（有机化学专业论文）人工核酸酶寡聚酰胺与丝组二肽缀合物的合成研究.pdf

摘要 摘要 化学合成的d n a 、r n a 定位切割试剂是国际上8 0 年代开始发展起来的一 类新型的非酶断裂工具，被称为人工核酸酶或化学核酸酶。人工核酸酶是分子 生物学及基因工程的重要工具，它可以作为研究核酸结构和功能方面的探针。 因此开发出高效的人工核酸切割试剂，具有非常重要的理论意义和应用价值。 人工核酸酶主要由识别试剂和切割试剂通过某种连接物缀合而成。 本论文设计合成出了寡聚酰胺，丝组二肽缀合物这样一类新型的人工核酸 酶。它以单体n 一甲基吡咯为原料，合成的寡聚酰胺作为该分子的核酸识别系统。 同时，连接物( 己二胺部分) 与切割系统( 丝组二肽部分) 的组氨酸残基c 端 相连，这样就可以保证切割活性基团一丝氨酸残基上氨基和侧链羟基的相对位 置。实验主要用到了d c c h o b t 偶合反应，c h l o r o f o r m 反应，p d - c 催化氢化反 应，该系列的合成反应条件温和，反应时间短，除少数步骤产率较低外，大部 分收率较高。 我们利用氢谱、碳谱、红外光谱、电喷雾质谱、高分辨质谱及多种二维核 磁麸振谱等分析手段对化合物结构进行了详细的表征，并从中总结出了一些规 律，这对以后判别此类化合物提供了参考。例如，利用1 hn m r 可以很方便的 判断化合物中含有几个n 一甲基吡咯环，利用电喷雾质谱可从化合物的断裂途 径判断出各个基团的连接顺序。 同时为了保证合成的化合物在生物活性测试时的纯度，我们利用高效液相 与质谱联机方式( h p l c e s i m s ) 对多步合成的寡聚酰胺，丝组二肽缀合物进 行分析。与清华大学合作，初步实验发现合成的多聚酰胺，丝组二肽缀合物对 d n a 的切割活性高出丝组二肽数百倍。 关键词：寡聚酰胺丝组二肽缀合物，核酸切割试剂，化合物合成及表征 擅要 a b s t r a c t c h e m i c a lr e a g e n t su s e da st o o l so f d n ao rr n a c l e a v a g ei nas e q u e n c e s p e c i f i c w a yi san e wk i n do f n o n - e n z y m ec l e a v a g et o o l ，w h i c hi sc a l l e dc h e m i c a ln u c l e a s eo r a r t i f i c i a ln u c l e a s e 。a r t i f i c i a ln u c l e a s ei sa l li m p o r t a n tt o o li nm o l e c u l a rb i o l o g ya n d g e n e t i ce n g l n e e r i n g ，i ti sa l s ou s e da sak i n do fn u c l e i ca c i ds t r u c t u r ea n df u n c t i o n p r o b e 。h e n c e ，i th a sv e r yi m p o r t a n ts e n s eo ft h e o r e t i c sa n da p p l y i n gv a l u et of i n d o u t h i g h l ye f f i c i e n ta r t i f i c i a ln u c l e a s er e a g e n t , e s p e c i a l l yc l e a v a g er e a g e n ti na s e q u e n c e - s p e c i f i cw a y 。d n ao rr n ac l e a v a g er e a g e n t sc o n s i s to ft w om a i np a r t s ： t h eo n ei sc l e a v a g es y s t e m ，t h eo t h e ri sr e c o g n i t i o ns y s t e m 。t h e n , t h et w om a i np a r t s a r e c o u p l e d 、i t h al i n k t h e c o u p l e dc o m p o u n d c a l lc u td n ao rr n a s e q u e n c e - s p e c i f i cg r o o v e 。 t h es y n t h e s i sm e t h o do fan e wa r t i f i c i a ln n c l e a s ei sd e v e l o p e di nd e t a i l si nt h e d i s s e r t a t i o n 。t h ep r o d u c t sc o n s i s to fp o l y a m i d eu s e da sr e c o g n i t i o ns y s t e ma n d s e r y l - h i s t i d i n ed i p e p t i d e ( s e r - h i s ) u s e da sc l e a v a g es y s t e m 。t h et w om a i ns y s t e m s a r ec o n n e c t e dw i t hh e x a m e t h y l e n ed i a m i n ea sal i n k 。i nt h ep r o c e s so f s y n t h e s i s ，t h e r e a r ed c c h o b tc o u p l i n gr e a c t i o n , c h l o r o f o r mr e a c t i o n ，h y d r o g e n a t i o nr e a c t i o nu s e d p d - ca sc a t a l y s t s 。t h er e a c t i o nc o n d i t i o ni sm i l d ，t h en e e d e dt i m ei ss h o r ta n dt h e y i e l do fm a n yc o m p o u n d si sg o o d 。a n o t h e rr e a c t i o ni nt h ep r o c e s so fs y n t h e s i si s g e t t i n gr i do fp r o t e c t i n gg r o u po f a m i n oa c i d s 。 s o m ea n a l y s i st o o l sa n dm e t h o d sa r ev e r yn e c e s s a r yi nc h a m c t e r i z a t i o no f s y n t h e t i cp m d u c t s ，s u c ha sl hn m r , 1 3 cn m r ，i n f i a r e ds p e c t r o s c o p y , e l e c t r o s p m y i o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t e r ( e s i m s ) a n dm a n yt w o d i m e n s i o n a ln u c l e a rm a g n e t i c r e s o n a n c es p e c t r a 。s o m ec o n c l u s i o n sc a nb eg e t t e df r o mal o to fd a t a , t h e yc a nb e u s e da sr e f e r e n c e st oo t h e ra n a l o g u e s 。f o re x a m p l e ，b a s e do nt h e s ec o n c l u s i o n si ti s v e r yc o n v e n i e n tt oe s t i m a t eh o wm a n yn - m e t h y l p y r r o l er e s i d u e si no n ec o m p o u n d t h r o u g h1 hn m r 。o r d e ro f r e s i d u e sc o n n e c t i o nc a nb ei d e n t i f i e df r o mf r a c t u r ep a t h s o fc o m p o u n d si ne l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t e r ai no r d e rt om a k ec e r t a i n t h a ti m p u r i t yi ns y n t h e t i cc o m p o u n d sd o n ta f f e c tt e s t so fb i o l o g i c a la c t i v i t y , w em a k e 擅耍 u s eo fo n l i n et e s t i n go fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n de s i - m st o a n a l y z et h em u l t i s t e ps y n t h e t i cp o l y a m i d e d i p e p t i d ec o n j u g a t e 。t h r o u g hp r e l i m i n a r y t e s t s ， i ti sf o u n dt h a td n ac l e a v a g ea c t i v i t yo fs y n t h e t i cp o l y a m i d e d i p e p t i d e c o n j u g a t e si ss e v e r a lh u n d r e dt i m e sm o r et h a nt h a to fs e 】c y l l f i s t i d i n ed i p e p t i d e 。 k e y w o r d s ：p o l y a m i d e d i p e p t i d ec o n j u g a t e ，n u c l e i c a c i d c l e a v a g er e a g e n t ， s y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc o m p o u n d s 郑重声明 入戆学位论文是在导帮摆导下骧立撰写著竞戏鹃，学位论文没有票 袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，褥则，本人愿意承担由 麓一切法德责任积法律焉果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ：华慨 衫年厂月矽r 第一章】鞋- i t 第一章前言 1 1 研究人工核酸酶的意义 分子识别和分子间相互作用的化学基础研究是当前化学生物学的研究热 点，而人工核酸酶是这一研究方向中最为活跃的前沿领域之一【卜4 l 。选择性地水 解切断磷酸二酯键是基因工程的重要课题，具有巨大的潜在应用前景和经济效 益，但是核酸的磷酸二酯键在生理条件及非酶存在条件下，稳定性非常高。例 如：在p h = 7 及温度为2 5 。c 的环境中，d n a 和r n a 中磷酸二酯键的半衰期分 别为2 0 1 0 8 年和1x1 0 8 年，所以需要发展核酸切割试剂。虽然限制性内切酶 在特定位点断裂d n a 分子，但其识别位点仅为轧8 个核苷酸，而且只能在数目 有限的位点断裂d n a ，碎片过多，无法满足分子生物学和基因工程的需要，也 不利于碎片的进一步利用，这就给飞速发展的基因工程技术带来了一定的限制。 化学合成的d n a 、r n a 定位断裂工具是国际上8 0 年代开始发展起来的一类新 型的非酶断裂工具，被成为人工核酸酶或化学核酸酶【“。它们既有限制性内切酶 的高度专一性，有能在人们预先设计的位点断裂d n 百和r n a ，还具有制备简 便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制等优点。随着遗传工程及分子生物学 技术的不断发展，人们已越来越不满足于限制性内切酶的应用，化学合成的人 工核酸断裂工具引起人们的极大重视。 开发出高效的人工核酸切割试剂，尤其是定点切割试剂的研究，具有非常 重要的理论意义和应用价值。首先，对化学核酸酶的切割机理的研究将大大有 助于我们对核酸酶催化机理的清楚了解。尽管在天然核糖核酸酶、酶性核酸的 动力学性质、溶液结构和固态结构的研究方面已取得了许多重要信息，但是关于 它们的作用机制仍有许多不清楚的地方，例如金属离子在化学核酸酶中的具体 作用。在机理研究方面很典型的一个例子就是：在1 9 9 1 年，b r e s l o w 等人将两 个咪唑基团引入到b 环糊精分子中用作r n a s ea 的模拟物，研究了它对r n a 的切割机理【6 1 ，很好的再现了r n a s e a 的催化机理和效果，从而使人们对r n a s e a 的酶催化机理有了深入的认识。 其次，定点切割试剂在疾病的基因治疗中有着十分重要的应用。基因治疗 的化学基础是反义技术，就是通过使专一性地表达有害蛋白的m r n a 失活或解 第一章前言 体，从而抑制了这种有害蛋白的合成而达到治疗疾病的目的。具体来说就是根 据w a s t o n c r i c k 碱基配对原则，采用与靶m r n a 上某段序列互补的寡聚核苷酸 作为识别系统，再接上合适的切割试剂就可以将靶m r n a 定点的切断使之失活。 第三，人工核酸酶还是分子生物学及基因工程的重要工具，可以作为研究 核酸结构和功能方面的探针。而且，由于人工合成的切割试剂的识别系统可以 识别的核苷酸序列能远远大于天然核酸酶的4 8 个碱基，因此它的专一性比天 然的内切酶要高的多，所产生的切割碎片也就很少从而易于分析，而且也可以 很容易地进一步得到利用。如果将这种具有高度序列特异性的人工酶用于反义 p c r 技术i7 1 ，则可以更大程度地推进克隆技术。 1 2 现有人工核酸酶的切割系统研究进展 研究核酸酶的主要目的是想合成能够定点切割核酸的化学试剂，它由两部 分组成：第一部分叫做切割系统，由某种核酸切割试剂组成；第二部分叫做识 别系统，由可以识别核酸底物特定核苷酸序列的某种分子组成。切割系统与识 别系统连接形成定点切割试剂后，便可以在核酸底物的特定部位将其断裂a 因 此，定点切割试剂又被称为人工核酸酶。 核酸切割试剂除了天然的核酸酶以外，还有许多非酶的人工切割试剂。下 面就切割试剂的研究现状作一简要评述。现在发展起来的人工核酸切割试剂的 切割机理可以分为三种：自由基氧化机理、磷酸酯水解机理和消去机理。 l 。2 1 按鸯由熬梳理氧证留裁核酸的试裁 按自由基切割核酸的体系都能在一定条件下产生某种自由基，然后进攻梭 黢中豹糖环或楚簸基，导致焚氧化破坏，进藤使核酸镳产生暖裂嘲。蜜出基规理 盼切割存在较多盼缺点：l ，切害i 产生的碎片的末端结构不同于酶解所产生的末端 缩构，因此它们不能再用逐接酶连接丽很雉再被进一步利用：2 活泼的自由基一 缎产生，还泰避攻糖强或爨辍基裁已经扩散了，因藤会在多个位点造成切割， 邀不利于合成斑点切割试剂；3 墙由基用予生物活体时有毒副作用，因而不论是 用于体内研究述是作为药用都是不利的。4 自由基机理往往需要具有氧化还原活 羧鹣辘韵嚣予，瀵撩了棼系豹复杂毪。 目前按照自由基机瑗切割核酸的研究主要集中在切割d n a 上，有 2 e d t a f e 2 + h 2 0 2 体系【9 】， 1 ，1 0 一二氮杂菲铜 c u ( p h e n 矿】体系1 0 1 ，1 ，1 0 一二氮杂 菲的八面体络合物，c u 2 + 还原剂体系【1 2 1 ，卟啉及金属卟啉体系13 1 ，含有铀盐 的光化学切割体系【1 4 ，可以鳌合金属的三肽【1 5 】，铑的络合物”1 ，抗生素体系【1 7 l 。 1 2 2 按消除机理切割核酸的试剂 以消除机理切割试剂的例子很少，不具有普遍性。在1 9 8 1 年，h e l e n e 和 l a v a l 的实验室同时分别发现了l 赖氨酰l 色氨酰l 赖氨酸三肽( k w k ) 不仅 可以识别d n a 中的脱碱基部位，并且在该部位产生切口 1 ”。1 9 9 0 年，m a z u m d e r 等研究k w k 的反应机理，发现三肽催化3 磷酸基是反式b 消去反应，并且 为反式消除。消除机理产生的碎片不含3 - - o h ，故而不能用连接酶连接起来。 由于此类消除反应不具普遍性，应用价值小，所以就不作详述。 1 2 3 以酯水解机理切割核酸的试剂 由于d n a 和r n a 的核苷之间均由磷酸酯键连接，因此磷酸二酯键的水解 也可以导致核酸断裂。对于r n a ，往往是切割试剂促使2 - o h 脱质子化形成 2 - o ，然后它进攻连在3 位上的磷原子从而发生分子内转酯反应形成2 ，3 一环 磷酸酯，同时使得r n a 断裂( 见图1 1 ) 。 一 图1 1r n a 水解示意图 对d n a 嚣舅，裂是甥戴滚热壹接掇供菜静亲蔹豢黧送攻磷原予，歇瑟发生 索核取代反应而使d n a 水解。无论是r n a 水解还是d n a 的水解都需要具备两 个条件：合适的亲核试剂j 靛攻磷原子；邋当的正电荷稳定水解过程中形成的带 蠢受毫蓑豹夏辩位磷过渡态。峦予d n a 释r n a 孛豹磷酸二魏键豢受毫黄，静 电排斥作用减弱了亲核试剂对其进攻的速度【9 1 ，这健褥磷酸二酯键本身很难发生 水解，在p n = 7 及2 5 ，并且无任何催化剂存在时，d n a 和r n a 中的磷酸二 戆键拳舞兹半嶷蘩分裂舞2 纭零窝l 予万肇礴。这耪黪豫戆稳定毪魄搜褥核酸拳 解试剂在切割核酸的活性方筒不如自由熬机理类的切害试剂。 i 誓h 第一章前膏 酯水解机理类切割试剂与自由基机理类的切割试剂相比有许多优点：一是 水解机理产生的碎片具有3 或5 磷酸末端，且碱基和糖环不会被破坏，因此可 以用连接酶连接起来，达到修复和重组的要求；二是水解类切割试剂定点具有 高度的专一性；三是对生物体毒害较小，有利于进行细胞内等其它活体研究。 这类切割试剂主要有核酸酶模拟物类、金属离子及其络合物、二胺和多元胺和 含有碱性氨基酸残基的多肽等。 正是由于酯类水解核酸切割试剂具有上述优点，其成为人工切割试剂的最 佳选择，因而成为人们争相研究的热点，下面就其近年来酯水解机理类核酸切 割试剂的研究进展作一简要介绍。 1 2 3 1 水解型金属化学核酸切割试剂 人们研究发现许多天然核酸酶中都含有金属离子，因此有关金属配合物的 水解型化学核酸酶研究更是倍受关注，近年来合成出了许多具有高催化活性的 金属配合物的模拟核酸酶体系，并且对此类化学核酸酶的作用机理也作了较为 深入的探讨，取得了很大进展。水解型金属化学核酸切割试剂按配合物中金属 离子的数目可以分为单核、双核及多核配合物，下面进行逐一介绍。 单核配合物 单核配合物就是只有一个金属离子与配体结合，因此它的结构一般比较简 单，易于研究，对研究金属配合物的作用机理很有帮助。j i kc h i n 等人1 卅就曾设 计了三个结构相似的配体 ( i ) c u ( t c r p y ) ( h 2 0 ) 2 2 + 、( i i ) c u ( b p y ) ( h 2 0 h 2 + 、o i l ) c u ( n e o c u p r o i n e ) ( h 2 0 ) 2 】2 + ) 分别与c u 2 + 络合形成相应的单核配合物，研究了它们 对a p a 的切割活性。结果显示：它们切割a p a 的t 】位分别为1 0 小时、4 2 天和 3 0 分钟，配合物3 的活性要远高于1 和2 。于是，j i kc h i n 等人在研究后提出了 一个可能的机理认为：配合物3 与a p a 作用时形成双i g w i $ 酸活性中心4 ，而 配合物1 和2 只能形成萃l e w i s 酸中心5 ，所以配合物3 的切割活性比1 和2 都 要大的多 4 营：黔：i 键 m 皤m 巷 m 二鬻爹m 二 卷 黢棱配合掳 由于许多天然水解酶都县有双金属核活性中心，因此双核配含物是金属香己 含物中最受人们关注的一类，近年来研究出了很多具有高活性的协割试剂，并 基递过对反应过程豹研究，述得出了谗多 鬻畜用的缳论。双核众满离子具蠢 双倍的l e w i s 酸性，能有效的降低底镪中心原子的密度，使之更有利于亲核试黼 的进攻，并可通过催化中心的协同作用加速过渡态中间的形成，同时促进离去 慕强豹魏离。这些他舍物撂蠲静共同特链就是秀个鑫攥离子都分剃磷酸蘸上 的一个羟基氧褶连，构成了个o p - o 的桥式结构。两个金属离子作为两个l e w i s 酸性中心同时作用在了磷酸酯，使得配僦中心上的p 原子呈现出更多的电正性， 遮撵就更有零l 予被亲蔹进竣，麸蠢易于发生嚣交换戆承艇颤裂爱应。这就是双 梭配合物一般鬻比相应单核配合物切割谲性高的直观原因。 另一个影响双核或多核酉己台物活性的因素就是金属离子在配合物中的空间 爨离，过大或_ i 筻小数踅褰都不裁予怒合物零解嚣牲豹提嵩。v a l l e e 等入鳓在嗣 x - r a y 研究天然酶的晶体结构时就发现：必然酶的催仡活性部分中的金属离子之 间的距离都在3 - 5 a 的范围内。那么，人工合成的各种模拟酶的金j j 弱配合物中的 愈演蹇子阗瓣鼷离是否选影薅羞嚣会耪豹灌毽寝? s h u n - i c h i 等人剿建实验绘 予了证明。秘实验中，s h u n - i c h i 等人【2 l 】合成了如下几种配体( 6 一l o ) ，研究它 第一章前t 们分别与z n 2 + 的络合物对u p u 的活性，并得出结论：二核配合物中金属离子配位 点之间的距离是影响其活性的一个重要因素。 r = q 。户 三核和多核配合物 由于双核相对单核配合物增加了一个金属离子后，具有了双倍的l e w i s 酸性 中心，增加了磷酸酯中心磷原子的亲核活性，并且两个金属离子之间还存在协 同作用，使二核配合物比单核在水解磷酸二酯韵反应中活性增加。由此我们会 想到当在二核配合物中再引入一个金属离子，变成三核配合物后，其活性是不 是能进一步增大? 最近，已经有人开始研究三核金属配合物，m o r i oy a s h i o 等人 圆以n , n , n ，n n ：”- h e x a k i s ( 2 - p y r i d y l m e m y j ) 打i s ( 2 - 锄曲劬y 1 ) 脚i n e 】为配体与 z n 2 + 络合分别得到二核、三核配合物1 1 ，1 2 。在p h = 7 ，5 0 。c 的条件下将“，1 2 分别作用于二核苷n p n 时发现1 2 比1 1 具有更大的切割活性，这一结果与预期 值是一致的。而且，三核配合物1 2 在切割c p a ，a p a ，g - p a 和c r p c 生成的产物 3 a - n m p 和2 a - n m p 的比率大于9 0 ，而二核配合物1 1 切割时产物的a - n m p 和2 a - n m p 的比率则低得多。这使得人们对三核配合物甚至多核的研究充满了 期望，也增加了信心。 尽管如此，到目前为止人们对于三核和多核的研究还是很少的，原因可能 是由于多核化合物不易制备，结晶困难等客观因素限制了人们对它的研究。但 我们相信，随着二核研究的不断深入以及对其水解核酸的机理的不断完善，以 及对三核研究的不断探索，三核及多核配合物必会为金属化学核酸酶的发展带 来广阔的发展前景。 6 。叫 z n 止2 1 l z r b 1 2 1 2 3 2 不含芳香基的肽类核酸切割试剂 a n d r eb r a c k 等人研究发现许多含精氨酸或赖氨酸等碱性氨基酸残基的多肽 可以催化r n a 的水解。p o l y ( l l y s ) 、p o l y ( l a r g ) 、p o l y ( l e u - l y s ) 、p o l y ( a r g l e u ) 、 p o l y ( l e u a r g - a r g - l e u ) 以及7 5 的a r g - l e u 与2 5 f qa r g l e u - g l u - l e u 的共聚物 均对寡聚r n a 有切割作用。其中p o l y ( l e u l y s ) 最为有效，在p h = 7 5 、赖氨酸 残基浓度为l m m 时可使o l i g o ( a ) 的水解速度提高2 0 0 倍。此类多肽在催化水解 核酸时首先由于侧链带有的n h 2 的质子化后可以与核酸分子上的带负电的磷酯 基团靠静电力相互作用，继而，当多肽的二级结构为b 折叠或a - 螺旋结构时形 成与核酸磷酸二酯的分子骨架相似的结构，侧链的碱基就可以对核酸分子进行 亲核进攻，形成2 - 3 环磷酸酯，之后它水解就产生2 或3 位的磷酸酯。而在这 个作用过程中多肽的特定的二级结构对于对切割是必须的。只在当带正电荷的 碱性氨基酸残基排列成线性时可对r n a 水解起催化效应，而亮氨酸这样的脂肪 族氨基酸残基的存在可以使多肽链具有合适的二级结构。p o l y ( l - h i s ) 不能切割 r n a ，原因是其侧链咪唑基的碱性不够强，而且其二级结构也不合适。 1 2 3 3 含芳香残基的肽类核酸切割试剂 在最早j o h nc s h e e h a n 等人合成出的c y c l o - g l y - l h i s l - s e r l - h i s l s e r 、 l t h r l a l a - l - s e r - l h i s l a s p 和l s y a m i n o b u t y r y l - l h i s - 丫- a m i n o b u t y l - l - a s p 作为酯水解酶的模型，它们都含有带芳香基残基结构。研究发现它们对对- 硝基 苯基乙酸酯有良好的水解作用。并且，多肽的旋光性的不同会造成在水解活性 方面的变化，这与天然酶的性质相吻合。 j o s i a n ep i e r r e 小组在研究了碱性残基间包加一含芳香基氨基酸残基的三肽 结构( 例如l y s 。t r p l y s 和l y s - x y r l y s ) 后发现这些简单的三肽可以识别并切割 去尿基或嘧啶基后的d n a 。当去尿基或嘧啶基的d n a 在被还原后，这些三肽 便失去了对它们的切割活性，因此他们认为切割过程中发生了p - 消除反应，产 7 第一章前童 生3 - o h 和5 p 末端。而j e a n - j a c q u e st o u l m e 小组在研究了此类三肽与核酸的 作用后认为它们之间的作用可以分为两步，第一步是由于碱性残基侧链的带正 电荷的基团与核酸分子骨架上的带负电的磷酯基团通过静电作用形成络合物 ( i ) ，第二步则是含芳香基的氨基酸残基中芳环与核酸分子中碱基上的芳环发生 堆积作用产生络合物( i i ) 。络合物( i ) 由于只是静电力的作用，因此它受溶液 离子强度，d h 值等条件影响很大。而络合物( i i ) 则很少受这些条件的影响， 但却对d n a 的结构十分敏感，当d n a 为单线分子、d n a 分子受紫外光照射或 发生d n a 变性后都可以增强络合物( i i ) 的形成，这也使得这种简单的三肽可 以选择性识别单线d n a 。 我们知道，h i s t i d i n e 在许多天然酶中都是作为活性基团存在，主要是因为它 分子中所含的咪唑基既可以起质子接受体又可以作供质子基团，因此人们对含 有此基团的研究很为关注。杨频等人1 2 3 1 的最新研究发现c u 离子与组氨酸形成的 简单络合物可以有效地水解切割d n a ，并且对5 - g t - 3 有一定的选择性。这一 发现就为以后设计新的更有效的d n a 切割试剂提供了很好的思路。 1 2 3 4 丝组二肽体系 丝氨酸和组氨酸残基是很多天然酶的活性中心，直接参与酶解反应。如丝 蛋白酶、糜蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、弹性蛋白酶( e l a s t a s e ) 和 磷酸化酶( u r i d i n ep h o 印h o r y l a s e ) 参与的生物活性反应中【2 抛7 1 ， 丝氨酸和组氨酸 残基可以按照酶水解机理直接参与肽键和酯键的断裂，丝氨酸的侧链羟基可以 作为亲核试剂，而组氨酸的咪唑基团可接受质子。这些天然酶的生物活性高并 且区域选择性也强，但是使用的活性条件有一定的局限性，受温度和p h 值的影 响较大。 丝氨酸和组氨酸残基在天然酶的活性位点成对出现，这些现象也提示我们 这类小肽是不是也具有这样的切割活性。赵玉芬课题组首次发现丝氨酰组氨酸 二肽即丝组二肽( s e t - h i s ) 对d n a 具有切割活性2 8 1 ，这是迄今为止的第1 例不含 金属离子的能够以水解方式切割d n a 的小肽。 然后研究了丝组二肽( s e r - h i s ) 的切割机理并且按照定点d n a 切割剂的思路 进行修饰合成新的功能小分子，另外模拟天然酶研究了丝组二肽对蛋白质和酯 的切割活性 2 9 3 1 】。 s e t - h i s 不仅可以切割线性九d n a ，还可以切割超螺旋型p b r 3 2 2d n a 。琼 脂糖凝胶电泳实验证明，九d n a 被切割成1 0 0 0 1 0 0 0 0 b p 左右的碎片，保温3 7 h 后则变成了大约几百至2 0 0 0 b p 的碎片，当保温时间继续延长时，碎片会变成弥 散带，s e r - h i s 对d n a 的确具有明显的切割活性。考虑外环境的影响，在咪唑环 p k a 值( p h = 6 o ) 的缓冲条件下，s e r - h i s 表现出最优的切割活性。另外，切割速率 受切割温度的影响，温度越高活性越高。使用5 同位素标记的寡聚单链核萤酸 f 6 0 b a s e ) 作为s e r h i s 的切割底物，聚丙烯酰胺( p a g e ) 电泳实验表明，s e v h i s 对 碱基没有识别性并且同时产生3 羟基和3 磷酸。这类切割模式不同于天然核酸 酶的水解模式。 一定的p h 值范围内，反应的最适p h 值接近中性( 5 o 7 0 ) ，s e r - h i s 二肽对 牛血清白蛋白( b s 舢具有较明显的切割作用。聚丙烯酰胺( p a g e ) 电泳实验表明， 牛血清白蛋白田s a ) 被s e v h i s 切割成弥散带。所有的实验均表现出很好的重现 性，而且以细胞色素c 、溶菌酶为切割底物得到了类似牛血清白蛋i 刍( b s a ) 的结 果。 为了研究s e v h i s 中各官能团在切割d n a 时所可能起到的作用，分别用结 构上与s e r - h i s 相似的组丝二肽( h i s s e t ) 、丝丙二肽( s e r - a 1 0 、丙组二肽( a l a - h i s ) 、 丝氨酸、组氨酸、丝氨酸甲酯、乙醇胺、二乙醇胺为对照，研究它们对d n a 切 割作用( 反应条件相同) ：s e r - h i s 在切割蛋白质中各官能团与切割d n a 中起作 用的官能团一致。 实验结果表明：1 ) a l a - h i s 无切割活性，而p h 为7 0 时，s e r - a l a 具有微弱的 切割活性，这说明s e r 残基侧链羟基是s e r - h i s 具有切割活性的必须官能团，而 h i s 残基则增强了切割活性：2 ) s e r 与h i s 在反应1 0 0 h 后对d n a 和b s a 没有明 显作用说明s e r - h i s 即使在反应中水解产生s e r 与h i s ，其切割活性也不是由这 两种物质引起的；3 1 丝氨酸、丝氨酸甲酯、乙醇胺对d n a 和b s a 无切割活性， 考虑到s e r - a l a 的微弱的活性，说明二肽的酰胺键与羧基对其切割活性有一定贡 献：4 1s e r - h i s 的异构体h i s s e r 无切割活性则证明切割试剂分子中各个官能团之 间的空间位置对切割作用也有很重要的影响。 因此，s e r - h i s 所含氨基和羟基是具有切割活性的必需基团，咪唑基的存在 虽非必需，但却可以提高s e 卜h i s 的切割活性，相对而言羧基则不是必需基团。 9 第一翦奢 此外，s e r - h i s 中各基团的相对位置也对其有无切割活性具有重要影响。 1 3 现有人工核酸酶的识别系统研究进展 研究人工核酸酶的最主要目的是合成定点切割试剂。前己述及，定点切割 试剂由切割系统和识别系统构成。上面已经介绍了很多核酸切割试剂，这些试 剂均可作为切割系统。下面介绍目前文献报道过的识别系统。目前已经发展了 多种识别系统，包括寡聚核苷酸、多肽核酸( p n a ) 、胍基核酸( d n g ) 、d n a 结 合蛋白或多肽、多聚酰胺等。 1 3 1 寡聚核苷酸 寡聚核苷酸( 既可以是寡聚d n a 也可以是寡聚r n a ) 可以通过w a s t o n c r i c k 碱基配对原则与单链的核酸底物形成双螺旋或是通过h o o g s t e e n 氢键与双链的 核酸底物形成三螺旋，从而识别底物的碱基序列。由于d n a 自动合成仪的出现， 使得合成寡聚d n a 的成本变得很低，它已成为常用的一种识别系统。但是，寡 聚核苷酸与双螺旋形成的三螺旋不易穿透细胞膜，而且易被降解，这些特点阻 碍了寡聚核苷酸在基因选择药物中的应用。 1 3 2 多肽核酸0 n a ) p n a 是一种d n a 类似物，它以电中性的肽键骨架取代了d n a 中电负性的 脱氧核糖磷酸骨架( 图1 - - 2 ) 。p n a 可与互补的d n a 、r n a 或p n a 形成类似 d n a 双螺旋的结构，并遵守w a s t o n c r i c k 碱基配对原贝t 1 1 3 2 。p n a 还可以与双链 d n a 结合形成三链f 3 3 】。p n a 与互补的核酸链结合具有亲和性好，稳定性好等特 点，而且既不被核酸酶水解，也不被蛋白酶水解，因而当由它制得的定点切割 试剂进入生物活体后具有相当好的稳定性。但是p n a 的细胞通透性也不好，而 且不能很好的识别胞嘧啶胸腺嘧啶碱基，同样制约了它的广泛应用。 1 3 3 胍基核酸( d n g ) d n g 也是一种d n a 的类似物，它以胍基骨架取代了d n a 中的磷酸二酯骨 架3 4 1 ( 图1 - - 2 ) 。d n g 可与互补的d n a 、r n a 形成类似d n a 双螺旋的结构，也 可以与双链d n a 结合形成三链，并遵守w a s t o n - c r i c k 碱基配对原则。由于d n g 的胍基骨架带正电荷，而d n a 或r n a 中的磷酸二酯骨架带负电荷，因此d n g 1 0 第一章前言 相比于p n a 而言，与d n a 或r n a 的亲和性更高，形成的复合物具有高度的稳 定性。同样不被核酸酶水解，蛋白酶水解，在生物活体中很稳定。 d n ap n ad n g 图1 2p n a 、d n g 与d n a 的结构比较 1 3 4d n a 结合蛋白和多肽 许多天然存在的蛋白和多肽，如d n a 结合蛋白如阻遏物( r e p r e s s o r s ) 、转 录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ) 以及分解代谢基因激活蛋白( c a p ) 也具有与d n a 特定部位结合的识别功能。它们在d n a 的复制和转录过程中起着重要的作用。 目前根据它们与d n a 结合部位的结构特征，一般将其分为以下三类： ( a ) “螺旋转折螺旋”型结构域( h e l i x - t u r n h e l i xm o t i f ) 该结构模型由a n d e r s o n 于1 9 8 1 年提出1 3 5 】，目前已有大量的晶体结构证实了 这一结构域模型。该结构域一般含有2 0 个氨基酸残基，包括两个q 一螺旋，由 一个转折相连。其中一条螺旋的氨基酸残基与d n a 大沟中的碱基直接接触，成 为识别螺旋；另一条螺旋跨卧在大沟上，与d n a 的结合是非特异性的。 ( b ) “锌指”型结构域( z i n c f i n g e rm o t i f ) 该结构由m i l l e r 等在研究瓜蟾属转录因子i i i a ( t f i i i a ) 分子时发现p 6 1 ，该 分子含7 1 1 个锌原子和9 个结构相似的重复单位，每个单位约含有3 0 个氨基 酸残基，一般含有比较保守的两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基，它们与锌 形成四面体配位。 ( c ) “亮氨酸拉链”型结构域( 1 e u c i n z i p p e rm o t i f ) 蕈一章前室 1 9 8 8 年l a n d s c h u l z 等提出“亮氨酸j 囊链”型结构域【3 7 】。这类蛋白质含有4 个 藏5 个亮氨簸羧基，它翻之越难骥建程隳7 令氨基骏，这些蹇氨敬虢基澄着a 螺旋的轴向排成一列。该缀白与d n a 的大沟结合。 用蛋白质作为核酸识别结合系统的优点是对目标d n a 的附加干扰较小，不 鼹俸变牲娃璎，浚爱旁到长发可达8 1 t o p ，这对予大片段基霞分辑魄是鞋 芏熬。 不足之处是具有识别功能的礞白质不是徽多，灵活多样性方面不足。 1 3 5 多聚酰胺 天然证食物纺锤菌素c n e t r o p s i n ) 及偏灞霉素a ( d i s t a m y c i na ) 分翔是镰刀状 的含有两个肽键和三个肽键的化合物，它们可通过d n a 小沟结合在有着4 或5 个连续a ，t 碱蒸对的位点。程这种类型的结合中，d n a 的一个特定位点既可结 念一个福应静凝俸，被称为l ：l 模型，诲胃结合两个栩应的配幸誊，被称为2 ：1 禳 _ 巡t 3 s l ( 图1 3 ) 。 巍社攮n 辖埭噼咐薅秘槲峭哇蜡赫懈瞬搬辘矧懒 图1 32 ：l 模型偏端霉索( d i s t a m y c i n ) a 与d n a 敷含物 逶遗对这魏懿合兹懿x - 瓣线结穆测定、棱磁分橱敬爱蒸力学戮筑表饔：氢 键、范德华力以及静电力的相互作用都对肽与d n a 缋合的亲合势及特异性起作 用。为了给出题朴配位的最适宜形态，这些分子主要憝由芳环通过酰胺键或其 京籍徐键联缭藤成翡乎嚣熬筏俸系棱藏，矮骞半习形捩( c r e s c e n ts h a p e d ) 。这静枣 分子形状与d n a 的小沟曲率相吻合，宦们依靠氢键、范德华力、静电相互作用 对d n a 的小沟中特异性进行识别p 9 1 。 受这些天然化合物的启发，d e r v a n 将研究重点转向以寡聚酰胺为模板的 d n a 识别分子上。使用固相合成法合成含p y i m 的多酰胺，研究以此类寡聚酰 胺为模板的d n a 识别分子。在2 ：l 的寡聚酰胺d n a 复合物模型的基础上， d e r v a n 等又设计了发卡状( h a i r p i n ) ( 图l _ 4 ) 的寡聚酰胺( 通过氨基酸将两条反向平 行寡聚酰胺链的c 端与n 端连结起来) 【4 ”。d n a 酶i 印迹实验结果表明：这种 “头对尾”的发卡状寡聚酰胺的序列选择性和亲合性优于两条独立的反向平行 酰胺链。 导静，h 郴c 6 臼脚，越r 口啦 雌嘲1 u _ 0 3h ，姆q 雌哪和c 图i - 4 发卡式寡聚酰胺h i l p y p y 识别d n a 的配对规则 d e r v a n 邋过研究提出了寡聚酰胺识别d n a 的配对舰贝u ( t a b l e ) ：反向平行成 鼹熬p y l m 特努谖鬟c 心虢蒸对，瑟i m p y 识剩g c 溅基对i 反怒擎嚣藏对豹 h p p y ( h p = n 一甲基- 3 一羟基毗咯) 特异识别t a 碱基对。p y h p 识别a t 碱基对ax 龋体衍射实验滏明：在i m p y 与g c 碱錾对之间共有两个氢键，熟中眯唑环的 n ( 3 ) 与鸟漂冷琴接熬氨基之润毒一令氢镶；瑟在 秽魏与t 焘碱基越之闯共毒 三个氢键，篡中h p 与胸腺嘧啶的o ( 2 ) 之间有两个氢键 4 2 1 。利用这个规则，可 以针对某一段d n a 特定序列设计出相应的寡聚酰胺识别分子，然聪进行生物活 酸静测试与分凝。 发卡式聚酰胺中的几种连接子的对比实验显示，由y 氨基丁酸充当连接子 形成的发卡状寡聚酰胺具密最好的亲合燃1 4 3 。进一步研究发现，y 氨基丁酸 孩及丙氨羧( 辩不仅充姿德接的囊色，瞧是吴有一定滓列选择毪豹重要基霞靠 瓴基丁酸和p 丙氨酸与a 1 h a 的结合性相对g c c 0 要强2 0 0 4 0 0 倍) l 矧。 3 相对于独立的两条寡聚酰胺链，发卡状寡聚酰胺与d n a 的亲合性提高了约4 0 0 倍，而将发卡状寡聚酰胺的两端再用一个y 氨基丁酸关环，形成环状的寡聚酰 胺，则能进一步提高亲合性和序列