（药剂学专业论文）二氢卟吩e6载药胶束的制备与评价.pdf

浙江大学同等学力硕士学位论文中文摘要 中文摘要 二氢卟吩e 6 载药胶束的制备与评价 浙江大学药学院药剂学 2 0 0 4 级同等学力硕士研究生蒋小红 导师胡富强教授 聚合物胶团系两亲性嵌段或接枝共聚物，在水性介质中自发形成核一膜结构的 胶粒，共聚物的疏水片段形成胶粒的内核，亲水片段形成外膜。聚合物胶团的内 核可以作为疏水性药物的储库，将药物增溶在核心，外膜可以维持胶团在水性环 境中的稳定性，对药物起保护作用，提高药物的稳定性，聚合物胶团对药物具有 缓释作用。胶团特有的纳米级粒径可有效促进聚合物胶团的“渗透与保留作用”， 赋予其被动靶向肿瘤组织的功能，同时通过对聚合物胶团表面进行配体或抗体修 饰可帮助其达到主动靶向的目的。聚合物胶团对难溶性药物、大分子药物和基因 治疗药物在载体给药方面具有独特的优势，与传统的低分子量表面活性剂相比， 聚合物胶团具有更低的临界胶团浓度，因而在体循环中具有更高的稳定性。 本研究以1 8 0k d a 的低分子量壳聚糖( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o ) 为原料， 以碳二亚胺为偶合剂，将硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，s a ) 的羧基以共价键的形式结合到 壳聚糖链的游离氨基上，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物( s t e a r i ca c i dg r a f t e dc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d ec o p o l y m e r ，c s o s a ) 。以三硝基苯磺酸法测定嫁接物氨基取代度； 以芘荧光法测定该嫁接物在水中的临界胶团浓度；以荧光淬灭法测定该嫁接物在 水中自聚集后形成的疏水核区域数；以微粒粒度及表面电位分析仪测定嫁接物胶 团在水中的粒径与表面电位。同时以光敏剂二氢卟吩e 6 ( c h l o r i ne 6 ，c e 6 ) 为模型 药物，进行嫁接物胶团载药性能研究。考察胶团载药前后粒径与表面电位变化， 并进行包封率测定。以a 5 4 9 为模型细胞进行嫁接物胶团的细胞摄取实验。利用壳 聚糖链游离氨基和叶酸分子游离羧基的反应活性，对壳聚糖硬脂酸嫁接物进行叶 浙江大学同等学力硕上学位论文 中文摘要 酸修饰，考察叶酸修饰前后嫁接物胶团理化性质的变化。以a 5 4 9 ( f r = ( ) ) ， m c f 7 ( f r = 3 2 ) 细胞系为模型细胞，考察叶酸修饰对细胞选择性摄取嫁接物胶 团的影响。以二氢卟吩e 6 为模型药物，考察叶酸修饰对胶团载药行为和细胞摄取 的影响。 经生物酶降解得到重均分子量为1 8 。0k d a 的低分子量壳聚糖在水中具有良好 的溶解性。采用偶合反应对其进行疏水性修饰，得到氨基取代度为4 9 6o 甜：0 1 0 的壳聚糖硬脂酸嫁接物( c s o s a ) ，在水中的临界胶团浓度为3 6 2 7 士1 5 1l l i g m l 。 1 0m g m l 浓度的嫁接物胶团溶液中，单个c s o s a 分子形成的疏水性微区域数 为4 5 5 个。1 0m g m l 浓度的嫁接物胶团溶液，其数均粒径为2 8 9n n l ，表面电位 为3 9 1 4 - 0 5m v 。 叶酸修饰的壳聚糖硬脂酸嫁接物，可以提高嫁接物在水中的自聚能力，并进 一步增加单个嫁接物分子形成的疏水核数。a 5 4 9 ( f r = ( - ) ) ，m c f - 7 ( f r = 3 2 ) 细 胞系对嫁接物载药胶团的药物摄取实验结果表明，叶酸分子的表面修饰，使肿瘤 细胞a 5 4 9 对药物的摄取无明显影响，但显著增加了叶酸受体过表达的肿瘤细胞 m c f 7 ( f r = 3 2 ) 对药物的摄取百分率。叶酸分子的表面修饰，对c e 6 载药胶 团的药物包封率和载药量无影响，但在一定程度上减少了药物的体外释放量。 以h e l a 细胞系为模型细胞，采用四唑蓝比色法考察c e 6 包载前后的细胞毒 性。在无光照条件下，c e 6 在c s o s a 和f a - c s o s a 包载后，对h e l a 细胞的 2 4 h 半数致死量增加，说明载药胶团可以降低药物的毒性。在光照条件下，c e 6 、 c s o s a c e 6 和f a c s o s a c e 6 对h e l a 细胞的毒性作用明显增加。 f a c s o s a c e 6 的安全系数最大，说明采用较小的光敏剂量就可以达到与游离药 物相当的光动力效应，并可降低药物的毒副作用。 关键词：壳聚糖硬脂酸嫁接物；胶团；二氢卟吩e 6 ；细胞摄取；体外释放；叶酸 m 浙江大学同等学力硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i c t i c so f m i c e l l ed e l i v e r y s y s t e ml o a d i n gc h l o r i ne 6 d e p a r t m e n to fp h a r m a c e u t i c s c o l l e g eo fp h a r m a c e u t i c a ls c i e n c e s ，z h e j i a n gu n i v e r s i t y g r a d u a t es t u d e n t j i a n gx i a o - h o n g m e n t o rh uf u - q i a n gp r o f e s s o r p o l y m e r i cm i c e l l e s a r em a d ef r o m a m p h i p a t h i cc o p o l y m e rc o m p o s i n go f h y d r o p h o b i cs e g m e n t sa n dh y d r o p h i l i cs e g m e n t s p o l y m e r i cm i c e l l e sh a v ec o r e - s h e l l s t r u c t u r ec o m p o s e do fh y d r o p h o b i cs e g m e n t sa st h ei n t e m a lc o r ea n dh y d r o p h i l i c s e g m e n t sa sas u r r o u n d i n gc o r o n ai na q u e o u sm e d i u m t h ei n t e r n a lh y d r o p h o b i cc o r e p r o v i d e sas t o r e r o o mf o rl o a d i n gh y d r o p h o b i cd r u ga n dr e d u c e st h es i d ee f f e c t t h e h y d r o p h i l i cs h e l la l l o w st h es t a b i l i t yo fp o l y m e r i cm i c e l l ei na q u e o u se n v i r o n m e n t ，a n d g e t su pt h ep r o t e c t i v ef u n c t i o nt ot h em e d i c i n e ，e n h a n c e st h em e d i c i n et h es t a b i l i t ya n d a c h i e v e st h es l o wr e l e a s ef u n c t i o n t h en a n o s c a l ed i m e n s i o n so fp o l y m e r i cm i c e l l e s p e r m i tt h ee f f i c i e n ta c c u m u l a t i o ni nt u m o rt i s s u ev i at h ee n h a n c e dp e r m e a b i l i t ya n d r e t e n t i o n ( e p r ) e f f e c t ，w h i c ht e r m e d 私p a s s i v et a r g e t i n g m e a n w h i l et h ea c t i v e t a r g e t i n gt ot u m o rc e l l sc a nb er e a c h e db yf u r t h e rl i g a n do ra n t i b o d ym o d i f i c a t i o n t h i s s p e c i a lc h a r a c t e r i s t i co fp o l y m e rm i c e l l em a k e si t ap o w e r f u lc a r r i e ri ni n f u s i b i l i t y m e d i c i n e ，m a c r o m o l e c u l em e d i c i n ea n dg e n ed e l i v e r ys y s t e m c o m p a r i e dw i t h t r a d i t i o n a lm i c e l l e so fl o w - m o l e c u l a r - w e i g h ts u f f a c t a n t ，p o l y m e rm i c e l l e sa r eg e n e r a l l y m o r es t a b l ew i t har e l a t i v e l yl o w e rc m c ，a n ds h o ws l o w e rd i s s o c i a t i o na n de n h a n c e d s t a b i l i z a t i o ni na q u e o u se n v i r o n m e n t i nt h i ss t u d y ，s t e a r i ca c i dg r a f t e dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d ec o p o l y m e r ( c s o s a ) i v 浙江大学同等学力硕士学位论文 英文摘要 w a ss y n t h e s i z e db y1 - e t h y l - 3 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ( e d c ) 一m e d i a t e d c o u p l i n gr e a c t i o no fs t e a r i ca c i d ( s a ) a n dl o w - m o l e c u l a r - w e i g h tc h i t o s a n ( c s o ，m w = 18 0k d a ) s u b s t i t u t ed e g r e e so fa m i n og r o u p s ( s d 呦m e a n st h eg r a f tn u m b e ro fs a g r o u p sp e r10 0a m i n og r o u p so fc s o ，w h i c hw a sm e a s u r e db yt n b sm e t h o d t h e c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( c m c ) o fc s o - s ai nw a t e rw a sd e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n tu s i n gp y r e n e 嬲ap r o b e a g g r e g a t i o nn u m b e ro fs t e a r a t e g r o u p sp e rc s o - s am o l e c u l e sw a se s t i m a t e db ys t e a d y - s t a t ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g m e t h o d s i z ea n dz e t ap o t e n t i a lo fc s o - s am i c e l l e sw e r em e a s u r e db yd y n a m i cl i g h t s c a t t e r i n g 。 c e l l u l a ru p t a k ep e r c e n t a g eo fc s 0 - s am i c e l l e si na 5 4 9c e l l sw a sc a r r i e do u t c h l o r i n ee 6 ( c e 6 ) w a sc h o s e na st y p i c a la n t i c a n c e rd r u g s i z ea n dz e t ap o t e n t i a lo f c s o - s am i c e l l e sb e f o r ea n da f t e rc e 6w e r ed e t e r m i n e d t h ed r u ge n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c y , r e l e a s ep r o f i l e s ，a n dc e l l u l a ru p t a k ep e r c e n t a g eo fc s o - s m c e 6w e r ef u r t h e r i n v e s t i g a t e d u t i l i z i n gt h ec a r b o x y lg r o u po ff o l i ca c i d ( f a ) a n dr e m a i n e da m i n og r o u p s o fc s o s a ，t h ef am o d i f i e dc s 0 - s a ( f a c s o s a ) w a so b t a i n e d t h ep r o p e r t i e so f f a - c s o - s am i c e l l e sw e r ed e t e r m i n e d a 5 4 9 ( f r = ( - ) ) a n dm c f - 7 ( f r = 3 2 ) w e r e c h o s e na st y p i c a lt u m o rc e l l s ，t h ec e l l u l a ru p t a k e so ff a - c s o s aa g a i n s tt h et w oc e l l l i n e sw e r ee s t i m a t e d t h ep r o p e r t i e so fc e 6l o a d e dm i c e l l e sw e r ee v a l u a t e d ，a n dt h e c y t o t o x i c i t i e so ff a - c s o - s a c e 6 i nt h et w oc e l l sw e r ea l s od e t e r m i n e d l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a nw i t h18 0kd a a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h tw a sw e l l s o l u b l ei nw a t e r ，w h i c hw a so b t a i n e db ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s t h es u b s t i t u t ed e g r e e so f a m i n og r o u p s ( s d ) w a sd e t e r m i n e da s4 9 6 ，a n dt h ec m cv a l u eo fc s o s aw a s d e t e r m i n e dt ob e3 6 2 7 + 1 51 i t g m li nd 1w a t e r a g g r e g a t i o nn u m b e ro fh y d r o p h o b i c m i c r o d o m a i np e rc s o s am o l e c u l ew a s4 5 5u n d e r1 0m g m lc s o - s ac o n c e n t r a t i o n t h em e a nn u m b e rd i a m e t e ro fc s o - s am i c e l l e sw i t h1 0m g m lw a s2 8 9n n la n dt h e z e t ap o t e n t i a lw a s3 9 1 4 - 0 5m v v 浙江大学同等学力硕士学位论文英文摘要 m o d i f i c a t i o no ff ap r o m o t e ds e l f - a s s e m b l yo ff a - c s o s ai nw a t e r , t h e a g g r e g a t i o nn u m b e ro fh y d r o p h o b i cm i c r o d o m a i np e rf a c s o - s a w a sm o r et h a n c s o s a i tw a sf o u n dt h a tc e l l u l a ru p t a k e so ff a - c s o - s ai nm c f - 7c e l l sw h i c hw i t h h i g h e rf ar e c e p t o re x p r e s s i o nw e r ef a s t e rt h a nt h a t i na 5 4 9c e l l s t h e r ew e r en o s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e so nt h ep r o p e r t i e so fd r u gl o a d e db e t w e e nc s o - s am i c e l l e sa n d f a - c s o - s am i c e l l e s d r u gr e l e a s ei nv i t r of r o mf a - c s o - s a c e 6w a ss l o w e rt h a n c s o s a c e 6 u s i n gh e l ac e l l sa sm o d e lt u m o rc e l l s ，t h ec y t o t o x i c i t yo fc e 6 ，c s o s a c e 6a n d f a - c s o - s a c e 6w a sd e t e c t e d i nt h ea b s e n c eo fi l l u m i n a t i o n ，t h ec y t o t o x i c i t yo fc e 6 w a s m u c hg r e a t e rt h a nt h a to fc s o - s a c e 6a n df a - c s o - s a c e 6a f t e r2 4 hi n c u b a t i o n i tm i g h tb ea t t r i b u t e dt ot h ed r u gl o a d e db e t w e e nc s o s am i c e l l e sa n df a - c s o - - s a m i c e l l e s i nl i g h t i n g ，t h ec y t o t o x i c i t yo fc s o = s a c e 6a n df a c s o - s a c e 6w a sm u c h g r e a t e rt h a nt h a to fc e 6 i nt h i ss t u d yw ed e s i g n e dt h er a t i ob e t w e e nt h ec y t o t o x i c i t y i c 5 0v a l u e sa n dp h o t o t o x i c i t yi c 5 0v a l u e so fap h o t o s e n s i t i z e ra si t ss a f e t yc o e f f i c i e n t t h eh i g h e rs a f e t yc o e f f i c i e n ti n d i c a t e dal o w e rc y t o t o x i c i t ya n dh i g h e rp h o t o t o x i c i t y t h e s a f e t y c o e f f i c i e n to ff a - c s o - s a c e 6w a sh i g h e rt h a nt h a to fc e 6a n d c s o - s a c e 6 d e s c r i p t i o no ft h ep h o t o s e n s i t i z e rw i t hav e r ys m a l la m o u n to fl i g h t c o u l db ea c h i e v e db e t t e rd y n a m i ce f f e c ta n dl e s st o x i ca n da d v e r s ee f f e c t k e yw o r d s ：s t e a r i ca c i dg r a f t e dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ；m i c e l l e s ；c h l o r i n ee 6 ； c e l l u l a ru p t a k e ；i nv i t r od r u gr e l e a s e ；f o l i ca c i d v i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 靴敝储戳予一辩醐： 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 7 勇参扩 j 导师签名：苫门7 初乏 签字日期：7 卵歹年，月 日 签字日期： 口7 年f ，月；。日 浙江大学同等学力硕士学位论文致谢 致谢 本论文在导师胡富强教授的热忱鼓励和悉心指导下完成。胡老师渊博的知识、 严谨的治学态度、精益求精的工作态度以及在学术上的高标准、严要求使我受益 匪浅。胡老师在繁忙的工作之余，对我的研究进展、论文工作及研究中出现的问 题都给予详尽的指导，使我的科研思维方式不断得到提高。此外，胡老师一直以 辛勤的工作为我们创造着良好的科研条件。在此论文完成之际，我谨对胡老师表 示深深的敬意和感谢。 同时我还要感谢嘉兴学院的黄嫘老师、课题组的杜永忠老师和吴秀铃同学， 对本人在研究工作及论文修改过程中给予了大力指导和帮助，由衷地感谢他们为 我所做的一切。 本论文的研究工作还得到了课题组袁弘老师、郭仕华、楼慧等研究人员及其 他同学的配合，在此一并感谢，感谢大家的鼓励与帮助，感谢各位带给我的美好 回忆。 最后，向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷 心的感谢! 蒋小红 浙江大学同等学力硕士学位论文引言 引言 光动力学治疗( p h o t o d y n a m i c th e r a p y ，p d t ) 是2 0 世纪8 0 年代初兴起并在近年 迅速发展的治疗肿瘤的新颖方法。最近几年，p d t 在临床上得到了较为广泛的应用， 一些光敏剂已被很多国家批准作为p d t 药物。有关新型光敏剂的合成、体内体外试 验、作用机制等方面的研究得到了迅速的发展，并取得了丰硕的成果。 光动力学疗法具有毒性小、收效快、靶向性强的特点，在杀伤增殖细胞的同 时不危及正常组织【1 一通过生物光动力敏化作用，即在特定波长的激光照射后， 光敏剂受到激发，由基态( s o ) 经激发单线态( s 1 ) 转变为激发三线态( t 1 ) ，然 后由激发三线态( t 1 ) 使周围介质中的分子氧成为单线态氧( 1 0 2 ) 等活性物质， 它们与生物分子中的氧化敏感基团作用，导致其氧化失活，最终引起肿瘤细胞死 亡而显示其治疗作用【3 】。p d t 治疗肿瘤就是用光动力反应产生的活性氧物质而达到 治疗肿瘤目的的一种新方法，而单独积聚在肿瘤组织内的光敏剂或单独照射在肿 瘤组织上的光并无治疗作用。p d t 治疗肿瘤主要通过三种机制：( 1 ) 直接导致靶细 胞的死亡；( 2 ) 破坏肿瘤组织内的血管，阻断肿瘤的血供；( 3 ) 免疫调节反应。 p d t 于上世纪7 0 年代最早应用于膀胱癌的临床治疗，目前已应用于治疗体 表、空腔和实质性脏器的多数肿瘤。与传统的手术、化疗和放疗等常规三大治疗 肿瘤的方法相比，p d t 治疗具有二次选择性( 光敏剂选择性聚集在肿瘤组织，激 发光选择性照射在肿瘤组织) ，对正常组织损伤轻，并发症和副作用少，且可反复 应用、无治疗次数限制等优势【4 ，5 1 ，恰可补偿目前常规手段的某些不足，在肿瘤的 综合治疗中日益显示出重要作用。目前临床上应用的光动力治癌药物如血卟啉衍 生物( h p d ) 、光敏素i i 等均为成分复杂的卟啉类混合制剂，存在着在红光区的吸 收系数小、有效光动力效应低、光毒反应大及化学组成不确定等缺点。而二氢卟 吩e 6 是叶绿素稳定降解产物中与生物活性联系最广的成分之一，并且已成为光 动力治癌新药研究中倍受瞩目的研究对象。有报道表明，二氢卟吩e 6 具有两亲 性能( 亲水性和亲脂性) ，能产生良好的肿瘤正常组织比率，且吸收波长移到了红 浙江大学同等学力硕士学位论文 引言 光区( 6 6 4 n m ) ，单线态氧产率o 较高，对肿瘤的抑制率远好于血卟啉衍生物 ( h e m a t o p o r p h y r i nd e r i v a t i v e ，h p d ) 对肿瘤的抑制率【6 1 。 在动物试验中观察到，二氢卟吩e 6 的分布特点是血药浓度高、半衰期较长 和肿瘤组织中潴留量大且相对时间较长。缺点是二氢卟吩e 6 呈现长时间皮肤光 毒性1 7 ，且有效剂量大。由于肿瘤组织对光敏剂只是相对的选择性吸收，并不具备 特异性，所以正常组织中不可避免地潴留有少量的光敏剂，可能产生光毒副作用。 当难以把光源局限在靶位组织，如腹腔和胸腔肿瘤时，为了减少对周围正常组织 的毒副作用，开发靶向型的光敏剂就显得尤为重要【8 , 9 1 。 近年来，为了提高光敏剂在肿瘤细胞的浓度，许多研究组将第二代光敏剂负 载在适当的载体上，制成脂质体、纳米粒等，通过正常生理过程选择性地运送、 积集至靶组织，大幅度提高光敏剂抗肿瘤活性，这对提高药物治疗作用，降低毒 副作用，具有十分重要的意义。r i c h t e r 等【1 0 1 研究发现，苯并卟啉衍生物单环酸a 制成脂质体，能介导药物迅速地进入组织。v a r g a s 等【1 1 】将m e s o ( 对羟基苯) 卟啉 ( p t h p p ) 制成p l g a 纳米粒，可明显增强药物对乳腺癌细胞的作用。 k o n a n k o u a k o u 等【1 2 1 研究发现，将维替泊芬制成乳酸羟乙酸共聚物( p l g a ) 纳 米粒，小粒径的载药纳米粒比药物的d m s o p b s 溶液对乳腺癌e m t - 6 细胞的光 细胞毒性大，并且进入组织的速度明显加快。 壳聚糖是一种具有低毒、高生物相容性、可体内降解的阳离子型载体材料【l 3 1 。 将硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，s a ) 嫁接到壳聚糖( c h i t o s a n ，c s o ) 的主链上，得到两亲性 壳聚糖一硬脂酸嫁接物( s t e a r i ca c i d g r a f t e dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o - s a ) 。前期 的研究工作发现，c s o s a 胶团的正电荷及其具多个疏水核区域的特殊球形结构， 使其能快速被肿瘤细胞摄取【1 4 1 ；并且通过正负电荷之间的相互作用，该胶团可以 将质粒d n a 浓缩于疏水内核，并将d n a 转运到细胞内，获得很高的转染效率 【1 5 】 o 本研究以碳二亚胺为交联偶合剂对水溶性的低分子量壳聚糖进行疏水性修 浙江大学同等学力硕士学位论文 引言 饰，制备得壳聚糖硬脂酸嫁接物，并以三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。 将该嫁接物分散于水中，可通过自聚集形成嫁接物胶团，通过芘荧光法测定嫁接 物在水中的临界胶团浓度，并采用荧光淬灭法测量嫁接物在水中自聚集后形成的 疏水核区域数，研究嫁接物胶团对疏水性药物的载药行为。 嫁接物胶团亲水性表面一般具有大量活性基团可以作为化学修饰的位点。嫁 接物胶团偶联上配体后，通过受体介导的内吞途径进入靶细胞，即可增加嫁接物 胶团的靶向性。叶酸受体是一种通过磷脂酰肌醇锚着在细胞膜上的糖蛋白，属于 肿瘤相关性抗原，在大部分恶性肿瘤如卵巢癌、宫颈癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、 鼻咽癌等组织中高度表达，且其表达量与肿瘤细胞的耐药性及肿瘤的恶性程度呈 正相关，近年来，叶酸受体介导的药物靶向投递系统因其具有突出的优势而广受 关注。 本研究通过碳二亚胺介导，利用壳聚糖长链上残留的氨基与叶酸分子的羧基 间的化学反应，对壳聚糖硬脂酸嫁接物进行叶酸修饰，从而赋予它靶向肿瘤细胞 的特性。并以a 5 4 9 ( f r = ( - ) ) ，m c f 7 ( f r = 3 2 ) 为模型细胞，考察叶酸修饰对嫁 接物胶团选择性摄取的影响。并以二氢卟吩e 6 为模型药物，考察叶酸修饰对胶 团载药行为和细胞摄取的影响。 以h e l a 细胞系为模型细胞，对壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶团的细胞光动力 学研究，考察二氢卟吩e 6 在被壳聚糖硬脂酸嫁接物包载前后的细胞光动力效应 变化。以细胞毒性i c 5 0 与光动力细胞毒性p d ti c 5 0 之比，评价光敏药物的安全 系数，此比值越大，表示载药胶团本身的毒性越小、光毒性越大，安全性越高。 探讨壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团作为抗肿瘤光敏药物靶向制剂的细胞治疗效果。 浙江大学同等学力硕士学位论文第一章壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的细胞摄取和载药行为研究 第一章壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成与理化性质研究 本研究采用酶解法制备低分子量壳聚糖，以碳二亚胺为交联偶合剂合成壳聚 糖硬脂酸嫁接物( s t e a r i ca c i dg r a f t e dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o s a ) 。采用三硝 基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度；以芘荧光法测定嫁接物在蒸馏水中的临界 胶团浓度；用微粒粒度及表面电位分析仪测定嫁接物胶团的粒径与表面电位；采 用稳态荧光淬灭法测定嫁接物的疏水核数量；用透射电镜观察纳米粒形态和大小。 1 1 材料与仪器 1 1 1 材料 低分子量壳聚糖( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o ，分子量1 8 0k d a ，由本实验 室对分子量为4 5 0k d a ，9 5 脱乙酰度的高分子量壳聚糖经生物酶降解得到，高 分子量壳聚糖由浙江玉环海洋生物化学有限公司提供) ；碳二亚胺 ( 1 - e t h y l 一3 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ，e d c ，s i g m ac h e m c o ，s t l o u i s ， u s a ) ，2 ，4 ，6 三硝基苯磺酸( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d ，t n b s ，s i g m a c h e m c o ，s t l o u i s ，u s a ) ，芘( p y r e n e ，a l d r i c hc h e m c o ，u s a ) ，二氢卟吩e 6 ( c h l o r i ne 6 ，c e 6 ，上海红绿光敏剂研究所有限公司) ；十二烷基吡啶盐酸盐 ( 1 - d o d e c y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ，d p c ，j a p a n ) ，硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，s a ，上海化学试 剂厂) ，其他溶剂和试剂均为分析纯。 1 1 2 仪器 高效液相色谱仪( w a t e r s2 4 7 8 ) ；紫外分光光度仪( t u 1 8 0 0 p c ，北京谱析 通用仪器有限责任公司) ；荧光分光光度仪( f 2 5 0 0 ，h i t a c h ic o ，j a p a n ) ；微 粒粒度与表面电位测定仪( z e t a s i z e r3 0 0 0 h s ，m a l v e mc o ，u k ) ；超声波清洗器 ( u s c 3 0 2 ，上海船舶电子设备厂) ；恒温磁力搅拌器( 8 5 2 型，上海司乐仪 浙江大学同等学力硕士学位论文第一章壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的细胞摄取和载药行为研究 器厂) ；电子天平( b s l l 0 s ，上海天平仪器厂) 。 1 2 实验方法 1 2 1 壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成 采用碳二亚胺( e d c ) 1 1 6 】法合成壳寡糖硬脂酸嫁接物。取低分子量壳寡糖( c s o ， m w = 1 8 0k d a ) 1 0 0 0m g ，精密称定，溶于2 0 0m l 去离子水中；另取硬脂酸( s a ) 8 0 0m g ，精密称定，溶于1 0 0m l 热乙醇中，8 0 c 水浴条件下将两者混合，加入 处方量的e d c ，维持2 5 0r m i n 搅拌5 h 后停止加热，待反应产物冷却后，将其 置于透析袋中( m w c o3 5k d a ，s p e c t r u ml a b o r a t o r i e s ，l a g u n ah i l l s ，c a ) ，用1 0 乙醇水透析4 8 h ，以除去副产物，将透析液冷冻干燥，得壳寡糖硬脂酸( s t e a r i c a c i d - g r a f t e dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o - s a ) 嫁接物固体粉末。 1 2 2 壳寡糖硬脂酸嫁接物的理化性质研究 1 2 2 1 壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度测定 采用三硝基苯磺酸( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o b e n z e n e s u l f o n i ca c i d ，t n b s ) 法【1 7 1 ，测定 c s o - s a 的氨基取代度( s u b s t i t u t ed e g r e eo f a m i n og r o u p ，s d ) 。取不同质量的壳聚糖 ( 1 0 、2 0 、5 0 ，1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、5 0 0i i g ) 分别溶于2 0m l 水，加入4 碳酸氢 钠2 0m l 和0 1 三硝基苯磺酸2 0m l ，3 7 孵育2h 。加入2 0m o l l 盐 酸2 0m l ，摇匀，在3 4 4n m 处测定吸光度，制备标准曲线。取l m g m l 的 c s o s a 溶液3 0 0u l ( 即c s o - s a3 0 0p g ) ，同法操作，测定3 4 4n n l 处的吸光 度，按标准曲线计算氨基取代度。 1 2 2 2 壳寡糖硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度测定 采用芘荧光法【1 引，测定c s o s a 在蒸馏水中的临界胶团浓度( c r i t i c a lm i c e l l e c o n c e n t r a t i o n ，c m c ) 。取芘1 2 0m g ，精密称定，置1 0 0m l 容量瓶，加丙酮溶 解并定容。精密移取芘溶液1 0m l ，再加丙酮稀释并定容于1 0 0m l 容量瓶中。 精密移取该浓度的芘溶液1 0m l ，分别置1 0m l 玻璃试管中，5 0 。c 水浴挥去丙 气 浙江大学同等学力硕士学位论文第一章壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的细胞摄取和载药行为研究 酮。分别加入不同浓度( 0 0 0 0 1 、0 0 0 0 5 、0 0 0 1 、0 0 0 5 、0 0 1 、0 0 5 、0 1 、0 2 5 、0 5 、 l m g m l ) f 均嫁接物溶液l o 0m l ，室温水浴超声3 0r a i n ( 使每管中芘的终浓度为7 l o 7m o l l ) 。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度。 1 2 2 3 壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的粒径与表面电位测定 取嫁接物2 5m g ，精密称定，加入2 0m l 去离子水( p h 为5 7 ) 分散，探 头超声2 0 次( 4 0 0w ，工作2s ，停3s ) ，转移至容量瓶，并加去离子水定容至2 5 m l ，制得浓度为1 0r a g m e 的嫁接物胶团溶液。取上述浓度的嫁接物胶团溶液适 量，以微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定粒径及表面电位。 1 2 2 4 嫁接物胶团疏水核数量测定 采用稳态荧光淬灭法【1 9 】，测定c s o s a 的疏水核数量( a g g r e g a t i o nn u m b e ro f s t e a r a t cg r o u p s ，a n ) 。取十二烷基吡啶盐酸盐( d p c ) 7 1m g ，精密称定，用无水 乙醇定容至2 5m l 。移取上述d p c 溶液1 0m l ，用无水乙醇定容至1 0 0m l 。 分别取稀释后的d p c 溶液0 ，0 2 5 ，o 5 ，o 7 5 ，1 0m l 置试管中，1 0 0 水浴 挥干乙醇。另取5 支试管，分别加入“1 2 2 2 ”中稀释的芘液0 5m l ，5 0 。c 水 浴挥干丙酮，各加入1 0m g m l 的c s o s a 溶液5 0m l ，室温水浴超声3 0m i n ， 依次加入到以上含不同量d p c 的试管中，室温静置1 0m i n ，测定荧光强度( e x = 3 3 6n i i l ，e m = 3 9 0n m ，狭缝= 5n m ) 。 1 2 2 5 嫁接物胶团的形态表征 取在蒸馏水中制备得到的c s o s a 溶液，加蒸馏水稀释l o 倍，滴加于覆盖 碳膜的铜网上，用透射电镜观察纳米粒形态和大小。 1 3 结果与讨论 1 3 1 嫁接物氨基取代度 在嫁接物的合成反应中，碳二亚胺( e d c ) 是该反应的交联偶合剂2 0 1 ，将硬 脂酸上的羧基共价嫁接到壳寡糖主链上的游离氨基上，即壳寡糖中有一定数目的 6 浙江大学同等学力硕士学位论文第一章壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的细胞摄取和载药行为研究 氨基被脂肪酸链取代，反应的副产物异脲可由透析除去。通过测定壳寡糖分子上 的自由氨基数即可获得嫁接物的氨基取代度。 三硝基苯磺酸( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r i b e n z e n e s u l f o n i ca c i d ，t n b s ) 是一种显色试剂，可 与自由氨基发生共价反应形成三硝基苯的衍生物，在紫外3 4 4n n l 处有吸收。通 过测定吸收值a ，对壳寡糖浓度c ( 1 x g m l ) 线性回归，得标准回归方程为：a = 0 0 0