（果树学专业论文）柑橘反转录转座子基因的特征分析及其相关分子标记的开发.pdf

柑橘反转录转座子基因的特征分析及 其相关分子标记的开发 摘要 反转录转座子广泛存在于果树基因组中，可以通过改变等位基因或调控基因表 达以改变园艺学性状( 成熟期和果皮色泽) 。体细胞突变是柑橘等果树比较常见的生 物学现象，不仅能为研究柑橘芽变形成，而且还对研究柑橘反转录转座子提供素材。 本研究从c o p a 1 i k e 反转录转座子的反转录酶入手，系统研究柑橘基因组中这类反转 录转座子的组成、变异和演化模式；在柑橘愈伤组织离体保存过程中及秋水仙素处 理诱发四倍体的逆境条件下，分析g v s p s y - l i k e 反转录转座子p o l 结构域的甲基化变 异情况：同时对实验技术体系进行了完善与拓展，自主开发了柑橘反转录转座子 i r a p 、r e m a p 和s s a p 标记。主要研究结果如下： 1 、柑橘基因组中c o p i a l i k e 反转录转座子的研究 1 ) 利用c o p i a 1 i k e 反转录转座子反转录酶的保守位点设计引物，从三个柑橘基 因组红肉脐橙、沙田柚和默科特橘橙中扩增得到长度为2 4 0 b p 左右的p c r 产物。对扩增产物进行分离和克隆，并随机挑选了7 0 个克隆进行测序，结 果得到了4 0 个不同的反转录酶( r r ) 序列。b l a s t x 分析表明，这些克隆均 为真实的反转录酶序列。这些核苷酸序列组内和组间均具有较大的差异，说 明其核酸序列的高度异质性。这些序列中有1 6 个是完整的，其余的有移码 突变、终止子或二者兼有，可能是产生反转录酶异质性的原因。根据序列比 对，这些序列可分为7 个家族。 2 ) s o u t h e r n 杂交表明，c o p i a 1 i k e 反转录转座子( 探针t c c l 0 ) 在柑橘基因组中 为多拷贝。甲基化分析表明r t 序列在柑橘中被高度甲基化。 3 ) 点杂交对不同柑橘基因组中c o p a 1 i k e 反转录转座子拷贝数进行了分析。结 果表明：c o p i a 1 i k e 反转录转座子( t c c l 0 ) 占柑橘基因组9 左右，而且柚 ( 沙田柚) 基因组中反转录转座子拷贝数低于橘( 本地广橘) 和橙( 红肉脐 橙) 。 2 、 r a p d 分析秋水仙素处理的默科特橘橙四倍体愈伤，得到了1 个可能发生 d n a 脱甲基化的位点，该位点与g y s p s y - l i k e 反转录转座子有关( 命名为m c k r e ) 。 结果表明：m c k r e 编码g y s p s y - l i k e 反转录转座子p o l 结构域中2 3 2 个氨基酸，包含了 反转录酶活性氨基酸位点d d 和高度保守的氨基酸序列s k c e f ，及反转录酶下游的 4 0 个氨基酸。s o m h e m 杂交表明，m c k r 在柑橘基因组中为多拷贝。采用m s pi h p a i i 酶切组合结合s o u t h e r n 杂交发现，三个月愈伤组织培养的材料和用o 1 秋水仙素 处理4 8 小时及7 2 小时的愈伤材料基因组发生了d n a 脱甲基化；而且变异主要发 生在g y s p s y - l i k e 反转录转座子( m c k r e ) 序列中，在同时检测的对照c o p i a - l i k e 反转 录转座( t e c l 0 ) 和色素基因( l o b ) 序列中没有发现甲基化变异。 3 、根据已发表的柑橘反转录转座子右侧l t r 序列，使用p r i m e r5 0 软件设计7 条i r a p 引物，结合s s r 引物8 条，从中筛选出谱带清晰、再现性强的引物组合对 柑橘属植物的亲缘关系进行i r a p 和r e m a p 分析。本试验共扩增出1 9 6 条带，其 中多态性位点1 4 7 条，多态位点百分率为7 5 ，扩增片段大小在2 0 0 - 2 0 0 0 b p 之间。 选用2 4 份柑橘及近缘属材料进行扩增，检测到等位位点的数目为2 8 个，平均位点 数为3 5 4 个，平均多态性信息量( p i c ) 值为0 5 3 7 。供试材料的相似系数变化范围 从o 1 9 ( 本地广橘和h b 柚) 到0 9 9 ( 华盛顿脐橙和红肉脐橙) ，平均值0 5 9 。聚 类分析结果显示，2 4 份材料聚为7 类：橘和橙类、四季橘类、柚类、枸橼来檬类、 宜昌橙类、金柑类、和枳类。 4 、应用r a p d 、s s r 、a f l p 、s s a p 、i s t r 分子标记研究1 4 个来自普通甜橙、 脐橙和温州蜜柑芽变品种的多态性，a f l p 、s s r 和i s t r 均没有鉴别出柑橘芽变品 种之间的遗传差异；r a p d 的检测效率也很低，5 0 对引物中也只有一对显示红肉脐 橙有一条带缺失。而s s a p 中9 1 个l t r m s e i 引物对，有9 对引物显示有多态性， 结果表明s s a p 技术能有效的鉴别柑橘的芽变品种。对s s a p 分析得到的1 0 个差 异片段进行测序，序列分析表明，其主要与信号传导、抗逆性和核糖体蛋白有关， 可能参与调节柑橘果实发育。 关键词：柑橘，反转录转座子，芽变，d n a 甲基化，i r a p ，r e m a p ，s s a p i i c h a r a c t e r i z a t i o no fr e t r o t r a n s p o s o ne l e m e n t sa n dd e v e l o p m e n to f r e l a t e dm o l e c u l a rm a r k e r si nc i t r u s a b a s t r a c t r e t r o t r a n s p o s o n sw h i c ha l eu b i q u i t o u sa n da b u n d a n ti np l a n tg e n o m e sm i g h t c o n t r i b u t et oa g r o n o m i cv a r i a t i o n ( m a t u r i t yd a t e ，f l e s hc o l o r ) b yi n c r e a s i n ga l l e l i c d i v e r s i t yo rb yc h a n g i n gt h er e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n s o m a t i cm u t a t i o n ，am a i n b i o l o g i c a lp h e n o m e n o no fc i t r u sa n do t h e rf r u i t s ，p r o v i d et h eu s e f u lm a t e r i a l sn o to n l yf o r t h ef o r m a t i o no fb u ds p o r tb u ta l s of o rr e t r o t r a n s p o s o na c t i v i t y t h ep r e s e n tr e s e a r c h i s o l a t e dr t ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ) s e q u e n c e sf r o mc o p i a - l i k er e t r o t r a n s p o s o n sf o rt h e i n v e s t i g a t i o no ft h e i rh e t e r o g e n e i t y , a c t i v i t ya n dg e n o m i cd i s t r i b u t i o ni nc i t r u s ；u n d e r t i s s u e - c u l t u r ea n dc o l c h i c i n e t r e a t e dc o n d i t i o n s ，t h ec i t r u sc a l l u sw e r eu s e dt os t u d yt h e m e c h a n i s ma b o u td n am e t h y l a t i o no fp o ld o m a i ns t r u c t u r ef r o m g y p s y - l i k e r e t r o t r a n s p o s o n s w i t ht h ee x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e sm o d i f i e da n do p t i m i z e d , t h r e en o v e l 。： m a r k e r m e t h o d so fi r a p , r e m a p , s s a p , w e r ed e v e l o p e df o ri n d e p e n d e n ti n n o v m i o ni n c i t r u s t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 r t ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ) s e q u e n c e sf r o mc o p a l i k er e t r o t r a n s p o s o n sw e r ec l o n e d a n dc h a r a z t e r i z e d r e s u l t ss h o w e d ： 。 1 ) c o p i a - l i k es e q u e n c e sw e r ea m p l i f i e df r o mt h r e ec i t r u sg e n o m i cd n a ( c a r ac a l a n a v e l ， s h a t i a np u m m e l oa n dm u r c o t tt a n g o r ) b yp c rw i t h d e g e n e r a t e o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sc o r r e s p o n d i n gt oh i g h l yc o n s e r v e dr td o m a i n si nt h e c o p i a - l i k er e t r o t r a n s p o s o n s p c rf r a g m e n t so fr o u g h l y2 4 0 b pw e r ei s o l a t e da n d 7 0c l o n e dw e r es e q u e n c e d , 4 0d i f f e r e n tr ts e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d t h e n u c l e o t i d es e q u e n c es i m i l a r i t ys h o w nb yc o m p u t e ra n a l y s i sb e t w e e ni n t e r - a n d i n t r a - g r o u p w a si naw i d er a n g e ，w h i c hi n d i c a t e sh i 曲l e v e lo f s e q u e n c e h e t e r o g e n e i t ya m o n g t h e s ec l o n e sa n d g r o u p s a m o n gt h e s es e q u e n c e s ，16c l o n e s h a du n i q u en u c l e o t i d es e q u e n c e s ( i n t a c ts e q u e n c e s ) ，a n dt h eo t h e r sh a da f r a m e s h i f i ，as t o pc o d o n , o rb o t h a c c o r d i n gt oa l i g n m e n ta n dp h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ，a l ls e q u e n c e sw e r ed i v i d e di n t os e v e ng r o u p s 2 ) s o u t h e r na n a l y s i sr e v e a l e dt h ed i s t r i b u t i o no fr ts e q u e n c e ( t c c l0 ) i nd i f f e r e n t c i t r u sg e n o m e s m e t h y l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h e r ew a sh i 曲l e v e lo fm e t h y l a t i o n i nc i t r u sg e n o m e s 3 ) t h et o t a lc o p yn u m b e ro ft h ec o p i a l i k er e t r o t r a n s p o s o n si nc i t r u ss p e c i e sg e n o m e w a se s t i m a t e db yd o t b l o th y b r i d i z a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h ec o p i a l i k e i i i r c t r o t r a n s p o s o n s ( t c cl0 ) c o v e r e dn e a r l y 17 o fc i t r u sg e n o m e ，a n di t sc o p y n u m b e ri nc g r a n d i s ( c v s h a t i a np u m m e l ) l o w e rt h a ni nc r e t i c u l a t a ( c v b e n d i g u a n g i um a n d a r i n ) a n dc s i n e n s i s ( c v c a r ac a r an a v e l so r a n g e ) 2 ap o t e n t i a ls i t e ，c l o s e l yr e l a t e dw i t hg y p s y - l i k er e t r o t r a n s p o s o n s ( d e s i g n a t e d 弱 m c k r e ) w a so b t a i n e db yr a p da n a l y s i sf r o mt h et e t r a p l o i dc a l l u so fm u r c o t tt a n g o r u n d e rc o l c h i c i n e st r e a t m e n t r e s u l t ss h o w e db o t hm c k r eh a da nu n i n t e r r u p t e do p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n g 2 3 2a m i n oa c i d sw h i c hc o n t a i n e dc o n s e r v e d r e t r o t r a n s p o s o np o lm o t i f s 、i t i lt h ei n v a r i a n td dm o t i f , t h eh i g h l yc o n s e r v e ds k c e fo f t h er e v e r s et r a n s c r i p t a s ea c t i v es i t eb l o c ka n da p p r o x i m a t e l y4 0r e s i d u e si ni t s d o w n s t r e a m s o u t h e r nb l o tr e v e a l e dt h a tm c k r ew a so f m u l t i p l yc o p y d n a d e m e t h y l a t i o nw a so b s e r v e di nt h ec a l l u st h a th a db e e nc u l t u r e df o rt h r e em o u t h sa n d t r e a t e d 研mo 1 c o l c h i c i n ef o r4 8ha n d7 2l l ，b ym s pu h p ai id i g e s t i o n sa n ds o u t h e r n b l o t a n dt h ea l t e r e dm e t h y l a t i o np a t t e r n sw e r er e l a t e dw i t hg y p s y - l i k er e t r o t r a n s p o s o n s ( m c k r e ) ，n o n e t h e l e s s ，n o n eo fc o p i a l i k er e t r o t r a n s p o s o n s ( t c clo ) a n dp i g m e n tg e n e ( l c y b ) s h o w e da p p a r e n tm e t h y l a t i o na c t i v a t i o n 3 s e v e ni r a pp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ol t rs e q u e n c e so fc o p i a l i k ea n d g y p s y - l i k er e t r o t r a n s p o s o n si nc i t r u s t h ei r a pa n dr e m a pb a n dp a a e m sb e t w e e nt h e g e n o t y p e se x h i b i t e dh i g hl e v e lo fp o l y m o r p h i s m i nt o t a l ，c o m b i n e di r a pa n dr e m a p a n a l y s i s ，19 6s c o r a b l ea m p l i f i c a t i o np r o d u c t sr a n g i n gf r o m2 0 0b pt o _ 2 0 0 0b pw e r e g e n e r a t e d ，14 7o fw h i c hw e r ep o l y m o r p h i c ，w i t ha na v e r a g eo f5p o l y m o r p h i cb a n d sp e r p r i m e rc o m b i n a t i o n t h el e v e lo fp o l y m o r p h i s mw a s7 5 t w e e n t y - f o u rr e p r e s e n t a t i v e a c c e s s i o n so fc i t r u s ，f o r t u n e l l a ，p o n c i r u sw e r es e l e c t e d ，a n da m p l i f i e db yt h ei r a pa n d r e m a p p r i m e r s l o c ia m o n gt h e2 4g e n o t y p e sr a n g e df r o m2t o8 、砘t l la na v e r a g eo f 3 5 4 ，a n dt h em e a np i cv a l u ew a s0 5 3 7 p a i r w i s ec o m p a r i s o nw a sc o n d u c t e db e t w e e na l l t h eg e n o t y p e si n c l u d e di nt h i ss t u d y j a c c a r d ss i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t sc a l c u l a t e df r o m i r a pa n dr e m a pd a t av a r i e df r o m0 19b e t w e e nb e n d i g u a n g i um a n d a r i na n d h b p u m m e l o ，t o0 9 9b e t w e e n w a s h i n g t o n n a v e lo r a n g ea n d c a r ac a r a n a v e lo r a n g e ，w i t h am e a no f0 5 9 n e i g h b o r - j o i n i n gc l u s t e rr e s u l t sb a s e du p o nt h ei r a pa n dr e m a pd a t a s h o w e dt h a ta l lt h es a m p l e sw e r ed i v i d e di n t o7c l u s t e r s ，n a m e l yo r a n g e m a n d a r i n ( c s i n e n s i s cr e t i c u l a t a ) ，c a l a m o n i d n ( cr e t i c u l a t a ) ，p u m m e l o ( cg r a n d i s s ) ，c i t r o n l i m e ( c m e d i c a - ca u r a n t i f o l i a ) ，i c h a n gp a p e d a ( ci c h a n g e n s i s ) ，k u m q u a t ( f o r t u n e l l as p p ) ，a n d t r i f o l i a t eo r a n g e ( p o n c i r u ss p p ) c l u s t e r s 4 r a p d ，s s r , a f l 只s s a pa n di s t ra n a l y s e sw e r eu s e dt od e t e c tt h ev a r i a t i o n s a m o n g14b u dm u t a n tc u l t i v a r sf r o mn a v e lo r a n g e ，s w e e to r a n g ea n dm a n d a r i n n o i v p o l y m o r p h i s mw a sf o u n db ya f l p , s s ra n di s t r r a p dm a r k e rw a si n e f f e c t i v e ，o u to f 5 0p r i m e r s ，o n l yo n er e v e a l e dp o l y m o r p h i s m s ，s h o w i n go n em i s s i n gb a n di n c a mc a r a n a v e lo r a n g e i ns s a p , f r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e du s i n g9 1p a i r so fl t r m s e is e l e c t i v e p r i m e r s ，a n d9p r i m e r ss h o w e dd n ap o l y m o r p h i s m s t h e s er e s u l t sa l s os h o w e ds s a p t e c h n i q u ew a sa ne f f e c t i v em e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o no fc i t r u sb u dm u t a n tc u l t i v a r s t e n s p e c i f i cb a n d sd e r i v e df r o ms s a pa n a l y s i sw e r es e q u e n c e d s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tt h o s ea m i n oa c i d sw e r ei d e n t i f i e d 、析t l lc o r r e s p o n d i n gg e n e si n v o l v e dm a i n l yi n s i g n a lt r a n s m i s s i o n , a n t i a d v e r s i t ya n dr i b o s o m ep r o t e i n ，a n dm i g h tb ec l o s e l yr r e l a t e d w i t hc i t r u sf r u i tr i p e n i n g k e yw o r d s ：c i t r u s ，r e t r o t r a n s p o s o n s ，b u d - m u t a n t , d n am e t h y l a t i o n , i r a p , r e m a p , s s a p v 缩略词表 a b b r e a t i o n s v l v i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 0 8 年0 7 月2 6 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研姓签名：幸岛帆砷年舌月。日 学位论文作者签名：4 - 哥1 1导师签名：研兑巧( 义坎( 岳弘彳、f 签名日期：彦司年z 月加日签名日期：a 伊勿年月y 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 1 1 课题的提出 第一章问题提出与研究进展 柑橘是世界第一大果树，我国第二大水果，对我国南方农村经济和社会发展起 到了重要的推动作用。据统计，2 0 0 4 年我国柑橘面积为1 2 6 7 万公顷，比2 0 0 3 年 增长8 ；产量1 4 9 6 万吨，比2 0 0 3 年增长1 1 ，2 0 0 5 年全国柑橘产量达到1 5 9 2 万吨，比2 0 0 4 年增长2 8 ( 邓秀新，2 0 0 4 ；邓烈，2 0 0 5 ) 。随着人们生活水平的提 高，柑橘的消费量会保持上升的势头，其选、育种的研究目标也随之不断更新。 长期以来，由于受珠心胚、性器官败育、育种周期长以及遗传上高度杂合等影 响，柑橘杂交育种比较困难，特别是脐橙雌雄性器官均败育，品种改良主要依赖芽 变选种。据统计，柑橘品种的7 0 来自体细胞突变( 芽变和珠心胚变异) 。与常规育 种相比，芽变选种还具有周期短，育种进程快，一般从主栽品种中选择芽变，因而 更容易获得优良品种( 系) 。由于芽变最初由个别细胞变异导致，而且果树遗传上高 度杂合，因此人们对果树芽变的分子机理知之甚少。现有的研究主要集中在反转录 转座子的插入、d n a 甲基化、基因结构和表达差异等方面。 植物反转录转座子是植物基因组中一类可移动的遗传元件，以高拷贝广泛分布 于植物基因组中，具有高度的异质性，可被某些生物或非生物逆境激活并通过纵向 和横向在物种内和物种间传递，对植物基因组的结构、功能和进化起着重要的作用 ( 唐益苗和马有志，2 0 0 5 ) ：反转录转座子广泛存在于果树，如柑橘( a s i n se ta l ， 1 9 9 9 ；b r e t 6e ta l ，2 0 0 1 ；b e m e te ta l ，2 0 0 3 ) 、苹果( y a oe ta l ，2 0 0 1 ；孙俊等，2 0 0 5 ) 、 桃( c h a p a r r oe ta l ，1 9 9 5 ；s h ie ta l ，2 0 0 2 ) 、柿子( n a k a t s u k ae ta l ，2 0 0 2 ) 、葡萄( k o b a y a s h i c ta l ，2 0 0 4 ) 等基因组中，并参与品种的进化。 c h a p a r r o 等( 1 9 9 5 ) 认为 p i l l a r 桃叶片和果实均积累花青素是由于反转录 转座子活动造成。y a o 等( 2 0 0 1 ) 研究发现苹果r a ei m e 、s p e n c e rs e e d l e s s 和 w e l l i n g t o i lb l o o m l e s s 等单性结实品种的m d p i 基因内含子中均有反转录转座子 的插入，从而导致该基因的转录受阻，花瓣和雄蕊不能形成而引起单性结实。t i g n o n 等( 2 0 0 1 ) 用差异显示法鉴定苹果果皮色泽的变异，发现其中l 条差异片段与若干 c o p i a 类反转录转座子的反转录酶基因有很强的相似性，s o u t h e r n 杂交表明该片段在 苹果基因组中有多个拷贝。k o b a y a s h i 等( 2 0 0 4 ) 研究发现白皮葡萄品种i t a l i a 和 m u s c a to f a l e x a n d r i a 芽变成红皮葡萄的原因是由于调节基因v v m y b a l 的上游启 动子区域被反转录转座子插入所致。 a s i n s 等( 1 9 9 9 ) 的工作则表明柑橘基因组中普遍存在的c o p i a 类反转录转座子 与裸子植物( g n e t u mm o n t a n u m ) 的相似程度很高，而且脐橙中包含r t 序列的d n a 片段存在c 甲基化现象，而在伏令夏橙中并不存在，说明反转录转座子也参与了甜 橙的品种演变过程。b r e t 6 等( 2 0 0 1 ) 揭示了北非和西班牙两种生态型克里曼丁橘之 间的演变也与反转录转座子的多态性变化有关。因此，本研究从c o p i a - l i k e 反转录 转座子的反转录酶编码序列的克隆入手，系统研究柑橘基因组中这类反转录转座子 的组成、变异和演化模式，以c o p i a - l i k e 反转录转座子在柑橘基因组进化中的作用。 此外，采用一对同位酶h p a l i 和m s p i 消化柑橘基因组d n a ，研究在柑橘愈伤组 织离体保存过程中及秋水仙素处理诱发四倍体的逆境条件下，分析g y s p s y 1 i k e 反转 录转座子p o l 结构域的甲基化变化情况。最后，本研究还期望能够以反转录转座子 开发分子标记，开发简单快捷的柑橘品种分子鉴别方法。 1 2 前人研究进展 1 2 1植物反转录转座子的研究进展 1 2 1 1 植物反转录转座子的类型与结构 反转录转座子是真核转座元件中最为丰富的一类，包括长末端重复( 1 0 n g t e r m i n a lr e p e a t s ，l t r s ) 反转录转座子和非长末端重复反转录转座子( k u m a re ta l ， 1 9 9 6 ：g r a n d b a s t i e ne ta l ，1 9 9 2 ) 。l t r 反转录转座子又可分为c o p i a 类和g y p s y 类 ( v o y t a se ta l ，1 9 9 2 ：s u o n i e m ie ta l ，1 9 9 8 ) ，它们在植物基因组中都是高拷贝。c o p i a 类在单细胞藻类、苔藓植物、裸子植物和被子植物中广泛存在；g y p s y 类存在于裸 子植物和被子植物中。n o n - l t r 反转录转座子在植物物种中也是高拷贝( k u n z ee t a l ，1 9 9 7 ；b e n n e t z e n ，1 9 9 6 ) ，因为没有两侧的l t r 存在，而以p o l y ( a ) 或a - r i c h 序列结尾( g a b r i ea n dn o e k e ，1 9 9 6 ) ，根据结构它又分为长散在元件和短散在元件。 l i n e 在植物界中大量存在，s i n e 仅出现在被子植物中。 l t r 反转录转座子两侧翼具有长末端重复序列，其长度从1 0 0b p 到5k b 不等。 l t r s 不编码蛋白质，但包含有对转座起重要作用的起动子和终止子( j o s e pe ta l ， 2 0 0 3 ) 。l t r s 以短的反向重复为末端，通常为5 - t g 3 和5 - c a 3 。反转录转座子 编码很多的蛋白质，其中主要的有三个基因，即g a g ( 种属特异抗原) 、p o l ( 聚合酶) 和i n t ( 整合酶) 。g a g 基因编码的蛋白质参与反转录转座子r n a 的成熟与包装，使 反转录转座子的r n a 适合于整合入基因组。p o l 基因编码反转录酶和r n a s eh ，这 是反转录转座子的复制和转座所必需的。i n t 所编码的整合酶d n a 状态的反转录转 座子整合入染色体上新的位点。t y l - c o p i a 和t y 3 - g y p s y 两类反转录转座子的明显不 同之处在于栅和p o l 基因的排列顺序( k u m a r e ta l ，1 9 9 9 ) 。 非l t r 反转录转座子是比l t r 反转录转座子简单的转座因子。其中的l i n e s 也包含有和l t r 反转录转座子相同的蛋白质。l i n e s 有g a g 和p o ! 基因，但是缺乏 2 确定的整合酶基因。通过序列分析发现，l i n e s 可能是真核生物中最古老的一类反 转录转座子，第一个l t r 反转录转座子可能是由l i n e 获取l t r 而产生( x i o n g e ta l ， 1 9 9 0 ) 。s i n e s 是一类很小的反转录转移因子，和其他类型的反转录转座子明显不同， 它们不编码任何反式作用的具有转座功能的基因( y a s u ie ta l ，2 0 0 1 ) 。所有已知的 s i n e s 都来源于t r n a s ( l e n o i r e ta l ，2 0 0 1 ) ，具有高效复制能力，并且可以被l i n e s 和l t r 反转录转座子所编码的蛋白质整合入基因组。关于该类反转录转座子的复制 和整合，目前研究的还不是很清楚。 l t r 反转录转座子l t rr e t r o t r a n s p o s o n s t y l c o p i a 家族t y l - c o p i af a m i l y 5 l t r 1 - g a g _ ll 卜p o l 叫l 3 l t r 叫丑丑j 阳吨! _ n 叫习丑卫三亘 _ 附 母 t y 3 - 积p s y 家族t y 3 - 铡 p s yf a m i l y 5 l t r i _ g a g 呻ii p o i 叫i 3 l t r 科丑陋近三 - 叵叵叵亘匝1 唧七母 n o n l t r 反转录转座子n o n l t rr e t r o t r a n s p o s o n s 臣丑 s i n e 图1 - 1t y l - c o p i a ，t y 3 - g y p s y 、l i n e 、s i n e 反转录转座予的结构 f i g 1 1s t r u c t r u r eo ft y l - c o p i a ，t y 3 - g y p s y 、l i n e 、s i n er e t r o t r a n s p o s o n s 1 2 1 2 反转录转座子的分布特点 反转录转座子广泛分布于植物基因组中。在整个植物界，从单细胞的藻类植物 到裸子植物和被子植物都有t y l c o p h 2 类反转录转座子的存在。因此，植物的 t y l - c o p i a 类反转座子研究的较为透彻。t y 3 - g y p s y 类反转录转座子同样广泛存在于 裸子植物和被子植物中。并且，这两类反转录转座子在大基因组植物中都是以高拷贝 存在( m e y e r se ta l ，2 0 0 1 ) 。l i n e 也常常以高拷贝存在于已研究过的植物中，并且和 3 l t r 反转录转座子一样广泛分布于植物界( n i s h i m u r ac ta l ，2 0 0 0 ；n o m ae ta l ，1 9 9 9 ) 。 s i n e 目前在几种被子植物中发现，在其他植物中的分布还需要进一步的研究 ( l e n o i r , 2 0 0 1 ) 。迄今，在植物核基因组和线粒体基因组中都发现有反转录转座子的 分布( i m s a n d ee ta l ，2 0 0 1 ；u n s e l de ta l ，1 9 9 7 ；k n o o pe ta l ，1 9 9 6 ) ，而在叶绿体基因组 中还未发现有反转录转座子存在。通过原位杂交发现，反转录转座子在染色体上的分 布因其种类和宿主不同而不同。有的分布比较均匀，而有的很不均匀。有的只在某些 特定的区域较多，而在另外的区域则缺乏( p r e s t i n ge ta l ，1 9 9 8 ) 。在植物染色体的核 仁组织区，还没有发现反转录转座子的存在。很多反转录转座子在常染色质区分布 较多，而这些区域是基因较为集中的地带，最近在小麦上的研究表明，反转录转座 子的插入多集中在基因的临近区域或富基因区域的侧翼( s a n d h ua n dg i l l ，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 3 反转录转座子的传递和起源进化 反转录转座子的传递特点和其他基因一样，可以从亲代传递到下一代，称为纵向 传递( v e r t i c a lt r a n s m i s s i o n ) 。一般来讲，对于同一植物同一品系的同一家族的反转 录转座子，这种简单的遗传传递是主要的传递途径。除了纵向传递外，还有横向传 递( h o r i z o n t a lt r a n s m i s m o n ) ，即反转录转座子在不同物种之间，通过非有性途径进 行传递，这类似于病毒的传递。由于多数植物反转录转座子缺乏类似于反转录病毒 的包裹基因( e n v e l o p e ，e n v 基因) ，所以其传递必须有媒介的存在。目前的推测是 通过病毒或病菌将同一类反转录转座子在不同植物之间进行传递( k u m a re ta l ， 一- t 9 9 9 ) 。横向传递的结果使一种物种中的反转录转座子在多种无必然亲缘关系的物种 中广泛分布。关于转录反转录转座子的起源，一种观点认为，反转录转座子起源于 r n a 为基础的基因组向d n a 为基础的基因组转变过程的初期( g e s t e l a n da n d a t k i n ，1 9 9 3 ) ；但另外一种观点认为反转录转座子在第一个真核生物出现后就产生 了，然后纵向和横向传递后达到目前大范围的分布。通过对l i n e 和l t r 型反转 录转座子编码的保守的基因产物序列分析表明，第一个出现的反转录转座子是l i n e 元件，而l t r 型反转录转座子是l i n e 获得l t r 而进化来的( k u m a re ta l ，1 9 9 6 ) 。 反转录病毒是从t y 3 - g y p s y 类反转录转座子中的一个亚群获得一个编码外壳蛋白 的基因进化而来的( x i o n ge ta l ，1 9 9 0 ) 。 1 2 1 4 反转录转座子的高异质性 通过基因组序列比较，发现在所有高等植物中，同一类反转录转座子的同一家 族，在基因组上都是高度异质性的。v e r s h i n i n 和e l l i s ( 1 9 9 9 ) 对豌豆p d r l 反转录 转座子的研究发现，在其g a g 区域，存在着较其他区域更多的变异，这些变异与豌 豆属的进化系统图一致。反转录转座子存在高异质性的原因，可能是因为反转录转 座子的转