（高分子化学与物理专业论文）新型固相合成载体的合成和应用.pdfVIP

摘要 环氧类树脂的特性取决于其碳氧骨架，由于碳氧键能高于碳碳键能，使其具有高强 度高稳定性，同时使环氧类树脂比聚苯乙烯类树脂具有更好的亲水性，与生物体系兼容 性更强。本文选择苯基缩水甘油醚作为新型环氧类功能基树脂的单体，双( 4 一缩水甘 油羟苯基) 甲烷作为交联剂，利用氢化钠和d m s o 反应制得甲磺酰碳负离子引发剂， 在d m s o 中进行阴离子聚合，得到了不同交联度的聚苯基缩水甘油醚树脂。将树脂功 能基化，制得羟甲基化的聚苯基缩水甘油醚树脂。用此树脂做圆相合成的载体上，通过 f m o c 固相多肽合成方法，合成了a c p 6 5 7 4 ，此肽链容易产生二级结构，较难合成。 通过高效液相色谱分析了所得多肽的纯度，证明聚苯基缩水甘油醚树脂可以用作多肽合 成载体，并且在功能基树脂的领域确实具有较高的学术价值。 二乙烯苯交联的聚苯乙烯树脂在固相有机合成中得到了广泛应用，然而，由于二乙 烯苯分子较小且刚性较强，使树脂网络中靠近交联剂的反应位点活性降低；另外，连接 在树脂上的肽链会形成二级结构，肽链分子的聚集，使试剂难以接近反应位点，导致缩 合速率降低甚至缩合不完全，所得产物肽纯度不高。本论文选取一缩二乙二醇双甲基丙 烯酸酯和二缩三乙二醇双甲基丙烯酸酯作为聚苯乙烯树脂的交联剂，制备了两种新型的 w a n g 树脂。新型交联剂使树脂网络中增加了c = o 、c c o c c 这样的极性结构，增大 了聚苯乙烯在极性溶剂中的溶剂化程度。同时，这两种交联剂分子链较长，具有较大的 柔性，提高了聚苯乙烯交联网络的舒展程度，同样可以提高树脂的溶剂化能力，增加位 点可近性。我们以两种新型w a n g 树脂和二乙烯苯交联的w a n g 树脂做固相合成的载体， 分别合成了a c p 6 5 - - 7 4 ，结果表明在同样条件下两种新型w a n g 树脂的缩合速率明显大 于二乙烯苯交联的w a n g 树脂，并且高效液相色谱的谱图表明，两种新型w a n g 树脂合 成的a c p 6 5 - - 7 4 杂峰较少且峰面积小，所得a c p 6 5 - - 7 4 的纯度高。 关键词：环氧类功能基树脂聚苯基缩水甘油醚树脂 相多肽合成 一缩- - 7 , - 醇双甲基丙烯酸酯二缩三乙二醇双甲基丙烯酸酯 a b s t r a c t e p o x yr e s i n sw i t h c c o m a i nc h a i n sp o s s e s sh i g hm e c h a n i c a ls v e n g t ha n dh i 曲 c h e m i c a ls t a b i l i t yb e c a u s et h eh i g h e rb o n d i n g e n e r g yo f c ob o n dc o m p a r i n gt oc - cb o n d i na d d i t i o n ，t h ee p o x yr e s i n sa r eh y d r o p h i l i ca n dt h u sm o r e b i o c o m p a t i b l et h a np o l y s t y r e n e r e s i n s c r o s s l i n k e d e p o x yr e s i n s w i t hd i f f e r e n t c r o s s l i n k a g e w e r ep r e p a r e d b ya n i o n i c p o l y m e r i z a t i o n i nt h ep o l y m e r i z a t i o n , p h e n y lg l y c i d y l e t h e rw a su s e da st h em o n o m e r , d i ( 4 一g l y c i d y lh y d r o x i d ep h e n y l ) m e t h a n ea sc r o s s l i n k e r , d i m s y ls o d i u ma st h ei n i t i a t o r , a n d d m s oa st h es o l v e n t h y d r o x y m e t h y lr e s i nw a sp r e p a r e db yf u n c t i o n a l i z a t i o no ft h ee p o x y r e s i n w i t ht h eh y d r o x y m e t h y lr e s i na st h ec a r r i e ro f s p p s ，w e s y n t h e s i sap e p f i d e ，a c p 6 5 - - 7 4 ，w h i c hi sd i f f i c u l tt os y n t h e s i z ea si te a s i l yf o r m st h es e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h er e a c t i o n s y s t e m t h er e s u l t so ft h eh p l ca n dl c m ss h o w e dt h er i g h tp e p t i d ew a so b t a i n e d ， i n d i c a t i n gt h a tt h en e w r e s i nc a nb eu s e di nt h es p p s p o l y s t y r e n ec r o s s l i n k e dw i t hd i v i n y l b e n z e n ei sw i d e l yu s e d a st h es o l i dp h a s em a t r i xi n b o t hs p p sa n ds p o s h o w e v e r , t h er e a c t i o ns i t e sn e a rt h es h o r tc r o s s l i n k i n gb r i d g ef o r m e d b yd v b h a v el o w r e a c t i v i t y i na d d i t i o n ，g r o w i n gp e p t i d ec h a i n sb u i l tu po n t h er e s i nm a t r i x c a nf o r ms e c o n d a r ys t r u c t u r e so ra g g r e g a t e se i t h e rw i t ho t h e rp e p t i d ec h a i n so rw i t ht h e p o l y m e rs u p p o r t ，c a u s i n gt h ef o l l o w i n gc o u p l i n gd i f f i c u l tt oe a l t yo u t i nt h i sw o r k ，w eu s e d d i ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i m e t h a c r y l a t eo rt r i ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i m e t h a c r y l a t ea sc r o s s l i n k e r t o c o p o l y m e r i z ew i t hs t y i ：e n e t of o r mn e wp o l y s t y r e n er e s i nm a t r i c e sf o rs p p so rs p o s h y d r o x y m e t h y i p h e n y o x y lr e s i n s w e r ep r e p a r e df r o mt h en e wp o l y s t y r e n er e s i nm a t r i c e s p a r a l l e lr e a c t i o n st e l lu s 也a tt h er e a c t i v er a t e so ft h en e wr e s i n sa r ef a s t e rt h a nt h o s eo ft h e t r a d i t i o n a lw a n gr e s i n s t h ep u r i t yo ft h ep e p t i d e ss y n t h e s i z e db yt h en e wr e s i n si sh i g h e r a c c o r d i n g t ot h er e s u l to ft h eh p l c k e y w o r d s ： c r o s s l i n k e de p o x yr e s i n s ；p o l y ( p h e n y lg l y c i d y le t h e r ) ；s o l i dp h a s ep e p t i d e s y n t h e s i s ；d i ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i m e t h a c r y l a t e ；t r i ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i m e t h a c r y l a t e 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 第一章前言 1 1 固相多肽合成的基本原理 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋 白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到目前 为止，人们已发现和分离出近干种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一 个空前繁荣的景象。 生命科学的飞速发展愈来愈表明许多生物活性肽在生命过程中起着极其重要的作 用。多肽的全合成不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的应用价值。通过多肽全合 成可以验证一个新的多肽的结构；可以设计新的多肽，研究其结构与生物活性的关系； 为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶，在分子水平上揭示酶的作用机制； 合成新的特异性疫苗和多肽药物等。 1 1 1 固相多肽合成的发展历程 多肽合成已经有1 0 0 多年的历史了，多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法 都已成熟。在传统的液相多肽合成中，每次接肽以后都要进行分离纯化或结晶以除去未 反应的原料或者反应的副产物，这种操作相当费时而且麻烦，并且由操作带来的损失也 很大。为了克服这一缺点，m e r r i f i e l d 于1 9 6 3 年首先发展了固相多肽合成的方法。 固相合成的方法可以避免繁琐的分离提纯的步骤，与液相的方法相比具有明显的优 越性：( 1 ) 多肽合成过程中，肽链连接于不溶性载体上，因此产物肽也是不溶的，易洗 涤易过滤；( 2 ) 反应中可以加入过量的反应物使反应趋于完全，而过量的试剂和副产物 可以通过洗涤和过滤除去；( 3 ) 整个反应在同一容器中进行，避免了液相法合成中的多 次沉淀、洗涤、分离造成的机械损失，操作简便快捷；( 4 ) 操作具有很强的重复性，有 利于多肽合成反应的自动化。m e r r i f i e l d 首先利用这个方法合成了结晶的 l e u a l a g l y v a l 四肽呻】，差不多与之同时，l e t s i n g e r 和k o m e t 用类似的方法合成了 l e u g l y 二肽【3 l 。以后通过m e r r i f i e l d 及其他实验室对这种方法进行不断的改进和完善 4 - 9 1 ，多肽固相合成技术已经相当成熟。固相多肽合成是基于液相反应发展起来的，由 于在液相反应中普遍采用的是以羧基活化的方式进行接肽，因此在固相上大多也采用由 离开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 c 一端向n 一端伸长肽链的方式。固相多肽合成的基本原理是：在不溶性的载体上引入反 应基团，如氯甲基，氯代乙酰基，羟甲基等，通过这些基团与o l 一氨基保护的氨基酸的 羧基反应，将氨基酸共价键联到载体上，然后将吼一氨基保护基脱除，加入第二个保护 氨基酸，在缩合剂的作用下反应形成肽键。如此反复，顺次向n 一端方向每次缩合一个 n 一端保护，c 一端活化的氨基酸。在反应中使用过量的n 一端保护氨基酸和其它试剂以增 加产率。固相多肽合成的反应流程见图1 1 。由于挂在固相载体上的多肽是不溶的，因 此可以用简单的洗涤方式除去多余的试剂及副产物。当达到所需的肽链长度时从载体上 切下合成好的多肽，溶解、纯化即可得到所需的产品。其中- 氨基用b o c ( 叔丁氧羰基) 保护的称为b o c 固楣合成法，廿氨基用f m o c ( 9 芴甲氧羰基) 保护的称为f m o c 固耜 合成法。 固相合成法的创立，特别是以此为基础的多肽合成仪的问世，使在实验室大量合成 中小型肽成为可能，这为在化学、生物和医学领域制备各种活性肽，研究肽的结构和功 能提供了极其有利的工具。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便 于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并已扩展到核苷酸合 成等其它有机合成领域。 1 1 2 固相多肽合成的具体实施步骤 1 1 2 1 树脂的选择及氨基酸的固定 用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：苯乙烯一二乙烯苯交联树脂、聚丙 烯酰胺、聚乙烯一乙二醇类树脂及其衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能连上第 一个氨基酸。根据所导入的反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树 脂、羟基树脂、氨基树脂以及酰肼型树脂。b o c 合成法通常选择氯甲基树脂，如m e r r i f i e l d 树脂；f m o c 合成法通常选择羟基树脂如w a n g 树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨 基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成共价键来实现的，形成共价键的方法有很多：氯 甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下， 直接同树脂反应或在合适的有机溶裁如二氧六环、d m f 或d m s o 中反应：羟基树脂， 通常热入适当的缩合剂如d c c 或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成酯键以完成 氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，则是加入适当的缩合剂如d c c 后，通过保护 通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。 南歼大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 囚 旷n 一卜k 上 囚 匝卜一6 t 一0 8 一。 r ， 囚= s i d e - c h a i n p r o t e c t i n g g r o u p 回- n _ 。州e c t i n g g r o u p 匦卜o i a t t a c ht ol i n k e r i 1 啪 0 呐 一 一 l 厂“e 喇 e f 0 二l 一“一l 二l 一。函南 甲c 图 虬* 一i l 曹一l 一。函 - 1 甲卜。 二嶂* 一r 5 x 一0 l * 一r 5 1 0 4 一。o r i h 2 n 目 图1 1 固相多肽合成的流程 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 i 1 2 2 氨基、羧基、侧链的保护及脱除 要成功合成具有特定氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基 以及氨基酸侧链上的活性基因加以保护，反应完成后再将保护基脱除。b o d a n s z k y 等【加】 曾对各种氨基酸保护基作过详尽的综述。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基 作为a 一氨基的保护基，因为此类保护基不易发生消旋。最早是用苄氧羰基1 1 】，由于它 需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基( b o c ) 【12 j 保护，它可用t f a ( 三氟乙酸) 脱保护，但此方法不适用于合成含有对酸不稳定的残基( 色氨酸等) 的肽 类。1 9 7 8 年，c h a n gm e i e n l o f e r 和a t h e r t o n 等人采用了c a r p i n o 报道的f m o c ( 9 - 芴甲 氧羰基) 作为c c 一氨基的保护基。f m o c 基对酸很稳定，但能用哌啶c h 2 c 1 2 或哌啶d m f 脱 除。近年来，f m o c 合成法已得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。 甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片 断缩合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、 组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的残基的肽来说，为了避免由于侧链功能基所带来的副 反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧 链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，还要保证在最后肽 链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的s 一，用酸或银盐、汞盐除去；组氨 酸的咪唑环用2 ，2 ，2 一三氟一卜苄氧羰基和2 ，2 ，2 一三氟一卜叔丁氧羰基乙基保护，可通过 催化氢化或冷的三氟乙酸除去。精氨酸用金刚烷氧羰基( a d o c ) 保护，用冷的三氟乙酸 除去。 1 1 2 3 成肽反应 固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被 保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化， 变成对称酸酐、混合酸酐【1 3 1 、活化酯【1 4 l 、酰氯，或用强的缩合剂( 如碳二亚胺) 形成 酰胺键。其中选用d c c 、h o b t 或h o b t d c c 的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。 1 1 2 4 裂解及合成肽链的纯化 b o c 法用t f a 脱除侧链保护基，h f 裂解：f m o c 法直接用t f a 同时进行侧链脱保护 和裂解，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合 成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析或毛细管电泳等。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 1 1 3 固相合成的特点及存在的主要问题 固相合成法对于多肽合成具有显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在 一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载 体共价键联的肽链处于适宣的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤来完成中间的纯化， 避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分离步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失； 使用过量反应物，使反应进行完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间 产物：固相载体上肽链和轻度交联的聚合物链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂化效 应，这对肽链自聚集热力学不利而对反应适宜。 但是，固相多肽合成法并非完美无缺，也存在着产物纯度不如液相法合成高的缺点 ”6 1 。如果把接一个氨基酸叫做一个“循环”的话，每个“循环”都要经过几个步骤： 脱除保护基、中和、形成肽键的缩合反应、洗涤和过滤。若合成百肽的话，需要几百个 步骤，即使每步收率都是9 9 5 ，在反应百步以后，收率仅为3 6 6 。除了由于洗涤 过滤不彻底而残留的反应试剂和反应副产物，以及其它外源性污染外，还积累了大量结 构类似的欠缺肽和空心肽，它们的性质和目的肽非常接近，这给分离带来了很大的困难。 因此提高所合成的多肽的纯度是固相多肽合成中的核心问题。 目前，人们还只能合成一些较短的肽链，当肽链的长度增长到一定程度，无论是缩 合反应速率或是缩合率都会明显降低。甚至，在合成一些较短的肽链的时候，同样会出 现缩合反应速率降低以及缩合不完全的情况。人们发现，产生这种现象的主要原因是连 接在树脂上的多肽形成了蛋白质的二级结构。 蛋白质的二级结构 1 是指它的多肽链中有规则重复的构象。二级结构可涉及少至 三个氨基酸残基或多至肽链中的大部分残基。氢键是稳定二级结构的主要作用力。在一 个简单蛋白质中，二级结构的一定组合能形成可辨认的花样( p a t t e r n ) 。这些特定的二级 结构组合体被称为超二级结构( s u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 。 一般认为，驱使蛋白质折叠的主要动力来自为使暴露溶剂中的疏水基团降低至最少 程度的需要。但是同时需要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子之间形成的氢键相 互作用的有利能量状态。为满足第一个需要，多肽链将发生折叠使多数疏水基团躲开与 溶剂水接触。为维持系统的能量平衡，要求在折叠状态的多肽主链的基团之间形成氢键 相互作用。这要求对蛋白质的折叠产生一个由氢键维系的有规则的重复构象。因为主 链肽键上的羰基( c = o ) 和胺基( 一n h ) 是沿多肽主链有规则排列的，因此在最适状态时 将在多肽链内或多肽链之间出现周期性排列的氢键相互作用，从而形成蛋白质的二级结 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 构。从构象图的角度来研究，当多肽链中的一段连续的c 成对二面角( 击和掣) 分别取相 同的数值，那么这一段肽链的构象就成二级结构。 二级结构的三种基本类型，一螺旋，b 折叠和p 转角，广泛地存在于球状蛋 白质内。但是各种类型的二级结构并不是均匀地分布在蛋白质中。某些蛋白质，如血红 蛋白和肌红蛋白含有大量的a 一螺旋，而另一些蛋白质如铁氧化还原蛋白( f e r r e d o x i n ) 则不含任何的a 一螺旋。不同蛋白质中8 一折叠的含量和1 3 一转角的数目也有很大的变 化。某些纤维状蛋白质，例如，角蛋白完全由a 一螺旋构成，而丝心蛋白( f i b r o i n ) 是具 有b 一折叠片的典型代表。 一一一一一- l 二虹重型 1 0 一一一：h 一8 年n h 。h r c o 斗是一 l j 薯3 n 端 c 端 图1 2d 一螺旋的尺寸 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 ( 1 ) a 一螺旋 n 一螺旋( a h e l i x ) 是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。n 一螺旋中每个残 基( c 。) 的成对二面角中和1 l r 各自取同一数值，中= - - 5 7 。、1 i r = - - 4 8 。，即形成具有周期 性规则的构象。多肽主链可以按右手方向或左手方向盘绕形成右手螺旋或左手螺旋。每 圈螺旋占3 6 个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0 5 4 r t m ，每个残基绕轴旋转1 0 0 0 ，沿 轴上升0 1 5 n m ( 图3 - - 5 5 ) 。a 螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧。相邻螺圈之间形成 链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。氢键是由肽键上的n h 氢和它后面州端) 第四个残基上的c = 0 氧之间形成的。 如图1 2 ，n = 3 表示氢键封闲的环共包含1 3 ( 3 3 + 4 ) 个原子。常用3 6 1 3 - 螺旋( n = 3 ) 代表q 螺旋，其中3 6 指每圈螺旋含3 6 个残基( 非整数螺旋) ，3 6 的右下角1 3 表示 氢键封闭的环内含1 3 个原予。3 1 0 螺旋( n = 2 ) 表示该螺旋每圈含3 个残基( 整数螺旋) ，氢 键所封闭的环含1 0 ( 3 2 + 4 ) 个原于。这个螺旋是当成对二面角取由= - - 4 9 。，1 9 - = - - 2 6 。时的构象，它只存在于蛋白质的类型i i ib 一转角( 1 3 - v a r n ) 中。 f 2 ) 1 3 一折叠 1 3 一折叠或b 一折叠片( b - p l e a t e ds h e e t ) 也称b 结构( 1 3 - s t m c t u r e ) 或1 3 一构象( b 。c o n f o r m a t i o n ) ，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。两条或多条几乎完全伸展的多 肽链侧向聚集在一起。相邻肽链主链上的n h 和c = o 之间形成有规则的氢键，这样 的多肽构象就是0 一折叠片。在b 一折叠片中，所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢 键与肽链的长轴接近垂直，在肽链的长轴方向上具有重复单位，因此也是一种二级结构。 除作为某些纤维状蛋内质的基本构象之外，b 一折叠也普遍存在于球状蛋白质中。b 一 折叠可分两种类型，一种是平行式( p a r a l l e l ) ，肽链的排列极性( n c ) 是一顺的，即所有 肽链的n 末端都在同一方向；另一种是反平行式( a n t i p a r a l l e l ) ，肽链的极性一顺一倒， n 一末端间隔同向( 图3 5 9 ) 。 在b 一折叠中，多肽主链取锯齿状折叠构象。侧链的c - - c 键几乎垂直于折叠片平 面，侧链r 基交替地分布在片层平面的两侧。反平行式b 一折叠在纤维轴上的重复周 期为7 0 a ，而平行式b 一折叠是6 5 a ，因此平行式的折叠程度略大于反平行式的。平行 式构象中巾= 一1 1 9 。，v = + 1 1 3 。，反平行式中中= 一1 3 9 。，y = + 1 3 5 。在纤维状蛋 白质中1 3 一折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式几乎同样广 泛地存在。此外，在纤维状蛋白质的b 一折叠中，氢键主要是在肽链之间形成；而在球 状蛋白质中，1 3 一折叠既可以在不同肽链或不同分子之间形成，也可以在同一肽链的不 堑查堂婴主! 壅生里些! 堂垡! 笙壅 | 声c c h 。户。 h 0 世c 呻一。 b c - 矗 。，知 嗲啦 卜一k - n p 一k 一k 肛中鼍p 。哆邶z 嗲叫c 玉一 。、 i 。一c , ，一。o c 一。一。一，旷o - 7 、- 一 。即， “ 叩c黔c he c ：- 譬肚h如 一，；确一叫嘞k 一 腔平眵们r 声们 眵一胛旁中c 反平行式 平行式 图1 、3b 一折叠的平行式和反平行式 同部分之间形成。 ( 3 ) b 一转角 b 一转角( b t 啪) 也称回折( r e v e f s et 啪) 、1 3 一弯曲( b - h c a d ) 或发夹结构( h a i r p i n s t r u c t u r e ) ，它是球状蛋白质中发现的又一种二级结构。p 一转角有三种类型，每种类型 都有4 个氨基酸残基( 图3 6 0 ) 。在所有这三种类型的b 一转角中，弯曲处的第一个残 基的c - - o 和第四个残基的n i l 之间形成个4 1 氢键，产生一种不很稳定的环形结 构。 类型h 图1 4b 辛 角 研究发现，一旦连接在树脂上的多肽形成了二级结构，这种二级结构将很难被破坏。 肽链分子间产生聚集，也即待反应的氨基产生了聚集，在此情况下，羧基被活化且带有 f m o c 保护基的氮基酸就很难靠近聚集的氨基，尤其是一些本身位阻较大的侧链带有保 护基的氨基酸，这就导致缩合、脱保护甚至两者同时反应不完全。 玺 穗煳 埔弦耘 众 一 引誊辫 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 1 2 固相多肽合成的树脂 将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，m e r r i f i e l d 和e r i c k o n 提 出能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求 1 8 】：必须包含反应位点( 或反应基团) ， 以使肽链能够连在这些位点上，并在以后切除；必须对合成过程中的物理和化学条件稳 定；载体必须允许不断增长的肽链和试剂能够快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必 须提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出一定产量的肽，并且必须尽量减少被 载体束缚的肽链之间的相互作用。 用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯一二乙烯苯交联树脂、聚 丙烯酰胺、聚乙烯一乙二醇类树脂及其衍生物。表1 1 列举了用于固相多肽合成中的部 分高分子载体。 化合物分类交联形态 l聚苯乙烯2 二乙烯苯微孔凝胶( 悬浮共聚体) 2聚苯乙烯1 二乙烯苯微孔凝胶 3聚苯乙烯05 二乙烯苯无特定形状的细珠体 4聚丙烯酰胺 5 n ，n7 甲烯基双丙稀酰胺微孔凝胶 5聚二甲基丙稀酰胺c o 叔1 4 n ，n7 一乙烯基双丙稀酰胺微孔凝胶( 乳胶共聚物) 丁氧羰酰b 丙氨酰n 丙烯酰 6 聚( n - 丙稀酰吡咯烷) 一c o - 5 n n 双丙稀酰乙二胺微孔凝胶反相悬浮共聚物 n 丙稀酰乙己胺( 1 1 m 0 1 ) f 7聚二甲基丙稀酰胺 2 n ，n 二甲基n ，n 乙烯微孔凝胶 二丙稀酰胺 8 葡聚糖( 羟丙基化的) 各种各样的三氯一，二环氧丙烷微孔凝胶 1 9聚苯乙烯聚乙二醇接枝二乙烯苯微孔凝胶 1 0聚苯乙烯2 0 二乙烯苯大孔平均孔径为2 0 0 a 1 1聚苯乙烯8 二乙烯苯大孔平均孔径为1 6 3 0 a 1 2硅胶涂层控制孔状玻璃无大孑l 平均孔径为1 1 5 0 a 1 3聚苯乙烯0 2 二乙烯苯爆米花状 1 4玻璃珠上涂聚苯乙烯o 5 二乙烯苯薄膜 ( 1 ：2 0 0 w w ) 1 5聚苯乙烯包聚苯乙烯二乙烯苯低交联的外壳薄膜 高交联的内心 1 6将聚苯乙烯经光照接枝在直链聚苯乙烯外壳薄膜 k e l f 上( 5 15 w w ) 1 7聚乙烯皿胺( 先吸附在大孔戊酰胺醛g l u t a c a ic l e b o v d e g h o s t 氧化铝上) 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 面积，大小供应者，商业名称评论 参考文献 l5 0 “m 珠体d o wc h e m i c a l 第一个成功的载体 【1 9 1 b i o - r a d b i o b e a d s s - x 2 和另外几家 公司 21 5 0u m 珠体b i e r a d b i o - b e a d s可选作广泛应用的载体 2 0 1 s - x 2 氯甲基型 p i e r c e ，f l u k a ，e t c 3微孔凝胶没有商品高溶胀脆性载体，需用特制 2 1 的离心反应器 41 0 0um 珠体 b i o - r a d b i o g e lp未用于多肽合成，而用于固 2 2 ，2 3 】 相酶 5珠体或无定形没有商品具有和肽键相近的溶剂化性 【2 4 ，2 5 质 6全部珠状1 5 0u m没有商品有利于在包括水在内的广大 2 6 】 范围的极性溶剂中溶剂化 71 0 0 um 珠体没有商品未用于固相多肽合成，但用 2 7 】 于寡核苷酸的固相合成 85 0um 珠体p h a r m a c i a摘要报道过，经验有限 2 8 1 s e p h a d e xl h - 2 0 95 0 u m 珠体没有商品未用于固相肽合成，但对其 2 9 1 潜溶剂特点进行过讨论 1 04 0 0 p m 珠体 r o h md早期的不满意的结果 【3 0 】 表面积= 1 0 0 m 2 g h a s s a m b e r l i t e 改进的载体 1 l2 0 0um 珠体曾用于小肽合成得到满意的 3 1 ，3 2 表面积= 2 0 m 2 g 结果 1 21 2 0 i j , m 珠体 w a l e r s 伊o r a s i t溶剂在玻璃孔内交换困难 【3 3 表面积= 1 5 m 2 g e ；p i e r c e ，c p g 1 3磨成2 0ug 碎片没有商品月；j 于早期研究 3 4 】 1 41 0 0u m 玻璃珠 n o r t h g o t e l a b s适宜于柱内操作，运载量低， 3 5 】 1u m 外壳有时会脱壳 1 54 0 u m 内心无详细的具体经成功地用于增血糖素的固相【3 6 5 - 6u m 厚度外壳验片断缩合 1 61 2 0u m 内心密度2 2i c i 澳大利皿其结果与标准树脂( n o s 1 和 3 7 3 9 】 2 0 u m 2 1 相近 1 7 7 5 ( w w ) 聚苯乙烯 没有商品具有对合成很有意义的犬的 4 0 】 原来的内心可用无机 面积对体积比 酸溶解 表1 1 用于固相多肽合成的部分高分子载体 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 1 2 1 聚苯乙烯二乙烯苯交联树脂 聚苯乙烯一二乙烯苯交联树脂是多肽合成中最早、最常用的固相载体，其结构如图 1 2 。它由小珠体构成，直径2 0 - 1 5 0 t ii n 。为了使载体具有较大的网格空间足以容纳不断 增长的较长肽链，同时便于反应物进入载体内部，一般均采用卜2 交联的聚苯乙烯树 脂。但交联度过低，则溶胀性过大，不易过滤，而且机械性能不好，易于破碎。有人采 用了另外一些办法。例如，采用交联度高达2 0 的聚苯乙烯树脂。这种树脂的内部 网格很小，类似于实心球。因此，肽链的接长反应只能在树脂表面上进行。以玻璃 珠或聚乙烯醇( p v a ) 为内核，聚合上一层低交联或无交联的聚苯乙烯。用2 0 交 联的聚苯乙烯珠体为核心，再在表面聚合上层低交联的聚苯乙烯，制成表层树脂或者 在k e l f 上进行光照接技。但和的应用效果并不理想。 釜 万h 矿一一 ：岔回 图1 5 聚苯乙烯二乙烯苯交联树脂 1 , 2 2 聚酰胺树腊 一般指聚丙烯酰胺凝胶。最先是由s h e p p a r d 等人提出用于多肽合成的 1 8 a 将 二甲基丙烯酰胺( 2 1 ) 、n 、n - 双丙烯酰乙二胺( 2 2 ) 和不对称的二酰胺的衍生单体， 如n 一丙烯酰n 叔丁氧羰基邛丙烯酰六次甲基二胺( 2 3 ) 共聚可得到珠状或无定形的 丙烯酰胺载体( 2 5 a ) 。其中( 2 2 ) 为交联剂，( 2 3 ) 则是为了使载体带有可反应的氨 基，及一个六碳隔离臂将官能团与聚合物主体分开。 采用聚丙烯酰胺作为多肽合成载体的原初设想是由于它具有与肽链相近的结构类 型，不会象用聚苯乙烯树脂那样，随着合成肽链的增长而显著地改变载体的理化性质， 因而可能更适用于合成长肽。但最初的实践并不显示它比聚苯乙烯树脂具有更大的优越 性。另外，还难以获得规则的球体，一些时候会得到大量的无定形聚合物，给操作带来 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 困难。这可能和复杂的衍生物( 2 3 ) 有关。它与其它单体相比，具有非常不同的溶解 性能和相分配性能，同时它也难以制备。 c h j = c h c o n m h j c = c h c o n h c h j c h 2 c o c h = c h 2 ( 2 1 )( 2 2 ) 屿g = c h c 0 n h ( c h 2 k n h c o c h l c h j n h b o ch 2 c = c h c o n n i e c h 2 c 0 0 m e ( 2 ，3 ) ( 2 4 ) c o n m e 2 c o n m e 2c o n me o c h c h 2 一s h c i - 1 2 一c 王王一c h 2 一q h c h 2 一c h c h 2 c o n m 0 2 c o n h c h 2 c o n m e 2 c o n h c 上i 2 c h c h 2 一c h c h 2 一h c h2 一c h c h 2 一q h c h 2 一 c o n me ， c o n m e 2 c 0 一r r _ n h ( c h 2 ) 6 n h c o ( c h 2 ) 2 n h b o c r = 一n m e c - 1 2 c o o me r = 一n a 压e c i - 1 2 co n h f c l - 1 2 ) 2 n h 2 图1 6 聚酰胺树脂 ( 2 5 a ) ( 2 5 b ) ( 2 5 c ) 用丙烯酰n 甲基甘氨酸甲脂( 2 4 ) 代替( 2 3 ) 可以解决上述问题。这种功能化 试剂和基本单体( 2 1 ) 的结构很接近，并且聚合可以不费力地得到漂亮的球体聚合物。 另外，与( 2 1 ) 及( 2 4 ) 相似的结构似乎表明它们将以可比的速率聚合，这就提高了 官能团在整个树脂母体中均匀分配的程度。第二种树脂( 2 5 b ) 则有必要用一个后聚合 化学步骤将它转变成氨基型聚合物( 2 5 c ) 。 聚酰胺树脂在极性溶剂如d m f 中溶胀至体积的1 0 倍，在水中则更高；而在非极 性的d c m 中的溶胀性就低多了。它们的溶胀特性与聚苯乙烯树脂恰好相反。 s p a r r o w j t 等在制备聚酰胺树脂时用了一些功能单体：n ( 2 一( 甲基磺酰基) 乙酰 羰基) 一烯丙基胺( m s c 烯丙胺) 、n 一丙烯酰基1 ，6 二氨基己烷h c l 【4 2 】，或n 一甲基丙烯 酰基1 ，3 - 二氨丙烷h c i + 2 1 1 4 ”。树脂载荷o 1 5 1 4 m m o u g 。该树脂很适用于f m o c 法合 成多肽。纯品肽可占粗品的8 0 9 5 ，包括那些用传统聚苯乙烯树脂合成失败的氨基酸 顺序。h a y n i e s l 等准备了乙烯二氨修饰的聚酰胺树脂( p e p s nk ) ，在上面合成出两亲 性的多肽，并报道了这种多肽具有抗菌活性 4 ”。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 1 2 3 聚乙烯一乙二醇类树脂 1 2 3 1 聚乙烯一乙二醇一接技聚苯乙烯( p e g p s ) 它由不溶的聚苯乙烯母体构成，聚乙烯一乙二醇( p e g ) 链附着在上面。和以上讨 论的聚酰胺树脂一样，它试图提高固相载体中肽链的溶剂化。研究过各种链长的p e g ， 值应用最成功是的分子量在2 0 0 0 3 0 0 0 d a 之间的。 近年来机器合成多肽发展很快，机器合成包括半自动( 间歇式) 和自动( 连续流动) 两种形式，它与手工合成相比，具有快速、完全、方便等优点。因为p e g p s 树脂一般 都有较好的物理化学特性，如溶胀性，物理稳定性，在流动系统中抗磨和抗机械压力能 力等，所以，它也随之发展起来。k a t es a ，m c g u i r m e r sb f 等最近报道了该实验室研 究的“低载荷”( 取代值0 1 5 0 2 5 m m 0 1 g ) 和高载荷( o - 3 0 5 m m o l g ) p e g p s 树脂的优 点【4 5 】。 1 2 3 2p e g a 树脂及p e g 类树脂的新应用 p e g a 树腊是由m o r t e nm e l d e r 发展起来的亲水性树脂，由p e g 与酰胺基团交联 而成【4 6 1 。一般用于间歇式和连续流动多肤合成。它们的性质和p e g - p s 树脂有很多相似 之处，如n o v a s y n t g e 4 7 1 1 4 8 】【4 9 j n j 指，其平均珠体大小为9 0 p r o ，每克树脂有2 8 6 x 1 0 6 个 小珠体，特别适合应用于连续流动多肽合成。n o v a s y n t g a 树脂，是在聚苯乙烯载体 基础上接枝p e g ，它能抵抗很高的流速，己成为快速合成长链肽的理想选择。 n o v a s y n t g a 树脂如连上一个r i n k 接头，用t f a 处理肽树脂就可以很容易地得到多 肽酰胺。另外，此树脂有一个自由氨基，这将增加产物保存时的稳定性，同时意味着不 需要经过一个预先脱保护循环，就可以直接连上第一个氨基酸。它们的取代值一般为 0 2 0 3 m m o t g 。r i n k 酰胺p e g a 树脂也可连上一个r i n k 接头，和前面介绍的 n o v a s y n t g a 树腊性质相似，不过它有更高的取代值( o 3 - 0 4 m m o l g ) 。 近年来，p e g 类型树脂( 如p e g a ) 的一些新的应用越来越引起人们的兴趣。这些 应用包括免疫学、树脂上酶合成及酶分析，以及多肽文库的合成，而后者是发现新药物 的强有力的工具。上述n o v a s y n t g 树脂就特别适合此类工作。 a u z a n n e a uf i 等研究了具有高含量p e g 的三种类型的p e g a 树脂。它们在从水 到d c m 的不同溶剂中都有很好的溶胀性，载荷为0 3 5 m m o l g 。他们在此树脂上合成出 了几个高纯度的多肽，研究表明，作为相应的抗菌肽，它们有足够的致死活性。 r e n i lm ，f e r r e r a sm 等【5 1 】合成出了两种类型的p e g a 树脂。由双单- 丙烯酰胺- p e g 与丙烯酰胺p e g 共聚，得出一个低交联的树脂( 类型i ) ，进而，丙烯酰- 肌氨酸乙酯与 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 双丙烯酰胺p e g 共聚得到较高交联的树脂( 类型i i ) 。它们在很多溶剂中显示出了高 溶胀性，包括h 2 0 、d c m 、乙腈、t f a 和甲苯。类型i 根据单体组成的不同，可以给 出o 0 7 1 0 m m o l g 之间的容量，并可应用于固相酶文库的合成；用乙二胺处理类型i i 后，应用于连续流动多肽合成，能够给出相当好的产量和纯度。 c a n l a r e r oj a 和c o t t o ngj 等【5 2 j 在一个3 一巯基一3 戊酮酰胺p e g 一聚一( n ，n f 二甲基 丙烯酰胺) 共聚物载体( h s p e g a ) 上，通过最优化的b o c s p p s ，可以从固相载体上直 接得到未保护的多肽。这种方法降低了操作中的损失，明显提高了整个化学偶联的效率。 他们合成了几个较长的