m a p i b a s e dc l o n i n g ) 和转座子标签法 ( t r a f l s p o s o n 协g g i n g ) 从拟南芥中克隆到了十几种抗病基因。其中包括抗细菌性斑 点病基因卧2 2 1 、抗霜霉病基因2 钟、系统获得性抗性基因【3 0 j 、抗白锈病基因、抗 病原真菌和细菌所必需的基因【3 2 】、限制烟草蚀纹病毒( t e v ) 的远距离传播基因m ”j 、抗白粉病基因口。”j 等。目前，从拟南芥中克隆抗病基因又有了新的进展。如通 过t d n a 插入获得了对狄霉病菌感病性提高的拟南芥突变体，并从中分离得到了 曰0 6 ，( b o t r y t i ss u s c e p t i b l e l ) 。坎霉病菌的侵染能够诱导b o s ，的表达。b o s ， 编码一个r 2 r 3 m y b 转录因子蛋白，在信号传导过程中具有定的功能【3 7 j ；同时首 次采用基因j 芯片技术对狄霉侵染拟南芥的过程进行了研究，结果表明在扶霉侵染过程 中7 的基因差异表达。鉴定了2 7 个重要的上游调控基因，其中2 个基因与病菌的致 病性有关，8 个基因的功能未知吲：对白粉病菌抗性提高的e d r ，基因，编码类似 c t r l 的蛋白激酶。肋尺，属于抗病性的负面凋控因子之一，同时该基因还能够提高 河北农业人学硕十学位论文 植株对乙烯的敏感性。进一步分析发现肋月，在压力胁迫反应和细胞死亡调控过程 中也具有定的功能 3 ”。凶此，拟南芥巾存在广谱的抗病爨凼克隆这些抗病基因并 研究其抗病机制，不但有利于深入研究植物与病原真菌的分予互作机理，而且克隆的 抗病基因也可以为植物抗病育种和重要病害的有效控制提供丰富的抗性资源。 紫斑病菌属半知菌亚门链格斑属，病原为葱链格孢( 爿f ，p 朋口r 出口d f ) 。该病在我 国发生普遍，严重发病时可影响鳞茎生长和种子质量。目前的防治方法仍以化学防治 为主，但大量化学药剂的使用不仅造成严重的农药残留，同时还影响葱的品质。目前， 用现有的技术在葱中克隆抗病基因非常困难。我们在研究中发现，将葱链格孢接种到 拟南芥不同生态型上后，一些生念型对葱链格孢表现抗病，而另外一些生态型则表现 感病。因此，本研究根据拟南芥不同生态型对葱链格孢抗性差异，利用m r n a 差异显 示技术对抗感葱链格孢拟南芥生态型之问基因的差异表达进行研究，从而为克隆拟南 芥抗葱链格孢基因奠定基础。 拟南芥抗葱链格孢侵染基冈的差异表达 2 1 材料 2 1 1 供试拟南芥 2 材料和方法 c 0 1 、c 2 4 、l f r 、s h a i d l d a r a 、w s - 2 、n d 一1 、e s t - l 、k a s 一1 、w s 一0 、b a y 一0 和转基 因n a l l g ，由美国丹佛植物科学中心夏亦荠博士提供。 2 1 2 供试病原菌 白粉病菌( 跏矗口e 加腩p c 日c “c “，6 f m p ) 采集于河北农业大学校园，寄主为丝瓜。 白粉病菌( 矽 枷船c 甜c 计6 妇c e 日r “m ) 采集于河北农业大学校园，寄主为葫芦。 白粉病菌( 西埘加c o ”v o z v 讲f ) 采集于河北农业大学校园，寄主为酮旋花。 白菜黑斑病菌( 彳船r 甜胁6 ，d 鼬耙盯p ) 采集于保定菜园。 棉花黄萎病菌( 圪r 如j 胁“m 砌h ，f 日e ) 河北农业大学植物保护学院真菌毒素实验室保存。 玉米大斑病菌( 眈p 加 玎“m ，“阳配“脚) 河北农业大学植物保护学院真菌毒素实验室保 存。 番茄早疫病菌( 爿f 把r 加r 抽s o 抽h i ) 河北农业大学植物保护学院真菌毒素实验室保存。 葱紫斑病菌( 彳口r 胁p o f ) 采集于保定菜园。 2 1 3 供试培养基 p d a 培养基：去皮马铃薯2 0 0 9 ，切成小块，加水煮沸3 0 m i n ，将滤液补足至 1 0 0 0 m l ，加葡萄糖2 0 9 ，琼脂粉1 2 9 ，高压灭菌3 0 m i n 。 l b 培养基( 配制1 0 0 0 m l ) ：胰化蛋白胨1 0 9 、酵母提取物5 o g 、n a c n o g ，加 水至1 0 0 0 m l 。摇动溶液至完全溶解，用5 mn a o h 调节p h 值至7 o ，固体培养基中 加入1 2 9 琼脂粉，高压灭菌2 0 m i n 备用。 2 1 4 试剂 t a qd n a 聚合酶、d l 2 0 0 0m a r k e r 、d n t p s 、a c r i l 锄i d e 、b i s a c r i l 锄i d e 、t r i s h c l 、 s m a r t ”r a c ec d n aa m p l i f i c a t i o nk i t ( c l o n t e c h ，c a t a l o go ：k 1 8 1l 1 ) 、b d a d v a i l t a g e t m2p c re n z y m es y s t e m 、凝胶回收试剂盒等均购于大连宝生物公司； m m l v 反转录酶( 目录号m 】7 0 1 ) 购于p r o m e g a 公司：i n i q l o 柱式t i z o i 总r n a 抽 提试剂盒( 产品编号s k l 3 2 2 ) 、p c r 引物、锚定引物t 1 2 n v 、2 6 种随机引物( 目录号 b 0 3 0 1 一b 0 3 2 6 ) 、d e p c 、t e m e d 、m a l e i ca c i d ( 马来酸) 、2 0 s s c 、s d s 、尼龙膜等 购自上海生物工程有限公司；地高辛d n a 标记及检测试剂盒( c a t n o 10 9 36 5 7 ，r o c h e a p p l i e ds c i e n c e ，g e r m a n y ) 、d i ge a 3 yh y b 杂交液等购于上海吉泰公司；感受态细胞 河北农业大学硕士学位论文 d h 5 a 购于北京天为时代科技有限公司：t r i s 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水碳酸钠、过 硫酸铵( a p ) 、冰乙酸、硝酸银、3 7 甲醛、u r e a 、n a a c 等常用试剂均为分析纯， 购自国内有关厂家和保定市试剂公司。 2 1 5 探针 特异于抗病相关基因p r 一，、眦文p 月，4 、刷) f ，2 的特异性引物序列以及含有 p 尺一2 基因的质粒d n a 均由美国丹佛植物科学中心夏亦荠博士提供( 表1 ) 。 表l 用作探针的抗病相关基因 ! ! ! ：! 要! ! ! 兰! 坐! ：! ：! 竺：竺! ：! ! ! 引物序列 抗病相关基凼 p r 3 p r 一4 5 c t c g c t c g c c c a c c a c a a g a r 厂a t c t j a g g g 3 s c t g g t r c g g c c c a c c t o c a t a t g a t g ct c c 下3 5 一a a t g g ，盯c c p 汀g g c t a a g 丁兀g c t t c c 町c - 3 5 一a a r g a a t i a ：t a c a c a c g a 兀1 a g c a c c 3 5 a t g a a 丌c t g g a t g g g c t a c a g c a c c - 3 5 一a a l 、aa ：l u g c t l aa ：i a g c a g c t t c g a g g a g g 一3 5 a a r g g r c c a c a 蛆、g c g g t c g t c a a g g 一3 5 1 一a t g a a 丌c t 丁c t g g a t a g g c 下g c c 一3 2 1 6 杂交液的配制 w a s h i n gb u f k r ：0 1 mm a i e i ca c i d ，o 1 5 mn a c l ，0 3 ( v v ) i h e e n 7 0 ，p h 7 5l 2 0 ) 。 m a l e i ca c i d b u f k r ：o 1 m m a l e i ca c i d ，o ，1 5 m n a c l ，p h 7 5 ( 2 0 ) 。 d e t e c t i o n b u f f e r ：o 1 mt r i s - h c l ，o 1 m n a c l ，p h 9 5 ( 2 0 ) 。 1 0 b l o c k i n gs t o c ks o l u t i o n ：将试剂盒中的b l o c k i n gr e g e n t 用m a l e i ca c i db u 行e r 溶解成 l o ( w v ) 的浓度，在6 5 水浴中边加入边搅拌，灭菌后4 保存备用。 b l o c 砧n gs o l u t i o n ：在使用前将1 0 b l o c k i n gs t o c ks o l u t i o n 用m a l e i ca c i db u 圩e r 稀释成 l b i o c k i n 2s t o c ks o i u t i o n ，每次都要新鲜配制。 a n t b o d ys o l u t i o n ：在每次使用前将试剂盒中提供的a n t i d i g o x i g e n i n a p1 0 0 0 0r p m 离 心5 m i n ，小心从液面上部取所需的数量，按1 ：5 0 0 0 ( 1 5 0 m u m l ) 的比例用l x b l o c k i n g s o l u t i o n 稀释，用于结合标记的d n a ，2 - 8 可保存1 2 h 。 c o i o r s u b s t r a t es o l u t i o n ：在1 0 m ld e t e c t j o nb u r 中加入试剂盒中的n b t ，b c i p2 0 0 u l ( 每次都要新鲜配制，避光保存) 。 型壹垄垫苎壁垫塑堡鲨苎婴塑茎墨查些 一 2 1 7 主要仪器和设备 高速冷冻离心机( e p p e n d o r f ) 、d y y - 3 1 3 4 型琼脂糖水平电泳槽、垂直板电泳槽、 p c r 扩增仪、e c 4 0 0 0 p 电泳仪、u v i t e c 凝胶成像系统、h z - 9 6 1 2 k 高温振荡培养箱( 太 仓市科技器材厂) 、电热恒温鼓风干燥箱g z x 9 1 4 0 m b e ( 上海博迅实业有限公司医疗 设备厂) 、b i o m e t r ac o m p a c ti i n eo v 4 分子杂交炉；电子天平( 精度l 10 0 0 9 ) ；电热恒 温水浴锅：平板与耳板；洗槽；水浴锅等。 2 2 方法 2 2 1 拟南芥的种植 参照k u n k e l 的种植方法，并稍加改动1 4 。 种子消毒；将拟南芥的种子放在1 5 m l 离心管中，加入1 m l1 0 n a c l o ，混匀消毒 5 m i n 。最后用无菌水清洗5 次以上。 播种：将蛭石与珍珠岩按( 3 ：1 ) 的比例混好，装入铁盘( 1 5 c m 1 5 c m ) 。将铁盘放入 盛有营养液的塑料周转箱中，待吸足水后播种，4 春化处理3 4 d 。春化处理后将 铁盘转移到培养室中( 2 3 ，1 6 h 光照，8 h 黑暗) 培养。2 周后，长出3 4 片真叶对 即可移栽。 移栽：将蛭石装入营养钵中，然后将营养钵放入盛有营养液的塑料周转箱中。蛭石吸 足水后，用镊子小心的从铁盘中连根拉出小苗，把根平放在蛭石表面，用镊子轻轻压 下。移苗结束后，用保鲜膜覆盖，3 4 d 后揭膜。从苗期直至丌花，可在塑料周转箱 中始终保持i 3 c m 的水层。拟南芥整个生长期浇3 4 次营养液。 收籽：刀：始收籽时不再需要过多的水分，应尽量保持塑料周转箱的干燥。当种荚变黄、 变干时就可以收籽。为了保证以后的试验中所用植物材料的一致性，每一株拟南芥的 种英放到同一个1 5 m l 离心管中，分别编号。种荚晾干后，将种子抖落到纸上，用 金属滤网过一下以除去杂质，将种子装入写有标记的小纸袋中并放于干燥的环境中。 待种子进一步干燥后，封存于1 5 m l 离心管中备用。 拟南芥营养液配方：5 m mk n 0 3 ，2 5 m mk h 2 p 0 4 ，2 m mm g s 0 4 ，2 m mc a ( n 0 3 ) 2 ， 5 0 “mf e s 0 4 ，7 0 肛mh 3 8 0 4 ，l4 p mm n c l 2 ，o 5 p mc u s 0 4 ，1 肛mz n s 0 4 ，o 2 “mn a 2 m 0 0 4 ， l o 肛mn a c l ，0 0 1 mc o c l 2 ，调节p h 为5 7 。 2 2 2 不同植物病原菌接种及其病情调查方法 白菜黑斑病菌a f l e r n q r i nb r n s s i c n c ) 将p d a 斜面保存的白菜黑斑病菌于接种前转接于p d a 平板培养基上，2 0 左右 培养4 5 d 。选取长势一致的拟南芥4 周龄植株，用微量移液器接利，叶片正面( 孢子 浓度为4 8 1 0 7 个m l ) ，接种后控制温度l5 2 0 ，相对湿度1 0 0 ，6 d 后进行调 河j 七农业人学硕十学何论文 查。以叶片有病斑并有霉层记为感病，仅有坏死斑没有霉层记为抗病卧4 2 1 。 包粉莉龟s p h n e r o t | “ c nc h c h r h i t n e ；e l ，s i p h ec h c h r b i t n c e n r h m ；e r y s i p h e c o n v o i v h l i ) 采用扫苗接种的方法。选取长势一致的拟南芥4 周龄植株，将采集于不同寄主的 白粉病菌连同寄主在拟南芥植株上来回摆动，使带有白粉病的寄主叶片与供试拟南芥 植株接触。接种后保湿2 4 h ，满2 0 2 4 培养室中培养。6 l o d 后丌始进行调查， 以叶片上有白粉状物为感病。 ， 玉米大斑病菌( e 措p 加，l 妇卅m ，c 把h 肌) 将p d a 斜面保存的玉米大斑病菌于接种前转接于p d a 平板培养基上，2 5 左右 培养4 5 d ，诱发出分生孢子。选取长势一致的拟南芥4 周龄植株，用微量移液器接 种叶片正面( 孢子悬浮液浓度为1x l o7 个m l ) 。接种后控制培养室温度2 3 2 5 ， 相对湿度1 0 0 ，6 - 8 d 后进行调查【4 3 】。 葱紫斑病菌( 4 抛m a ，mp 口，一) 将p d a 斜面保存的葱链格孢于接种前转接于p d a 平板培养基上，2 5 左右光照 培养4 5 d 。选取长势一致的拟南芥4 周龄植株，用微量移液器接种叶片f 面，每叶 片接种葱链格孢孢子悬浮液5 乩( 浓度为6 8 1 0 6 个m l ) 。接种后控制培养室温度 2 3 2 5 ，相对湿度1 0 0 ，4 6 d 后进行凋查。 番茹旱瘦斌蔼( a l f e r h n r i ns o l 口h i ) 将p d a 斜面保存的番茄早疫病菌于接种前转接于p d a 平板培养基上，2 5 友右 培养4 5 d 。选取长势一致的拟南芥4 周龄植株，用微量移液器接种叶片正面( 孢子 浓度为l 1 0 7 个m l ) 。接种后控制培养室温度2 5 2 7 ，相对湿度1 0 0 ，6 d 后进行 调查。 棉花黄萎病菌( 阮，f 七棚m 朋妇，i 胁p ) 将p d a 斜面保存的棉花黄萎病菌于接种前转接于p d a 平板培养基上，2 5 左右 培养4 5 d 。选取长势致的拟南芥4 周龄植株，采用灌根和叶片接种两种方式进行 ( 孢子浓度为1 1 0 7 个m l ) 。接种后控制培养室温度2 5 2 7 ，相对湿度1 0 0 ，6 d 后进行调查。 2 2 3 拟南芥抗葱链格孢侵染的生化测定 2 2 3 1 接种及取样方法 选取对葱链格孢表现抗病的转基因n a h g 、生态型w s 。2 和表现感病的s h a k h d a r a 生态型4 周龄植株，用微量移液器在叶片上接种，每叶片接种孢子悬浮液5 u l ( 6 8 1 0 6 个m l ) 。接种后将植株置于2 3 - 2 5 光照培养室内保湿培养( 每天8 h 光照，1 6 h 黑暗) 。 以未接种植株为对照，分别在接种后3 、6 、1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 h 与未接 拟南芥抗葱链格孢侵染基冈的筹异表达 种对照同时取样。样品装入1 5 m l 离心管中，置于一8 0 冰箱中保存备用。 2 2 3 2 防御酶类粗提液的制备 称取0 5 9 叶片，置于预冷的研钵中，加入少量的液氮研磨成粉术状。将样品转 入1 0 m l 的离心管中，加入4 预冷的磷酸缓冲液( 提取液为o 0 5 m o l lp h 7 8 磷酸缓 冲液，内含1 聚乙烯毗咯烷酮) 使其终体积为5 m l 。4 1 0 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 上 清液即为过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、多酚氧化酶( p p o ) 和超氧化物 歧化酶( s o d ) 的粗提液。一2 0 低温保存。同时参考王敬文等【4 5 j 的方法提取p a l 粗提液即称取l g 样品经液氮研磨后加入o 1 mp h 8 8 硼酸缓冲液( 内含有巯基乙醇 2 m m ) 使其终体积为5 m l 。4 1 0 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 上清液用于p a l 酶活性测定。 为了避免系统误差，各样品同一种酶的比活性在同一测定中完成。 2 2 1 3 3 防御酶类活性测定 超氧化物歧化酶( s o d ) 活性测定：反应液中合有5 0 m m 磷酸缓冲液( p h 7 8 ) ， 1 3 m m 甲硫氨酸，2 o m 核黄素，1 0 p me d l a n a 2 ，7 5 m 氮蓝四唑( n b t ) 和5 0 此 酶液，在4 0 0 0 l u x 日光灯下反应1 0 m i n 后，黑暗终止反应，以末照光的处理为空白 对照，测定波长5 6 0 n m 下的吸光度值，以抑制n b t 光化还原反应5 0 为1 个酶活力 单位，计算s o d 活性 u 佗( f w ) 。 过氧化物酶( p o d ) 活性测定：反应混合液包括l o o m m o l l 磷酸缓冲液( p h 6 0 ) 5 0 m l 、愈创木酚2 8 “l 和3 0 过氧化氢1 9 此。取光径1 c m 比色杯2 个，于1 个加入 反应混合液3 m l 和磷酸缓冲液1 m l 作为对照，另1 个加入反应混合液3 m l 和上述 酶液1 m l ( 如酶活性过高可稀释之) ，立即丌启秒表记录时间，于分光光度计上测量 4 7 0 n m 波长下的吸光度值，每隔l m i n 读数1 次。以每分钟吸光度变化值表示酶活性 大小，即以a 4 7 0 【m i n g ( 鲜重) 1 表示之。 过氧化氢酶( c a t ) 活性测定：耿l o m l 试管1 支，其中1 支为样品测定管，另 1 支为空白管( 将酶液煮死) 。每支管中分别加入粗酶液o 2 m l 、p h 7 8 磷酸缓冲液 1 5 m l 和蒸馏水1 0 m l 。2 5 预热后，逐管加入o 3 m l0 1 m o l l 的h 2 0 2 ，每加完l 管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，2 4 0 n m 下测定吸光度值，每隔1 m i n 读数一 次，共测4 m i n 。待2 支管全部测定完后，以1 m i n 内a 2 4 0 减少o 1 的酶量为1 个酶活 单位( u ) ，计算酶活性。 多酚氧化酶( p p o ) 活性测定：采用李靖等( 1 9 9 1 ) 的方法【4 6 】，稍加修改。在1 个试管中依次加入o 0 2 m 0 1 m 邻苯二酚溶液1 5 m l ，0 0 5 m o l ，lp h 6 8 磷酸缓冲液 1 5 m l ，酶液o 0 1 m l ；在另1 个试管中只加前2 种溶液，不加酶液，作为对照。3 0 下反应2 m i n ，3 9 8 n m 波长下测定吸光度值。酶活单位用o d 值_ mg 1 鲜重_ m i n 。表示。 苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性测定；检测反应液总体积5 m l ，其中含o ，l md h 8 8 硼酸缓冲液l 一苯丙氨酸1 2 0 “m ，酶液l m l 。3 0 反应6 0 m i n ，加6 nh c l0 2 m l 终 止反应，2 9 0 n m 波长下测定吸光度值( 如有沉淀要离心除去) 。酶活结果表示方法为 河北农业人学硕+ 学位论文 o d 2 9 0 n m f w h r 。 2 2 3 3 丙二醛( m d a ) 和提液的制备 参照王敬文等的方法进行粗提液的制备4 扪。称取样品i g 剪碎，加入2 5 三氯 乙酸( t c a ) 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 m l t c a 迸一步研磨，匀浆在40 0 0 印m 离心l o m i n ，上清液即为样品提取液。 2 2 3 4 丙二醛( m d a ) 含量的测定 吸取上清液2 m l ( 对照加2 m l 蒸馏水) ，加入2 m l0 6 硫代巴比妥酸( t b a ) 溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸1 0 m i n ( 自试管内溶液中出现小气泡丌始记时) ， 取出试管冷却，30 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，取上清液并量其体积。以0 6 t b a 溶液为空 白测定5 3 2 n m 、6 0 0 n m 和4 0 0 n m 处的吸光度值，计算m d a 含量( m o l 儋) 。 2 2 4 拟南芥抗感葱链格孢生态型之间基因的差异表达 2 2 4 l 接种及取样 选取拟南芥转基因n a h g 、w s 2 和s h a k h d a r a 生态型4 周龄植株，用微量移液器在 叶片上接种，每叶片接种葱链格孢孢子悬浮液5 止( 孢子浓度为6 8 1 0 6 个m l ) 。接 种后将植株置于2 3 2 5 光照培养室内保湿培养( 每天8 h 光照，1 6 h 黑暗) 。以不接种 的植株为空白对照，分别在接种后3 、6 、1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、7 2 、9 6 h 与不接种对照同 时取样。样品装入1 5 m l 离心管中，置于8 0 冰箱中保存备用。 2 2 4 2 拟南芥叶片总r n a 的提取 参照分子克隆技术进行| 4 7 】。所有离心管、枪头部要用o 1 、o 2 的d e p c 溶 液处理。d e p c 处理方法：微量离，心管、t i p 头装于盒中，加适量d e p c 后立即盖上盖 子；双蒸水中按0 1 的浓度加入d e p c 处理，于通风橱中过夜，高压灭菌1 5 m