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生物分子在羟基磷灰石修饰电极上的电化学行为研究 摘要 氧化还原蛋白质和酶等生物大分子的直接电化学是生物电化学的热门研究 课题。它的研究对于人们获得蛋白质和酶的热力学和动力学性质，深入研究蛋白 质和酶等生物大分子在生命体内的生理作用、电子传递反应机制，以及开发新型 生物传感器都具有重要的意义。然而，对于大多数蛋白质而言，由于其电活性中 心深埋于非导电性的肽链中，通常条件下难以观察到蛋白质与电极之间直接的电 子转移。 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) 作为一种骨修复材料，有良好的生物兼 容性和生物活性，且对人体无毒、无害、无致癌作用，作为人体骨骼的替代材料 已有临床应用。本文在实验室已有的对h a 电沉积研究的基础上，应用双电位阶 跃法在铂电极和玻碳电极上电沉积制备羟基磷灰石涂层，考察细胞色素c 、葡萄 糖氧化酶、血红蛋白等生物大分子在h a 修饰电极上的电化学行为。 1 细胞色素c 在h a 修饰铂电极上的电化学行为研究 采用双电位阶跃法在铂电极上电沉积制备h a 涂层，细胞色素c 在该修饰 电极上测得的c v 曲线上呈现一对氧化还原峰，氧化还原峰电流之比接近1 ：1 、 式量电位e o 为0 0 1 8 v 、峰电位差为7 0 m v ，表明h a 可以促进细胞色素c 的电 子传递，并且是一受扩散控制的准可逆过程。 实验结果表明，不同沉积条件下制备的h a 修饰电极对细胞色素c 的电子 传递有一定的影响。基于电化学交流阻抗谱的测试结果及其相关的电化学参数拟 合，讨论了细胞色素c 在修饰电极上迸行的直接电子传递的机制。实验结果表 明，适当增加涂层的厚度，有利于细胞色素c 发生直接的电子传递反应。 2 葡萄糖氧化酶在i n 修饰的玻碳电极上的电化学行为研究 采用双电位阶跃法电沉积制备h a 涂层修饰的玻碳电极，并用n a t i o n 将葡萄 糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 固定于电极上，制得g o d h a g c 电极。测得 的循环伏安曲线上可以观察到一对近乎可逆的氧化还原电流蜂，表明固定在h a 修饰电极上g o d 能进行有效的直接电子传递。对葡萄糖的响应测定显示了葡萄 糖氧化酶仍然保持其生物电催化活性。同时还考察了不同p h 值，不同温度对修 饰电极电流响应的影响。 3 血红蛋白在h a 修饰玻碳电极上的电化学行为研究 采用双电位阶跃法在玻碳电极上电沉积制备羟基磷灰石涂层，将血红蛋白 ( h b ) 滴涂到电极上并用n a t i o n 进行固定，以制得h b h a 修饰的玻碳电极 ( h b h 刖g c ) 。紫外可见光谱和红外光谱表明，固定在修饰电极上的血红蛋白 保持了原有的二级结构。循环伏安测量结果表明，h b 在修饰电极上没有发生变 性，能进行有效的直接电子转移，表现为吸附控制的准可逆反应。修饰电极对过 氧化氢、氧气均有良好的催化活性，同时还能用于n o 厶的检测。 关键词：羟基磷灰石，细胞色素c ，葡萄糖氧化酶，血红蛋白，电催化，电沉积， 循环伏安法，电化学交流阻抗谱 s t u d y o nt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fb i o l o g i c a lm o l e c u l e a tt h ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t hh y d r o x y a p a t i t e a b s t r a c t d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fr e d o xp r o t e i n sh a sb e e nah o to b j e c ti nb i o l o g i c a l c h e m i c a lf i e l d s r e s e a r c h e so nd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo ft h ep r o t e i n s e n z y m e sc a nb e u s e dt oe x t r a c te s s e n t i a lp h y s i e o c h e m i e a ld a t ac o n c e r n i n gt h et h e r m o d y n a m i c sa n d k i n e t i c si n f o r m a t i o n ，p r o v i d em e c h a n i s mo fe l e c t r o n e x c h a n g e sa m o n gp r o t e i n s e n z y m e si nb i o l o g i c a ls y s t e m m o r e o v e r , i tc a l le s t a b l i s haf o u n d a t i o nf o rf a b r i c a t i n g n e wk i n d so fb i o s e n s o r s b u tu s u a l l yi ti sd i f f i c u l tt oa c h i e v et h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e rb e t w e e nt h ep r o t e i n sa n de l e c t r o d e s ，m a i n l yb e c a u s et h ee l e c t r o a c t i v ec e n t e r s a r ee m b e d d e di nt h en o n c o n d u c t i n gp o l y p o p t i d e s t h e h y d r o x y a p a t i t ec o a t i n g a st h eb o n e s u b s t i t u t e ，h a sg o o db i o l o g i c a l c o m p a t i b i l i t ya n db i o a c t i v i t y , i ti sa l s on o n - t o x i c 、h a r m l e s sa n dn o n c a r c i n o g e n e s i st o h u m a nb o d y b yn o wi th a sb e e np u ti n t oc l i n i c a lu s ea st h eh u m a nb o d ys k e l e t o n s u b s t i t u t i o nm a t e r i a l o nt h eb a s i so ft h ep r e v i o u sr e s e a r c hw o r ko fo u rl a b ，t h e p a m a m h ac o m p o s i t i o nc o a t i n g sh a v e b e e n d e p o s i t e do nt h ee l e c t r o d e sb y c o n t i n u o u sp o t e n t i a ls t e pm e t h o d , t os t u d yt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h e b i o l o g i c a l m o l e c u l es u c ha s c y t o c h r o m ec ( c y t c ) ，g l u c o s e o x i d a s e ( c o d ) ， h a e m a c h r o m e ( r i b ) t h ec o a t i n go fpm h d e p o s i t e do np te l e c t r o d e sh a v eb e e np r e p a r e db y d o u b l ep o t e n t i a ls t e p t h ec vr e s u l t ss h o wap a i ro fw e l l d c 丘n e dr e d o xp e a k s t h e r a t i oo f a n o d i ca n dc a t h o d i cp e a kc u r r e n ti s1 ：1 ，t h ef o r m a lp o t e n t i a li sa b o u t0 0 1 8v ( v s s c 卿a n dp c a l 【p o t e n t i a ls e p a r a t i o na e p i s7 0m y , a l lo fw h i c hd e m o n s t r a t et h a t i tw a saq u a s i - r e v e r s i b l ep r o c e s sc o n t r o l l e db yd i f f u s i o n ，a n dt h ee l e c t r o nt r a n s f e ro f c y t cc a n b ep r o m o t e db yh a t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h et h ee l e c t r o nt r a n s f e rc y t cc a l lb ea f f e c t e db y d i f f e r e n tc o n d i t i o n so fe l e c t r o d e p o s i t i o n o nt h eb a s i so fi m p e d a n c es p e c t r a ( e i s ) a n d e l e c t r o c h e m i s t r yp a r a m e t e rf i t t i n g , t h ep o s s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e rm e c h a n i s mo fc y t c p r o m o t e db yp a m a m h ac o a t i n gi sa l s od i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ed i r e c t e l e c t r o nt r a n s f e ro fc y t cw i l lb em u c hb e t t e ri ft h et i m e o fd e p o s i t i o ni si n c r e a s e d t h ec o a 曲g so fh aa r ed e p o s i t e do ng ce l e c t r o d e sw i t hd o u b l ep o t e n t i a ls t e p t h eg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i si m m o b i l i z e do n t ot h eh a g ce l e c t r o d e sa n df i x e db y n a t i o nt of o r mg o d h a g ce l e c t r o d e t h ec vr e s u l t ss h o wt h a tap a i ro fn e a l y r e v e r s i b l er e d o xp e a k sa i co b s e r v e dd u et ot h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fg o do nt h e h a g ce l e c t r o d e s t h ee x p e r i m e n ts h o wt h a tg o dm o d i f i e do nh a g ce l e c t r o d e s c a nk e e pi t sb i o l o g i c a la n de l e c t r o c a t a l y s i sa c t i v i t y t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tp ha n d t e m p e r a t u r eo nt h er e s p o n dc u r r e n to ft h em o d i f i e de l e c t r o d eh a v eb e e nd i s c u s s e d t h eg ce l e c t r o d em o d i f i e dw i t hh a c o a t i n g si sp r e p a r e db yd o u b l ep o t e n t i a ls t e p t h eh e m o g l o b i n ( r i b ) i si m m o b i l i z e do n t ot h eh a g ce l e c t r o d e sa n df i x e db yn a t i o n s o l u t i o n c a l l e da sh b h a g ce l e c t r o d e t h eu v - v i sa n df n rs p e c t r o s c o p y d e m o n s t r a t et h a tt h eh bm o d i f i e do nt h eh a g ce l e c t r o d e sc a nk e e pi t so r i g i n a l s e c o n d a r ys t r u c t u r e t h ec vr e s u l t s s h o wt h a tl a bd o c s n td e n a t u r a l i z ea si t s e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r sc a l lb eo b s e r v e d i tw a saq u a s i r e v e r s i b l ep r o c e s s c o n t r o l l e db ys u r f a c e b e s i d e s ，i tc a nc a t a l y s e0 2a n dh 2 0 2e f f i c i e n t l y , i ta l s oc a nb e u s e dt od e t e c tn 0 2 。 k e yw o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ，c y t o e h r o m ec ，g l u c o s e o x i d a s e ，h e m o g lo _ b i l l ， e l e e t r o c a t a l y s i s ，e l e c t r o d e p o s i t i o n , c y c l i cv o l t a m m e t r y , e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：翅龟准日期：p 哆j - 粥 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名 导师签名漂蟊象日期：。哆r 形 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 生物分子的直接电化学行为研究进展 蛋白质广泛存在于各种生物组织，是生物细胞中最重要的组成物质。促进和 决定生物体内化学反应的酶、调节生理系列活动的某些微量元素都是蛋白质。如 血液中输送氧气的血红蛋白、呼吸链上的细胞色素c ( c y t o c b r o m ec ，c y t c ) 、防 御病菌感染的免疫球蛋白等都是蛋白质。蛋白质是生命活动的物质基础，生命活 动几乎都是通过蛋白质实现的。 已有的研究证明，蛋白质是由许多氨基酸通过肽链相连而成的。分子巨大， 分子量一般为数万至数十万。蛋白质大分子一般来说很不稳定，容易受物理或化 学因素的影响而发生变性，从而丧失其生物活性。分子内部有自由氨基和自由羧 基，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，在等电点p h 时溶解度最小。 开展氧化还原蛋白质的电化学行为的研究，对于理解和认识其在生命体内的 电子转移机制和生理作用具有重要意义。但迄今为止，只观察到少数氧化还原蛋 白质可以在裸固体电极上表现出电化学活性【l - 2 。这主要是由于多数蛋白质的结 构庞大，电活性中心被深埋在其多肽链的内部而不易暴露，与电极表面的距离较 远，电子隧道距离相当大，因此很难与电极之间发生直接的电子传递，蛋白质在 电极表面的取向也往往不利于其电活性基团与电极之间的电子交换1 3 】o 此外，绝 大多数氧化还原蛋白质会强烈地吸附在固体电极表面，并伴随蛋白质的变性，变 性蛋白质分子的电极反应常为不可逆的，而且影响其自由扩散分子的电子传递 州。蛋白质分子表面电荷分布的不对称性也极大地影响了氧化还原蛋白质分子的 电化学反应的可逆性。 目前，通过构筑适宜的蛋白质一电极界面可以实现氧化还原蛋白质与电极之 间的直接、快速的电子传递。常用的方法是通过在溶液中加入或在电极表面修饰 电子传递促进剂( p r o m o t e r ) 的方法来加快蛋白质与电极之间的电子传递。这类 电子传递促进剂本身在所研究的电位范围内并不发生任何电化学反应，它是通过 改善蛋白质在电极表面的取向及其与电极的界面相容性，并阻止杂质吸附，起到 相当于电子导线的作用，从而促进蛋白质与电极之间直接的电子传递【5 l 。1 9 7 7 年， h i l l 研究组1 6 1 发现4 ，4 一联吡啶存在下，细胞色素c 能在金电极表面进行准可逆的 上海师范大学硕士学位论文 氧化还原反应。这是由于4 ，4 - 联吡啶吸附到金电极表面形成一单分子层，从而 促进了细胞色素c 的异向电子传递。以后的研究发现，含硫的吡啶化合物吸附更 牢固，促进效果更明显。这一发现使得细胞色素c 的电化学研究得到了迅速的发 展，此后许多促进剂相继被发现，现在已发现了5 0 多种促进剂。这些促进剂一般 都是“x - y ”双功能基团型，其中x 是把促进剂固定在电极表面，而y 则与蛋白质 的一些特定氨基酸残基相作用，使得蛋白质在电极表面能形成一种有利于电子传 递的分子定向同。h a l a d j i a n 研究组1 8 】对1 5 种含有吡啶基团的化合物的促进作用进 行了系统的研究；董绍俊小组1 9 l 研究了染料分子的促进作用；陆天虹等考察了氨 基酬1 m 1 1 1 、糖类1 1 2 1 的促进作用。本实验室也报道了在4 ，4 - 二巯基联吡啶【1 3 1 、l 一 半胱氨酸【1 4 】、腺嘌呤1 1 5 j 等修饰电极上可实现细胞色素c 、超氧化物岐化酶 ( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e , s o d ) 与电极之间直接快速的电子传递。 另外一种方法是在溶液中加入或者电极上修饰一类称作媒介体( m e d i a t o r ) 的物质，以加速氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递1 1 纠9 】，然后再采用电化学 方法、光谱分析法等进行研究。在所研究的电位范围内，媒介体本身是有活性的。 可以通过它们在电极上的氧化还原反应来研究蛋白质的氧化还原，从而间接研究 蛋白质的电子传递过程。如董绍俊研究小组用亚甲基蓝为媒介体开展了对血红蛋 自的研究，得到了准可逆的催化反应体系l 硼 7 蛋白质在媒介体作用下的电化学研究被称作间接电化学，在促进剂作用下的 电化学研究被叫作直接电化掣2 1 】( 图1 1 ) 。 耩 c i ( y 双y b 直接电子传递 s p 图1 1 蛋白质的闻接( a ) 和直接电化学( b ) 示意图 f i g u r e1 1o v e r a l lt o p o l o g yo fi n d i r e c t ( a ) a n dd i r e c t ( b ) e l e c t r o c h e m i s t r yo f p r o t e i n s 通过促进剂对生物分子电催化性能的深入研究，可获得诸如蛋白质和酶的热 力学和动力学性质，更深入地了解到蛋白质和酶等生物大分子在生命体内的生理 2 上海师范大学硕士学位论文 作用及电子传递反应机制，从而为开发无介体的新型生物传感器提供了理论和技 术基础。 1 2 纳米材料在生物电化学研究中的应用 纳米材料具有的独特的物理化学性质为生物电化学的研究提供了一条崭新 的途径。纳米材料是指在三维空间至少有一维处于1 1 0 0 n m 或由它们作为基本结 构单元构成的材料。纳米材料处在原子簇和宏观物质交界的过渡区域，是一种典 型的介观系统，其表面电子结构发生变化，产生宏观物质材料所不具有的物理化 学性质，其独特的性质主要表现如下【2 2 j ： ( 1 ) 小尺寸效应：当颗粒尺寸与光波波长等物理特征尺寸相当或者更小 时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米微粒表面附近原子密度减小， 纳米颗粒表现出新的光、电、声等体积效应。 ( 2 ) 量子效应：当纳米粒子的尺寸下降到一定程度，金属粒子费米面附 近的电子能级由连续变为离散；纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据的分子 轨道能级和最低未被占据的分子轨道能级，从而使得能隙变宽，以及由此导致的 不同于宏观物体的光、电和超导等性质。 1 8 m o ， 上海康雷分析仪器有限公司超纯水器) 配制成所需的研究溶液。 2 2 2 实验仪器 电沉积和交流阻抗测试在m 2 7 3 恒电位仪( 美国e g & g p a r c ) 及1 0 2 5 频相 分析仪上进行，计算机操作软件分别为m 2 7 0 和m 3 9 8 。电化学阻抗谱的测试范 围为1 h z 1 0 5 h z ，正弦波幅值为5 m v 。 电解池采用三电极体系，其中工作电极为直径2 m m 的铂圆盘电极，辅助电 极为铂片电极，参比电极为饱和甘汞电极。 2 2 3 修饰电极制备 铂金圆盘电极先在金相砂纸上打磨，再依次在麂皮上用0 3 、0 0 5 脚的 a 1 2 0 3 粉抛光成镜面。然后用超纯水超声清洗数分钟后取出，再用水淋洗后置于 0 5m o l l h a s 0 4 溶液中在- 0 2 1 5v 的电位范围内进行循环伏安扫描，直至获 得标准的c v 图，以证明电极已处理干净。 于o 0 3 3 4m o i lc a ( n 0 3 ) 2 4 h 2 0 与0 0 2m o l ln h 4 h 2 p 0 4 的溶液中加入 p a m a m ( 使p a m a m 与c a 2 + 的质量比m m = l ：5 0 ) ，调节p h = 4 4 左右，将处理 干净的铂电极插入其中，恒温6 0 0 c 、搅拌下，按文献 5 7 1 所述的连续双电位阶跃 技术进行电沉积。本实验中设定的阶跃电位e 1 - 1 8v ，e 2 = 0v ，阶跃时间 h = t z = 2 0 s ，即从0 v 阶跃到一1 8 v 维持2 0 s 后，再阶跃到0 v 维持2 0 s ，如此连续 循环阶跃不同的次数，以制得不同厚度p a m a m h a 复合涂层的修饰电极( 记作 p a m a m h a p t ) ，电极经超纯水洗净、干燥后，进行细胞色素c 的电化学行为 上海师范大学硕士学位论文 研究。 2 3 结果与讨论 2 3 1h a 纳米晶体的红外及x r d 表征 图2 1 b 是本实验制得涂层测得的红外光谱图。其中，5 6 6 啪，6 0 2 锄一， 1 0 3 6c m d 处显示了表征p 0 4 3 存在的特征吸收峰，6 3 1c m ，3 5 6 8g m d 处显示了 表征o h 。存在的特征吸收峰，与文献报道的h a 特征峰相吻合【5 8 】。同时，可以看 到与不含p a m a m 的涂层( 图2 1 a ) 相比较，图2 1 b 曲线上在1 5 5 0c m d 处出 现了p a m a m ( - c o n h 一) 的特征峰，说明p a m a m 确实参与了h a 涂层的沉积 【6 2 】。 05 0 01 0 1 3 01 5 0 02 0 0 02 5 0 03 0 0 03 5 0 0 w a v e n u m b e r s ( c m 1 ) 图2 1 有 无( a ) 添加p a m a m 电沉积制得涂层的m 图 f i g u r e2 1 t h ei rs p e c t r ao fc o a t i n g se l e e t r o d e p o s i t e dw i t h o u tp a m a m ( a ) a n dw i t hp a r t c o ) 01 0 4 0 7 0 2 0 0 誉蓄is毛c芒- 伽 耄| 伽 姗 撇 伽 。 上海师范大学硕士学位论文 图2 2 h a 涂层( a ) 和p a m a m h a 复合涂层( b ) 的x r d 图 f i g u r e2 2t h ex r ds p e c t r ao fc o a t i n gh a ( a ) a n dp a m a m m a 0 ) 图2 2 a 中，除了金属基底的衍射锋，其它几处主要衍射锋与文献报道的谱 峰【5 9 - 6 0 l 基本一致，表明本实验条件下电沉积所制得的是纯度较高的h a 。此外， 图2 2 b 与图2 2 a 没有显著的差别。这是由于p a m a m 的添加量很小，且p a m a m 为有机高聚物，没有固定的晶形，所以在x r d 图中看不出p a m a m 的存在。在 前面眼光谱中证明了p a m a m 确实存在于h a 涂层中。 2 3 2p a m a m h a p t 电极的表面形貌 循环阶跃5 次与1 5 次的p a m a m h p t 电极的表面形貌如图2 3 所示。可 以看到，与不加p a m a m 制 ：导的涂层( 图2 3 c ) 相e 匕确实有差异。当阶跃5 次 时，涂层的晶体呈相连的薄片状，中间有较大的孔洞( 图2 3 a ) 。阶跃1 5 次时， 晶体的尺寸有所减小，且交叠程度高，比较致密( 图2 3 b ) 。以1 岬作为标尺， 发现h a 涂层的长度和宽度还是微米级，但厚度已接近纳米级。后面循环伏安测 量的结果表明，添加p a m a m 后制得的修饰电极上o y t c 的电子传递有了明显的 改善。 上海师范大学硕士学位论文 图2 3 阶跃5 次、1 5 次( b ) 制得的p a m a m - h a p t 与h a p t ( c ) 电极表面的s e m 图 f i g2 3t h es e mi m a g eo fp a m a m - h a p t ：s t e pn u m b e ri s5 ( a ) 、1 5 ( b ) a n dh a p t ( c ) 2 3 3 细胞色素c 在p a m a m h a it 电极上的循环伏安行为 图2 4 是连续循环阶跃1 5 次制备的修饰电极分别在缓冲溶液和细胞色素c 溶液中测得的循环伏安图。 0 30 20 1 0 0 - 0 1- o 2 e n v s s c e 图2 4 裸p t 电极在o 2 6 m m o l l c y t c 溶液( a ) ，h a p t 电极在0 2 6 m m o l l c y t c 溶液( b ) 和磷酸盐缓冲溶液( c ) 中的循环伏安图( 扫速：1 0m v s ) f i g u r e2 4 c v s o f b a r e p t i n 0 2 6 m m o l l c y t cs o l u t i o n ( a ) ，t h e h a p t i n p b s ( c ) a n d c y t c ( b ) s o l u t i o n s c a nr a t e ：1 0m v s 细胞色素c 在裸铂金电极上的c v 曲线( 图2 4 a ) 与修饰电极在缓冲溶液中测 得的c v 曲线( 图2 4 c ) 相似，均没有出现氧化还原电流峰，而细胞色素c 在修饰 电极上( 图2 4 b ) 则可以观察到一对氧化还原峰。细胞色素c 在p a m a m 啊a 复合 涂层修饰的电极上，则呈现一对明显的氧化还原电流峰( 图2 5 b ) 。1 0 m v s 的扫 速下，还原峰电位为1 7 m v ，氧化峰电位为5 3m v ，峰电位差( d e p ) 为7 0m v ， 氧化还原峰电流之比接近1 ：1 。 1 4 力2 1j1|jtj1|j14 m 鲫 暑； 舯 上海师范大学硕士学位论文 0 30 20 1 0 o0 1 - 0 ，2 e ，vv 5 s c e 图2 5 h a p t 电极( a ) 与p m m - h a ，p t ( b ) 在0 2 6 m m o l l c y t c 溶液中的循环伏安图( 扫 速：1 0 m v s ) f i g u r e2 5 c v s o f h a p tc a ) a n d p a m a m h a p t ( b ) i n 0 2 6 m m o l l c y t cs o l u t i o n s c a nr a t e ：1 0r o w s 进一步的实验表明，峰电位不随扫描速度的改变而变化，且氧化还原峰电流 与扫描速度的平方根呈现良好的线性关系( 图2 6 ) ，表明c y t c 在该修饰电极上 的电极反应是一个受扩散控制的准可逆电极过程。h g c 电极在l m m o l l r u ( n h 3 ) 6 c l s 和o 5m o l lk n 0 3 溶液中于不同扫速下进行循环伏安扫描，根据 i p = 2 5 9 1 0 5 n 1 2 矿尼c ，已知r u ( r 讦1 3 ) 6 c 1 3 在n a t i o n 膜中的扩散系数为 2 3 1 0 9 锄2 s1 6 1 1 条件，在固定其它条件时以i p 对v 1 尼作图为一直线，通过其斜率求 得h a g c 电极的有效面积a 。经计算扩散系数为1 2 1 0 7c ，m 2 s 一。 以上结果表明，h a 涂层可以促进细胞色素c 的电子传递，类似于起到了电 子传递促进剂的作用。这是因为h a 涂层中同时具有带正电荷的c a 2 + 和带负电荷 的p 0 4 3 。形成的两类吸附位点，与细胞色素c 之间发生的相互作用使深埋在细胞 色素c 内部的电活性中心处于有利于电子传递的电极表面。而在沉积液中添加了 p a m a m 后，在h a 晶核形成和生长的过程中，p a m a m 以其独特的结构起到调 控h a 晶核大小、形貌结构等的作用。在p a m a m 粘度的作用下产生的分散效 应使h a 涂层更趋均匀有序【6 2 1 ，因而给细胞色素c 的电子传递创造了更加有利 的微环境。另外，h a 涂层均匀有序多孔的片状结构也增大了电极的有效表面积， 5 4 3 2 1 o l 2 3 o o 0 0 o o o 0 o 上海师范大学硕士学位论文 同时也为细胞色素c 的电子转移提供了更多接近电极表面的离子通道。 0 80 20 1 n m- 0 1- 0 8 e ，vv 8 s c e 2345 6 7 8 1 7 = ( m y s ) 1 4 图2 6p a m a m - h a p t 电极在细胞色素c 中的循环伏安图 扫描速度分别为5 、7 、1 0 、3 0 、5 0m v s ( a q ) 以及电流与扫速的关系 f i g u r e 2 6 c v s o f p a m a m - h a p t n 0 2 6 m m o l l c y t cs o l u t i o n w i t h d i f f e r e n t s c a nr a t ea n d t h e p l o t so f p e a kc t l i t e n t sv e r s u ss c a i lr a t e 2 3 4 电沉积不同厚度的复合涂层对细胞色素c 直接电子传递的影响 电化学石英晶体微天平( e l e c t r o c h e m i c a lo u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，e q c m ) 的实验结果证明，随着阶跃次数的增加，电沉积涂层不断增厚【吲。实验中分别 试验了循环阶跃5 、1 0 、1 5 次，制得不同厚度p a m a m h a 修饰的p t 电极，并 考察了c y t c 在该修饰电极上的循环伏安行为。从图2 7 可以看到，氧化还原峰 电流略有变化，但峰电位基本保持不变。随着阶跃次数的增加，峰形更趋于对称。 其中阶跃1 5 次时，修饰电极上测得的c v 更接近于准可逆的电子传递反应。究 其原因可能是，随着阶跃次数增多，p a m a m h a 涂层变厚，带负电的p 0 4 3 位点 也随之增多，涂层与c y t c 之间的静电吸引力增大，有利于c y t c 中的血红素活 性基团更靠近电极表面。所以适当增加阶跃次数，即增加涂层厚度，有利于c y t c 的电子传递。但2 0 次以上则对电子传递的阻碍作用也增大，不利于细胞色素c 的电极反应。 1 6 上海师范大学硕士学位论文 0 30 2 0 10 0 - n 1- 0 2 e v s s c e 图2 7p a m a m h a 涂层厚度对c y t c 循环伏安行为的影响( 扫速：1 0m v s ) 连续循环阶跃5 次( a ) 、1 0 次( b ) 、1 5 次( c ) f i g u r e2 7t h ee f f c to fd i f f e r e n tt h i c k n e s so fp a m a m h a i nc y l cs o l u t i o n s t e pn u m b e ri s5 ( a ) 、1 0 ( b ) a n d1 5 ( c ) ，s 咖m t e ：1 0m v s 2 3 5h a 修饰p t 电极的电化学阻抗谱及相应的等效电路 为了进一步理解细胞色素c 在修饰电极上的电子传递作用机制，进行了电化 学阻抗谱的研究。图2 8 a 是循环阶跃1 5 次的p a m a m h a 修饰p t 电极在p b s 溶液中的电化学阻抗谱，在高频区域没有出现表征电子传递反应的半圆。在c y t c 溶液中测得的阻抗谱图上( 图2 8 b ) 可见，高频区略呈圆弧，表明在p a m a m h a 修饰电极上发生了细胞色素c 的电子传递，低频区呈线性，但斜率大大降低。 可以认为，细胞色素c 在修饰电极上的电子传递反应是受动力学和扩散同时控 制的。 o5l o1 52 0 2 53 03 6 z k o h m 1 7 上海师范大学硕士学位论文 图2 8p a m a m - h a p t 电极在0 2 6 m m o l l c y l c ( b ) 和磷酸盐缓冲溶液中( a ) 的电化学阻抗谱图 h g u m2 8 t h ee i so f p a m a m h a 伊ti nc y t b ) a n dp b s ( a ) s o l u t i o n 图2 9 为循环阶跃不同次数制备的不同厚度p a m a m h a 涂层修饰的p t 电 极在细胞色素c 溶液中测得的电化学阻抗谱图。高频区部分无显著变化，但低 频区线性部分的斜率随循环阶跃次数的增加而依次降低，即直线的倾斜角随厚度 的增加依次减小。 05l o1 52 02 53 03 5 z k o h m 图2 9 不同厚度( 不同阶跃圈数) p a m a m h a 涂层修饰的p t 电极在c y t c 溶液中的抗谱图 ( 直流偏置电位设定为0 。0 1 8v ) f i g u r e2 9t h ee i so fp te l e c t r o d em o d i f i e dw i t hd i f f e r e n tt h i c k n e s sp a m a m m a i n0 2 6m m o l l c y t cs o l u t i o n 经拟合所得的等效电路如图2 1 0 所示。其中鼬代表电解质溶液电阻。耻和 勐e 分别是p a m a m h a 涂层的电阻和与电容相关的恒相位元件。r c t 为电荷传 递阻抗，而z d 表示电荷在p a m a m h a 涂层中的扩散阻抗即w a r b u r g 阻抗。r 御 为电荷传递的表观电阻，r 。= z d + r 。而在实际电路中，考虑到电极表面粗糙度 的影响，用恒相位元件c p e ( c o n s t a n tp h a s ee l e m e n t ) 替代纯电容后，可用以下方程 式表示：z c 西1 = c ( 叻“。式中z c p e 为电容阻抗，c 是与频率无关的常数，j = ( 1 ) i 2 ， ( ) 为角频率，当n 分别是0 ，0 5 和1 时，z c p e 代表纯电阻，w a r b u r g 阻抗和纯电容 柏 竹 o m c o i 对 上海师范大学硕士学位论文 【删。根据实验数据解析的结果示于表1 。 图2 1 0 修饰电极在c y t c 溶液中的等效电路图 f i g u r e 2 1 0 t h ee q u i v a l e n tc i r c u i t o f p te l e c t r o d e m o d i f i e d w i t h p a m a m h a i n o 2 6 m m o f l c y t cs o l u t i o n 表2 1 阻抗谱图拟合的电化学参数 t a b l e2 1t h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r ss i m u l a t e dw i t ht h ef i g u r e2 9 纵观表2 1 ，发现随着膜厚度的增加，溶液电阻并没有太大变化，而电荷传 递电阻如依次减小，w a r b u r g 阻抗也呈减小趋势。这可归因于h a 膜内的荷负 电的离子随着膜厚度的增加而增多，与荷正电的细胞色素c 之间的静电吸引力 增大，有利于细胞色素c 与电极之间的电荷传递。同时，p a m a m i - i a 涂层晶粒 之间的大量空隙也为电荷的传递提供了离子渗透通道。因此适当增加复合膜层的 厚度能较好的地促进细胞色素c 的电子转移，这与前面循环伏安得到的结论相 一致。 2 4 小结 用双电位阶跃方法成功地在铂电极表面制备了p a m a m h a 复合涂层修饰电 极。实验结果证明，细胞色素c 在该修饰电极上能实现直接快速的电子传递，涂 层对电子传递的促进作用与电沉积实验条件密切相关。对不同厚度的 p a m a m h a 复合涂层进行电化学阻抗谱测定的结果表明，电子传递反应电阻随 1 9 上海师范大学硕士学位论文 膜厚度的增加而减小，从获得的等效电路以及电化学参数的解析获得了与循环伏 安相一致的结论。 2 0 上海师范大学硕士学位论文 第三章葡萄糖氧化酶在h a 修饰玻碳电极上的直接电化学 3 1 引言 近年来，酶和生物氧化还原蛋白质的直接电子转移反应已受到越来越多的关 注f 6 5 删。一方面，这一研究对了解生命体系的能量转换和物质代谢、模拟生物体 系电子传递机制和代谢过程，获得其热力学和动力学性质的重要信息。另外，利 用生物反应的特异性和电分析的灵敏性及实时检测相结合，为制备生物电化学传 感器生物燃料电池提供强有力的手例明。然而，由于大部分氧化还原蛋白质和 酶在电极表面会发生强烈的吸附而发生变性，因而发生不可逆的化学反应；另外， 由于蛋白质和酶分子大多具有庞大的空间结构，因其氧化还原中心被多肽链包围 加之特有的高离子特性和表面电荷的非对称分布，从而阻碍了蛋白质和酶在电极 表面直接电子转移反应的发生【鲫。因此，为了实现蛋白质和酶能在电极表面发 生可逆的直接电子传递，探索合适的电极材料和固定方法就非常重要。已经有部 分报道把酶固定在碳纳米管修饰的玻碳电极上嘟l ，还有将酶固定在自组装单分 子层修饰电极上【叫，均可实现酶的快速的电子传递并保持其本身的生物催化活 性。 基于酶的生物传感器已经有很多报道。其中，以氧气为受体的第一代生物传 感器的稳定性受氧分压波动的影响，基于媒介体( 如二茂铁) 的第二代生物传感