（急诊医学专业论文）百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤的关系研究.pdf

原创性声明 l i l lll11 1 11 11 11 111 111l y 17 9 2 8 5 8 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：塾达日期：型翌! ! ! 堡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：叁选导师签名：劲 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要1 英文摘要3 符号说明6 1 l 一 刖 舌7 材料和方法1 0 结 果1 4 讨 仑一l8 结 论j 2 1 参考文献2 2 附图2 5 综述。3 4 参考文献4 3 致 谢4 8 攻读学位期间发表的论文4 9 3 山东大学硕士学位论文 c a t a l o u e c h i n e s ea b s t r a c t 一l e n g l i s h a b s t r a c t 。3 s y m b o l i cd e s c r i p t i o n 6 p r e f a c e 7 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1o r e s u l t 1 4 d i s c u s s i o n 1 8 c o n c l u s i o n 2 l r e f e r e n c e s 2 2 f i g u r e 2 5 r e v i e w 3 4 r e f e r e n c e s - 4 3 a c k n o w l e d g e m e n t 4 8 p u b l i c a t i o na r t i c l e s 4 9 4 山东大学硕士学位论文 百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤的关系研究 硕士研究生：赵波 导师：菅向东教授 中文摘要 背景百草枯( 1 ，l7 一二甲基一4 ，47 一联吡啶阳离子盐) 是世界上广泛使用 的除草剂之一，是种快速、非选择性、接触杀灭性除草剂。在世界上1 3 0 多个 国家广泛使用，在农业生产中起着重要的作用。从七十年代初，研究发现百草枯 对人类和动物具有较强的毒性，且没有特效的解毒剂，百草枯的肺毒性是导致死 亡的主要原因，同时也会对其他脏器产生损害，如肾脏、肝脏、心脏等。一旦发 生误服等事故时具有很大危险性。自服百草枯导致人急性中毒在发展中国家是非 常值得注意的问题，特别是在亚洲部分地区。摄入大量百草枯可导致患者快速死 亡。百草枯中毒早期可造成急性肺损伤( a l i ) 或急性呼吸窘迫综合征( a r d s ) ，患 者多死于多脏器功能衰竭( m o d s ) 或呼吸衰竭，其发病机制尚不十分清楚。目前尚 无理想的治疗方法。因此，加强急性百草枯中毒的基础和临床研究具有重要的意 义。 目 的通过观察百草枯染毒大鼠模型中百草枯在血液和脏器组织中含量的动 态变化，探讨百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤之间的关系。 方法9 0 只成年健康雄性w i s t a r 大鼠随机分为对照组和染毒组。观察染毒后 不同时间点百草枯在血浆和脏器组织中的动念变化，同时留取肺、肾、肝、心、 脑组织做病理学检查和肺组织羟脯氨酸测定。 结果百草枯染毒后8 、2 4 、4 8 h 时血药浓度为( 5 2 5 6 9 9 8 9 1 ) 、( 3 5 7 7 4 7 5 2 8 ) 、( 6 9 4 4 1 7 2 2 ) n g m l ，3 d 时检测消失。8 、2 4 、4 8 h 及3 、7 d 时其在肺 组织含量分别为( 2 1 7 0 8 5 4 5 2 3 3 ) 、( 2 7 6 9 1 8 5 9 6 1 7 ) 、( 1 3 5 1 9 0 1 5 8 6 0 ) 、 ( 1 0 5 4 0 3 8 7 4 7 ) 、( 5 2 8 2 8 1 2 5 0 4 ) n g g ，1 4 d 时检测消失。在肾脏、肝 脏、心脏组织中8 h 时百草枯含量分别为( 2 3 9 1 5 4 4 0 0 7 8 ) 、( 2 5 1 2 6 8 8 7 1 ) 、 ( 3 3 0 9 5 6 2 0 9 ) n g g ，然后逐渐减少，肝脏、心脏组织1 4 d 时检测消失，肾 脏组织2 8 d 时检测消失。在脑组织中含量较低但存在时间较长，2 8 d 时仍可检测出 百草枯。染毒大鼠各脏器损伤病理变化不同，以肺组织损伤最为严重，脑组织损 山东大学硕士学位论文 伤最小。肾、肝、心组织损伤有逐步恢复趋势，而肺组织损伤逐渐加重，肺组织 羟脯氨酸含量也逐渐增高( p o 0 5 ) 。 结论百草枯染毒大鼠不同脏器组织在不同时间点其毒物含量不同。百草枯 在脏器组织中含量越高，其损伤就越重，提示百草枯在脏器组织中含量与脏器损 伤之间可能有关。百草枯在肺内完全消除后，肺损伤仍可继续发展。 关键词百草枯；中毒；高效液相色谱法；肺纤维化 2 山东大学硕士学位论文 s t u d yo nr e l a t i o n s h i pb e t w e e np a r a q u a t t i s s u ec o n t e n ta n do r g a ni n j u r yi n p a r a q u a tp o i s o n i n gr a t s p o s t g r a d u a t e t u t o r z h a ob o j i a nx i a n g d o n g a b s t r a c t b a c k g r o u n dp a r a q u a t i st h et r a d en a m ef o r l ，1 - d i m e t h y l 4 ，4 7 b i p y r i d i n i u md i c h l o r i d e ，o n eo ft h em o s tw i d e l yu s e dh e r b i c i d e si nt h e w o r l d p a r a q u a ti sq u i c k - a c t i n g ，an o n s e l e c t i v ea n dk i l l i n gg r e e np l a n t t i s s u eo nc o n t a c t p a r a q u a ti sw i d e l yu s e di nm o r et h a n13 0c o u n t r i e si n t h ew o r l d ，a n di tp l a y sa ni m p o r t a n to r l ei na g r i c u l t u r e f o r m7 0 s ，i t sh i g h t o x i c i t yh a sb e e nr e p o r t e di na n i m a l sa sw e l la si nh u m a n ，a n dn os p e c i f i c a n t i d o t e s ，p u l m o n a r yt o x i c i t yi st h em a i nc a u s eo fd e a t hb u td a m a g et o o t h e ro r g a n sh a sa l s ob e e nr e p o r t e d ，s u c ha s l i v e r ，k i d n e y sa n dh e a r t o n c es o m e o n ep o i s o n e d ，t h el i f ew i l lb ei n d a n g e r a c u t ep a r a q u a t s e l f - p o i s o n i n gi s as i g n i f i c a n tp r o b l e mi nt h ed e v e l o p i n gc o u n t r i e s ， e s p e c i a l l yi nt h ep a r t so fa s i a ，i n g e s t i o no fl a r g ea m o u n t so fp a r a q u a t c o u l dr e s u l t si nr a p i dd e a t h p a r a q u a tp o i s o n i n gi nt h ee a r l yp h a s ec o u l d c a u s ea c u t el u n gi n j u r y ( a l i ) o ra c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ( a r d s ) p a t i e n t su s u a l l y d i eo f m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o n s y n d r o m e ( m o d s ) o rr e s p i r a t o r yf a i l u r e t h ep o i s i o n i n gp a t h o g e n e s i si s 3 山东大学硕士学位论文 u n c l e a r ，a n dn oi d e a lt h e r a p ya tp r e s e n t t h e r e f o r e ，i tw a sg r e a ti m p o r t a n t s i g n i f i c a n c e t h a tt h eb a s i ca n dc l i n i c a lr e s e a r c ho fa c u t e p a r a q u a t i n t o x i c a t i o nw a ss t r e n g t h e n e d o b j e e t i v et oo b s e r v et h ec o n t e n td y n a m i cc h a n g e so fp a r a q u a ti n p l a s m aa n dt i s s u ei nt h ep a r a q u a tp o i s o n i n gr a tm o d e la n de x p l o r et h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np a r a q u a tt i s s u ec o n t e n ta n do r g a n si n j u r y m e t h o d sa l l9 0a d u l th e a l t h ym a l ew i s t a rr a t sw e r er a n d o m i z e d l y d i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u pa n dp a r a q u a tp o i s o n i n gg r o u p s p a r a q u a ti n p l a s m aa n dt i s s u ew e r ed e t e r m i n e da td i f f e r e n tt i m ep o i n t sa n da tt h e s a m et i m et h et i s s u eo f l u n g ，k id n e y ，l i v e r ，h e a r ta n db r a i nw e r er e t a i n e d f o rp a t h o l o g i c a le x a m i n a t i o n t h eh y d r o x y p r o l i n eo f l u n gt i s s u ew a sa l s o d e t e r m i n e d r e s u l t st h ec o n c e n t r a t i o n so fp a r a q u a ti nr a t sb l o o dw e r e ( 5 2 5 6 94 - 9 8 9 1 ) ，( 3 5 7 7 4 士7 5 2 8 ) ，( 6 9 4 44 - 1 7 2 2 ) n g m lr e s p e c t i v e l ya t8 ，2 4 ， 4 8ha f t e rp a r a q u a te x p o s u r e ，a n dd i s a p p e a r e da t3 d t h ec o n t e n t so f p a r a q u a ti nl u n gt i s s u ew e r e ( 2 1 7 0 8 54 - 4 5 2 3 3 ) ，( 2 7 6 9 1 84 - 5 9 6 1 7 ) ， ( 1 3 5 1 9 04 - 1 5 8 6 0 ) ，( 1 0 5 4 0 3 土8 7 4 7 ) ，( 5 2 8 2 84 - 1 2 5 0 4 ) n g g a t8 ，2 4 ，4 8h ，3 da n d7da f t e rp a r a q u a te x p o s u r er e s p e c t i v e l y ， d i s a p p e a r e da t14 d t h ec o n t e n t so fp a r a q u a ti nk i d n e y ，l i v e ra n dh e a r t t i s s u er e s p e c t i v e l y w e r e ( 2 3 9 1 5 44 - 4 0 0 7 8 ) ，( 2 5 1 2 64 - 8 8 7 1 ) ， ( 3 3 0 9 54 - 6 2 0 9 ) n g g a t8 h ，t h e nr e d u c e dg r a d u a l l y t h ep a r a q u a ti n l i v e ra n dh e a r tt i s s u ed i s a p p e a r e da t1 4 d ，a n di nk i d n e yt i s s u ea t2 8 d 4 山东大学硕士学位论文 t h ec o n t e n t so fp a r a q u a ti nb r a i nw e r el o w e s t ，b u ti te x i s tf o rl o n g e s t t i m ew h i c hw e r es t i l ld e t e c t e di nt h eb r a i nt i s s u ea t2 8 d t h e p a t h o l o g i c a lc h a n g e sw e r ed i f f e r e n ti no r g a n i ct i s s u e s ，t i s s u ei n j u r yw a s m o s ts e r i o u sa n db r a i nt i s s u ei n j u r yw a sl i g h t e s t t h ei n j u r yo f k i d n e y ， l i v e ra n dh e a r tw e r er e s t o r e d g r a d u a l l y ， b u tt h el u n gi n j u r yw a s a g g r a v a t eg r a d u a l l y ，w h i c ht h ec o n t e n to f l u n gh y d r o x y p r o l i n ew a s i n c r e a s e da tt h es a m et i m e ( 氏o 0 5 ) c o n c l u s i o n st h e r ew e r ed i f f e r e n t p a r a q u a tc o n t e n ti nd i f f e r e n t o r g a n st i s s u ea n dt i m ep o i n t si np a r a q u a tp o i s o n i n gr a t s t h em o r e c o n t e n to f p a r a q u a ti nt h et i s s u e ，t h em o r ei n j u r yo c c u r r e d ，t h e r ec o u l d b er e l a t i o n s h i pb e t w e e np a r a q u a tt i s s u ec o n t e n ta n do r g a n si n j u r y t h e l u n gi n j u r y c o n t i n u e dt o d e v e l o p a f t e r p a r a q u a t w a s c o m p l e t e l y e l i m i n a t e di nt h e r a t s k e yw o r d sp a r a q u a t ；p o i s o n i n g ：h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ；p u l m o n a r y f i b r o s i s 5 英文缩略语 pq a l i a r d s m o d s g c c t x h p g l u c o c o r t i c o i d c y c l o p h o s p h a m i d e h e m o p e r f u s i o n 糖皮质激素 环磷酰胺 血液灌流 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱法 h e h y p t 1 2 pd c t n i h e m a t o x y l i n e o s i n h y d r o x y p r o l i n e h a l 1 i f e p a r k i n s o nd i s e a s e c a r d i a ct r o p o n i ni 苏木精伊红 羟脯氨酸 半衰期 帕金森病 心肌肌钙蛋白i n g a ln e u t r o p h i lg e l a t i n a s e - a s s o c i a t e dl i p o c a l i n中性粒细胞胶酶相 关脂质运载蛋白 m 一1 k i d n e yi n j u r ym o l e c u l e - 1肾损伤分子1 6 山东大学硕士学位论文 百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤的关系研究 硕士研究生 导师 赵波 菅向东教授 -上-j一 丽吾 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) ，又名克无踪、对草快。化学名称是1 ，l7 一二甲基 一4 ，47 一联吡啶阳离子盐，分子式为c 1 2 h 1 4 c 1 2 n 2 2 c 1 ，纯品为白色结晶，以阳离 子形式存在，分子量为2 5 7 2 ，熔点约为3 0 0 ，相对密度为1 2 4 1 2 6 ( 2 0 ) ， 不易挥发，易溶于水，微溶于低级醇类，不溶于烃类溶剂，酸性条件下稳定，约 在3 0 。c 能分解。常用商品为二氯化物的2 0 水剂。不论p q 进入机体的途径如何， 都能很快分布于大多数组织，极易被肺细胞摄取。p q 通过能量依赖过程逐渐在肿 内聚集，与血浆蛋白结合很少，且不经代谢，以原形排出体外，大多在肾脏排泄， 少量通过胆汁。 h。c二二二二口ch3 2 0 f p a r a c l u a t 百草枯结构模式图 1 9 5 5 年英国卜内门化学工业有限公司( i c i ) 发现了百草枯的除草活性，并于 1 9 6 2 年作为除草剂获得登记，由于对周围环境无害，因而迅速推广使用，是目前 使用最广泛的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂之一，在世界上使用量仅次于草 甘膦的第二大的除草剂。国内商品为2 0 的百草枯溶液，为深绿色有气味的液体。 目前有1 3 0 多个国家和地区在5 0 多种农作物上广泛应用百草枯，是世界上使用量 仅次于草甘膦的除草剂。百草枯是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定 内吸作用。能迅速被植物绿色组织吸收，对非绿色组织没有作用，对植物绿色组 织有很强的破坏作用。在土壤中迅速与土壤结合而钝化，对植物根部及多年生地 7 山东大学硕士学位论文 下茎及宿根无效，一般在土壤中无残留。正常使用情况下，对野生动物和环境少 有危害，正确的使用对喷洒作业人员的健康影响也不大。百草枯主要用于防治玉 米、大豆、蔬菜、水稻、果园内的一年生杂草，在棉田和油椰子种植园内也广泛 应用，也用作谷物、棉花、蛇麻油、甘蔗、大豆和向f 1 葵收割前的脱叶剂，也可 r 1 1 用于免耕农业上除草和路边、排水沟、下水道等非农业除草”。可减少耕种作业， 有助于防止土壤被侵蚀，保持土壤湿度，有利于促进无需消耗时间和能量的“免 耕农业”或“直播农业”开展。 1 9 7 8 年中国黑龙江省农垦首先从英国进口百草枯进行使用，1 9 8 4 年正式进 入中国市场，随着它在中国的日益推广使用，使用量逐步扩大。然而发现百草枯 对人体健康和生态环境存在严重危害，在一定程度上已成为了社会问题。百草桔 对人、畜均有较强的毒性作用。只有彻底禁止生产和使用百草枯除草剂，才能从 根本上控制百草枯中毒的发生。然而，我国是农业大国，粮食问题仍然是我国国 民经济首先要解决的基本问题，百草枯是国家“十一五”重点建设的替代进口、 替代高毒、填补国内空白的世界第二大环保型、无公害灭生性除草剂，目前中国 已成为百草枯生产、使用和出口大国。百草枯除草效果好，成本低廉，长期使用一 有助于免耕作业的推广，大大减少了劳动力的使用。因此，尽管世界上已有欧美 等2 0 多个国家和地区禁止或限制了该除草剂的生产、使用和进口。但是，百草 枯在今后相当长的时间内是不会退出中国的除草剂市场。 百草枯经消化道和皮肤黏膜吸收时，对人畜有较强的毒性，可造成急性中毒。 r 9 1 1 9 6 6 年b u l h v a n t 首次报道了两例百草枯中毒死亡病例“。，此后世界各地相继报道 百草枯中毒病例。在亚洲、美洲、欧洲，每年都有大量的百草枯中毒致死病例的 r q 一7 报道一。自服百草枯导致人急性中毒在发展中国家是非常值得注意的问题，特 别是在亚洲部分地区，摄入大量百草枯可导致患者迅速死亡。在我国，百草枯中 i r - 1 9 毒已经成为急诊科常见的急危重症，病死率极高，可达7 2 4 - - - 8 2 2 。百 草枯急性中毒后将会产生多个器官的损害，可对肺、肾、肝、心脏、脑和消化道 等造成损伤，患者多死于多脏器功能衰竭( m o d s ) 或呼吸衰竭。由于其发病机制 尚不清楚 1 3 14 l ，目前尚缺乏特效的治疗手段，临床上多采用漂白土、活性炭、 糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d ，6 c ) 联合环磷酰胺( c y c l o p h o s p h a m i d e ，c t x ) 8 山东大学硕士学位论文 冲击治疗。1 5 - 1 6 。及血液灌流( h e m o p e r f u s i o n ，h p ) 清除血液中的百草枯等方法治 疗急性百草枯中毒，虽然可以提高抢救成功率，降低死亡率，但是仍有很多百草 枯中毒病人死亡。目前百草枯中毒的治疗方法仍是处于探索阶段，难以得到满意 的治疗效果，病死率仍居高不下。因此，加强急性百草枯中毒的基础和临床研究 具有重要的意义。为了进一步了解百草枯在体内的分布和代谢规律的特点，以及 和脏器损伤的关系，我们设计了该实验。通过观察急性百草枯中毒w i s t a r 大鼠模 型中百草枯在血浆和脏器组织中的代谢特点，利用高效液相色谱法( h i g h p e r f o r m a n c e1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 检测百草枯中毒大鼠血浆百 草枯浓度和主要脏器组织中百草枯含量变化，探讨百草枯在脏器组织中含量与脏 器组织损伤之间的关系，以期望能为临床治疗百草枯中毒提供新的思路和依据。 9 山东大学硕士学位论文 材料和方法 1 试剂与仪器： 1 1 主要试剂及药品： 2 0 百草枯溶液( 江苏先正达南通作物保护有限公司) ；百草枯标准品1 0 0m g ( 美i 雪s i g m a 公司) ；磷酸( 分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司) ；乙腈( 色 谱纯，美国j t b a k e r 公司，批号l o t c 2 8 8 2 9 ) ；三乙胺( 色谱纯，美国t e d i a 公 司，批号l o t 6 0 1 0 4 8 ) ；庚烷磺酸钠( 美国j t b a k e r 公司，批号l o t b l 3 6 6 2 ) ； 羟脯氨酸测试盒( 南京建成生物技术研究所) 。 1 2 主要仪器： w a t e r s 5 1 5 高效液相色谱仪、2 4 8 7 紫外检测器、7 1 7 自动进样器( 美国沃斯 特公司) ；x w 8 0 a 型漩涡混合器( 上海精科实业有限公司) ；p k 5 1 4 b p 超声清 洗器( 德国b a n d e l ) ；梅特勒一托利多a x 2 0 5 d e l mr a n g e 电子天平( 瑞士梅 特勒公司) ；t 2 5b a s i c 匀浆机( i k aw o r k sg u a n g z h o u ) ；s k 一1 混匀器( 常州国 华电器有限公司) ；7 2 2 n 型可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ； x i - i f 1 内切式高速分散器( 上海金达生化仪器厂) ；芬兰移液器( 上海雷勃分析 仪器有限公司) ；h h 4 恒温水浴锅( 常州国华电器有限公司) ；8 0 一2 型低速离 心机( 上海手术器械厂) ；1 0 0 水浴锅( 北京市医疗设备厂) ；华东电子d g 5 0 3 3 a 酶标仪( 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；普通冰箱( 西门子) ；一7 0 冰箱( 日本三洋) ；p m i o a 型光学显微镜( 同本o l y m p u s ) 。 2 动物分组及染毒方法：成年健康s p f 级雄性w i s t a r 大鼠9 0 只，山东大学实验动 物中心提供，证书号：s c x k ( 鲁) 2 0 0 3 0 0 0 4 ，体重在2 4 0 - - 2 6 0 9 ，活动能力相近。 采用标准颗粒饲料及标准饮用水( 山东大学实验动物中心) ，按常规饲养。专人 单笼饲养大鼠，明暗周期1 2 h 自由取食和饮水，房间温度保持在2 5 。c 左右，湿度 在5 0 左右。将上述大鼠饲养观察一周后，随机分为染毒组和对照组，每组1 0 只。 染毒组给予5 0 m g k g 百草枯原液( 2 0 ) 加蒸馏水稀释至l m l 灌胃染毒，对照组同 时给予l m l 蒸馏水灌胃；染毒组分别与染毒后8 h 、2 4 h 、4 8 h 、3 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 和2 8 d 处死，对照组于实验结束后一并处死。实验期间严密观察并记录各组动物 表现。 3 动物处理及标本采集：各组动物均于观察结束后，采用1 0 水合氯醛腹腔注 1 0 山东大学硕士学位论文 射麻醉动物，采用下腔静脉穿刺取血约5 m l ，取血后处死动物，血液中加入适量 肝素抗凝并静置3 0 分钟，离心后留取血浆，- 7 0 * ( 2 冻存待检测。死亡动物于呼吸 停止前采血。留取左肺、左肾、心脏、肝脏、脑组织，- 7 0 冻存待做组织百草 枯含量检测；留取右肺、右肾、心脏、肝脏、脑组织做病理学检查，置于质量体 积分数为1 0 的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，组织切片，苏木精一伊红( h e ) 染色及m a s s o n 染色，光学显微镜观察；同时留取右肺组织约l o o m g ，- 7 0 冻存， 待做肺组织羟脯氨酸测定。 4 百草枯组织含量检测： 4 1 标准溶液配制：精确称取百草枯l o m g 于l o m l 容量瓶中，加水稀释至刻度得浓 度为1 0 m g m l 浓标液。浓标液储存于4 冰箱，工作液在使用前由浓标液逐级稀 释制得。 4 2 仪器分析条件：色谱条件钻石( c 1 82 5 0 m m x 4 6 m m ，5 i ，t m ) 色谱柱；流 动相：乙腈：7 5 m m o l l 庚烷磺酸钠( 1 2 ：8 8 ，v ，三乙胺调p h = 3 o ) ：流速 为1 0 m l m i n ；柱温为室温；检测波长为2 5 8 n m 。 4 3 组织匀浆处理：称取适量肺、肝、肾、心、脑组织，在冷生理盐水中漂沈， 除去血液与杂质，滤纸拭干并精确称重，放入塑料匀浆试管中，力h a 2 m l 冷生理盐 水，用剪刀剪碎组织块。用组织匀浆机( 1 3 5 0 0 r r a i n ) 电动匀浆，制备组织匀浆。 将制备好的匀浆用低温低速离心机3 0 0 0 r m i n 离一6 , 1 0 分钟，将离心好的匀浆留下上 清弃下面沉淀。 r 1 7 1 4 4 样品处理：参照f u k e 等“利用高效液相色谱法检测百草枯的方法并加以改 进，分别吸取血浆、组织匀浆上清液0 5 m l 置于试管中，加入3 5 高氯酸1 0 0 p 1 ， 蜗旋1 分钟，高速离心5 分钟，取上清液2 0 p l 进样进行h p l c 分析，记录实验数据。 4 5 建立标准曲线：精确配制百草枯质量浓度为2 0 、5 0 、1 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 、5 0 0 0 n g m l 范围内的6 个空白对照血浆样品及不同组织空白对照匀浆样品，在本色谱条件下， 按样品处理方法处理后，测其峰面积，由百草枯峰面积y 对百草枯质量浓度x 进行 线性回归，绘制标准工作曲线及计算百草枯样品的回归方程。 4 6 计算数据：依据百草枯回归方程可得血浆和各组织匀浆中的百草枯浓度 ( n g m 1 ) ，然后计算各组织中百草枯含量，计算公式： 山东大学硕士学位论文 百草枯含量( n 砂= 塑塑堡堕墨豸薹冀产2 川， 5 肺组织羟脯氨酸测定：羟脯氨酸( h y d r o x y p r o l i n e ，h y p ) 是机体胶原蛋白的 主要成分之一，在正常胶原蛋白中含量约1 3 4 ，在弹性蛋白中含量极少，而在 其它蛋白中则不存在。因此，不同组织中羟脯氨酸含量可作为衡量其胶原组织代 谢的重要指标。肺纤维化时，肺组织内胶原纤维量增加。由于羟脯氨酸为胶原纤 维所特有，以此作为肺纤维化的指标，可以判断纤维化程度。 5 1 样本前处理： 、准确称取3 0 一- - l o o m g n $ 组织放入试管中，准确加水解液1 o m l ，混 匀。加盖后沸水浴水解2 0 分钟( 水解1 0 分钟混匀一次，目的是使 水解更充分) 。 、将各试管流水冷却后各管加指示剂l 滴，混匀； 、各管准确加入调p h 甲液1 o m l 至溶液变红，混匀； 、各管逐滴小心加入调p h 乙液，混匀，至颜色变成黄绿色，p h 值在6 o 左 右： 、加蒸馏水至2 0 m l ，混匀； 、取稀释后的检测液3 m l 力i 适量活性炭，混匀，3 5 0 0 转分离, o l o 分钟， 取上清1 o m l 直接检测。 5 2 操作表： 空白管标准管测定管 蒸馏水( m 1 ) 1 0 5 p g m l 标准应用液 1 0 ( m 1 ) 上清夜( m 1 ) 1 0 试剂一( m 1 ) 0 50 5 0 5 混匀，静置1 0 分钟 混匀，静置5 分钟 混匀，6 0 0 c 水浴1 5 分钟，冷却后，3 5 0 0 转分离心1 0 分钟，取上清在5 5 0 h m 处， l c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 1 2 山东大学硕士学位论文 5 3 计算公式： 羟脯氨酸含量c 腿m g 湿重) = 掣喜蓦赛箍三鬻标准管含量c 5 憎m 1 ) v 水解液总体积( m 1 ) 组织重量( 峨) 6 统计学方法：采用s p s s1 3 o 统计软件进行分析，实验数据采用x s 表示，进 行单因素方差分析，各染毒组分别与对照组间进行d u n e t t 检验，p 0 0 5 为差异有 统计学意义。 山东大学硕士学位论文 结果 1 各组大鼠一般情况：百草枯染毒各组大鼠在7 d 内，蜷缩少动，不同程度的 耸毛，反应迟缓，饮食量减少，体重下降明显，呼吸喘促，部分大鼠有口、鼻及 眼角出血；7 1 4 d 各组大鼠体重不再继续下降，活动增多，毛发较前光整，呼 吸渐趋平稳，饮食量增加；1 4 2 8 d ，各组大鼠体重有所增加，精神较前好转， 但整体改善情况不一。其中2 4 h 组有1 只死亡，3 d 组有2 只死亡，7 d 组有2 只死 亡，2 1 d 组有3 只死亡，2 8 d 组有2 只死亡。对照组饮食正常，反应灵敏，活动 敏捷，毛发光泽，呼吸平稳，无自然死亡。 2 线性范围与检出限：w i s t a r 大鼠空白血浆及肺、肾、肝组织匀浆中添加百草 枯( 5 0 0 n g m 1 ) 的h p l c 色谱图见图l 、2 、3 、4 。血浆及各组织回归方程见表1 ， 血浆及肺、肾、肝组织回归方程分别用于各组织百草枯含量计算，肝组织回归方 程用于心和脑组织百草枯含量计算。以上各组织标准工作曲线线性范围均在2 0 - - 5 0 0 0 n g m l 范围内线性关系良好，最低检测线为2 0 n g m l 。 表1血浆及各组织回归方程 血浆中添加百草枯色谱图( 图1 ) 肺组织中添加百草枯色谱图( 图2 ) 1 4 染毒后8 h 1 0 5 2 5 6 9 - - + 9 8 9 1 2 1 7 0 8 5 4 - - 4 5 2 3 32 3 9 1 5 4 _ _ _ 4 0 0 7 82 i l 2 6 - - + 8 8 7 13 3 0 9 5 - + 6 2 0 9 3 8 5 6 1 0 7 0 染毒后2 4 h 1 03 5 7 7 4 4 - 7 5 2 82 7 6 9 1 8 - + 5 9 6 1 72 0 8 2 4 1 - + 3 4 4 ，8 61 9 1 0 4 4 - 8 2 4 72 9 1 6 8 4 - 8 9 2 0 4 6 5 0 4 - 1 1 1 4 染毒后4 8 h1 0 6 9 4 4 4 - 1 7 2 21 3 5 1 9 0 4 - 1 5 8 6 04 5 8 1 0 4 - 1 1 2 0 8 1 6 7 5 9 - + 3 7 6 31 4 2 8 3 4 - 8 2 9 46 4 1 9 4 - 1 0 5 7 染毒后3 d1 0 01 0 5 4 0 3 4 - 8 7 4 7 3 5 4 3 1 - + 6 0 2 31 5 4 6 8 4 - 6 4 9 51 2 8 9 2 4 - 3 3 9 71 1 0 1 0 4 - 3 9 0 9 染毒后7 d1 0 05 2 8 2 8 - - + 1 2 5 0 42 4 1 1 5 + _ 7 4 2 4 7 8 0 3 _ + 1 2 9 88 6 4 1 - + 1 0 0 91 2 1 2 5 4 - 3 0 9 1 染毒后1 4 d 1 0 00 染毒后2 1 d1 0 0 0 染毒后2 8 d 1 0 00 1 5 3 8 6 2 5 4 2o 1 4 6 9 7 4 - 3 1 1 40 0 0 06 0 0 7 4 - 1 0 7 4 0 5 z 7 l 1 8 3 7 0 4 3 8 5 1 3 2 7 对照组 1 0 0 0000 0 1 5 山东大学硕士学位论文 图5 血浆和各组织中百草枯含量的柱状示意图 4 0 0 0 圈血浆 肺 旧肾 旧肝 l 一心 l 囡脑 【8h2 4 h 4 8 h3 d7 d1 4 d2 1 d2 8 d 时间 4 肺组织h e 染色、m a s s o n 染色和羟脯氨酸含量测定结果： 4 1 肺组织病理学变化：染毒组：3 d ，约2 0 大鼠肺泡萎陷，肺泡壁毛细血管扩 张充血，细支气管周围炎细胞浸润；7 d 时，见大量多形核白细胞、单核巨噬细 胞等浸润，肺泡间隔增宽，结构受损，部分肺泡腔消失，呈现为弥漫性肺泡炎； 1 4 d ，约2 0 ，- - - 3 0 大鼠肺泡萎陷，炎症较7d 时减轻，纤维组织开始增生；2 1 d ， 大部分( 5 0 以上) 大鼠肺组织实变，周围肺泡代偿性扩张，纤维化进一步形成； 2 8 d ，肺结构紊乱，炎细胞较前明显减少。m a s s o n 染色可见较多染成蓝色的胶 原纤维，为稳定的肺纤维化期。 4 2 肺组织羟脯氨酸含量的变化：肺组织羟脯氨酸的含量反映了肺组织胶原的含 量，用以判断肺纤维化的程度。7 、1 4 、2 1 、2 8 d 大鼠肺组织中羟脯氨酸含量均 明显高于对照组，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，见表3 及图6 。 表3 各组肺组织羟脯氨酸含量( x s ，i 上g m g 肺组织湿重) 注：与对照组比较， o 0 5 ，b p o 0 1 1 6 山东大学硕士学位论文 图6 肺组织羟脯氨酸含量的柱状示意图 l 。6 1 4 1 2 1 b c 之0 8 b c j 0 6 o 。4 o 2 o 7 d1 4 d2 l d2 8 d 时间 5 肾、肝、心、脑组织病理学变化： 肾：染毒后3 d ，肾