（发育生物学专业论文）利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究 花生中自藜芦醇合酶i ( p n r s l ) 的分离及其在植物中的功能研究 中文摘要 植物生物反应器是指通过基因工程途径，将常见的农作物进行大规模种植从而生产具 有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂。具 有经济、高效、安全的特点，其应用能够满足科研及人们日益增长的健康、保健的需求。 白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，简称r e s ) 是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅 是植物遭受胁迫时产生的一种植物抗毒素，还具有抗癌、抗氧化、调节血脂，影响寿命等 多方面有益于人类健康的重要功能。自然的条件下r e s 在植物体内的含量非常低，且用传 统的提取方法获得高丰度的r e s 非常困难。白藜芦醇合酶( r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ，简称r s ) 是r e s 合成途径中最后一个起作用的关键酶，也是唯一必须的合成酶。本实验通过分子生 物学手段，分离得到花生白藜芦醇合酶基因( p n r s l ) 的基因组d n a 和e d n a ，通过构建不 同的表达载体，分别对大肠杆菌和植物进行遗传转化，己经取得了如下进展： 利用r t - p c r 技术从花生根部c d n a 扩增出户m 2 田基因的e d n a ( 登陆号：f m 9 5 5 3 9 3 ) ， 然后将其重组到克隆载体中。通过测序并进行序列比对证明，所获得的p n r s l 基因与登陆 号为a y l 7 0 7 3 4 的序列同源性达到9 5 。其编码的氨基酸序列与登陆号为a a 0 1 1 8 3 7 的氨基 酸序列同源性达到9 6 ，且序列中包含有r s 的特征结构及活力位点，成功获得了花生e p n r s l 基因的c d n a 。r t p c r 分析表明，p n r s l 在花生根中特异表达，并可被紫外诱导表达。 将测序正确的烈碾肼基因与原核表达载体p e t - 2 8 a 融合获得读框正确的表达载体 p e t - 2 8 a - p n r s l 。该载体转化大肠杆菌感受态后，经i p t g 诱导后p n r s l 能够正确表达，融 合蛋白分子量约为4 6 k d ，与预期相符，且最适i p t g 诱导浓度为1 m m o l l ，最佳诱导时间为 3h 。证明实验中成功构建了花生r s 的原核表达载体，优化了r s 高效表达体系，为进一步 深入研究花生r s 的功能打下了基础。 同时，将测序正确的花生r s e d n a 基因分别正向、反向插入到植物表达载体p b l l 2 1 和 修饰过的p c a m b i a l 3 0 1 的c a m v 3 5 s 启动子和n o s 终止子之间，成功获得植物表达载体 p b r s 和p 1 3 0 1 3 5 s r s l 。经农杆菌介导转入烟草，获得了若干转基因植株。利用紫外分光 光度法及h p l c 对部分转基因植株进行了白藜芦醇含量测定，证明白藜芦醇含量较对照植 株均有提高。 本实验在传统育种的基础上，通过基因工程手段，获得了花生r s 基因并将其导入植 山东师范大学硕士学位论文 物中，得到了r e s 含量变化及抗环境恶化能力提高的株系，为进一步将白藜芦醇的天然活 性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高及作物抗逆性育种提供了指 导。它的开发和利用，必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。 关键词：自藜芦醇( r e s ) ；白藜芦醇合酶( r s ) ；花生p n r s l 基因克隆；原核蛋白表达；紫 外线损伤。 分类号：q 7 8 i l 山东师范大学硕士学位论文 i n v e s t i g a t i o no fr e s v e r a t r o lp r e p a r a t i o nb yp l a n tb i o - r e a c t o r - i s o l a t i o no fp e a n u tr e s v e r a t r o ls y s t h e s i se n z y m e1 ( p n r s l ) a n di t s f u n c t i o n a la n a y s i si np l a n t s a b s t r a c t p l a n tb i o - r e a c t o rm e a n st ou s et r a n s g e n i cp l a n t st op r o d u c eb i o l o g i c a la g e n t s ，s u c ha s r e c o m b i n a n tp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n s ，i n d u s t r i a le n z y m e s ，l i p i d sa n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e se t a l ， b yg e n ee n g i n e e r i n gm e t h o dw i t ht h ea d v a n t a g e ss u c ha se n c o n o m y ，h i g he f f i c i e n c ya n ds a f t y i t c o u l dp r o v i d ev i r t u a l l yu n l i m i t e dq u a n t i t i e so fp r o t e i n st om e e tt h ei n c r e a s e dr e q u i r m e n t sf o r b o t hh u m a nh e a l t hc a r ea n dt h eb i o s c i e n c er e s e a r c h r e s v e r a t r o l ( r e s ) i san a t u r a l l yo c c u r r i n gs t i l b e n e ，ak i n do fp o l y p h e n o l i cc o m p o u n d s ， f o u n di nal i m i t e dn u m b e ro fu n r e l a t e dp l a n ts p e c i e s i th a sb e e nc o n s i d e r e da sap h y t o a l e x i ni n p l a n t s ，a n dm a n ys t u d i e sh a v ea l s os h o w n i th a sh e a l t hb e n e f i t ss u c ha sa n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s ， c a n c e rp r e v e n t i o n ，b l o o dt h i n n i n g ，l i f es p a ne x t e n s i o ne ta 1 a st h ec o n t e n to fr e si sl o wi np l a n t ， i t i sv e r yd i f f i c u l t ya n dc o s t l yt ob ee x t r a c t e dp l e n t i f u l l yb yt r a d i t i o n a l l ym e t h o d r e s v e r a t r o l s y n t h a s e ( r s ) i st h ek e ya n dn e c e s s a r ye n z y m ei nr e ss y n t h e s i sp r o c e d u r e ，a n di n v e s t i g a t i o no f r sc o u l ds h e dl i g h to ns t u d yo fr e ss y n t h e s i sp a t h w a y i nt h i sp a p e r , t h er sg e n eo f p e a n u t ( p n r s l ) i sc o l o n e db yt h em e t h o do fm o l e c u l a rb i o l o g y , a n di ti se x p r e s s e db yp r o k a r y o t i cs y s t e ma n dg e n e t i c a l yt r a n s f o r m e di n t op l a n t ss u c ha st o b a c c o t h e f o l l o w i n gp r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d eb yn o w ： ar se d n an a m e dp n r s l ( a c c e s s i o nn o f m 9 5 5 3 9 3 ) w a sc l o n e da c c o r d i n gt or t - p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) p r o t o c o lu s i n gr o o te d n ao fp e a n u ta s t e m p l a t e s e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w e dt h a tt h eh o m o l o g yo f p n r s l c d n as e q u e n c ei su pt o9 5 w i t ht h a to fa y17 0 3 4 7 ，a n dt h es i m i l a r i t yo fi t sa m i n oa c i ds e q u e n c ei su pt o9 6 w i t ht h a to f a a o 118 37 t h ef e a t u r es t r u c t u r ea n da c t i v i t ys i t ea r ea l lp r e s e n ti nt h es e q u e n c e r t - p c r a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tp n r s lw a ss p e c i c a l l ye x p r e s s e di nr o o to fp e a n u t ，a n dc o u l db ei n d u c e d u n d e ru vi r r a d i a t e dc o n d i t i o n s p n r s lw a ss u b - c l o n e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a a f t e rt h e g e n e s e q u e n c ea n dr e a d i n gf r a mw e r ec o n f i r m e dc o r r e c t l yb ys e q u e n c i n g ，t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d n a m e dp e t - 2 8 a - p n r s1w a st h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21 ( d e 3 ) t h ei p t gi n d u c e d i i i 山东师范大学硕士学位论文 e x p r e s s t i o np r o d u c tw a sd e t e r m i n e db ys d s - p a ga n ds h o w e dab a n do fw i t ht h em o l e c u l a r w e i g h ta b o u t4 6k d t h ef u r t h e ra n a l y s i sa l s os h o wt h a tt h ep n r slg e n ec o u l db ee f f i c i e n t l y i n d u c e dw h e n u s i n g1m m o l li p t g t oi n d u c e df o r4ha f t e rt h et r a n s f o r m a n t sw e r ec u l t u r e df o r 3ha t3 7 m e a n t i m e ，t h ee d n ao fp n r s lw a sc o n f r o n e dc o r r e c t l yb ys e q u e n c i n ga n di n t e g r a t e di n t o t h em u l t i p l ec l o n i n gs i t e ( m c s ) o fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s ，s u c ha sp b i121t og e tt h ec o n s t r u c t p b r s ，a n dam o d i f i e dp 13 01v e c t o r , w h i c hh a sc a m v 35sa sp r o m o t e rw i t hn o sa st e r m i n a t o r t og e tt h ec o n s t r u c tp13 01 3 5 s r s1 t h ec o n s t r u c t i o n sw e r et h e nt r a n s f o r m e di n t ol b a 4 4 0 4 ， a n dt h e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n i n t o p l a n t s ，s u c h a st a b a c o ol e a f , w a sc a r r i e do u t b y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dm e t h o d a f t e rt h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eg e n e r a t e da n dv e r i f i c a t e d ， p a r t so ft r a n s g e n i cl i n e sw e r ee x a m i n e db yt h em e t h o do fu vs p e c t r o p h o t o m e t r ya n dh p l ct o a n a l y s i st h ec o n c e n t r a t i o no fr e s c o m p a r e dw i t ht h a to fc o n t r o l ，t h er e sc o n t e n tw e r ea l lr a i s e d m o r eo rl e s si nt h et r a n s g e n i cp l a n t s ，w h i c hs u g g e s t e dt h eh e t e r o l o g o u sg e n ei n t e g r a t e di nt h e g e n o m i cd n a o ft h ep l a n t sa n d p l a yr o l ei nr e ss y s e t h s i s p a t h w a y i ns u m m a r y t h es u c c e s s f u lc l o n i n go ft h ep e a n u tg e n ep n r sla n de f f e c t i v ee x p r e s s i n go fi t i np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e ma n dp l a n tl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o no ni t s b i o l o g i c a lf u n c t i o na n ds h e dl i g h tf o rt h ei m p r o v e m e n to fd i s e a s er e s i s t a n c ea n dh e a l t hc a r i n g q u a l i t yo fc r o p sa n df o o d k e yw o r d s ：r e s v e r a t r o l ( r e s ) ；r e s v e r a t r o ls y n t h a s ee n z y m e ( r s ) ；p n r s ig e n ec l o n e ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；u v - i n d u c e dd a m a g e c a t e g o r y ：q 7 8 i v 山东师范大学硕士学位论文 - 一一 英文缩略表 ：_ = ：= _ _ = ：- ：一：= _ _ _ - - 一_ 一一 一一 英文缩写英文全称中文全称一一。 2 ，4 - d 2 ，4 - d i c h o l o r op h n o x y a c e t i ca c i d 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 6 - b a 6 - b e n z y l a d e n i n e 6 苄基腺嘌呤 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b p b a s e p a i r 碱基对 c a m vc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s 烟草花叶病毒 c e f c e f o t a x i n 头孢霉素 c t a b c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三乙基溴化铵 d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙脂 e b e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g a g i b b e r e l l i ca c i d 赤霉素 g u s 1 3 - g l u c u r o n i d a s e b 葡糖醛酸糖苷酶 h y g h y g r o m y c i nb潮霉素b k a n k a n a m y c i n卡那霉素 l b l u r i a b e r t a n im e d i u m l b 培养基 m s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i am s 培养基 n a a n a p h t h y l a c e t i ca c i d萘乙酸 n p ti i n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i 新霉素磷酸转移酶i i o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e l se l e c t r o p h o r e s i s 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p v p p o l y v i n y l p v r o l l i d o n e聚乙烯吡咯烷酮 r i f r i f a m p i c i n利福平 r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i n 反转录酶聚合酶链式反应 r e a c t i o n s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s - p a g es d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e t r i s 。h c l - e d t ab u f f e r t r i s h c l e d t a 缓冲液 二望! 一t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 。- 一 ：= ：= ： v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏 可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：韩易晶 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权趋可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 辫 易品 签字日期：刊叩年 1 0 ) t 稳定性差一些；而顺式白藜芦醇在避光条件下只有在中性p h 下较稳 定；反式与顺式白藜芦醇在紫外光2 1 0 r i m 处有强吸收，其第二吸收峰分别在3 0 5 3 3 0 h m 和 2 8 0 2 9 5 n m t 3 6 3 7 】处。 p 呛喇一 图1 反式、顺式白藜芦醇的结构。 f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo ft r a n s - r e s v e r a t r o la n dc i s - r e s v e r a t r 0 1 3 白藜芦醇的合成 目前市售的白藜芦醇多是从天然植物中提取的，但是植物提取技术面临成本高，得率 低和植物资源有限等问题。近年来，随着人们对白藜芦醇在心血管和肿瘤等疾病的预防、 人类健康保健等方面功能认识的加深，国内外对白藜芦醇的合成研究有了很大进展。 3 1 化学合成 白藜芦醇的化学合成包括二苯乙烯骨架的形成、顺反异构化和去保护基三步。化学合 成的关键在于二苯乙烯骨架的形成。白藜芦醇的化学合成主要包括五类。 3 1 1w i t t i g 反应 w i t t i g 反应通过w i t t i g - 鳓u ( 磷y l i d e 等) 与醛、酮的羰基发生亲核加成反应，形成烯烃。 此方法简便，但产率较低。目前，已有很多利用w i t t i g 反应合成白藜芦醇的报道【3 8 3 9 1 。 3 1 2w i t t i g 一h o m e r 反应 这是对w i t t i g 反应的一种改进，它是用亚磷酸酯代替三苯基膦所制得的磷y l i d e 与醛酮 反应形成双键。该反应操作简便，条件温和，产率高。w a n g 、t a k a y a ：等都在w i t t i g h o m e r 反应基础上进行了白藜芦醇的合成，只是他们所用的保护碱基不同【加“1 1 。 3 1 3p e r k i n 反应 p e r k i n 反应为有机化学中的经典反应，具体指：芳香醛与酸酐在同酸酐相应的酸的羧 酸钠盐、钾盐( 或叔胺) 的存在下进行缩合反应，生成p 芳丙烯酸类化合物。该反应可以用 于自藜芦醇的合成。 2 0 0 3 年，s o l l a d i 6 等以3 ，5 二异丙氧基苯甲醛和以对异丙氧基苯乙酸通过p e r k i n 反应合成 山东师范大学硕士学位论文 自藜芦醇的过程中，将得到的单一顺式构型产物经脱羧反应后，得到以顺式构型为主的混 合构型的产物，并以异丙基作为羟基保护基团来保持产物的立体构型，进一步对顺式构型 产物异构化得到单一反式构型产物 4 2 】。 3 1 4h e c k 反应 指钯催化的烯烃芳基化和烯基化偶联反应。2 0 0 2 年，g u i s o l 4 3 】等使用了一种新的方法 合成白藜芦醇，即：利用3 ，5 二乙酰氧基苯乙烯与对乙酰氧基碘苯发生h e c k 反应，接着水 解即可，总产率达到了7 0 。e r i k 和m e 埘t t 【删等的专利中也报道了一种利用h e c k 反应合成 白藜芦醇的路线。 h e c k 反应优点在于选择性较高，且去保护容易，但成本高，不适合工业化生产，使用 的催化剂为含钯的络合物，价格昂贵且毒性大。 3 1 5 利用碳负离子与羰基化合物的缩合反应制备白藜芦醇 碳负离子与羰基发生亲核加成反应，所得的羟基消除后可形成双键，这类反应也可用 于白藜芦醇的合成。 a l o n s o 4 5 1 等使3 ，5 二甲氧基苄醇的硅衍生物通过强碱作用形成苄基碳负离子，该碳负 离子再进攻茴香醛的羰基，继而脱水，去甲基，最后得到了反式白藜芦醇，总产率为2 1 ； 该方法在构型选择性上有优势。 3 2 生物合成 白藜芦醇广泛存在于种子植物中，作为芪类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢途径 合成的，其中最关键的调节酶为二苯乙烯合酶，又称芪合酶( s t i l b e n es y n t h a s e ，简称s t s ) ( 图 2 ) t 4 6 1 。芪合酶在植物中多以基因家族存在，目前已克隆的芪合酶可分为两种类型：一种为 白藜芦醇合酶( r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ，简称r s ) ( e c2 3 1 9 5 ) ，又被称为3 ，4 ，5 三羟基二苯乙烯 合酶，主要在花生或葡萄中存在，以4 香豆酰辅酶a 和丙二酰辅酶a 为底物合成白藜芦醇； 另一种为赤松素合成酶( e c2 3 1 。1 4 6 ) ，以肉桂酰辅酶a 和丙二酰辅酶a 为底物合成赤松素 ( p i n o s y l v i n ) t 4 7 1 。研究表明，r s 是白藜芦醇合成代谢途径中最后二个起作用的关键酶，也是 合成途径中唯一必须的合成酶。在葡萄、花生、松树等植物中都具有诱导型芪合酶如r s 的 表达机制，但大多数植物细胞中虽然有酶的底物，但缺少r s 基因，从而缺乏在诱发因子作 用下合成该类物质的能力。 6 山东师范大学硕士学位论文 r 2 h 券轮票p i r 礴y l v i n r 2 h 生松素嚣尔酮p 蝴b r mc h 毡l c o 鼬 r ；o 量 自藜声醇r e s v 豇- a t r o l r = o h 桂皮鬟聋尔醺k 鲫堍胡嘶c h a i o , k i t 跫 苠类化台物懿l b e n o i d s黄醒类化合物f h v o n o i d s 图2 植物芪类次生代谢物生物合成途径( 引自何水林等) 【蛔。 f i g 2t 1 1 em e t a b o l i cp a t h w a yo fs t i l b e n o i da n df l a v o n o i d si np l a n t s ( f r o ms h u i l i nh e 【蛔) 以往对白藜芦醇生物合成研究的主要目标是以植物抗病性的遗传改良为主。不少研究 者将分离到的s t s 基因转入不含有芪合酶基因的植物中，使得植物的抗病性得到增强。例 如：h a i n 等将r 蹉因转入烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 和西红柿亿e s c u l e n t u m ) 中，转基因植物 对葡萄孢属砷矽冽和疫霉属俾砂印j l z 砌d 阳) 病菌的抗性大大提耐4 8 1 。h i p s k i n d l 和p a i v a ( 2 0 0 0 ) 将花生中的雕基因转入苜蓿( m e d i c a g os a t i v a ) ，发现转基因苜蓿大大抑制了茎点霉属 ( p h o m a ) l 船g 菌的生长【4 9 】。此外，许多研究者还将r s 基因分别转入油菜、水稻、大麦、小 麦等作物中，均获得了抗病性增强的转基因植株5 0 , 5 1 】。 随着对白藜芦醇生物活性及药理功能方面认识的加深，其基因工程在植物营养、保健 品质遗传改良方面的应用逐渐受到研究者的广泛关注。利用细胞培养技术，郭斌等【5 2 】通过 h e - n e 激光辐照用根癌农杆菌感染过的葡萄皮脱皮化组织进行诱变处理，可得到较高含量 的白藜芦醇。k o b a y a s h i 等t 5 3 】将该类基因导入猕猴桃，希望能获得对人体健康产生有益影响 的转基因猕猴桃。北大林忠平实验室在葡萄科植物川鄂爬山虎中克隆到了r s 基因，导入烟 草和生菜中，获得了能够产生白藜芦醇的转基因植株。 近年来，随着人们对食品营养及医疗保健需要的提高，结合基因工程手段提高目标植 物中白藜芦醇含量的研究己成为白藜芦醇分子生物学研究的另一个热点。由此可见，生物 合成白藜芦醇的方法比化学合成方法应用前景更为广阔。 山东师范大学硕士学位论文 4 提取、纯化与检测 4 1 提取 鉴于虎杖中白藜芦醇含量较高，最初人们在从天然植物中直接提取白藜芦醇时，多是 以虎杖为材料进行的，通过有机溶剂浸提法进行的。其中魏萌等通过精密称取一定量预先 干燥、粉碎的虎杖粗粉，加入适量8 0 的乙醇溶液搅拌提取上清液，滤渣再用适量8 0 的 乙醇溶液重复以上操作，将两次上清液合并并经真空浓缩制得白藜芦醇粗品，经检测白藜 芦醇的提取率为0 3 8 8 t 5 4 1 。 近年来，随着理论的成熟及体系的完善，可广泛用于白藜芦醇提取的植物材料逐渐增 多，如花生、葡萄、桑椹等，同时，提取技术也更加优化。以往传统的提取方法中，有机 溶剂浸提法所需的时间较长，溶剂用量大，提取效率不高；而加热回流提取时回流所需的 温度较高，易造成活性成分的分解或挥发，对白藜芦醇的提取不利【5 5 】。相对于这些传统的 提取方法，新近出现的用微波和超声波技术辅助提取白藜芦醇的方法具有较多的优点：它 们能够提高提取率，缩短提取时间，缩短生产周期；另外，超临界c 0 2 萃取法中超临界c 0 2 具有性质稳定、无毒、不污染环境等特点，也是常用方法之一【5 6 1 。这些新型的提取方法的 出现，对于白藜芦醇的纯化以及检测技术的发展都有很大的推动作用。 4 2 纯化 白藜芦醇是植物体中的一种次生代谢产物，在植物组织中含量很低，白藜芦醇含量较 高的葡萄皮中，其含量仅为1 0 - 1 0 0v g g ，为了得到高纯度的白藜芦醇产品，必须将提取物 进行分离、纯化【5 7 】。白藜芦醇的纯化目前常采用硅胶柱层析、高速逆流色谱和大孔吸附树 脂纯化，其中，硅胶柱层析价格便宜，提取量大，但操作相对繁琐，得率较低，产物杂质 多例；高速逆流色谱纯化技术具有分离效率高，产品纯度高，没有载体对样品的吸附和污 染，制备量大且溶剂消耗少等特点；大孔吸附树脂分离纯化技术广泛用于纯化黄酮类、生 物碱类等活性成分【5 9 1 。 4 3 检测 目前普遍使用的检测方法有高效液相色谱、毛细管电泳、薄层色谱等技术。高效液相 色谱具有高灵敏度、高效能和高速度的特点，广泛应用于葡萄酒、虎杖、花生、毛脉酸模、 何首乌等样品中白藜芦醇的检测【6 0 】。毛细管电泳是近几年来发展迅速的一种分离检测技 术，与h p l c ( h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c ，h p l c ) 相比，毛细管电泳具有柱效 更高，分离速度更快，几乎不消耗溶剂，样品用量少等特点，它能够同时进行白藜芦醇顺、 r 山东师范大学硕士学位论文 反异构体的分离和检测【6 1 】。另外，白藜芦醇属于二苯乙烯化合物，在葡萄酒、虎杖、花生 等样品中都含有与其结构相似的化合物，因此在进行分析鉴定时，仅使用单一的测定方法 是不能达到特殊要求的精度和灵敏度。栾天罡等应用固相微萃取和甲硅化处理葡萄酒样 品，然后利用g c m s ( g a sc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r , g c m s ) 对样品中的反式白藜芦 醇进行了定性和定量分析 6 2 1 。与固相萃取相比，固相微萃取具有色谱峰分离明显、杂峰干 扰小、峰面积大等特点，而且既可用于气相色谱，也可用于液相色谱【6 2 1 。有文献报道的色 谱联用技术还有薄层荧光扫描法、毛细管电化学检测等【钢。 5 白藜芦醇的生物活性研究 1 9 8 9 年，世界卫生组织( w h o ) 主持的心血管疾病控制系统的调查结果显示的“法国悖 论”( f r e n c hp a r a d o x ) ，引起了人们的兴趣，即：同样以三高食品( 高蛋白、高脂肪、高热量) 为主食的法国人，其冠心病、高血脂等心血管疾病的发病率远远低于其他饮食习惯类似的 国家，原因在于法国人爱喝葡萄酒，葡萄酒内高含量的白藜芦醇是法国人心血管疾病发病 率低的重要原因之一【6 4 1 。 近十几年来，人们从多方面对白藜芦醇的研究结果证实，其具有许多重要的生理活性 及功能，因而引起全世界科学家的高度重视【6 5 1 。 5 1 白藜芦醇生物学活性的分子机制 白藜芦醇作为一类重要的植物次生代谢产物，本身即具有重要的保健作用与多种生物 学功能。随着对其功能研究的深入，人们对其作用的分子机制也有了初步了解。h o w i t z 等 研究发现：植物中多种多酚类小分子物质，如白藜芦醇、漆树黄酮( f i s t e i n ) 、紫铆因( b u t e i n ) 等具有的较强的抗氧化、抗自由基作用，主要是通过激活组蛋白去乙酰化酶( s i r t u i n ，s i l e n t m a t i n gt y p ei n f o r m a t i o nr e g u l a t i o n2h o m o l o g ) 的活性，进而调控下游基因转录及活性来实现 的【钢。s i r t l ( s i r t u i nt y p e1 ) 为s i r t u i n s 家族成员之一，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 w a d + ) 的组蛋白脱乙酰酶，可以许多转录因子，如抑癌基因( t u m o u rs u p p r e s s o rg e n e ，p 5 3 ) 、 叉头转录因子( f o r k h e a db o xc l a s so ，f o x o ) 等，作为底物，具有调控基因沉默、影响寿命长 短及调节代谢过程等功能。哺乳动物中s i r t l 与酵母染色质沉默因子s i r 2 ( s l i e n ti n f o r m a t i o n r e g u l a t o r2 ) 同源【6 7 6 8 1 ，主要通过与一些相关的细胞因子相互作用来发挥其功能。 s i r t i 可通过使抑癌基因p 5 3 特异位点的赖氨酸残基发生去乙酰化作用，从而抑制p 5 3 介导的细胞凋亡，使细胞能够继续分裂生长1 6 9 】。而肿瘤抑制因子d b c l 是s i r t l 的一个负 调控因子，通过抑制s i r t l ，d b c l 促进肿瘤抑制因子p 5 3 发生更多乙酰化反应，并促使 9 山东师范大学硕士学位论文 人类细胞中发生由p 5 3 诱导的自杀【7 0 1 。此外，s i r t l 还能够作用于与b a x 结合的d n a 修 复因子k u 7 0 ，使之不被乙酰化，阻止b a x 转位到线粒体，从而抑制细胞凋亡【7 1 1 。但也有 研究认为s i r t l 可增强p 1 9 a r f p 5 3 信号通路的活性，诱导体内细胞进入复制性凋亡【7 2 】。 因此，s i r t l 是否通过延缓细胞衰老来延长寿命尚有待进一步研究。 通过限制营养摄取来延长寿命被称为限制热量摄取( c a l o r i cr e s t r i c t i o n ，c r ) ，研究认为 该过程也与s i r t u i n s 的酶的活性有关。摄取较少热量会增长寿命，但却易引起许多副作用。 而s i r t l 最近被证明可通过调控与脂肪代谢密切相关的f o x o 家族成员的表达，达到介导 寿命延长的效剁7 3 1 。f o x o 家族成员在与动物的长寿、繁殖、代谢、肿瘤发生及免疫过程 相关的细胞凋亡调控中起重要作用【7 4 , 7 5 】。哺乳动物中f o x o 是s i r t l 的直接和功能性的调 控靶点，s i r t i 通过使f o x 0 3 a 以及其他f o x o 家族成员发生去乙酰化，抑制了其转录调 控活力，起到促存活、抗凋亡的作用【7 6 1 。s i r t l 还可通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受 体( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r sa c t i v a t a e dr e c e p t o r - t ，p p a r 吖) 消耗白色脂肪组织( w h i t e a d i p o s e t i s s u e ，w a t ) ，从而降低体内脂质过氧化积累，达到延长哺乳动物寿命的目叫7 7 1 。 白藜芦醇作为s i r t l 的激活剂，也具备以上生理功能，通过激活s i r t l 调控的不同信 号及代谢途径从而发挥生物学功能( 图3 ) 。 1 0 氯亿应教( o x l 4 a t a v es t t - * n ) 。 代膏应鼓( h i b b o h cg 灯e 嬲) + 基量推卅( c = d o n ( r n l l c t l o n ) 矗庄重( h ts h o c k ) 。 l 白摹 繁外鳗( u x ) 一 l r 一” 图3s i r t i 与f o x o 、p 1 9 、p 5 3 、k u 7 0 、p p a r - t 等相关因子之间的互作关系网络图。 f i g 3i n t e r a c t i o nn e t w o r ko fs i r t lw i t hf o x o ，p 1 9 ，p 5 3 ，k u 7 0a n dp p a r 吖 山东师范大学硕士学位论文 5 2 白藜芦醇的生物学功能 5 2 1 抗肿瘤活性 在白藜芦醇的各项药理作用中，最引人注目的是其在抗肿瘤中的作用。j a n g 等首先发 现白藜芦醇抗癌活性【7 8 1 。进一步研究发现，白藜芦醇可对癌症发生的三个阶段( 起始、增殖、 发生) 进行抑制乃至逆到7 9 1 。近几年研究表明：白藜芦醇通过抑制由m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 或n f r b 途径调节的信号转导来促进癌细胞的自溶【8 0 ，8 l 】。 5 2 2 对心血管系统的作用 白藜芦醇可以通过减少心肌缺血再灌注损伤、舒张血管、抗动脉粥样硬化【8 2 】等发挥心 血管保护作用。生理浓度( o 1m i c r o m ) 的白藜芦醇能够使血管舒张，因而能降低血压和降低 心血管病的风险【8 3 1 。在民间，早已用富含白藜芦醇的中药如虎杖、首乌治疗和预防高血脂症、 动脉硬化。最近的研究也表明，白藜芦醇是一种有效的和有前途的预防心脏功能紊乱的分 罩【蚓 j o 5 2 3 抗氧化、抗自由基作用 近年来发现多酚物质大多具有显著的抗氧化、抗自由基的作用。k i m u r a 等报道，白藜 芦醇在1 3 1 x g m l 时，能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶血和由h 2 0 2 引起的氧化溶血，并 对小鼠心、肝、脑、肾的体内外过氧化脂质的产生有明显抑制作用【8 5 】。多酚能够显著增加 l d l ( 1 0 w d e n s i t yl i p o p r o t e i n s ，l d l ) 的抗氧化活性，其中白藜芦醇的活力最强。研究表明， 白藜芦醇对于防治衰老相关的氧化胁迫具有很好的作用【8 6 1 。由于白藜芦醇有抗氧化作用， 它可能通过调节乙酰胆碱酯酶来改善a d ( a l z h e i m e r t sd i s e a s e ) d , 鼠的认知能力【8 7 1 。 5 2 4 抗菌作用