（高分子化学与物理专业论文）丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究.pdf

复旦大学硕士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 宰5 月 摘要 本文利用圆二色谱法观察了再生丝素蛋白由无规线团( s i l ki 结构) 向b 折叠 ( s i l ki i 结构) 的转变及其d 折叠的聚集过程，对此提出了类似于病毒蛋白的神经 性退变过程的成核依赖性机理。在这个机理中存在两个过程：( 1 ) 成核过程，这是 决定转变速率的一步，涉及无规卷曲向p 折叠转变及其聚集成核的过程；( 2 ) p 折叠 聚集增长过程，该过程的增长速率对于无规卷曲的蛋白质浓度遵循一级反应动力 学。而且还证明了只有在核或称为种子引入的情况下，温度升高方可明显加速d 折 叠的聚集增长过程，否则该过程即使在温度很高的情况下也进行很慢。我们推测 在蚕和蜘蛛的吐丝过程中，丝蛋白分子链都存在着这样一种具有成核依赖性的构 象转变及聚集过程。这一工作为我们更好地理解生物体中的成丝过程提供了理论 依据。 ( 另外，为进一步了解导致无规卷曲向d 折叠构象转变的原因，我们利用“c n m r 谱和r 眦a n 光谱证实了金属离子( c a ”，k + ，c u “，z n 2 + ) 的存在能诱导p 折叠 的形成。金属离子和蛋白质中的氧原子及氮原子的络合作用使蛋白质分子产生折 叠，由此导致更多氢键的形成，从而形成稳定的p 折叠的核，这种稳定的核将促使 更多的b 折叠构象出现。然而不同的金属离子，如碱金属k + ，碱土金属c a 2 + 与过 渡金属c u ”，z n ”在肽链中的作用形式不同，这种情况可能导致了这些金属离子在 丝中的含量不同。 本文还用密度泛函理论( d e n s i t yf u n c t i o nt h e o r y d f t ) 的方法计算了前人提 出的各种蚕丝蛋白分子结构中碳原子的化学位移，并与核磁共振的实验结果进行 了比较。结果表明：( 1 ) 蚕丝蛋白的s i l ki 结构具有类似于3 。螺旋的构象，其扭 曲角的范围为：丙氨酸 = 一5 9 2 。， = 1 1 9 2 。， = 1 7 8 2 。；甘 氨酸 = 一7 8 2 。， = 1 4 9 2 。， = 1 7 8 2 。；( 2 ) 分别由m a r s h ， f o s s e y 和a s a k u r a 等人提出的s i l ki i 结构被认为是合理的，其扭曲角的范围对 一 、 7 7 c 丙氨酸和甘氨酸均为 = 一1 4 3 6 。， = 1 4 2 5 。和 2 1 7 8 2 0 。 尸 复旦大学硕士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 宰5 月 a b s t r a c t t h es p i n n i n gm e c h a n i s mo fn a t u r a ls i l kh a sb e e na no p e ni s s u e i nt h i ss t u d y , b o t ht h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o nf r o mr a n d o mc o i lt o3 - s h e e ta n d3 - s h e e ta g g r e g a t i o n g r o w t ho f s i l kf i b r o i na r ei d e n t i f i e di nt h eb o m b y xm o r ir e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i na q u e o u s s o l u t i o n b y t h ec i r c u l a r d i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r o s c o p y a n u c l e a t i o n - d e p e n d e n t a g g r e g a t i o nm e c h a n i s m ，s i m i l a r t ot h a tf o u n di nv i r a l p r o t e i n d e n a t u r a t i o no f n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ，i ss u g g e s t e df o rs u c has t r u c t u r a lp r o t e i ns y s t e mi nt h es i l k s p i n n i n gp r o c e s s t w os t e p s a r ei n v o l v e di nt h i sm e c h a n i s m ：( i ) n u c l e a t i o n ，ar a t e l i m i t i n gs t e pi n v o l v i n g t h er a n d o mc o i lt o 3 - s h e e t t r a n s i t i o na sw e l la s 3 - s h e e t a g g r e g a t i o n ，i e ，t h e f o r m a t i o no fan u c l e u so rs e e d ；( i i ) a g g r e g a t i o ng r o w t hw h i c h f o l l o w saf i r s to r d e rk i n e t i cp r o c e s sw i t l lr e s p e c tt ot h er a n d o mc o i lc o n c e n t r a t i o n t h e i n c r e a s eo ft e m p e r a t u r ea c c e l e r a t e st h e3 - s h e e ta g g r e g a t i o ng r o w t hi ft h e3 - s h e e ts e e d w a si n t r o d u c e di n t ot h er a n d o mc o i ls o l u t i o n b o t ht h es i l k w o r ma n ds p i d e rs i l k s p i n n i n gp r o c e s s e s a r e p r o p o s e d t oo c c u rv i aan u c l e a t i o n d e p e n d e n t a g g r e g a t i o n p a t h w a y t h i s w o r ke n h a n c e so u r u n d e r s t a n d i n go f t h en a t u r a ls i l ks p i n n i n gp r o c e s s n i na d d i t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to fm e t a li o n ( c a 2 + ，k + ，c u 2 + ，z n 2 + ) o nt h e c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no fs i l kf i b r o i no f b o m b y xm o r is i l k w o r mf o rv i e w i n gi n s i g h ti n t o t h eo r i g i no fn u c l e u sf o r m a t i o n b o t hr e s u l t sf r o m1 3 c - n m ra n dr a m a ns p e c t r o s c o p y s h o w e dt h a tt h ee x i s t e n c eo fm e t a li o n si n d u c e st h et r a n s f o r m a t i o nf r o mc o i lc h a i nt op 复旦大学硕士论文丝索蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 宰5 月 s h e e t t h er e a s o nw h yk + a n dc a 2 + c a ni n d u c ei b - s h e e tf o r m a t i o ni st h a tt h e yd e s t o r y t h ei n t r a c h a i n h y d r o g e nb o n d si n r a n d o mc o i l c h a i n ，m a k i n gt h e s i l kf i b r o i nc h a i n s t r e t c h ，p r o v i d i n gt h ep r o b a b i l i t yo ff o r m i n g m o r er e g u l a r 3 - s h e e t b u tt h er e a s o nw h y z n 2 + a n dc u 2 + i n d u c e 3 - s h e e tf o r m a t i o ni st h a tt h e yc a nf o r mn e w t u r n sb yf o m i n gp l a n a r f o u rc o o r d i n a t i o nc o m p l e xw i t hh i s t i d i n e i n v o l v e dr e s i d u e s ，m a k i n gt h es i d ec h a i n so f t u r n sf o r mi n t e r - c h a i nh y d r o g e nb o n d ，t h e r e f o r ei n i t i a t i n g1 3 - s h e e tf o r m a t i o n t h e d i f f e r e n tm e c h a n i s mb e t w e e nk + c a 2 + a n dc u 斗z n 2 + m i g h tm a k et h e me x i s tw i t h d i 髓r e n tc o n t e n t si ns i l kf i b r o i n a l s oi nt h i sw o r k ，ad e n s i t yf u n c t i o n a lt h e o r y ( d f t ) a p p r o a c hw a su s e dt oa s s e s s t h o s ea v a i l a b l es t r u c t u r a lp a r a m e t e r sb a s e do i lt h ec o m p a r i s o no f c a l c u l a t e d 13 cc h e m i c a l s h i f t sa n ds h i e l d i n gt e n s o r sw i t he x p e r i m e n t a lo n e s t h er e s u l t si n d i c a t et h a t ：( i ) s i l ki f o r m ，f i r s t l yb ep r o p o s e di nt h i sw o r k ，i ss i m i l a rt oa3 1 - h e l i xc o n f o r m a t i o n w i t ht o r s i o n a n g l e so f = 一5 9 2 。， = 1 1 9 2 。， = 1 7 8 2 。f o ra l a n i n e r e s i d u ea n d = 一7 8 2 。， = 1 4 9 2 。， = 1 7 8 2 。f o rg l y c i n er e s i d u ei nt h es i l kf i b r o i n ；( i i ) s i l ki is t r u c t u r e si n d i v i d u a l l yd e t e r m i n e db ym a r s h ，f o s s e ya n da s a k u r aa r ec o n s i d e r e d t ob em o r er a t i o n a lt h a nt h o s ed e t e r m i n e db yo t h e ra u t h o r s t h er e s u l t a n tt o r s i o na n g l e r a n g e sf o rs i l k i if o r ma r e = 一1 4 3 6 。， = 1 4 2 5 。a n d = 1 7 8 2 。b o t h f o r a l aa n dg l yr e s i d u e s 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 年j 月 1 1 蚕丝的结构与性能 第一章前言 在自然界中，有3 0 ，0 0 0 种蜘蛛和11 3 ，0 0 0 种昆虫纲鳞翅目的大部分物种以 及昆虫纲的其他几个物种【2 i 可以吐丝。在这些丝中，大部分都已经在一定程度上 予以了表征，只有1 ，0 0 0 种左右的丝没有被表征过【3 i 。研究最多的是家蚕丝( b o m b y x m o r is i l k ) 和金色球形蜘蛛( n e p h i l ac l a v i p e s ) 的拖丝( d r a g l i n e ) 和捕丝( c a p t u r e t h r e a d ) ，其中家蚕又被称为桑蚕。在这些吐丝的昆虫中，家蚕是唯一可被人工养 殖的昆虫。家蚕丝由于其5 ，0 0 0 年的历史和在纺织工业上的应用而被广泛研究。 n a p h i l ac l a v i p e s 也因为它的个体很大，易于获得而广泛研究。 许多年来，纺织工业一直试图合成具有蚕丝的某些优良性能的高分子材料。 虽然许多合成物( 如尼龙系列) 在化学结构上和蚕丝相似，并在某些方面p 1 ( 如耐 磨性高、韧性好、摩擦系数小等) 可以和蚕丝相比，甚至优于蚕丝，但与合成聚合 物相比蚕丝因兼具高强度( 表1 1 ) 、透气性好、吸汗强、手感好等优点使其仍然 是一种最令人满意的纺织材料之一。另外人们也积极开发其各方面的用途，如酶 的固定化、化妆品添加剂【6 】、生物传感器( ，】等。虽然对于蜘蛛丝的研究起步较迟， 但目前也受到人们广泛地关注。特别是对它出色的力学行为( 表1 1 ) 的关注1 8 】。 从下表可以看出蚕丝和蜘蛛丝在力学性能的许多方面都是令人满意的。人们试图 用它们做防弹衣的纺织材料。如泰国警方曾用1 6 层薄薄的蚕丝丝绸制成了防弹 衣，它可以挡住呼啸飞行的9 毫米子弹的冲击【9 i 。为了探究这些丝为什么具有如此 优异的力学性能以及开发新型材料，丝素蛋白的结构和性能之间的关系成为重要 的研究方向。 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 车5 月 t a b l ei - 1 一些结构材料的力学性能的比较口 材料 m o d u l u s s t r e n g t h e n e r g y t ob r e a k ( n1 1 1 1 )f n m “) ( jk g 1 ) b o m b y x m o r is i l k 16 1 0 1 06 1 0 84 1 0 4 s p i d e rf r a m es i l k 1 x1 0 1 0 1 1 0 9l 1 0 5 v i s c i ds i l k3 1 0 65 1 0 81 1 0 5 k e v l a rl 1 0 “4 1 0 93 1 0 4 l c e l l u l o s ef i b r e s3 1 0 1 。8 1 0 89 1 0 3 h i g h t e n s i l es t e e l2 1 0 1 12 1 0 91 1 0 3 t e n d o n1 1 0 9l 1 0 85 1 0 3 lr u b b e r 1 1 0 8l 1 0 8 8 1 0 4 蚕丝是由丝素蛋白( s i l kf i b r o i n ) 和丝胶( s e r i c i n ) 两部分组成。丝胶包覆 着丝素蛋白，约占总重的2 5 ，丝素蛋白约占7 0 ，蚕丝中还含有5 的杂质0 1 。 许多研究小组测定了蚕丝纤维蛋白中氨基酸的种类和含量删，表1 2 是两种天然 蚕的丝素蛋白和再生家蚕丝素蛋白溶液中氨基酸的种类和含量。 t a b l e1 - 2 家蚕( b o m b y xm o r i ) 和一种野生蚕( a n t e r a e ap e r n y i ) 天然丝素蛋白以及家蚕 再生丝素蛋白中氨基酸种类和含量的比较t u l 。 an a t i v es i l kf i b r o i nc o l l e c t e df r o mt h ep o s t e r i o rd i v i s i o no f t h es i l kg l a n d br e g e n e r a t e ds i l kf i b m i no b t a i n e db ys o l u b i l i z i n gt h en a t i v es i l kf i b e rw i t h 9 m l i b ra q u e o u ss o l u t i o na t6 0 。cf o r3 0m i n 复旦大学硕士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 筝j 月 丝胶可以通过脱胶过程与丝素蛋白分开，一般认为它不具有力学强度。分离 的丝胶其u v 吸收有四个吸收峰，意味着有四种不同的结构。这四种结构根据溶 解的难易程度分别用s e r i c i ni ，l i ，i i i ，i v 来表示 1 4 - 1 6 l 。 导致蚕丝具有优异力学性能的原因是丝素蛋白。丝素蛋白除了含有c 、o 、h 、 n 元素外，还含有k 、c a 、s i 、s r 、p 、f e 、c u 等多种元素“”。由于不同的蚕丝 其结构性能不尽相同，所以本文将仅就研究最多的桑蚕丝进行讨论。该蚕丝的丝 素蛋白是由十八种氨基酸组成。其中取代基较小的甘氨酸( g l y ) 、丙氨酸( a l a ) 和丝氨酸( s e r ) 按照一定的序列结构排列成较规整的链段即( g a g a g s ) 一。，主要 位于丝素蛋白的晶区内，它们的含量约为8 5 ；而取代基较大的苯丙氨酸( p h e ) 、 酪氨酸( t y r ) 和色氨酸( t r y ) 等则主要存在于非晶区。有些研究者认为桑蚕丝 素蛋白分子是由两种亚单元构成，大的亚单元分子量为2 8 3 0 1 0 5 ，小的亚单 元分子量为2 0 3 0 1 0 4 8 。“。而于同隐等人口”的研究认为桑蚕丝素蛋白分子是 由分子量分别为2 8 1 0 5 、2 3x1 0 5 和2 5 1 0 4 的三种亚单元构成。丝纤维中丝素 蛋白的聚集态结构由结晶态和无定型态两大部分组成，结晶度为5 0 6 0 左右口”。 一般认为丝素蛋白分子的构象分为两类，即s i l ki 和s i l ki i 结构，s i l ki 结构 包括无规线团( r a n d o mc o i l ) 和a 螺旋( d h e l i x ) ，s i l ki i 结构呈反平行p 折叠。在 一定的外界条件下( 如冷冻、加热、浓缩、稀释、溶剂浸泡、改变p h 值、引入金 属离子及施加应力等) ，这些构象可以互相转化。前人曾用红外( i r ) 、拉曼 ( r a m a n ) 、圆二色谱( c d ) 、广角x 射线衍射( l a x s ) 等研究了这些构象及其 转变 2 5 - 3 2 i ，表征结果如表1 3 。 s h e f f 3 3 1 等用透射电镜( t e m ，t a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ) 、区域选择电 子衍射( s a e d ，s e l e c t e da r e ae l e c t r o nd i f f r a c t i o n ) 、广角x 射线散射( w a x s ， w i d e a n g l ex r a ys c a t t e r i n g ) 和低压高分辨扫描电镜( l v h r s e m ，l o w v o l t a g e h i g h - r e s o l u t i o ns c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ) 研究了脱胶前和脱胶后蚕丝的微观结 构。丝茧的l v h r s e m 照片显示了双股丝纤维的缠绕结构。脱胶后，分为独立的 两根丝纤维，而且丝纤维的表面形貌和微观取向结构一致。用w a x s 和s a e d 的 结果证实了在蚕丝和蜘蛛丝中存在p 折叠结构，而且脱胶前后丝素蛋白的构象没有 复旦大学硕士沦文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 车j 月 明显变化。在脱胶后的丝纤维中，可以看到沿着纤维方向，有若干6 0 0n i n 宽的带 状条纹( 见图1 - 1 ) 。暗场照片揭示丝纤维中心和边缘p 折叠晶体大小分别为2 0 1 7 0 m 和1 2 41 1 r 1 1 。根据这些实验结果，作者提出了如图1 一l 的蚕丝微观结构模型。 图左侧的带状条纹是由氢键形成的p 折叠结晶区，“v ”型的空白间隔是由低分子 量蛋白、链端基及链折叠形成的非晶区。 t a b l e1 - 3 丝素蛋白的结构特征谱图陋” 方法s i l k l 结构s i l k l i 结构参考文献 i r 1 6 5 3c m 。1 ( 酰胺1 )1 6 2 7c m 。1 ( 酰胺i ) 2 5 2 7 1 5 4 3c m 。( 酰胺i i )1 5 3 1c m 。1 ( 酰胺i i ) 1 2 4 3c m 。( 酰胺i i i )1 2 3 6c m 。( 酰胺i i i ) 6 6 9c m 。( 酰胺v )6 9 5c m 。( 酰胺v ) r a r l l a l l 1 6 6 0c m 。1 ( 酰胺1 )1 6 7 6c m 。1 ( 酰胺i ) 2 8 3 2 1 2 5 2c m 。( 酰胺i i i )1 2 3 3c m 。1 ( 酰胺i i i ) 1 2 7 0c m 。( 酰胺i i i ) c d 2 0 6n r n ，2 1 8n l n ( 负峰) 3 0 ，3 1 】 1 9 2n i i ( 正峰) l a x s o 4 3n l n 0 4 7 6r i m 【2 8 f i b o i n l o wm wf i b r o i n f i g u r e1 - 1 m o d e lo f m i c r o s t m c t u r eo f t h eb m o 厂fs i l k 肋r o i l l 【3 3 j 复旦大学硕士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 年5 月 1 2 本文的出发点及主要内容 正如前文所述，虽然蚕丝蛋白的结构和成丝机理一直是人们研究的热点，但 仍有许多工作有待进行更加深入地探讨。本论文在成丝机理、金属离子在丝素蛋 白构象转变中的作用以及基于d f t 理论对丝素蛋白化学位移的计算以确定丝素蛋 白结构等方面进行了深入的研究。 虽然关于桑蚕和蜘蛛的吐丝机理已有许多报道 3 4 4 0 i ，然而是什么因素真正导 致吐丝过程在常温常压下得以进行还没有清楚的解释口4 ，”1 。蚕丝腺体中的丝素蛋 白在很浓的条件下还有很好的流动特性被认为是由于液晶态的存在”( 见1 3 2 ) 。 单轴取向的丝素蛋白纤维在低剪切速率4 0 1 以及低拉伸率条件下4 唧可形成。相反， 工业合成的纤维如k e v l a r ( 一种高强度高模量的高分子材料) ，需要高温、高压、 高后拉伸率及液晶态的存在才能使分子链沿着纤维轴取向【4 2 i 。因此，了解天然蚕 丝的形成过程对于促进材料科学的发展特别是聚合物的加工设计具有重要的意 义。本文第二章采用c d 的方法观察了蚕丝丝素蛋白由无规卷曲向p 折叠的转变及 其聚集过程，提出蚕吐丝过程存在着成核依赖性的机理。 另外，金属离子( 如c a “，k + ，c u 2 + 和z n 2 + ) 在成核及构象转变过程起怎样的作 用? 这些问题在第三章中予以了探讨。 虽然通过x 射线衍射、分子力学的计算以及”c 核磁共振的研究，已提出各 种s i l ki 和s i l ki i 的结构模型，但这些模型的结构参数大相径庭。本文在第四章用 d f t 的方法计算了前人提出的各种丝素蛋白结构中碳原子的化学位移，并与核磁 共振的实验值进行比较，确定了s i l ki 和s i l ki i 的扭曲角范围。 第五章对本论文的工作成果进行了总结。 复旦大学硕士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 聿5 月 参考文献： 1 f o e l i x ，r eb i o l o g yo f s p i d e r s ，1 9 9 2 ，h a z a r du n i v e r s i t yp r e s s ，c a m b r i d g e ，m a 2a c a d e m i ca m e r i c a n e n w c l o p e 击a ，1 9 9 3 ，g r o l i e r e l e c t r o n i cp u b l i s h i n g ，i n c 3 k a p l a n ，d ；a d a m s ，ww ；f a r m e r ，b ；v i n e y ，c a c s 妙掰s e r 1 9 9 4 ，5 4 4 ，2 3 4 - 2 5 1 4 h y d e ，n n a t i o n a lg e o g r a p h i c1 9 8 4 ，1 6 5 ( 1 ) ，3 5 高勤卫复旦大学博士毕业论文 6 中山博绢缮羟表1 9 8 9 ，4 5 ( 5 ) ，2 5 8 7 刘永成复旦大学博士毕业论文 8 g o s l i n e ，j m d e m o m ，m e ，d e n n y , mwe n d e a v o u r ，1 9 8 6 ，1 0 ( 1 ) ，3 7 4 3 9 ( 因特网) 英国广播公司6 月2 7 日报道，2 0 0 0 1 0 t h i e l ，b l ；k u n k e l ，d d ；v i n e y , c b i o p o l y m e r s ，1 9 9 4 ，3 4 ，1 0 8 9 1 0 9 7 11 e i s a k ui i z u k a ，s i l k ( p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ) p o l y m e rm a t e r i a l se n c y c l o p e d i a v e r s i o n1 ，c r cp r e s s1 9 9 6 1 2 l u c a s ，f ；s h a w , j tb ；s m i t h ，s g b i o c h e m ，1 9 6 2 ，8 3 ，1 6 4 1 3 l u c a s ，f ；s h a w , j tb ；s m i t h ，s g ，m 0 1 b f _ o l , 1 9 6 0 ，2 ，3 3 9 1 4 k e i i c h ik o m a t s u ，s i l k ( i t sf o r m a t i o n ，s t r u c t u r e ，c h a r a c t e r , a n du t i l i z a t i o n ) p o l y m e r m a f e r i n l se n c y c l o p e d i av e r s i o nj jc r cp r e s s1 9 9 6 1 5 k o m a t s u ，k ；b u l ls e r i c u l te x ps t a 1 9 7 5 ，2 6 ，1 3 5 16 i s h i k a w a ，h ；h i r a b a y a s h i ，k ；m o r o o k a ， l ，s o c f i b e rs c i 死如j a p a n1 9 7 4 ，3 0 t 9 6 1 7 刘永成；邵正中；孙玉宇；于同隐序分子通掼1 9 9 8 ，3 ，1 7 6 复旦大学硕士论文丝索蛋白构象转变机理及其分子结构的研究 2 0 0 1 宰5 月 18 t a s h i r o ，y ；o t s u k i ，e b i o c h i m i c ae tb b i o p h y s i c a1 9 7 0 ，2 1 4 ，2 6 5 1 9 s a s a k i ，工；n o d a ，h b i o c h i m i c ae t b b i o p h y s i c a a c t a1 9 7 3 ，3 1 0 ，9 1 2 0 s p r a g u e ，k u b i o c h e m i s t r y1 9 7 5 ，1 4 ( 5 ) ，9 2 5 21 t r f i l e t t i ，v ；c o n i o ，g ；p i o l i ，f ；e ta lm a 打o m 0 1 c h e m1 9 8 0 ，1 8 1 ，118 9 2 2 y a m a g u c h i ，k ；k i k u c h i ，y ；t a k a g i ，t ；e t a l ，m o lb i 0 1 1 9 8 9 ，2 1 0 ，1 2 7 2 3 于同隐；蔡再生；黄伟达高等享渡沈掌萼乞杞1 9 9 6 ，7 仞，8 9 2 4 梅士英等勿缨学掘1 9 8 1 ，2 ，1 0 2 5 a y u b ，z l ；a r a i ，m ；h i r a b a y a s h i ，k p o l y m e r1 9 9 4 ，3 5 ，2 1 9 7 _ 2 2 0 4 2 6 q i a n ，j ；l i u ，y ；y u ，t a n a lb i o c h e m ，1 9 9 6 ，2 3 6 ，2 0 8 2 7 l i u ，y q i a n ，j ；l i u ，h ；，a p p l p o l y m s c i 1 9 9 6 ，6 1 ，6 4 1 2 8 于同隐；李光宪序分于二学报1 9 9 3 ，4 ( 4 ) ，4 1 5 2 9 邵正中；吴冬；李光宪等老敖匆学掼1 9 9 5 ，7 ( 1 ) ，2 3 0 李光宪，于同隐群学通报1 9 8 9 ，2 1 ，1 6 5 6 31 l i ，g ，y u ，tc h i n e s es c lb u l l ，1 9 9 0 ，s s ( 1o ) ，8 5 4 3 2 z h e n g ，s ；l i ，g ；y a o ，w ；y u ，t a p p l i e d 印e 。f r 。例，1 9 8 9 , j 3 ( 7 ) ，1 2 6 9 3 3 s h e n ，1 】 ，；j o h n s o n ，m a ；m a r t i n ，d c m a c r o m o l e c u l e s1 9 9 8 ，3 1 ，8 8 5 7 8 8 6 4 3 4 h e ，s j ；v a l l u z z i ，r ；g i d o ，s pi n t e r n _ b i 0 1 m a c r o m 1 9 9 9 ，2 4 ，1 8 7 1 9 5 3 5k e r k a m ，k ；v i n e y , c ；k a p l a n ，d ；l o m b a r d i ，sn a t u r e1 9 9 1 ，3 4 9 ，5 9 6 _ 5 9 8 3 6 s i r i c h a i s i t ，j ；y o u n g ，r j ；v o u r a t h ，f p o l y m e r2 0 0 0 ，4 1 ，1 2 2 3 1 2 2 7 3 7 雎r e z r i g u e i r o ，j ：v i n e y , c ；l l o r c a ，j ；e l i c e s ，m p o l y m e r 2 0 0 0 ，4 1 ，8 4 3 3 8 4 3 9 3 8 s e i d e l ，a ；l i i v a k ，o ；c a l v e ，s e la 1 ，m a c r o m o l e c u i e s 2 0 0 0 ，3 3 ，7 7 5 7 8 0 3 9 l i i v a k ，o ；b l y e ，a ；s h a h ，n m a c r o m o l e c u l e s1 9 9 8 ，3 1 ，2 9 4 7 2 9 5 1 4 0 i i z u k a e u s - j a p a ns e m i n a r o n p o l y m e rl i q u i dc r y s t a l s ；j o h nw i l e y & s o n s ：n e w 7 复旦大学硬士论文丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 年5 月 y o r k ，1 9 8 5 ；1 7 3 1 8 6 41 w i l l c o x ，rj ；g i d o ，s p ；m u l l e r , wm a c r o m o l e c u l e s1 9 9 6 ，2 9 ，510 6 - 5110 4 2 b i l l m e y e r ，f w t e x t b o o ko f p o l y m e r s c i e n c e ；j o h nw i l e y & s o n s ：n e wy o r k ，1 9 8 4 c h a p 1 8 ( 1 ) 8 复旦大学硕士论文 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 宰j 月 2 1 引言 第二章蚕吐丝过程的成核依赖性机理假定 2 1 1 蚕的吐丝器结构和成丝过程 蚕的吐丝腺体是位于蚕幼体两侧的对管道( t u b e ) 。每个腺体被视为由三 部分组成：后部、中部和前部( 见图2 1 ) 。腺体的壁是由分泌丝素蛋白和丝胶 蛋白的六角细胞构成的上皮组织。位于后部腺体的管道狭小、高度弯曲且末端封 闭，主要的丝蛋白一丝素蛋白就在这里合成。相对比较宽大一点的中部腺体起储 存丝素蛋白作用，另一种丝蛋白一即丝胶蛋白就在这里合成。这两种丝蛋白一 起流人前部腺体但并不混合。前部腺体的管道向吐丝口靠近时逐渐变细( o 0 5 0 3 r n m ) 。两个前部腺体在靠近吐丝口时，合二为一。吐丝口由两个半圆形的压丝 器和一个吐丝孔构成。在压丝器中，液态的丝蛋白转变成固态丝纤维。在由吐丝 器向外吐丝的过程中，粘稠的蛋白溶液变为有强度及光泽的丝纤维，这种丝纤维 不容易再形成溶液。通过蚕的头部向后拉伸产生的力可以使丝素蛋白分子链沿着 拉伸力的方向取向。 9 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究2 0 0 1 年j 月 人们早就知道，不可溶的蚕丝是吐丝器施加于液态蚕丝的机械作用导致的心 。 k a t a o k a 的研究表明 ，这一过程可以分为两个步骤。第一步当丝素蛋白溶液的水 含量从后部腺体中的8 4 降到中部腺体的7 5 时，卷曲的无规线团逐渐变为伸展 链结构，并且所需的剪切力也由于水份的减少而从2 1 0 2 降为1 1 0 。s 。第二 步是由在丝素蛋白流动中最窄的部分( 即吐丝口) 的挤压作用完成的。在这里有 更大的剪切力，进一步进行解缠绕和向d 构象的转变，并且使p 折叠的排列更规整， 促使其结晶，形成完整的丝纤维。在这一过程中，同时从中部腺体中分泌出丝胶， 丝胶流向前部腺体而包裹住丝素蛋白。但丝胶并不结晶，因为液态丝胶的水含量 达8 6 ，所以导致分子链的解缠绕所需的剪切力是丝素蛋白的1 0 4 倍。 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究 2 0 0 1 年5 月 人们早就知道，不可溶的蚕丝是吐丝器施加于液态蚕丝的机械作用导致的心3 。 k a t a o k a 的研究表明跏，这一过程可以分为两个步骤。第一步当丝素蛋白溶液的水 含量从后部腺体中的8 4 降到中部腺体的7 5 h 寸，卷曲的无规线团逐渐变为伸展 链结构，并且所需的剪切力也由于水份的减少而从2 1 0 2 降为1 1 0 。s 。第二 步是由在丝素蛋白流动中最窄的部分( 即吐丝口) 的挤压作用完成的。在这里有 更大的剪切力，进一步进行解缠绕和向d 构象的转变，并且使p 折叠的排列更规整， 促使其结晶，形成完整的丝纤维。在这一过程中，同时从中部腺体中分泌出丝胶， 丝胶流向前部腺体而包裹住丝素蛋白。但丝胶并不结晶，因为液态丝胶的水含量 达8 6 ，所以导致分子链的解缠绕所需的剪切力是丝素蛋白的1 0 4 倍。 2 i 2 蚕吐丝中丝素蛋白的液晶态 有以下几点原因使人们猜测在蚕吐丝过程中是否有液晶态的出现：1 丝素蛋 白的分子量约3 1 0 5 ，但其溶液的粘度和合成高聚物相比要低得多，甚至比小分 子量的聚合物还低“1 ；2 蚕丝或蜘蛛丝的成丝条件十分温和，而合成材料的成丝 条件需要高温、高压、强溶剂以及很高的后牵伸力来确保分子链整齐排列。这种 温和的条件意味着蚕丝或蜘蛛丝中整齐的分子排列是很容易完成的，这正是液晶 态存在的特点之一”1 ；3 即使在腺体中蛋白质的浓度达到近3 0 ，其溶液仍保持很 低的粘度和很好的流动性，而在高浓度下仍保持低粘度正是向列型液晶的特点阳 引。 m a g o s h i 等人用偏振光观察到从家蚕前部腺体流出的液态丝素蛋白呈向列型 液晶。把这种丝腺体在2 0 c 下放置2 0 分钟，再切除前部腺体的端，液态丝由 于水分蒸发而使浓度升高因而不会自动流出来。这种丝素蛋白溶液经偏振光的检 测证明液晶沿着丝腺体取向。作者还观察了其他的野生蚕，如a n t h e r a e ap e r n i 、 a t h e r a e ay a m a m a i 和d i c t y o p l o c aj a p o n i c a 等，都观察到了液晶态的存在。李 光宪 8 3 也用偏光显微镜观察蚕丝中部腺体的丝素蛋白溶液，看到了液晶态的存在， 这说明前部腺体的高剪切力对液晶态的出现并非是必不可少的。对后部腺体的观 察并没有发现液晶态。作者也证明了向列型液晶是沿着吐丝方向排列的，而且双 折射的强度从中部腺体到前部腺体逐渐增加。小角光散射的研究表明中部腺体的 复旦大学硬士论文 丝素蛋白构象转变机理及其分子结构的研究 2 0 0 1 宰，月 粒子尺寸分布很窄，而且是各向异性的，在垂直吐丝方向上的粒子尺寸小于平行 于吐丝方向上的粒子尺寸。这意味着，粒子形状是棒状的而不是球形的。主要有 两种棒状粒子，宽度均为3 9 4a ，长度分别为6 0 2a 和7 0 0a 。v i n e y 9r ”3 研 究了n e p h h ac a r 助e s 蜘蛛主腺体和家蚕丝腺体的分泌物。随着水分的挥发，向 列型的微观结构逐渐形成。作者认为天然丝素蛋白在离开腺体之后，固化为纤维 之前形成液晶相。液晶态的存在起到在整体上决定丝纤维中分子取向的作用 。 g i d o ”1 用透射电镜和原子力显微镜对蚕和蜘蛛腺体的研究认为在纺丝过程中存在 胆甾型液晶的过渡态。这一观察和以前向列型液晶的存在并不矛盾。通过流动方 向上力场的作用这种胆甾型液晶会沿着这种力场规则取向而转变为向列型液晶。 2 1 3 成核依赖性机理简介 最近，一种称为成核依赖性的聚集过程( 也称为聚合过程或结晶过程) 机理 被用来解释许多病毒蛋白的失活过程 1 3 - 1 】。这些研究包括：正常态的病毒蛋白p r p c 转变为致病态蛋白p r p s c ”1 、p 淀粉状a p 蛋白转变为a p 淀粉状纤维6 1 蛋白的过程 以及a 一角蛋白的纤维化1 过程等。这些研究结果表明：蛋白质变性而发生聚集体 增长的过程是由蛋白质构象转变及随后该变性蛋白核的形成所需要的时间决定 的。而且一旦这种核形成，聚集体的增长对于变性前的蛋白浓度来说符合一级反 应动力学。这一过程有如下几个特点：首先，这种聚集过程是一个成核依赖性的 过程，并且这个过程可以由外界添加变性的聚集蛋白而引发；其次，有序聚集的 变性蛋白核的形成是决定速率的一步；第三，聚集态的增长过程是未变性蛋白浓 度的一级反应；第四，对单个链段即非聚集态来说，变性后蛋白的构象不如变性 前的构象稳定，但稳定的聚集蛋白的形成可以补偿构象转变和成核过程中需要的 能量“5 i 。图2 2 是一个典型的蛋白质聚集的成核依赖性随时间增长过程的示意图， 种子的作用在这一过程中至关重要。这些特征和传统的无机分子的结晶过程不同。