（外科学专业论文）apoa基因多态性与颅内动脉瘤发生的相关性研究.pdf

目录 中文摘要。1 英文摘要3 研究论文a p o a 基因多态性与颅内动脉瘤发生的相关性研究 前言6 刖吾。 材料与方法7 结果。1 0 附图一1 1 附表。1 6 讨 仑1 4 结论18 参考文献1 8 综述颅内动脉瘤的发生与相关易感基因多态性的研究进展2 1 致谢。3 9 个人简历4 0 中文摘要 a p o a 基因多态性与颅内动脉瘤发生的相关性研究 摘要 目的：颅内动脉瘤是一种临床常见且危害严重的脑血管疾病，约5 1 的自发性蛛网膜下腔出血是由于颅内动脉瘤破裂所致。颅内动脉瘤可以发 生在任何年龄段，4 0 , - - 6 0 岁患者发病率最高，儿童及青年发病较少，女性 略多于男性。其中以颅底动脉环以及颅内动脉的主要分支上发生的动脉瘤 最多见，颈内动脉系统发生率占8 0 ，椎动脉系统发生率占2 0 。由于 颅内动脉瘤破裂出血后致残率和病死率均较高。多年来，国内外学者对颅 内动脉瘤的发病原因和机制进行了大量研究，并从遗传、免疫、内分泌、 创伤及病毒感染等多方面提出了种种可能的解释，但仍存在较大分歧，而 且始终有些问题难以解释，比如为什么有些颅内动脉瘤患者终生未发病， 仅在尸体解剖时才被发现? 为什么有些颅内动脉瘤直径很小却在早期即 发生破裂出血? 目前得出的较为一致的看法为动脉瘤的形成是在环境因 素影响下由多基因遗传因素相互作用而产生，但其具体机制尚不明确。随 着分子生物学技术的进步以及对动脉瘤认识的深入，人们发现遗传因素在 颅内动脉瘤的发病过程中起重要作用，并且推测颅内动脉瘤的发生、发展 以及最终破裂可能与某些因子的单个核苷酸突变导致的基因多态性有关。 研究发现，脂蛋白a 水平升高可能是颅内动脉瘤发生的独立危险因素， 而血浆中脂蛋白a 的水平受载脂蛋白a 结构基因( a p o a ) 调控，其中， a p o a 中k r i n g l ei v 数目多态性和5 端调控区的多态性决定着载脂蛋白a 蛋白表型的多态性。因此，国内外诸多学者从基因水平探讨了a p o a 多 态性与颅内动脉瘤发生的相关关系，但受年龄、种族、性别及吸烟与否等 多种因素影响导致研究结果出现较大分歧。本研究旨在前人的研究基础 上，采用分子生物学技术，进一步探讨a p o a 5 端调控区9 1 4 位点g a 多态性与颅内动脉瘤发生之间是否存在的相关性，为颅内动脉瘤破裂出血 的早期预防、诊断及治疗提供理论依据。 方法：随机选择2 0 0 9 年1 2 月- 2 0 1 0 年1 0 月就诊于河北医科大学第 二医院神经外科且经全脑数字减影血管造影( d i g i t a ls u b t r a c t i o n a n g i o g r a p h y ，d s a ) 证实为颅内动脉瘤的患者3 0 例作为颅内动脉瘤组， 中文摘要 另选取健康志愿者3 0 例作为正常对照组。符合入选标准的研究对象均于 清晨抽取空腹外周静脉血样5m l 血样，测定血浆脂蛋白a 水平；另取外 周静脉血样5m l ，采用聚合酶链反应限制性内切酶片断长度多态性 ( p c r r f l p ) 分析技术提取d n a ，检测a p o a 多态性，并测定a p o a5 调控区9 1 4 位点g a 等位基因，以分析a p o a 多态性位点与颅内动脉瘤 发生的相关性。采用s a s6 1 2 统计软件进行统计学分析，数据以均数4 - 标准差( ；如) 表示，两组间均数的比较采用独立样本t 检验；研究对象 与h a r d y w e i n b e r g 平衡的符合程度、基因型和等位基因检出率的比较采 用# 检验；不同基因型间数据比较采用单因素方差分析；采用l o g i s t i c 回 归分析校正年龄、性别、高血压等危险因素对结果产生的影响，以p o 0 5 ) ； 2 颅内动脉瘤组及正常对照组均于a p o a5 调控区9 1 4 位点g a 检出 a 、a g 、g g 三种基因型，且两组间基因型频率分布均符合 h a r d y w e i n b e r g 平衡，颅内动脉瘤组a 、a g 、g g 三种基因型检出率 均高于正常对照组，且差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ； 3 两组a p o a5 调控区9 1 4 位点g a 检出的a ，a 、刖g 、g g 三种基 因型分布均以等位基因a g 最常见( p o 0 5 ) ； 4 颅内动脉瘤组及正常对照组血浆脂蛋白a 水平分别为( 6 1 5 4 - 1 0 1 ) m g d l 及( 1 5 5 4 - 6 9 ) m g d l ，颅内动脉瘤组血浆脂蛋白a 水平明显高于正 常对照组，且差异有统计学意义( 尸 0 0 5 ) 3i nt h et w og r o u p s ，a l l e l ea gw a sm o s tc o m m o ni nt h et h r e e g e n o t y p e so fa a ，a g ，g g ( p o 0 5 ) 4t h ep l a s m al i p o p r o t e i nal e v e l sw e r e ( 6 1 54 - 1 0 1 ) m g d la n d ( 1 5 5 4 - 6 9 ) m g d li ni aa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u pr e s p e c t i v e l y ，w i t ht h ef o n a a e r s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h el a t t e ra n d w i t hs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ：t h e r ei sn oc o r r e l a t i o nb e t w e e na p o a5 l o c u sc o n t r o l r e g i o n 一9 14g ap o l y m o r p h i s ma n dd i v e r s ep l a s m al i p o p r o t e i nal e v e l y e t i n c r e a s e dp l a s m al i p o p r o t e i nal e v e lm a yb er e l a t e dw i t ht h eo c c u r r e n c eo fi a k e y w o r d s ：i n t r a c r a n i a la n e u r y s m s ；g e n ep o l y m o r p h i s m ；a p o a ； l i p o p r o t e i na 5 研究论文 a p o a 基因多态性与颅内动脉瘤发生的相关性研究 上- ! - 刖茜 脑血管病是危害人类健康的三大疾病之一，我国每年死于脑血管病的 人数位居死亡人数的第一位。颅内动脉瘤是一种临床常见且危害严重的脑 血管疾病，约5 1 的自发性蛛网膜下腔出血是由于颅内动脉瘤破裂所致。 颅内动脉瘤可以发生在任何年龄段，4 0 - 6 0 岁患者最多见，其中4 1 5 0 岁 的患者占发病人数的4 2 6 ，儿童及青年发病较少，女性略多于男性。研 究显示，颅内动脉瘤人群的终生患病率为0 2 - - - 9 9 【1 】，而发病率仅为 0 18 o 2 3 o 2 1 ，尸体解剖和血管造影显示未破裂动脉瘤的发生率为 2 7 6 5 蝌3 1 。 颅内动脉瘤是颅内动脉的局限性异常扩张，多发生在颅底w i l l i s 动脉 环以及颅内动脉的主要分支上，常伴有管壁结构的薄弱和缺损，国外曾有 实验表明：3 8 9 8 例颅内动脉瘤中颈内动脉瘤占4 1 3 ，后交通动脉瘤占 2 4 4 ，大脑中动脉瘤占2 0 8 ，大脑前动脉瘤占9 0 ，椎基底动脉占 4 5 ，多发性动脉瘤占8 0 。由于颅内动脉瘤破裂出血后可出现一系列 诸如颅内压增高、脑脊液循环障碍、脑血管痉挛等临床表现，因此致残率 和病死率均较高。 多年来，国内外学者对颅内动脉瘤的发病原因和机制进行了大量研 究，并从遗传、免疫、内分泌、创伤及病毒感染等多方面提出了种种可能 的解释，但仍存在较大分歧，而且始终有些问题难以解释，比如为什么有 些颅内动脉瘤患者终生未发病，仅在尸体解剖时才被发现? 为什么有些颅 内动脉瘤直径很小却在早期即发生破裂出血? 目前得出的较为一致的看 法为动脉瘤的形成是在环境因素影响下由多基因遗传因素相互作用而产 生【4 】，但其具体机制尚不明确。 随着分子生物学技术的进步以及对动脉瘤认识的深入，人们发现遗传 因素在颅内动脉瘤的发病过程中起重要作用【5 】，并且推测颅内动脉瘤的发 生、发展以及最终破裂可能与某些因子的单个核苷酸突变导致的基因多态 性有关。研究发现，脂蛋白a l p ( a ) 水平升高可能是颅内动脉瘤发生 的独立危险因素【6 】，而血浆中l p ( a ) 的水平受载脂蛋白a a p o ( a ) 结 研究论文 构基因( a p o a ) 调控，其中，a p o a 中k r i n g l ei v 数目多态性和5 端调 控区的多态性决定着l p ( a ) 蛋白表型的多态性。因此，国内外诸多学者 从基因水平探讨了a p o a5 端调控区9 1 4 位点g a 多态性与颅内动脉瘤 发生的相关关系，但受年龄、种族、性别及吸烟与否等多种因素影响导致 研究结果出现较大分歧。 本研究旨在前人的研究基础上，采用分子生物学技术，进一步探讨 a p o a 5 端调控区9 1 4 位点g a 多态性与颅内动脉瘤发生之间是否存在的 相关性，为颅内动脉瘤破裂出血的早期预防、诊断及治疗提供理论依据。 材料与方法 l 材料 1 1 主要仪器 g e n e r a lt u 1 2 0 1紫外可见光分光光度仪 t g l 1 6 g 台式高速离心机 p e 4 8 0 p c r 热循环仪 d y y - i i l 8 a 电泳仪 d y y - i i l 3 4 a 电泳槽 e a g l ee y ei i 凝胶分析仪 o 1 2 5 ，1 1 0 ，2 0 2 0 0 ，1 0 0 1 0 0 0 微量移液器 h i t a c h im d f 4 5 0 型分析天平日本日立公司 s s w 型电脑电热恒温水箱 1 2 主要试剂 分析纯葡萄糖天津化学试剂公司 柠檬酸天津化学试剂公司 柠檬酸钠天津化学试剂公司 蛋白酶k 。德国m e r c k 公司 氯化铵天津化学试剂公司 碳酸氢钾上海化学试剂公司 分析纯e d t a北京化学试剂公司 分析纯t r i s北京化学试剂公司 研究论文 琼脂糖 分析纯硼酸 溴化乙锭 分析纯石蜡油 异戊醇 三氯甲烷二氯甲= j 艽 t r i s 平衡酚 d n a m a k e r 引物 d n t p 1o ) ( p c r b u f f e r t a q d n a 聚合酶 2 研究对象及分组 西班牙 天津化学试剂公司 天津化学试剂公司 美国p r o m e g a 公司 天津化学试剂公司 天津化学试剂公司 天津化学试剂公司 北京赛百盛生物工程公司 北京赛百盛生物工程公司 上海生工生物工程公司 上海生工生物工程公司 上海生工生物工程公司 随机选择2 0 0 9 年1 2 月2 0 1 0 年1 0 月就诊于河北医科大学第二医院 神经外科且经全脑数字减影血管造影( d i g i t a ls u b t r a c t i o na n g i o g r a p h y ， d s a ) 证实为颅内动脉瘤的患者3 0 例作为颅内动脉瘤组，另选取健康志 愿者3 0 例作为正常对照组。 3 试验步骤及方法 3 1 标本采集 于清晨抽取空腹外周静脉血样l om l 待检。 3 2 指标测定 3 2 1 血浆脂蛋白a 水平测定 取外周静脉血样5m 1 ，送临床检验室测定血浆脂蛋白a 水平。 3 2 2 采用多聚酶链反应限制性内切酶片断长度多态性( p c r r f l p ) 分 析技术检测a p o a 基因多态性，并测定a p o a5 调控区9 1 4 g a 等位基因 分布情况，分析a p o a 基因多态性位点与颅内动脉瘤发病的相关性。 ( 1 ) 提取d n a ：取外周静脉血样5m l ，采用聚合酶链反应限制性 内切酶片断长度多态性( p c r r f l p ) 分析技术提取d n a ： a 于清晨抽取空腹外周静脉血样5m l 血样，加a c d 抗凝剂1 7 5m 1 ， 充分混匀，离心取血浆； b 向离心管内加入l y s i sb u f f e r3 0m l ，置于冰上1 5 直接加5 m l 饱 研究论文 和酚，置于摇床上充分混匀1 5 分钟，3 0 0 0 转分钟，离心1 0 分钟；，轻轻 颠倒离心管混匀后3 0 0 0 转分钟，离心1 0 分钟，加5 m l 饱和酚，置于摇 床上充分混匀l5 分钟，离心3 0 0 0 转lo 分钟； c 弃去上清液，加入s e5 m l ，用吸管吹打沉淀，加2 0 s d s2 5 0 9 l 、 p k ( 2 0 m g m 1 ) 5 0 9 l ，37 。c 温育过夜； d 加入饱和酚5 m l ，置于摇床上充分混匀1 5 直接加5 m l 饱和酚， 置于摇床上充分混匀1 5 分钟，3 0 0 0 转分钟，离心1 0 分钟； e 轻轻吸出上清液5 m l ，加入氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 5 m l ，于摇床 上混匀15 分钟，3 0 0 0 转分钟，离心1o 分钟； 轻轻吸出上清液5 m l ，加3 m 乙酸钠7 0 9 l ，2 倍体积无水乙醇， 轻轻颠倒至d n a 析出； g 勾出d n a 至e p 管，用7 0 乙醇洗涤，倒出乙醇用t e 溶解， 保存。 ( 2 ) p c r 扩增 a a p o a 9 1 4 g a 的引物序列： 上游引物5 c c a c a a c t a c t a g a a t a g g a a g g 3 下游引物5 - g t g g c t c a t g c c t a t aa t c c 3 b p c r 扩增条件：两组分别混匀于p c r 扩增仪，先9 4 预变性4m i n ， 再9 4 变性4 0 s ，5 5 退火4 0 s ，7 2 延伸4 0 s ，共循环3 5 次，最后7 2 延伸5m i n ，4 。c 冰箱保存待检。 ( 3 )电泳 将p c r 产物以限制性内切酶t a qi 进行酶切后在3 琼脂糖凝胶中电 泳，鉴定9 1 4 g a 等位基因。 4 统计学处理 采用s a s6 1 2 统计软件进行统计学分析，数据以均数士标准差( ；如) 表示，两组间均数的比较采用独立样本f 检验；研究对象与h a r d y w e i n b e r g 平衡的符合程度、基因型和等位基因检出率的比较采用z 检验；不同基 因型间数据比较使用单因素方差分析；采用l o g i s t i c 回归分析校正年龄、 性别、高血压等危险因素对结果产生的影响，以p 0 0 5 ) ，见t a b l e1 ； 2 颅内动脉瘤组及正常对照组均于a p o a5 调控区9 1 4 位点g a 检出 a 、a g 、g g 三种基因型，且两组间基因型频率分布均符合 h a r d y w e i n b e r g 平衡，见f i g 1 ；颅内动脉瘤组a 、a g 、g g 三种 基因型检出率均高于正常对照组，且差异有统计学意义( p o 0 5 ) ， 见t a b l e 2 ，f i g 2 ； 3 两组a p o a5 调控区9 1 4 位点g a 检出的a 、a g 、g g 三种基因 型中以等位基因a g 最常见( p cp r o m o t e rp o l y m o r p h i s m sa r er e l a t e dt oc e r e b r a l a n e u r y s m s j 】n e u r o ln e u r o s u r gp s y c h i a t r y , 2 0 0 6 ，7 7 ( 8 ) ：9 15 917 6 4 张国忠，冯文峰，黄理金，等汉族人白细胞介素6 17 4 g c 基因多态 性与颅内动脉瘤的关联性研究中国神经精神疾病杂志，2 0 0 9 ，3 5 ( 4 ) ： 2 5 4 2 5 6 6 5s k i r g a u d a s m ，a w a di a ，k i mj ，e ta 1 e x pr e s s i o no fa n g i o g e n e s i sf a c t o r s a n ds e l e c t e dv a s c u l a rw a l lm a t r i x p r o t e i n s i ni n t r a c r a n i a ls a c c u l a r a n e u r y s m s j n e u r o s u r g e r y , 1 9 9 6 ，3 9 ( 3 ) ：5 3 7 - 5 4 5 6 6 李明昌，石忠松，黄正松，等颅内动脉瘤组织免疫和炎症相关差异表 达基因的研究 j 中华神经医学杂志，2 0 0 6 ，5 ( 9 ) ：9 1 1 9 1 4 6 7c h y a t t ed ，b r u n ogd e s a is ，e ta 1 i n f l a m m a t i o na n di n t r a c r a n i a l a n e u r y s m s j n e u r o s u r g e r y , 19 9 9 ，4 5 ( 5 ) ：1 137 114 6 6 8j a v a r a m a nt ，b e r e n s t e i nv m a y e rj ，e ta 1 t u m o r n e c r o s i sf a c t o ra l p h ai sa k e ym o d u l a t o ro fi n f l a m m a t i o ni nc e r e b r a la n e u r y s m s j 】n e u r o s u r g e r y , 2 0 0 5 ，5 7 ( 3 ) ：5 5 8 5 6 4 6 9l o u i se ，f r a n c h i m o n td ，p i r o na ，e ta 1 t u m o u rn e c r o s i sf a c t o r ( n 盯) g e n ep o l y m o r p h i s m i n f l u e n c e s t n f a l p h ap r o d u c t i o n i n l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) s t i m u l a t e dw h o l eb l o o dc e l lc u l t u r ei nh e a l t h y h u m a n s j c l i ne x pi m m u n e ，19 9 8 ，113 ( 3 ) ：4 01 - 4 0 6 7 0 宋秀娟，郭力，李彬，等肿瘤坏死因子p 基因多态性与多发性硬化的 相关性研究【j 】中国神经精神疾病杂志，2 0 0 8 ，3 4 ( 2 ) ：1 5 1 7 71f o n t a n e l l a m ，r a i n e r oi ，g a l l o n es ，e ta 1 t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h ag e n e a n dc e r e b r a la n e u r y s m s j n e u r o s u r g e r y , 2 0 0 7 ，6 0 ( 4 ) ：6 6 8 - 6 7 2 7 2 何伟文，陈锐聪，李明昌，等肿瘤坏死因子a 2 3 0 8 基因多态性与广东 3 7 综述 汉族人颅内动脉瘤的相关性研究中国神经精神疾病杂志， 2 0 0 8 ，3 4 ( 1 0 ) ：6 1 3 6 1 5 7 3l o c k s l e yr m ，k i l l e e nn ，l e n a r d om j t h et n fa n dt n fr e c e p t o r s u p e r f a m i l i e s j c e l l ，2 0 0 1 ，1 0 4 ( 4 ) ：4 8 7 5 0 1 7 4s a l z e ru ，c h a p e lh m ，w e b s t e ra d ，e ta 1 m u t a t i o n si nt n f r s f13 b e n c o d i n gt a c i a r ea s s o c i a t e dw i t hc o m m o nv a r i a b l ei m m u n o d e f i c i e n c yi n h u m a n s j n a t u r eg e n e t i c s ，2 0 0 5 ，37 ( 8 ) ：8 2 0 - 8 2 8 7 5 s c h a f f e ra a ，s a l z e ru ，h a m m a r s t r o ml ，e ta 1 d e c o n s t r u c t i n gc o m m o n v a r i a b l ei m m u n o d e f i c i e n c yb yg e n e t i ca n a l y s i s j c u r r e n to p