（特种经济动物饲养专业论文）化学交联丝素凝胶的结构和性能研究.pdf

摘要 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 随着生物技术的发展，生物医学材料显示出巨大的发展潜力和广泛的应用前 景。天然高分子丝素蛋白因其良好的生物相容性、透水透气性以及生物降解性等， 在固定化酶载体、药物缓释载体、抗血凝佳材料、刨伤敷料、细胞培养基质等生 物医学材料领域的研究广受人们的关注。然而目前所能制备的丝素材料的种类和 结构形态比较单一，而且一般方法所制备的丝素材料的机械性能往往达不到生物 材料实用性的要求。 为了探求适用于生物医学材料的高柔韧性丝素材料的制备方法，本文对用丝 素蛋白水溶液与环氧化合物交联剂二缩水甘油基乙醚( p g d e ) 反应制备的化学 交联丝素水凝胶( c f g ) 的结构和形成机理进行了详细的研究，对c f g 的制备 条件及相关性能进行了分析和探讨。研究表明丝素蛋白水溶液与环氧化合物交联 剂反应可以制备高柔韧性的c f g 。c f g 的f t - i r 图谱在1 1 0 4 7 e r a 。处出现了 p g d e 以两端开环的形式交联到丝素蛋白链上所产生的吸收。d s c 曲线显示c f g 的热分解温度出现在2 9 9 3 7 c ，高于f g 的2 9 5 1 4 ，表明c f g 具有更稳定的 交联结构，因而热稳定性较好。c f g 的乃cn m r 图谱显示了酪氨酸上芳香族原 子的化学位移发生了很大的变化，再次证明交联结构的存在，并且p g d e 与丝 素蛋白分子间相互作用，抑制了丝素蛋白分子内部的作用力。使得材料b 折叠 结构比例有所下降，而无规卷曲含量增加。氨基酸分析进一步表明化学交联的反 应位点主要在丝素蛋白链上带有苯羟基的酪氨酸、- 氨基的赖氨酸以及亚氨基的 组氨酸等活性较强的亲水氨基酸残基上，由此可以推测出丝素蛋白与环氧化合物 化学交联的反应模式和反应量。x - 衍射则迸一步证明交联反应所引起丝素蛋白立 体结构的变化，是由于p g d e 干扰了丝素蛋白的空间取向而造成的。其次对制 备条件的研究表明，交联剂添加浓度、丝素蛋白浓度、催化剂n a c i 浓度以及反 应温度对交联结构的形成都会产生影响，得出这些条件在影响丝素蛋白与p g d e 分子间的化学交联的同时，又影响着丝素蛋白本身分子内物理交联。最后交联丝 素凝胶的基本性能显示，在适当的p g d e 浓度下( 2 5 ) ，c f g 具有较好的强度 和柔韧性，压缩变形率可达到7 9 以上；但是在过高p g d e 浓度下( 8 2 0 ) ， 由于p g d e 的位阻作用，c f g 压缩强度反而降低。c f g 在酸、碱以及盐溶液中 的溶解度都明显低于f g ，预示了材料稳定性的增加。 本研究揭示了化学交联的方法获得柔韧性丝素材料的可能性，为丝素材料的 制备提供了新的思路和方法：对材料结构分析的方法为今后丝素蛋白化学交联结 构的相关研究提供了十分有意义的借鉴。 关键词丝素蛋白凝胶化学交联结构分析性能柔韧性溶解性 作者陈芳芳 指导老师闵思佳 2 s t u d i e so ns t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fc h e m i c a l a b s t r a c t c r o s s l i n k e ds i l kf i b r o i ng e l w i t ht h ed e v e l o p m e n to fb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y , b i o m e d i c a lm a t e r i a l se x h i b i t g r e a td e v e l o p i n gp o t e n t i a la n db o a r da p p l i c a t i o nf o r e g r o u n d s i l kf i b r o i n ( s f ) i sa n a t u r a lm a c r o m o l e c u l e b a s e do nt h e u n i q u ea d v a n t a g e s o fs fs u c ha s b i o c o m p a t i b i l i t y , 9 0 0 do x y g e na n dw a t e rv a p o rp e r m e a b i l i t ya n db i o d e g r a d a b i l i t y , i t h a sb e e na p p l i e df o rb i o m a t e r i a l ss u c ha se n z y m e - i m m o b i l i z a t i o n , d r u gc a r r i e r , a n t i t h r o m b o g e n i cm a t e r i a l s ，w o u n dd r e s s i n ga n dc e l lc u l t u r es u b s t r a t e ，h o w e v e r , t h e v a r i e t i e sa n df o r m so ff i b r o i nm a t e r i a l sp r e p a r e dc u r r e n t l yw e l et o os i n g l e ，w h a t s m o r e ，t h em e c h a n i cp r o p e r t i e so ff i b r o i nm a t e r i a l sm a d eb yn o r m a lm e t h o d sc a n n o t m e e tu t i l i t yd e m a n d s i no r d e rt oe x p l o r et h em e t h o do ff i b r o i nm a t e r i a l sw i t hh i g h e r f l e x i b i l i t y a p p l y i n gt ob i o m a t e r i a l s ，w es t u d i e dt h es t r u c t u r ea n df o r m a t i o nm e c h a n i s mo f c r o s s - l i n k e df i b r o i ng e l ( c f g ) ，w h i c hw a s p r e p a r e db yc h e m i c a lr e a c t i o nb e t w e e ns i l k f i b r o i ns o l u t i o na n de p o x i d ep o l y e t h y l e n eg l y c o ld i g l y c i d y le t h e r ( p g d e ) ，a n d p r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ，a sw e l l 勰s o m ep r o p e r t i e sw e r ea l s od i s c u s s e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tc f gw i t hh i g h e rf l e x i b i l i t yc o u l db em a d eb yt h er e a c t i o nb e t w e e l ls i l k f i b r o i ns o l u t i o na n de p o x i d ec r o s s - l i n k e r f t - i rs p e c t r u mo fc f gs h o w e dt h a ta s t r o n ga b s o r p t i o na p p e a r e da t110 4 7 e r a 。w a sd u e t op g d ei n d u c e do n t os i l kf i b r o i n c h a i n sb yo p e n n gt h er i n ge t h e r so nb o t l ls i d e d s cc l l r v ei n d i c a t e dt h a tt h et h e r m a l d e c o m p o s e dt e m p e r a t u r eo fc f ga p p e a r e da t2 9 9 3 7 ，h i 曲e rt h a nf gw h i c hw a sa t 2 9 5 1 4 t h i sr e s u l ts u g g e s t e dt h a tm o r es t a b l es t r u c t u r ew a sf o r m e d - a n dc f gh a d b e t t e rt h e r m a ls t a b i l i t y t h e1 3 cn m r s p e c t r u mo fc f gs h o w e dt h a tad o w n t i e l ds h i f t o f t h ea r o m a t i cp r o t o n so f t h et y r o s i n er e s i d u ef r o mt h ec o r r e s p o n d i n gp r o t o n so f s i l k f i b r o i n , c o n f i r m e dt h ep r e s e n c eo fc r o s s - l i n k i n gs t l l l c t u r e ，a n dp o i n t e do u tt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nf i b r o i na n dp g d ec o u l dr c j e c tt h ei n t r a - r e a c t i o ni nf i b r o i n m o l e c u l e s ，r e s u l t i n gt h ed e c l i n eo f 争s h e e tc o m p o n e n ta n di n c r e m e n to fr a n d o mc o i n s t r u c t u r e ，a m i n oa c i da n a l y s i sf a r t h e rs h o w e dt h ec r o s s l i n k i n gr e a c t i o ns i t e sw e r e m a i n l yo np h e n o l i ch y d r o x y lg r o u po ft h et y r o s i n er e s i d u e ，t h es - a m i n og r o u po f l y s i n er e s i d u ea n di m i d a z o l eg r o u po f t h eh i s t i d u n er e s i d u e ，b a s i n go nw h i c hw ed r e w 3 t h er e a c t i o np a t t e r na n dc a l c u l a t et h en e c e s s a r yd o s e x r a yd i f f r a c t i o ne x p l a i n e dt h e s t e r e os t r u c t u r ec h a n g eo fc f gw a sd u et od i s o r d e r i n gt h em o l e c u l a ro r i e n t a t i o nb y p g d eb o n d i n gt os i l kf i b r o i n s e c o n d l y , w es t u d i e dc f gp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ，a n d c o n c l u d e ds u c hf a c t o r sa sp g d e ，s f 、 概，n a c i a n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r ec o u l d m a k ei n f l u e n c eo i lt h ef o r m a t i o no fc r o s s - l i n k i n gs t r u c t u r e t h e s ef a c t o r sa f f e c t e dn o t o m yt h ei n t e r - m o l e c d e sc r o s s l i n k i n gb e t w e e nf i b r o i ma n dp g d e ，b u ta l s ot h e i n t r a - m o l e c u l e sc r o s s - l i n k i n gb c = t w e c bt i b r o i n s 1 a s t l y , w em e a s u r e ds o m eb a s i c p r o p e r t i e so fc f g tt h er e s u l t so fm e c h a n i cm e a s u r e m e n ts h o w e dt h a tc f g h a ds u p e r c o m p r e s ss t r e n g t ha n df l e x i b i l i t y , a n dt h ec o m p r e s sd i s t o r t i o nc o u l dr e a c hu pt o7 9 w h e na ta d e q u a t ep g d ea d d i t i o n s ( 2 - 5 ) ，w h i l et h ec o m p r e s s i o nd e c l i n e da th i 曲e r p g d ec o n t e n t s ( 8 - 2 0 ) ，d u ct os t c r i ce f f e c tc a u s e db yp o d e t h es o l u b i l i t yo f c f gi n a c i d ，a l k a l i ，a sw e l la ss a l ts o l u t i o n , w a sd e c r e a s c dc o m p a r e d 、i t i lp u r ef i b r o i ng e l ( f g ) ，s u g g e s t i n gt h ei n c r e a s i n gs t a b i l i t y a l lt h es t u d i e sr e s u l t si n d i c a t et h ef e a s i b i l i t yo fp r e p a r i n gs i l kf i b r o i nm a t e r i a l s w i t hh i 曲a rf l e x i b i l i t yb yc h e m i c a lc r o s s - l i n k i n g t h ec o n c l u t i o np r o v i d e san e ww a y f o r t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so ff i b r o i nm a t e r i a l s ，a n dt h es t r u c t u r ea n a l y s i sm e t h o d s w i l lg i v eam e a n i n g f u lr e f e r e n c ef o rr e l a t e ds t u d i e so ff i b r o i nm a t c r i m sw i t h c r o s s l i n k i n gs t r u c t u r e k e y w o r d s s i l kf i b r o i n g e l c h e m i c a lg r o s s l i n k i n g s t r u c t u r a la n a l y s i s p r o p e r t yf l e x i b i l i t ys o l u b i l i t y w r i t t e nb yc h e nf a n g f a n g d i r e c t e db yp r o f e s s o rm i n s i j i a 4 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 1 1 生物医学材料简介 第一章引言 2 l 世纪是综合学科交叉发展的年代。材料科学与物理学、化学、生物学及 临床科学越来越紧密地结合，并突破旧有科学的狭小范围，诞生了另一个新兴的 产业生物医学材料产业。生物医学材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l ) 是用于对生物 体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的新型高技术材 料。它是研究人工器官和医疗器械的基础，己成为材料学科的重要分支，尤其是 随着生物技术的蓬勃发展和重大突破，生物医学材料己成为各国科学家竞相进行 研究和开发的热点。 1 1 1 生物医学材料的特点 生物医用材料由于直接用于人体或与人体健康密切相关，对其使用有严格要 求首先，生物医用材料应具有良好的血液相容性和组织相容性。其次，要求耐 生物老化。即对长期植入的材料，其生物稳定性要好：对于暂时植入的材料，要 求在确定时间内降解为可被人体吸收或代谢的无毒单体或片断。还要求物理和力 学性质稳定，易于加工成型，价格适当。便于消毒灭菌、无毒无熟源，不致癌不 致畸也是必须考虑的。对于不同用途的材料，其要求各有侧重。 1 1 2 生物医学材料的分类 生物医学材料品种很多，有不同的分类方法f l l 。通常是按材料属性分为：合 成高分子材料( 聚氨酯、聚酯、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸乙醇酸共聚物及其它医 用合成塑料和橡胶等) 、天然高分子材料( 如胶原、丝蛋白、纤维素、壳聚糖等) 、 金属与合金材料( 如钦金属及其合金等) 、无机材料( 生物活性陶瓷，羟基磷灰 石等) 、复合材料( 碳纤维聚合物、玻璃纤维聚合物等) 。根据材料的用途， 这些材料又可以分为生物惰性( b i o i n e r t ) 、生物活性( b i o a c t i v e ) 或生物降解 ( b i o d e g r a d a b l e ) 材料。这些材料通过长期植入、短期植入、表面修复分别用于 硬组织和软组织修复与替换。 5 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 1 1 3 生物医学材料的发展动力 生物医学材料得以迅猛发展的主要动力来自两方面，一方面是人口老龄化、 疑难疾病患者的增加，另一方面是高新技术的发展 2 1 。髓着入口老龄亿、生活节 奏的加快、活动空间的扩展和饮食结构的变化等因素，在全球，心脑血管疾病、 癌症、艾滋病、糖尿病、老年痴呆症等发病率逐年增加，急需用于诊断、治疗和 修复的各种生物材料。人口老龄化进程的加速和人类对健康与长寿的追求，更激 发了对生物材料的需求。作为世界人口最多的国家。中国已进入老龄化国家行列， 具有巨大的生物材料的潜在市场。目前生物医学材料已经在人工瓣膜、人工肾、 人工关节等人工器官方面实现了应用，随着材料科学、医学、生物技术等学科的 发展，不同学科的交叉研究的深入，生物医学材料将在药物控放载体、刨伤敷料、 组织工程支架等更多方面展示出美好的应用前景口羽。 i i 4 天然高分子生物材料 天然高分子生物材料是目前生物材料领域中很活跃而且具有挑战性的一个 研究领域。它是直接从自然界动物、植物或微生物体内提取的高分子物质，主要 包括胶原、明胶、丝蛋白、纤维素、多糖、甲壳素及其衍生物等，无毒，无刺激， 无污染，具有良好的生物相容性和细胞亲和性，因而在生物医学领域占有独特的 优势1 6 j 。目前已经有多种商品投入市场，如内含胶原蛋白的人工皮肤，由甲壳素 制成的药物缓释胶囊等。 1 2 丝素蛋白在生物医学材料领域的应用 丝索蛋白是一种天然高分子有学者对丝素蛋白从生物整体、细胞和分子生 物学三个水平的检测结果，表明丝素蛋白安全可靠，具有良好的生物相容性，适 于开发生物医学材料7 一。在生物医学材料领域受到广泛的关注，在材料制备方 法、生物相容性、应用前景等多方面被进行了研究。 6 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 1 2 1 固定化酶材料 丝素蛋白可用于固定化酶载体材料，并应用于多种传感器1 9 】。目前对于丝素 蛋白固定化酶的原理和特点已经有比较清楚的认识。 早在1 9 7 8 年m i y a i r i f l o 用丝素膜固定b 葡萄糖苷酶作为尝试，发现固化后的 酶无论经过热处理还是电渗析，比较固定化前都有较高的稳定性和活性。但当酶 含量超过一定比率时，酶本身会成为限速因素，难以制得高活力的酶膜：另一方 面酶分子主要位于膜内，大分子底物无法通过从而限制了它的使用。为了克服 这一缺点，k u z u h a r a t “l 和a s a k u r a l l 2 】利用丝素膜中的蛋白分子中含有大量侧链羟 基和氨基的特点，通过有机溶剂对丝素进行不溶化处理并将酶固定在丝素膜表 面。这样可减少物质扩散阻力，酶的活性能够回复到9 8 ，且对热和p h 的稳定 性高于自由酶。用1 3 cn m r 测定固定化酶前后丝素膜的结构变化 1 3 1 ，得出丝素 蛋自与葡萄糖氧化酶之间相互作用甚微，因而固化不影响酶的活性，固定化酶丝 素膜能长久保持其原本活性，并在4 0 6 0 1 2 下相当稳定，预示着丝素膜是一种 很好的固定化酶材料。 丝素膜也可以与其它物质一起形成共混膜来固定各种酶，以提高膜的性能。 d e m u r a l l 4 l 制备丝素蛋白聚乙二醇( p e g ) 共混膜以提高丝素膜的通透性：l i u 等1 5 1 把葡萄糖氧化酶固定在丝素蛋白聚乙烯醇( p v a ) 共混膜上以提高材料的 力学强度；z h a n g 等 1 6 - 1 8 l 用类似的方法固定了过氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸酶， 这些固定化酶丝素膜不仅具有较高的酶的活性，而且能在4 下长期保存而不失 活性：朱祥瑞1 钆2 2 1 用丝素蛋白为基质利用简单包埋法和共价交联法先后研制了丝 素固定化糖化酶、丝素固定化过氧化氢酶、丝素固定化果胶酶、丝素固定化a 淀粉酶等，得出固定化后的酶对不良环境的抵抗能力较强，有较长的操作半衰期、 最适反应p h 和最适反应温度范围较广，酶的活力也有所提高。 固定化酶丝素膜适合用于生物传感器。d e m u r a 首次报道了固定化葡萄糖 氧化酶丝素膜传感器的原理。将固定化葡萄糖氧化酶丝素膜附在氧化电极表面， 组装在器械里。传感器对葡萄糖的浓度变化能产生相应的线性响应。这种响应显 示了可制备一种新型葡萄糖传感器而无需氧化电极的作用。a s a k u r a t u l 用丝素膜 固定过氧化氢酶，开发了光电传感器试验表明，光电流强度与水溶液中过氧化 7 化学交联丝素凝胶的结携f 和性能研究 氢的浓度呈正相关，光电反应的响应时间和光流强度取决于固定化过氧化氢酶丝 素膜的特性。 1 2 2 药物缓释载体 丝素蛋白内部具有许多微空隙，能够吸赡、填充各种药物，除了物理结合方 式外，丝素蛋白还具有能与药物共价结合的化学结构。因此，丝素蛋白是一种理 想的药物释放载体嘲 闵思佳等人【2 6 】曾研究过丝素蛋白对药物吸收释放的性能与调控。结果表明， 羧基酰胺化修饰可在一定程度上能改变丝素凝胶材料对离子型药物的吸收、释放 性能。丝素蛋白有望作为一种可调控药物缓释载体。 r ，r u j i r a v a n i t 等 2 7 1 用戊二醛作为交联剂，制备了交联壳聚糖丝素共混膜，在 共混膜的药物释放时检测共混膜的各种成分。释放实验是p h 分别为2 0 ，5 5 和 7 2 下进行。实验发现含有8 0 壳聚糖的共混膜在p h 为2 0 时显示了药物释放的 最大值，证明药物释放跟所处环境的p h 有关，有望通过改变p h 值来调控药物 释放速度。 s h o f r a a l l n 2 $ 1 i 舅：究了丝素蛋白对多糖和蛋白质的释放行为，发现丝素膜对多 糖的释放速度跟结晶度很有关系。甲醇处理后的丝素膜结晶度明显提高，则能持 续释放分子量不等的多糖，而低结晶度的丝素膜只能释放高分子量的多糖。另外， 甲醇处理过的丝素膜在释放有些蛋白质药物( 如溶菌酶素) 时会降低蛋白质的活 性，因此，在利用丝素膜用于药物释放载体时，不仅要考虑到材料的结晶度，还 要考虑到所释放药物的个别差异。 o b a y r a k t a r l 2 9 1 介绍了交联丝素材料的药物释放能力。通过与热处理丝素膜相 比，交联丝素( - - 氯乙烷e d c 为交联剂) 具有很高的成膜性，用不同方法涂抹 于茶碱药片上，得出单涂、双涂以及三涂的药物释放速度分别为0 2 6 、o 1 9 和 o 1 6 r a i n l ，预示可以通过涂层方法来调控药物释放速度。 8 化学交联丝索凝胶的结构和性能研究 1 2 3 抗血凝性材料 磺酸化丝素蛋白具有抗凝血性能，具有开发人造血管和抗血栓药物的前景 k g o s h 等【3 0 】报道了用硫酸化丝素体外阻止人体免疫缺陷病毒复制的研究。y t a m a d a 3 1 1 用“浓硫酸处理丝素溶液恒温搅拌- n a o h 中和透析脱盐一冷冻 干燥”工艺流程，获得硫酸化丝素粉。硫酸处理过的丝素蛋白显示出抗凝血活性。 在进一步研究中1 3 2 】，使用氯化硫酸来代替浓硫酸，得到的抗血液凝固活性提高约 1 0 0 倍。顾晋伟等【3 3 1 采用二氧化硫等离子体处理在丝素蛋白膜引入磺酸基团；或 丝素蛋白膜用氨气等离子体处理后，利用l ，3 丙磺酸内脂与氨基的反应在材料表 面按枝磺酸基团结果表明两种处理方法均能使材料的抗凝血性能有显著提高。 高运华等人 3 4 1 研究了利用凝血因子的抗体对生物材料进行表面改性以提高其抗 凝血性能。以丝素蛋白膜为基质，利用等离子体处理辅助的共价交联方法对v w f 因子( v o nw i l l e b r a n df a c t o r ) 抗体进行了固定化。结果显示，通过这种方法可以 有效地将v w 航体固定化，丝素蛋白膜固定化v w f 抗体后，其抗凝血性能有了一 定的改善。这些研究都是说明丝素蛋白在抗血凝性材料方面具有应用前景。 1 2 4 创面敷料 将丝素暂对性皮肤代替物应用于烧伤的桩床治疗上，被认为比目前常用的猪 皮或创可贴拥有更良好的应用性能，丝素材料与创口贴合紧密，但又不易融化， 可以防止感染，同时又保持良好的透气性，再加上丝素本身对皮肤细胞的生长促 进功能，使其愈创效果更显突出 t s u b o u c h i 【3 5 1 发现以丝素为滚辫的刨伤敷辩篦够促进康复，并且篚够去皮丽 不会破坏新形成的皮肤。又以丝素丝胶混合物为原料制成了创伤敷料1 3 6 1 。这种 敷料的厚度仅为1 0 - 1 3 0 t t m ，密度可达1 1 0 0 - 1 4 0 0 k g m 3 。 苏州大学研制了丝素创面保护膜。覆于剖面后能与剖面产生良好的初期粘 合，能起到促进刨面愈合的效果鲫。在这基础上又研制了多孔刨蘧丝素保护膜以 提高材料的孔性，控制药物吸释功能【3 酊。张幼珠等1 3 9 1 在丝素膜中添加致孔剂， 并用包埋法或共价法将具有广谱抗菌药物与丝索溶液溶合，制成药物丝素膜来提 高材料的抗菌性。阂思佳邮】研制了具有高柔韧性的多孔丝素材料，而且在保湿的 9 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 治疗条件下不会与新生组织发生粘连，因而避免了可能发生的二次损伤，有望用 于大面积皮肤治疗，并促进皮肤愈合，减少疤痕。 1 2 5 细胞培养基质 早在1 9 9 5 年n m i n o u r a l 4 1 1 就研究过小鼠成纤维细胞( l 9 2 9 ) 在丝素蛋白上的 黏附和生长结果表明l - 9 2 9 在丝素膜上的黏附和增殖情况是理想的。根据细胞 培养实验的结果和细胞的形态，可知丝素与哺乳动物细胞有良好的相容性，适合 作为哺乳动物细胞培养基质。 a c h i a r i n i 等h 萄把丝素蛋白涂在聚( 碳酸盐) 氨基甲酸酯( p c u ) 膜上制作 成细胞培养基进行成纤维细胞培养。结果表明与纯p c u 膜相比，涂有丝素蛋白 的p c u 膜能迅速促使正常人的原纤维细胞黏附、生长和进行特殊的代谢活动， 而不会引起任何一些细胞早期发炎。 h j j i n 等人f 4 3 】贝研究了人的骨髓茎干细胞( h b m s c s ) 在丝素上的粘甜，扩 展和增殖情况扫描电子显微镜( s e m ) 观察到丝素基质经电镀离心后。提高了 对h b m s c s 的附着性和增殖性。预示着电镀离心后的丝素基质有望成为组织工 程支架。 i n o u y e 等 4 4 1 拿胶原基质作对照，研究了在丝素膜上培养动物细胞。5 天后丝 素膜和胶原都呈现相等的细胞生长率。关于丝素和丝胶在提供l 9 2 9 纤维细胞粘 附、扩散及增长等的对比研究中得出脱胶丝是细胞和组织培养的良好基质。另外。 s o f i a 等【4 5 】用完整识别多肽化学修饰丝素膜以提高粘附效应，体外移植骨的诱导 也可显著增强。 2 l 世纪是新功能性材料研究突发猛进的时代。对丝素蛋白生物医学材料的 研究已经跨越生物、化工、材料科学、医学等多门学科，随着人们对丝素蛋白研 究开发的不断深入，将展现出更广阔的应用前景。 1 3 丝素蛋白的结构 丝索蛋白在生物医学材料领域具有如此广泛的应用前景，完全取决于其本身 独特的结构。了解剖析丝素蛋白的结构，为更好地利用和改造丝素材料奠定基础。 l o 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 丝素蛋白含有1 8 种人体所必需氨基酸。其中g l y , 朋a ，s e x , t y r 占9 0 以上。 酸性侧链氨基酸是碱性的2 3 倍，疏水性侧链氨基酸是亲水性的4 3 倍闱。 z h o u 4 t i 采用鸟枪法等不同技术基本上揭示了丝素蛋白氨基酸序列的基本特 征。丝素蛋白是由大小两个多默链通过二硫键缔合而成，大的肽链称重( h ) 链， 分子量3 0 万左右，小的称轻( l ) 链，分子量5 万左右f 4 舯。丝素蛋白的聚集态 结构主要包括结晶区和无定形区( 以及少量的半结晶区) 。结晶区主要含有甘氨 酸、丙氨酸以及丝氨酸等，肽链排列比较整齐密集：氨基酸残基比较稳定，不易 受外界影响而起变化；无定形区主要含有色氮酸、酪氨酸以及组氨酸等，肽链排 列醵松且不整齐，氨基酸残基比较活跃，分子间结合力弱( - c o o h , - n h 2 ) ，易受 外界影响，所以丝素蛋白与其它物质的化学作用主要发生在无定形区。丝素蛋白 的结晶度一般为5 0 6 0 。 清水正德首先发现家蚕丝素有两种构象，分别称为d 型和b 型。其后 k r a t h y 证明了两种结晶形态的存在，并指出丝素d 型的分子结构并非一般蛋白质 中的a 螺旋结构。为避免把丝素口型与n 螺旋相混淆，一般分别将丝素的a 型 和b 型称为s i l ki 和s i l k l i 关于s i l ki 结构，研究报道较多，说法不一【5 m 刃。 一般认为s i l ki 的晶体结构主要包括无规卷曲结构和n 螺旋结构。由于a 螺旋 属于亚稳定状态，而且含量较少，故很多学者将无规卷曲结构认同于s i l ki ；s i l k i i 的晶体结构模型由m a r s h 根据x 射线衍射结构提出【铆，是b 反平行折叠而形 成的层状结构。属单斜晶系。这些分子链构象与晶型结构决定了丝素的物理力学 性能。 1 4 丝素蛋白材料制备的研究 丝素纤维性质比较稳定。不溶于水、弱酸以及许多有机溶剂，但可以溶解于 中性盐( 5 7 捌、强酸网、和一些酶类 6 0 , 6 。再生丝素材料可以通过溶解丝纤维而获 得。丝素蛋白材料可以制成溶液配硒l 、薄膜州、凝胶嘲、粉末嗍、多孔材料明 等多种形态。 将再生丝素溶液平铺在聚乙烯薄板上，使丝素溶液均一地流动，并可用水平 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 仪校正平面和控制溶液量，以使膜的厚度均匀一致。然后在恒温或其它特定温度 下通风干燥，经剥离后即获得无色、透明的丝素膜。但是这种丝素膜在水中就会 溶解，还需进行不溶化处理。简单的方法就是用7 0 9 0 浓度酒精，进行短时 间的浸渍处理，使丝素分子间的水分被渗出，分子间的距离缩短，聚集结构紧密， 丝素分子8 化，得到的丝素膜则不溶于水，在潮湿条件下柔软，具有一定的延展 性，但是在低湿干燥环境中应用时，丝素膜又硬又脆，可拉伸性非常小，所以必 须经过改性才能成为实用性的生物材料。 再生丝素溶液经低温冷冻冻干法可制备成多孔材料。丝素溶液在低温下冷冻 的过程中，溶液中的水分子形成冰核，填充在丝素相之间；待冷冻干燥后，冰核 升华则留下孔鲥叫。因此，调控冷冻温度和时间可以影响到孔隙大小以及孔密度 分布情况。良好的孔性则是开拓丝素蛋白在组织工程领域应用的关键所在 在一定条件下，高分子溶质或胶体粒子相互连接。形成空间网状结构，而溶 剂小分子充满在网架的空隙中，成为失去流动性的半固体状体系，称为凝胶。这 种凝胶化的过程称为胶凝。 丝素溶液在一定条件下会发生胶凝而形成凝胶。自然状态下形成凝胶需要几 天甚至更长的时间，当口h 调节至等电点( p h 4 5 ) 时胶凝速度加快口o l 。丝素水 溶液的胶凝还受温度、丝素蛋白浓度的影响。研究表明，增加丝素蛋白浓度，升 高温度都可以促进胶凝嘲。另外，一些金属离子，可以与丝素蛋白分子发生络合 反应而促进胶凝，形成一种错体交联凝胶叭1 。添加有机溶剂也有助于胶凝t r 2 , 7 3 l 。 实验证明丝素蛋白在胶凝过程中，结构发生了根本的变化，即从液态的无规 卷曲转化为凝胶态时的b 构象1 7 4 1 。一般认为，丝素溶液凝胶化是因为氢键结合 形成了三维交联网络结构 7 0 1 。丝素溶液转变成凝胶态后在热水中不发生向溶液的 转化，故为非可逆性凝胶【7 s l 。丝素蛋白结构的变化引起热分解温度也相应增高。 从热分析结果来看，凝胶化了的丝素的失重拐点从2 6 6 c 增加至2 8 4 但是。用简单方法所制备的丝素凝胶比较脆弱，如同果冻，t h a n a w a 和 k j i r a b a y a s h i 等曾将其用于丝素凝胶食品和凝胶口服药剂【7 6 明。m t s u k a d a 用反 复冻结解冻丝素溶液的方法弗4 各而成的丝素水凝胶具有一定的柔韧性帕7 l 。柔韧性 的丝索水凝胶因其优良的生物相容性和较高的氧气和低分子物质的通透性在生 2 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 物医学材料领域具有应用前景1 7 。因此，提高材料的力学性质和功能性是丝素凝 胶材料真正实现实用性的一个重要关节。 1 5 丝素蛋白材料的改性研究 简单方法所制备的再生丝素材料功能单一，力学性能差要实现丝素蛋白材 料的实用化离不开对材料的改性。 1 5 1 丝素膜的改性 对丝素膜的改性，主要采用共混的方法。成膜性能良好的合成高分子p v a 和丝素蛋白的共混膜外观均匀透明，吸水性大大提高，力学性能有所改善，但是 p v a 和丝素蛋白发生两相分离，相容性较差，从而会影响到共混膜的热水溶失率 以及热稳定性挣棚。丝素蛋白和壳聚糖的共混膜基本相容，两者之间存在较强的 氢键作用，诱导丝素蛋白的构象由无规卷曲向b 折叠转变，共混膜是一种优良的 对水优先吸附性膜1 8 1 , 8 2 】。丝素蛋白纤维素共混膜中，纤维素的加入可以有效地 改变共混膜的性能，加入2 0 * , 4 的纤维素可明显的增加膜的吸湿性；共混膜具有优 良的弹性，含4 0 纤维素的共混膜的弹性是纯丝索膜的1 0 倍 s 3 l 。聚乙烯氧化物 ( p e o ) 与高浓缩的丝素溶液( 8 硼) 所制成的共混膜中，发现加入2 的p e o 可以提高膜的弹性；另外，p e o 能方便地从膜上萃取，因此，很容易控制膜的 多孔性和表面强度【刚。关于丝素共混膜的实验很多，如丝素蛋白藻酸钠共混膜 【鲫，丝素聚( c 己内酰胺c o d ，l 丙交酯) i 蚓，丝素明剧8 7 1 等等，根据聚合物 分子中极性基团的数目及强度，丝素分子会与这些大分子形成强弱不等的氢键， 诱导丝素分子构象从无规卷曲结构转变成更加规整的b 折叠结构，从而提高材料 的力学性能、热性能以及多孔性能等。除了与聚合物共混外，丝素蛋白还能与其 它聚合物发生化学修饰、化学交联等。经p e g 化学修饰后的丝素膜断裂伸长率 可从原来的1 9 增加到5 , 6 i s 刖，经乙炔甲壳素寡耱( c o s ) 修饰后的丝素膜能 够抑制大肠杆菌的生长，有望在抗菌性细胞培养支架领域发展i 曲一。环氧化合物 对丝素有明显的交联作用，采用较大分子量的环氧化合物作为交联剂，制得的丝 素膜在保持较低热水溶失率的同时，能达到较高的强伸度 9 1 j 。 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 1 5 2 多孔丝素材料的改性 多孔丝素材料改性的目的主要是针对力学性能和孔隙结构这两个方面。其 改性方法勇前主要有冷冻干燥法陋 9 3 l 、反复冷冻解冻法鲫、盐析法以及气沫法瞰蚓 等。经冷冻干燥制备的丝素材料具有较好的多孔结构，适合于向组织工程支架领 域发展；经空气干燥制备的材料具有较好的结晶度和拉伸强度，适合用于力学性 能要求较高的生物软组织用材料；反复冷冻解冻可以调控孔径大小和孔密度；盐 析法和气沫法则利用离子化合物的水化作用来提高孔性。当然，这些改性方法跟 具体的制各条件，如丝素蛋白浓度、冷冻温度、冷冻时问、反复冷冻解冻次数等 都有密切关系有学者报道在丝素溶液中加入少量二甲基亚砜( d m s o ) 等有机 溶剂，经单次冷冻解冻即可获得多孔丝素海绵材料。避免了冷冻干燥、反复冷冻 解冻方法，也不需化学交联剂，所获得的多孔丝素海绵材料的孔壁明显加深，细 胞在材料表面培养较好，有望应用于组织工程支架 9 7 。 另外，丝素与壳聚糖、p v a 通过紫外诱导交联制成的一种共混海绵材料。 在大鼠的创伤治疗中效果较好【9 s 】；丝素藻酸盐共混海绵，在力学性能上都有了 较大的改善 9 9 1 ；丝素胶原多孔支架，细胞培养结果较好l 。这些多孑l 复合丝素 材料在改善性能上又提高了一个层次。 1 5 3 丝素凝胶材料的改性 很多天然高分子凝胶可以通过化学改性来提高材料的某些性能。如胶原蛋白 可以在转谷氨酰胺酶作用下形成交联胶原凝胶，从而在不影响细胞生长的基础上 还能明显增强材料的强度，更适合于做细胞培养组织工程支架硎j 。藻酸则可以 通过二价阳离子( c a 2 + , b a 2 + , s r 2 + ) 或共价化学交联技术获得交联藻酸盐凝胶，能 提高材料的机械性能，易于创建和维持细胞生长空间，调控细胞粘附和基因表达 l 1 0 2 1 。 丝素凝胶也有化学改性相关的研究。h ，y k w e o n 先后用p e g i 粥1 以及伯洛沙 姆粗晶体( p o l o x a m e rm a e r o m e r ) 【1 与丝素蛋白交联形成半立穿网络聚合物 ( s 口n s ) ，并对其结构和性能进行详细的测定，结果表明，这种半立穿网络聚合 物凝胶具有很好的孔性，聚合物的加入明显提高了材料的透气透水性，压缩抗性， 化学交联丝素凝胶的结构和性能研究 且平衡水分也成倍提高，有望成为创伤敷料。 x c h e n t l 0 珂报道了甲壳素和丝素蛋白在戊二醛的作用下可以形成半立穿网络 聚合物( s i p n ) ，且对它的结构和性能进行表征，发现甲壳素与丝素蛋白之间存 在较强的氢键作用，这种材料对p h 值和离子比较敏感，在不同p h 和离子浓度 下表现出较好的溶胀收缩行为，因而有望成为人工肌腱材料。 e s g i l t l 0 6 , 1 0 7 1 制备了丝素明胶凝胶材料，并比较测定它的溶胀行为以及有机 溶剂对其结晶度和电流行为的影响，得出温度可以调控凝胶材料的膨胀和蛋白释 放动力学行为，有机溶剂可以提高结晶度，有望成为药物调控释放载体。 目前国内外关于丝素凝胶材料化学改性的研究报道还比较少，而丝素凝胶作 为丝素蛋白功能性材料的一种重要形态之一，有待于对它进行深一步研究和探 讨。 1 6 本研究的目的和意义 丝线作为手术缝合线开启了丝素蛋白进入生物医学领域的大门，而近年来随 着生物医学材料、以及各种生物技术的发展和丝素蛋白性能及应用的研究的深 入，使得丝素蛋白在生物医用材料方面的应用得到了广泛的关注。目前被期待的 材料大多属于软组织用材料，如人工皮肤、细胞支架材料、一次性隐形眼镜、药 物缓释载体、固定化酶材料、美容材料等，要求材料具有很好的柔韧性。而凝胶 材料是一种具有柔韧性的材料，而且它易于制成各种形状，具有较好的低分子物 质和气体的通透性，十分适合于软组织用材料，因此，我们以丝素凝胶材料作为 研究的主要对象。本研究将采用化学交联的方法研究具有高柔韧性的丝素蛋白凝 胶材料，分析交联丝素凝胶的形成机理，探明丝素凝胶材料的化学交联结构、丝 素分子构象等，提出交联丝素凝胶的结构模型；探讨制各条件对化学交联结构的 影响；揭示交联结构变化引起的材料相应性能的变化趋势，初步获得一种结构形 态和理化性能都优良的