（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕phf5a基因的研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 p h f 5 a ( p l a n th o m o l o g yd o m a i nf i n g e rp r o t e i n5 a ) 转录起始因子，它的分布十 分广泛，从酵母到人类几乎所有真核生物中都发现了该蛋白，但至今在原核生物 中尚未发现此蛋白。它编码1 1 0 个氨基酸，属于一种高度保守的小转录因子或协 因子，缺少了p h f 5 a ，会产生剪接不完全的p r e m r n a 。另夕 , p h f 5 a 还与细胞周 期密切相关，缺少了p h f 5 a ，有丝分裂终止在g 2 m 期。我们在对家蚕蛹c d n a 文 库测序过程中获得了一个类似p h f 5 a 的基因序列，此基因由三个外显子和两个内 含子组成，编码1 1 0 个氨基酸。序列分析发现此基因编码的氨基酸序列与果蝇、 人、小鼠、家鼠等物种的p h f 5 a 蛋白同源性都超过了9 0 ，因此我们将此蛋白命 名为b m p h f 5 a 。推测的蛋白分子量、等电点分别为1 2 4 7l ( d a 和8 4 ，这也与已知 的p h f 5 a 蛋白相似。 将b m p h f 5 a 基因o r f 克隆至i j p g e m t 载体上，构建了重组质粒，经e c o ri 和励di 双酶切后，插入表达载体p e t 一2 8 a ( + ) 的相应酶切位点中，成功构建了表 达质粒，并转化感受态大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经p c r 、酶切鉴定以及测序分析重 组正确。i p t g 诱导表达后裂解菌作s d s p a g e 分析，在1 6 k d 处有一条特别浓的 条带，与预期值相符，表达量可达菌体总蛋白的4 0 左右。融合蛋白以不溶性的 包涵体形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤；对包涵体进行溶解 和梯度透析复性；采用亲和层析纯化融合蛋i 刍h i s b m p h f 5 a 。以该融合蛋白为 抗原免疫雄性新西兰兔制作了该重组蛋白的多克隆抗体，e l i s a 检测该抗体血清 的效价可达到1 ：3 2 0 0 0 。w e s t e m f n 迹实验进一步验证了目的蛋白的表达。在亚 细胞定位中，发现该蛋白主要存在于在细胞核中。r n a i 显示b m 5 细胞在g 2 m 期 的数目增加。 关键词：p h f 5 a ；家蚕；锌指蛋白；亚细胞定位；细胞周期 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t r a n s c r i p t i o na c t i v a t o rf a c t o rp h f 5 ai sf o u n di nm a n yd i f f e r e n ts p e c i e sr a n g i n g f r o my e a s tt oh u m a n ，b u tn oh o m o l o g o u ss e q u e n c ew a si d e n t i f i e di nab l a s ts e a r c h o ft h ep r o k a r y o t i cd a t a b a s e i tb e l o n g st oas m a l lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro rc o f a c t o r w h i c he n c o d e s110a c i d s i fp h f 5 ad e l e t e d ，p r e m r n as p l i c e du n c o m p l e t e dw a s f o u n da n dc e l lc y c l ew a s d e p l e t e dt og e m a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l es e q u e n c i n go f s i l k w o r mp u p a e ，au n i q u eb o m b y xm o r ie d n aw a si d e n t i f i e dw h i c hc o n t e i n st h r e e e x o na n dt w oi n t r o n t h ep h f 5 a p r o t e i nc o n s i s t so f1 10a a s h o m o g e n e o u sa n a l y s i s s h o w e dt h a tb m p h f 5 as h a r e d9 0 o fi d e n t i t yw i t ht h a ti nb o t hd r o s o p h i l aa n d v e r t e b r a t es u c ha sh o m o s a p i e n s ，r a t t u sn o r v e g i c u s ，m u sm u s c u l u s a c c o r d i n gt ot h e s e q u e n c i n gd a t a ，t h em o l e c u l a rw e i g h t s ，a n di s o e l e c t r i cp o i n t sw e r ee s t i m a t e da s12 4 7 k d aa n d8 4f o rb m p h f 5 as i m i l a rt oo t h e rp h f 5 a p r o t e i n si d e n t i f i e d i nt h i sp a r t ，ap h f 5 ag e n ew a sf o u n di nt h ee d n a l i b r a r yo ft h i sl a b o r a t o r y t h e o r fo ft h eg e n ew a ss u b c l o n e di n t op g e m - t v e c t o r , a f t e rb e i n gd i g e s t e dw i t he c o r ia n dx h oi ，t h ed n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h e r e s u l to fp c ra n dd i g e s t i o nw i t he c o ri x h ois h o w e dt h a tt h ed e s i g n e df r a g m e n t w a si n s e r t e dc o r r e c t l y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss e q u e n c e da n dt h es e q u e n c e m a pi n d i c a t e dt h a tar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) i n d u c e db y i p t gt h ea n a l y s i so fs d s - p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh i s - - b m p h f 5 aw a s e x p r e s s e dh i g h l yi nb l 21 ，w h i c ha c c o u n t e du pt o4 0 o fg e r mp r o t e i n s t h em o s t r e c o m b i n a n t p r o t e i nw a s i n s o l u b l ei n c i s i o n b o d ya n do n l y l i t t l ef r a c t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i no fh i s b m p h f 5 aw a ss o l u b l e i no r d e rt oo b t a i na b u n d a n t s o l u b l er e c o m b i n a n tp r o t e i n ，t h ei n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d yw a ss o l u b i l i z e d ，r e f o l d e d a n dp u r i f i e d b yn i 2 + t r a pa f f p h f 5 a t yc h r o m a t o g r a p h y , p r o t e i nh i s b m p h f 5 aw a s o b t a i n e d i m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t hf u s i o np r o t e i ng e n e r a t e dh i g ht i t e r ( 1 ：3 2 0 0 0 ) p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ，m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e mb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ea n t i b o d yc o u l db i n dt h e e x p r e s s i o nh i s - b m p h f 5 as p e c i f i c a l l y p h f 5 aw a s i i 浙江理工大学硕士学位论文 f o u n di nn u c l e u sb ys u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n k e y w o r d s ：p h f 5 a ；b o m b y xm o r i ； z i n cf i n g e rp r o t e i n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ； c e l lc y c l e i i i 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是 本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和 引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及 成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：壶1 毒选 日期：沙哆年3 月日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作粪完全了解学校有关保留、使用学位论文的舰定，同_ ；蠹：学校傈鞭 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理二e 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据疼遴 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文藩予 保密口在年解密后适用本版权书。 不保密脚 学位论文作者签名：玉1 毒睦 日期：沙审年；月咫日 臌辄够幽 日期：2 岬年多月峥日 浙江理工大学硕士学位论文 第一章综述 植物同源域蛋白( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r p r o t e i n ，p h d ) 亦称白血病关联 蛋白1 1 1 ( l e u k e m i aa s s o c i a t e dp r o t e i n ，l a p ) 。是在1 9 9 3 年s c h i n d l e r f l l 在研究拟 南芥同源域蛋白( h o m e o d o m a i n ) h a t 3 蛋白时发现的。它含有一类特征为 c y s 4 h i s - c y s 3 的锌指蛋白结构域( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r ，p h d f i n g e r ) 长约 5 0 个氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均与r i n g f i n g e r ( c y s 3 一h i s c y s 4 ) 和l i m 结构域( c y s 2 一h i s c y s 5 ) 相似【2 1 。经研究证明p h d f i n g e r 除了在植物中，它也 广泛存在于酵母、线虫与哺乳动物q h 3 , 4 1 。p h i ) 一f i n g e r 主要存在于转录调节蛋白， 和染色质调节复合物( c h r o m a t i n m o d u l a t i n g c o m p l e x e s ) 中，它可能是蛋白质与 蛋白质、蛋白质与d n a 或蛋白质与r n a 相互作用区【2 1 。 转录起始因子是在基因表达中具有转录起始作用的一类蛋白质的统称。 p h f 5 a ( p l a n t h o m e o d o m a i n f i n g e r p r o t e i n5 a ) t 5 1 亦称i n i ( i n i = i m t i m i o n ) 【6 1 也是一种 含有p h d f i n g e r 的蛋白质，属于一种高度保守的小转录因子或协因子【5 】，并在 p r e r n a 剪接【7 】，细胞周期及d n a 损伤修复中具有重要的作用。 1p h f 5 a 的发现 i n i 是在研究受雌激素诱导的子宫肌层间隙连接蛋白c x 4 3 时发现的，并因其 具有转录起始因子的作用而命名【5 1 。 受雌激素诱导的子宫肌层间隙连接蛋i ! t c x 4 3 属于c o n n e x i n 家族【8 1 ，它是一种 跨膜蛋白，在胎儿发育早期表达【9 1 ，在成体中的许多组织中都有发现。它在心肌 中表达量最高，并且是组成型表达【1 0 1 。在子宫中，c x 4 3 在调节肌肉同步收缩中 是相当必要的】，与心肌的组成型表达不同，c x 4 3 在子宫中的表达受到固醇类 激素调控”】。为了研究雌激素在子宫肌层中的诱导机制，陈等提出在家鼠 t a t a 框上游1 2 b p 处有激活蛋白( a c t i v a t o r p r o t e i n ) 1 位点，转录激活因子家族c “h 和c - f o s 通过结合在激活蛋白1 位点而间接发挥作用。但是人们发现如果突变a p 一1 位点从而使c q u n 和c - f o s 不能与a p 一1 位点结合并不能消除c x 4 3 基因对雌激素的反 应f 7 】。通过分析表明，临近c x 4 3 启动子的区域对于c x 4 3 基因对雌激素的反应也是 非常重要的。此区域可以与含1 1 0 个氨基酸的蛋白质结合，人们通过扫描受雌激 浙江理工大学硕士学位论文 素诱导的鼠子宫肌层表达文库而鉴定出这是一个新的保守性相当高的锌指蛋白 1 5 ，它属于一种高度保守的小转录因子或协因子7 1 ，能增强c x 4 3 对雌激素的应答 f 1 。因为这种蛋白具有转录起始因子的作用，取起始( i n i = i n i t i a t i o n ) 前三个字母 命名之，即i n i ”，后来有人在鼠的基因组中分选出了这种蛋白质，因其含有 p h d f i n g e r 结构域就将其命名为p h f 5 a i ”，目l j 关于这种蛋白质还没有统一的名 称，本文中以p h f 5 a 命名。 2 p h f 5 a 的特征 p h f 5 a 是一种高度保守且广泛存在的蛋白质，分布在从酵母到人类的真核生 物中，但迄今为止在原核生物中没有发现p h f 5 a 的存在7 1 。n o r t h e r nb l o t 分析表 明，p h f 5 a 在不同的组织中，如：脑、心脏、卵巢、子宫、骨骼肌、睾丸中都只 有单一的转录本，长约1 2k b t ”。 2 1p h f 5 a 的保守性 p h f 5 a 只有短短的1 1 0 个氨基酸【5 1 ，但它在进化上是极度保守的。在蛋白质 水平上，在n c b i 上进行b l a s t 时发现( 如图1 1 所示) ，p h f 5 a 在脊椎动物中的 同源性为1 0 0 ，在多细胞生物中，p h f 5 a 的同源性要超过8 0 ，即使在同源性 最低的啤酒酵母中p h f 5 a 的同源性也超过t 5 0 t 羽。在核酸水平上，p h f 5 a 也是 相当保守的，在n c b i 上进行b l a s t 时发现，鼠和人的同源性超过了9 0 。在用 家蚕进行b l a s t 时发现，家蚕与人、鼠等脊椎动物及果蝇、冈比亚按蚊的同源 性都超过了9 0 ，但是家蚕与果蝇、冈比亚按蚊的同源性低于人、鼠等脊椎动物 等的同源性，相差的部分来自于羧基端的n l s 序列。 图1 1p h f 5 a 在不同物种中的同源性比对1 8 i 2 浙江理工大学硕士学位论文 f i 9 1 1a n a l y s i so fp h f 5 ah o m o l o g yi nd i f f e r e n ts p e c i e s ，i d e n t i c a lr e s i d u e sa r eb o x e di n b l a c k , c o n s e r v e dr e s i d u e sa r eb o x e di ng r a y 2 2p h f 5 a 的分布 从酵母到人类的真核生物中都发现了p h f 5 a ，但在原核生物中尚没有发现 p j 。在挪威鼠中的n o r t h e r nb l o t 分析表明，p h f 5 a 在不同的组织中，如：脑、心 脏、卵巢、子宫、骨骼肌、睾丸中都只有单一的转录本 ”。而在对家鼠进行染色 体定位时发现，p h f s a 存在假基因，并且p h f 5 a 与假基因分别位于不同的染色 体上【6 】。用融合了g f p 的重组g f p p h f 5 a 进行亚细胞定位发现p h f 5 a 位于细胞核 内，并在核仁中没有发现p h f 5 a 的存在【7 1 。目前，所有的研究都集中在脊椎动物 中的人、鼠及无脊椎动物的酵母、线虫中，在昆虫中尚没有报道。 2 3p h f s a 的结构特征 对p i t f 5 a 进行二级结构预测发现p h f 5 a 从n 端到c 端依次为：三个锌指结构、 一个亮氨酸拉链、一个核定位信号( n l s ) 【7 】( 如图1 2 所示) 。在此结构中，最 n 端的锌指结构含有较多的碱性氨基酸，体# b e m s a 实验发现，当切除此区域发 现p h f 5 a 不能结合至i d n a 上，而切除后两个锌指结构并不妨碍p h f 5 a 结合到 d n a ，说明最n 端的锌指结构是结合d n a 所必须的。虽然切除后两个锌指结构并 不妨碍p h f 5 a 结合到d n a ，但是p h f 5 a 并不具备转录因子或协因子的功能。c 端n l s 序列在p h f 5 a 的转运过程中发挥着重要的作用，人们发现【酿，如果切除 n l s 序y l j p h f 5 a 将不能进入细胞核内，而是富集在细胞质中。 t 鹳拣狮矬辅糖辅甜 狂猕符戡钔髓t 0 2t 琦 戳瞪疆童趟立篷毯越盎：越函杰波士士捌翻 材抖e e ee ee eeeeelgllr k 拭螭髓 = 罱= 墨= 目霉# t t _ 蚴 r h 婚f 嘲 h 籼z t p l w 图1 2p h f 5 a 序列分析h i f i 9 1 2a n a l y s i so ft h ep h f 5 as e q u e n c e 3 p h f s a 的功能特点 3 1p h f s a 在基因表达时的调节作用 浙江理1 ：人学硕士学位论文 3 1 1 作用特点 p h f 5 a 作为转录因子或协因子结合到基因的启动子7 5 - 3 4 附近的区域启动 或促进基因的转录【5 1 ；p h f 5 a 在不同的细胞或组织中对雌激素的反应可能是不同 的f 7 ，m 】，例如，在非洲绿猴肾纤维原细胞中p h f 5 a 的表达量随雌激素的浓度的 升高而增；9 1 1 7 1 ，而在人肝癌上皮细胞p h f 5 a 的表达量与雌激素的浓度没有关系 【7 】：在生物发育的不同时期具有不同的作用【1 7 】，如在线虫的幼虫中p h f 5 a 是必 需的，缺失了它将造成幼虫的死亡，但是缺失了p h f 5 a 的成体不会死亡。 3 1 2p h f 5 a 在c x 4 3 表达时的作用 c x 4 3 作为一种跨膜蛋白聚合在一起在细胞表面形成间隙连接通道【1 8 】，有利 于细胞间的物质和能量的交流。另外c x 4 3 能够调节细胞的电势差【1 9 】，在信号转 导途径中发挥重要的作用，比如，c x 4 3 能够调节心肌细胞有节律的跳动饽】。c x 4 3 基因在表达过程中受雌激素受体调节 7 , 2 0 , 2 1 】。 o l t r a 等人【5 】在研究中发现，在c x 4 3 表达过程中需要p h f 5 a 的参与。p h f 5 a 作为转录因子或协因子能够特异结合在c x 4 3 基因启动子一7 5 3 4 附近的区域增强 c x 4 3 基因对雌激素的反应【”。p h f 5 a 结合到c x 4 3 启动子上时，促进了雌激素受 体转录激活作用1 1 2 2 2 3 l ( a c t i v a t i n gf u n c t i o n1 ) ，而不是转录激活作用2 【7 l ( a c t i v a t i n g f u n c t i o n2 ) 。用重组质粒p c d n a f l a g 。p h f 5 a 转染h e l a 细胞发现【7 】，p h f 5 a 的过量表达以剂量效应的方式增强c x 4 3 的表达。在研究p h f 5 a 对c x 4 3 表达调 节作用是发现了一个十分奇特的现象，o l t r a 等人1 7 1 将p h f 5 a 与雌激素一同处理 小鼠，n o r t h e r n b l o t 分析表明，p h f 5 a 的m r n a 含量提高了，似乎表明p h f 5 a 的表达与受雌激素相关。 3 1 3p h f 5 a 对e r a 调节作用 雌激素受体( e r e 0 是配体依赖的转录调节因子【2 4 , 2 5 1 ，属核受体超家族成员。维 持雌性性征、卵泡发育、排卵等生理活动2 5 ，26 1 ，并在子宫成熟和胚胎附植过程 中起着重要作用2 ”。 在研究p h f 5 a 对c x 4 3 调节作用时，o l t r a 等人【7 坼带荧光素酶的重组质粒 h e l 5 p h f 5 a 转染到h e l a 细胞中，此质粒只表达e r a 的转录激活作用i ( a f 1 ) 结构域，在与只带有荧光素酶而没有e r a 的重组质粒h e l 5 比较发现，荧光素 水平有明显提高，暗示p h f 5 a 能够增强e r c t 的活性，并且能够激活a f l 7 , 2 8 。 随后他们又构建了重组质粒h e o p h f 5 a ，此质粒中可表达的e r a 的a f 一1 和转 4 浙江理l ：人学硕士学位论文 录激活作用2 ( a f 一2 ) 双结构域7 ，2 8 9 1 ，出现了同样的结果。但是当用只表达a f 2 的载体h e l 9 构建重组质粒h e l 9 p h f 5 a ，转染h e l a 细胞时发现，荧光素水平 并没有明显变化。这说明p h f 5 a 能够特异地与a f 1 结构域作用。 3 2p h f 5 a 在p r e - m r n a 剪接中的作用 r n a 剪接( r n as p l i c i n g ) 是t r n a 、r r n a ，特别是m r n a 加工与成熟的重 要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一f 3 0 , 3 1 。r n a 剪接 是一个多步骤、形成多种中问状态复合物的复杂过程。r n a 剪接需要多种因 子参与，包括杂性核r n a ( h e t e r o g e n e o u s n u c l e a r r n a ，h n r n a ) 结合蛋白 h n r n ( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n ) 、小核r n a ( s m a l ln u c l e a rr n a ， s n r n a ) 结合蛋白s n 时姐( s m a l l n u c l e a rr i b o n u e l e o p r o t e i n ) 等【3 2 ，3 3 ，3 4 1 。 p h f 5 a 是一种与p r e m r n a 剪接相关的蛋白质，2 0 0 2 年，o h i 等人对s c e r e v i s i a e 和p o m b e 中纯化的复合物u 2 ，u 5 脚6s n 对妤进行光谱分析时发现了 p h f 5 a 1 3 5 】，同时如果阻断t p h f 5 a 的表达，会产生剪接不完全的p r e m r n a t 6 ，15 1 。 通过r t - p c r 检测正常细胞的p r e m r n a 与剔除了p h f 5 a 的细胞的p r e - m r n a ，发 现在突变体中p r e - m r n a 累积【6 】，这些p r e m r n a 是c d c 2 5 ，c d c 2 8 ，p r p l 2 ，它们编 码的蛋白在细胞周期中具有重要的作用。在剔除了p h f 5 a 的细胞中除了有 p r e m r n a o b ，人们还发现细胞周期被阻滞在g 2 期【“，似乎表明在p r e m r n a 的剪 接中p h f 5 a 是必要的，同时一些有丝分裂必需因子m r n a 的形成也需要p h f 5 a 。 3 3p h f 5 a 在细胞周期中的作用 有丝分裂时从g 2 期到m 期的转换i ： t c d c 2 有丝分裂周期蛋白的活性控制【3 6 1 。 有丝分裂中，c d c 2 c d c l 3 - - - - 聚体中的c d c 2 亚基处于活性状态，其t h r - 1 5 没有磷酸 化，而t h r - 1 6 1 被磷酸化。在起始点后，c d c 2 c d c l 3 二聚体的活性被t h r - 1 5 上增加 的磷酸基团抑制p 引。因此，该抑制性磷酸基团的去除是激活有丝分裂的关键。 c d c 2 5 编码酪氨酸磷酸酶，该酶对c d c 2 c d c l 3 二聚体中c d c 2 的去磷酸化是必需的 3 9 4 1 1 。 在通常情况下，细胞分裂周期与细胞大小有关。w e e l 基因通常抑制细胞进 入有丝分裂直到系细胞体积足够大4 2 1 。w e e l 编码异常类型的激酶：它可以磷酸 浙江理l ：大学硕士学位论文 化s e r t h r 和t y r ，它通过磷酸化t h r - 1 5 抑带1 c d c 2 4 3 , 4 4 1 。 w e e l 产物与c d c 2 5 的产物有拮抗作用。w e e l 的激酶活性作用在t h r - 1 5 上抑 制c d c 2 的功能”1 。c d c 2 5 的磷酸化活性作用在同一个位点上激活c d e 2 。c d c 2 5 过量表达的突变与w e e l 的缺失突变有相同的表型。因此，c d c 2 活性的调控对决 定酵母细胞何时允许自身进入分裂循环很重要；被w e e l 抑制和被c d c 2 5 激活允 许细胞依赖环境或其它信号来控制这些调控因子。 2 0 0 3 年，w e r n e r 等人【”1 构建p h f 5 a 缺失体，发现细胞变长，失去有丝分 裂能力。而当他们将构建重组质粒p j k - r e p 8 1 一p h f 5 a i ( 载体r e p 8 1 含有硫胺素 抑制启动子n m t 8 1 ) 转染到p h f 5 a 缺失体中，记为a p h f s a l ，发现细胞恢复有 丝分裂能力，当用硫胺素处理a p h f 5 a 1 时发现，细胞表型与p h f 5 a 缺失体相 同。 为了检测w e e l 在a p h f 5 a 1 中是否起作用，w e m e r 等人剔除了w e e l 基 因，然后构建了w e e l 5 0 p 嬲跗j 双突变体。此双突变体含有硫胺素抑制启动 子n m t s l ，又受温度控制，在2 5 激酶w e e l 表达，而在3 6 就不会表达。经 过比较发现，如果在2 5 加入硫胺素，细胞仍会生长，但如果在3 6 下，细 胞数目就会增多，出现异常有丝分裂，但8 小时后细胞会大量死亡。而在p h f 5 a 缺失体中细胞延长，但不会死亡。这大概可能是因为w e e l 在p h f s a 缺失体起 保护作用。 3 4 在细胞d n a 损伤中的作用 d n a 破坏检验点( d n ad a m a g ec h e c k p o i n t s ) 是指d n a 损伤引发的能使细胞周 期延迟或阻滞的生化调控途径【舶1 ，它指在进入到细胞周期的下一时相前对d n a 的完整性进行检测的一些特殊时点【4 7 1 。如果d n a 损伤，会引发一系列细胞反应， 包括：( 1 ) 激活d n a 修复系统，修复受损的d n a ，使d n a 复制继续进行；( 2 ) 激活 d n a 破坏检验点，使细胞周期阻滞，以便细胞有充分的时间进行修复，避免该 损伤遗传至后代细胞；( 3 ) 使一些损伤严重、修复无望的细胞发生凋亡；( 4 ) 转录 某些特定的基因，以利于细胞的生存 4 8 - 5 1 】。 r a d 3 与属于p 1 3 k 激酶家族 5 2 1 ，在d n a 损伤检验点的活化中起着重要的作用 1 5 3 - 5 5 1 ，是作用于d n a 破坏检验点早期的一种重要蛋白。 浙江理l 大学硕士学位论文 o l t r a 等人构建了酵母p h f 5 a 的缺失菌株观测d n a 受损后细胞的反应，他们 检测了& p o m b e 中的检验点激酶r a d 3 。研究发现r a d 3 并没有什么变化，细胞也没 有出现修复的迹象【1 5 1 ，同时细胞仍然不能分裂，这似乎表明p h f 5 a 弓i 起的细胞 分裂中止现象是细胞本身不可修复的。他们随后构建了重组质粒r e p 3 x p h f 5 a 转染到缺失菌中，发现细胞又能进行有丝分裂。 但是，t r a p p 等人在线虫中进行相同的实验时发现【1 7 j ，在胚胎期和幼虫期缺 失了p h f 5 a 会引发线虫的死亡，而在成虫中缺失了p h f 5 a 不会诱发细胞的死亡。 4 展望 综上所述，p h f 5 a 在基因表达、细胞周期、p r e m r n a 剪接等过程中发挥着 重要的作用。但是作为一种上世纪9 0 年代后期才发现的蛋白质，相关研究还不 是很多，蛋白质的功能还不是很明确。比如：人们在p r e m r n a 剪接复合体中发 现了p h f 5 a t ”1 ，可p h f 5 a 是参与p r e m r n a 剪接复合体的形成，还是作为剪接 复合体的一部分参与p r e - m r n a 的剪接；p h f 5 a 作为转录因子或协因子存在【7 1 ， 那么它调控哪些基因的表达，具体调控机制又是怎样的? 另外，人们发现p h f 5 a 在幼体中是必不可少的，而在成体的缺失体又不是致死的【”】，这又是为什么? 在d n a 损伤时会引发多种细胞反应，但是当p h f 5 a 缺失时，细胞既没有激活 修复系统，也没使这些无法修复的细胞发生凋亡，那么在细胞中应该有一种代偿 机制，此机制虽然无法使细胞继续分裂，但却能够使细胞生存，此机制到底是什 么，又是怎样发挥作用的? p h f 5 a 的保守性相当高，但是它的分布又具有局限 性，那么p h f 5 a 是如何进化而来得，为什么只在真核生物中表达，原核生物中 到底有没有这种蛋白质，在真核生物中它最基本的功能到底是什么? 它能否作为 进化的标尺? 鉴于p h f 5 a 的高保守性，我们有理由相信它在生物体的发育过程 中扮演非常重要的角色。相信在不远的未来，p h f 5 a 的功能及其保守原因都会 更清楚。 浙江理 大学硕十学位论文 第二章b m p h f s a 的生物信息学分析 1 生物信息学工具 用b l a s t 软件( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 在g e n b a n k q 6 对获得的 家蚕新基因的氨基酸序列进行同源性比较，之后使用生物软件网在线b l a s t 工 具( h t t p ：w w w b i o - s o f t n e t ) 寻找o r f 框，并预测其氨基酸序列及基本性质，再 用此氨基酸序列在n c b i 进行b l a s t l l ：对，查找同源蛋白质，根据同源蛋白质的 性质预测其功能。并用b i o e d i t 软件对序列进行比对。并用在线工具p r o t s c a l e 、 t m h m m 、s i g n a l p 对p h f 5 a 进行疏水性分析，跨膜结构预测及信号肽预测。 2 生物信息学分析 2 1b m p h f 5 a 的基因分析结果 2 1 1 b m p h f 5 a 的基因分析 将本实验室的e d n a 序列在家蚕基因组比对确定后，用在线软件分析o r f ，在 n c b i 上比对后，推测为p h f 5 a ，下表两方框内的部分即为p h f 5 a 的o r f ，按 57 端到3 的方向，依次为起始密码子与终止密码子。此基因编码1 l o 个氨基 酸，在基因的3 u t r 处有三个加尾信号。 1 g t t t g 硝瞻a t a a c a a t c a a a g a a c a t t c g c c a g c a g a c c a g a c c 唧嫩t j 珏a a a d 酊g | g c ma 6 1 a a a g c a t c a t c c a g a t t t a a t t t t c t g c a g g a a a c a g c c c g g a g t c g c t a t t g g a c g t t t khh pdl ifcr kq p gva工grl 1 2 1 a t g t g a g a a a t g t g a c g g a a a a t g t g t g a t t t g c g a t t c t t a t g t g c g t c c g t g c a c g t t cekc d gk cv工c d syvr p ct l 1 8 1 g g t t c g t a t t t g t g a c g a g t g c a a c t a t g g c t c g t a t c a g g g g c g a t g t g t g a t t t g c g g vr i c de cny g syqgrcv工c g 2 4 1 c g g g c c t g g a g t a t c t g a t g c t t a t t a _ r t g t a a g g a g t g c a c g a t a c a g g a g a a g g a t a g gp gvs day y c ke c ti q e kdr 3 0 1 a g a t g g c t g t c c a a a g a t t g t c a a t t t g g g a a g c t c t a a a a c a g a t c t g t t c t a c g a g a g d gc pk ivnlgss k td lfyer 3 6 1 a a a g a a a t a t g g g t t t a g g a g a c a d t a g 阻t t a g g t t t c t t t t t a g t t t t t a a a t a t t a a kk y gf r rh 4 21 t t t c t g c a a a g t t t c t g t t a t t t a a a a t a a t a a a a a c a g a g g t t t t t c t c a a c t a a a g t t 4 8 1 t g a t t g a a a t a c a a g t t t g t t t t t a t c a a c t a c t t t g t t g t t g a c t t t t t a a a g c c a a c g 5 41 g c t a t t a t g a t c a a g t a t g g t t t t c a a t g t c t a a a g a g t t g c a g c t c g g g t c c a a g a g a a 浙江理f ：人学硕士学位论文 6 0 1a t t c a c a t a t a t t t t t t t a a a t t c a t t c a t t t a t a c a a t t g g a t 粥t 粥t i a t c g a t g a t 6 6 1 a t c t g t t a t t t t t t t a c a a t t t t t t t t a t c c t t t g t t t a t t c a a t g c a g a t t a g t t t t c a 7 21t t t t c c a a c t a g a a a g a a a a t a c t t g a a a a a t a c a t t t a g t t t t t g c a 唧a a a t t a t t a 7 8 1 a g a t t c a t t t t t a t t t t t t a t t t t t c t a c t a a a t t g t c a a t a a a g a t a t t t t t g a c t a c c 8 41 a t g t g c t c t g t a a a a c t a c a g a c a a t a t g t t a g c a a t a t t c a t g t a t g t a a t g a g a g t g a 9 0 1 t t g t a c t g t g t g a a t g t t g t c t g t c a t a t t t t g a a a a c t a t g t t t c t a g t g t g t a c t t a c 9 6 1 a t t a a g a c a t t a t g t a a t t a t t a a t a a a t g c a t t g g t a t t a c a c 2 1 1 口朋f 纠基因的结构分析 我们将b m p h f 5 a 的e d n a 在家蚕基因组中比对时发现，m p h f 5 a 基因由三 个外显子和两个内含子组成，结果如图2 1 ，其中最两端的用白色方框表示的部 分从左至右依次为5 u t r 和3 u t r ，黑色方框表示o r f ，黑色方框内的线段 表示内含子，各部分下面的数字表示各部分的碱基数。另外，如图所示，5 u t r 和3 u t r 分别与o r f 的5 7 端和37 端相连。 5 二】 二 a 5 5 5 27 4 1 9 1 4 4 49 0 6 1 5 2 2 保守性分析 图2 1b m p h f s a 基因的结构示意图 f i g2 1t h es c h e m a t i cs t r u c t u r eo f b m p h f s a 经过b l a s t 比对确认该基因编码1 1 0 个氨基酸。所预测的蛋白质分子量大约 为1 2 4 7k d a ，等电点约为8 4 。对该蛋白进行同源性分析时，发现该蛋白是相当 保守的，家蚕p h f 5 a 与人、