（野生动植物保护与利用专业论文）人源轮状病毒在胡萝卜中的表达.pdf

f _ | 一 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 i i 训jul9叭00 4眦7，iiii帆y 卜 | 、 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 目录 英文缩写一览表i 中文摘要v a b s t r a c t 。v i 第一章文献综述1 1 1 植物生物反应器的研究进展1 1 1 1 转基因植物疫苗的研究进展l 1 1 2 转基因植物疫苗的作用机理1 1 1 3 转基因植物疫苗的生产原理l 1 1 4 转基因植物生产疫苗的优势2 1 2 轮状病毒疫苗的研究进展3 1 2 1 轮状病毒的结构特征3 1 2 2 轮状病毒的致病机理4 1 2 3 轮状病毒疫苗的研究现状4 1 3 本论文研究的目的与意义7 第二章材料与方法8 2 1 材料8 2 1 1 菌株8 2 1 2 动植物材料8 2 1 3 主要试剂8 2 1 4 引物合成及目的基因的测序8 2 1 5 主要仪器9 2 2 方法9 2 2 1 转基因植株基因组d n a 的提取9 2 2 2 转基因植物的p c r 扩增l0 2 2 3 对各基因p c r 产物进行基因测序1 0 2 2 4 转基因植物r n a 的提取1 0 2 2 5 转基因植株的r t - p c r 11 2 2 6 转基因植株w e s t e r nb l o t 的检测1 1 2 2 7 轮状病毒v p 6 ，v p 7 蛋白在大肠杆菌中的提取及检测1 2 2 2 8 转基因胡萝b 蛋白免疫原性的检测1 2 2 2 9 胡萝b 总蛋白的测定1 3 2 2 1 0 转基因胡萝卜可溶性蛋白免疫小鼠1 3 第三章结果与分析1 3 i i i 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 1p c r 扩增反应l6 3 1 1d n a 检测结果1 6 3 1 2p c r 结果1 6 3 2r t - p c r 检测结果17 3 2 1r n a 的提取结果1 7 3 2 2r n a 中检测d n a 结果18 3 2 3 内参检测结果1 8 3 2 4r t - p c r 结果1 9 3 3w e s t e r nb l o t 分析结果2 0 3 3 1 转v p 7 基因胡萝卜w e s t e r nb l o t 检测结果2 0 3 3 。2 转v p 7 u 基因胡萝卜w e s t e r nb l o t 结果2 1 3 3 3v p 6 ，v p 7 阳性细菌蛋白w e s t e r nb l o t 检测结果2 2 3 4 转基因胡萝卜免疫原性的检测及抗原浓度的检测2 3 3 。4 1 转基因胡萝卜中抗原活性的检测。2 3 3 4 2 转v p 7 基因和v p 7 - u 基因胡萝卜免疫原性的比较2 4 3 4 3 蛋白浓度的测定2 5 3 5e l i s a 方法检测免疫小鼠体内的i g g 变化2 6 3 5 1 注射不同蛋白的小鼠体内的i g g 比较2 6 3 5 2 灌服不同蛋白的小鼠体内的i g g 比较2 8 第四章讨论3 1 4 1 植物生物反应器受体的选择3 l 4 2 外源基因在转基因植物中的表达3 2 4 2 1 造成外源基因表达量低的因素3 1 4 2 2 提高外源基因表达量的方法：3 2 4 3 实验过程讨论3 2 参考文献3 4 致 射3 8 个人简介3 9 导师简介j 4 0 独创性声明4 l i v 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 中文摘要 本实验利用胡萝b 作为生物反应器受体生产轮状病毒外壳蛋白v p 6 ，v p 7 。 通过p c r ，r t - p c r ，w e s t e r nb l o t ，e l i s a 检测整合有轮状病毒外源基因的胡萝 卜植株，即从基因水平到蛋白水平逐步检测。并将蛋白水平上表达有轮状病毒外 壳基因的胡萝卜植株免疫小鼠，免疫方法采用注射免疫和灌胃免疫。 1 提取胡萝bd n a 进行p c r 分析，表明v p 6 ，v p 7 ，v p 7 - u 基因都已整合 到胡萝卜植株基因组中。 2 转基因植株的r t - p c r 分析显示部分植株进行了反转录。 3 对转录水平上有表达的转基因植株进行w e s t e r nb l o t 和e l i s a 分析，结果 表明转基因胡萝b 植株可以有效地表达v p 7 蛋白，并具有一定的免疫原性。 4 利用转v p 7 基因胡萝卜根部蛋白注射免疫小鼠，抗原免疫量为l t t g 左右， 免疫周期为两周，免疫三次后采血并提取小鼠血清进行e l i s a 分析，结果表明 注射阳性胡萝卜植株蛋白的小鼠体内i g g 含量要高于注射阴性胡萝b 植株蛋白 的小鼠及未免疫的小鼠。利用转v p t - u 基因胡萝b 根部蛋白灌胃免疫小鼠，抗 原量为2 0 3 0 t t g ，免疫周期为一周，免疫四次后采血提取血清并进行e l i s a 检测， 结果表明灌服v p 7 - u 基因的胡萝b 植株蛋白的小鼠i g g 含量要高于灌服阴性植 株的小鼠或未灌h i , j , 鼠的i g g 的含量。 5 同时将转v p 7 - u 基因的植株抗原量与v p 7 基因植株抗原量进行比较， e l i s a 分析表明，转v p t - u 基因的植株抗原量要高于v p 7 基因植株抗原量。 关键词：轮状病毒；转基因胡萝卜；v p 6 基因；阡7 基因；抗原；抗体 v m i c et h r o u g h 蛔e c t i o nt o g e t h e rw i t hf r e u n d sa d j u v a n ta n dt h ed o s a g eo fa n t i g e nw a s a b o u tli n g t h ei m m u n i z a t i o np e r i o dw a st w ow e e k sa n dm i c eb l o o dw a sg o tt o e x t r a c ts e r u ma f t e rt h r e et i m e si m m u n i z a t i o n t h ee l i s a a n a l y s i sf o rs e r u ms h o w e d t h a tt h ec o n t e n to fi g gi nt h em i c ei n j e c t i n gp o s i t i v ec a r r o tr o o tp r o t e i nw a sh i g h e r t h a nt h a to ft h em i c ei n j e c t i n gn e g a t i v ec a r r o tr o o tp r o t e i no rn o n t h er o o tp r o t e i no f t r a n s g e n i cc a r r o tw i t h 阡7 - ug e n ew a se x t r a c t e dt oi m m u n em i c et h r o u g hf i l l i n g s t o m a c ha t t e ra n a l y s i s e so fp c r , r t - p c r ，w e s t e r nb l o t ，e l i s a ，a n dt h e a n t i g e n d o s a g ew a s2 0 p g t o3 0 i _ t g t h ei m m u n i z a t i o np e r i o dw a so n ew e e ka n dm i c eb l o o d w a sg o tt oe x t r a c ts e l l l ma f t e rf o u rt i m e si m m u n i z a t i o nf o re l i s aa n a l y s i s t h e e l i s ar e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fi g gi nt h em i c ei n j e c t i n gp o s i t i v ec a r r o tr o o t p r o t e i nw a sh i g h e rt h a nt h a to f t h em i c ei n j e c t i n gn e g a t i v ec a r r o tr o o tp r o t e i no rn o n 5c o m p a r i n gw i t ht h ec a r r o t st r a n s f o r m e d阳7g e n e t h e a n t i g e nc o n t e n ti n c a r r o t st r a n s f o r m e dv p t - u g e n ew a sh i g h e r k e yw o r d s ：r o t a v i r u s ；t r a n s g e n i cc a r r o t ；v p 6g e n e ；阡7g e n e ；v p t - ug e n ea n t i b o d y ； a n t i g e n v i 卜 卜 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 植物生物反应器的研究进展 1 1 1 转基因植物疫苗的研究进展 自1 9 8 3 年第一株转基因植物诞生以来，至今已有2 0 0 多种转基因植物问 世。基因技术所涉及的植物种类包括水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、花生、 番茄、黄瓜、辣椒、马铃薯、西葫芦等多种主要的粮食作物、蔬菜及其他一 些重要的经济作物。目前，有多种转基因植物已经准许商业种植，其经济价 值越来越令人瞩目【1 捌。1 9 9 2 年m a s o n 首先提出了转基因植物疫苗的定义【4 】， 利用分子生物学技术把外源基因导入到植物细胞中，在植物中能够大量表达 外源基因。人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质后，产生对此抗原的免 疫应答【5 】。转基因植物作为生物反应器具有医疗价值，是分子农业的重要组 成部分【每7 】，可以生产疫苗，抗体，药用蛋白的多肽和蛋白质。而且利用转基 因植物作为生物反应器生产口服疫苗成本低廉，安全有效0 1 ，因而已成为 医学和植物研究人员关注的热点和工作重心【l l - 1 4 1 ，可以说植物生物反应器的 时代已经来临。 1 1 2 转基因植物疫苗的作用机理 植物口服疫苗在经过胃内的不利环境时需要保护，否则到达肠内黏膜诱导部 位之前会失去免疫原性。植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可使细胞中的疫苗抗 原通过胃内的不利环境时受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，诱导 黏膜和全身的免疫反应。消化疫苗时，植物抗原由胃肠道及呼吸道等粘膜免疫系 统衬里抗原取样细胞m 细胞将抗原传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递 细胞再将抗原展示给辅助性t 细胞，t 细胞识别外源的蛋白质片段后会刺激b 细胞制造和释放能够中和抗原的抗体。当疾病因子出现时，记忆辅助性t 细胞 一方面刺激胞毒t 细胞攻击受感染细胞，一方面迅速刺激记忆b 细胞分泌中和 抗体，消灭入侵的病原体，并对敌人发动更广泛的攻击【1 5 棚】。不仅如此，转基因 植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织( g a l t ) 产生分泌性的 i g a ( s l g a ) ，在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应，从而 大大提高其免疫有效性【2 0 1 。 1 1 3 转基因植物疫苗的生产原理 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕十学位论文 转基因植物疫苗是借助植物遗传转化载体将抗原基因导入植物中使其表达， 生产出能使人或动物获得特异抗病能力的疫苗。植物的组织( 如叶、花、果实等) 、 细胞、原生质体均能在离体条件下诱导再生成一个完整的植株，而且植物细胞培 养，植株种植情况简单易成活。目前大体上有两种表达系统，即稳定表达系统和 暂态表达系统。 稳定表达系统是将外源基因与植物基因组整合的稳定表达，主要由农杆菌介 导，基因枪法将外源基因直接导入，将此d n a 序列的一个或多个拷贝整合到植 物的核基因组上，植物细胞在合适的条件下可以长成新的植株，植株在生长过程 中会表达外源基因并能够将这种性状传递给子代，进而培育出能够生产某种疫苗 的品系或品种。整合的位点是随机的，但是活性转录区通常是整合的热点【2 l 】。 除此之外还有聚乙二醇介导法、电穿孔法、显微注射法、花粉管通道法、转座子 介导法和脂质体介导法等。 暂态表达系统是将目的基因插入病毒基因组启动子之下或病毒外壳蛋白基 因中，形成重组病毒，然后接种到植物的叶片上，重组病毒能在宿主植物中迅速 增值，外源基因随病毒的复制而高效表达。其中，抗原基因融合于病毒外壳蛋白 的表达方式更具有免疫原性【2 2 1 。目前用作载体的病毒主要是烟草花叶病毒( t m v ) 和豇豆花叶病毒( c p m v ) 。 1 1 4 转基因植物生产疫苗的优势 利用转基因植物生产口服疫苗有很多的优点【2 3 之7 】。k u s n a d i 等人曾经计算过， 生产同一种药用蛋白，利用转基因植物作为生物反应器的成本可以比用大肠杆菌 作生物反应器降低1 0 5 0 倍【2 8 】。 ( 1 ) ：疫苗可以直接储存在植物种子和果实中，无需冷链系统设备进行储藏、 运输，可以大规模生产抗原蛋白，易于长距离运输和推广。据估计，植物表达系 统生产外源蛋白的成本是微生物发酵系统的2 1 0 ，相当于动物细胞培养系统的 0 1 1 2 9 。( 2 ) ：利用动物病毒作为载体导入抗原是动物细胞生产基n t 程疫苗的 常用方法，因而对人类有潜在的危险，转基因生产的疫苗不会感染人体，更具安 全性。( 3 ) ：目前医药生产常用的微生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行有 效的翻译后加工，而植物的全能性及其完整的真核细胞表达系统，如糖基化、磷 酸化、酰胺化等正确的加工，使植物表达的抗原蛋白具有免疫活性。( 4 ) ：植物 2 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕+ 学位论文 口服疫苗的出现，免除了以往亚单位疫苗必须打针带来的经济负担和肌肉疼痛。 ( 5 ) ：植物细胞壁具有天然生物胶囊的作用，可使细胞内的抗原蛋白抵抗消化道 的酸性环境和各种酶的降解，使表达的抗原在小肠内释放，实现其免疫功能。 科学家们已经利用稳定表达生产了多种病毒抗原和细菌抗原。包括产肠毒素 型大肠杆菌肠毒素b 亚基( m ) 【3 0 3 2 1 、霍乱毒素bi l 7 基( c t b ) 3 3 3 4 】、诺瓦克病毒 外壳蛋白q c p ) 【3 5 1 、呼吸道合胞体病毒( r s v ) f 蛋白【3 6 1 、麻疹病毒血细胞凝集素 【3 7 1 、牛瘟病毒血细胞凝集素蛋白【3 引、h i v - 1 t a t 蛋白【3 9 1 、轮状病毒n s p 4 f 4 0 4 1 1 、 v p 4 1 4 2 - 4 3 】、v p 6 4 4 4 5 1 、v p 7 【4 q 蛋白等相继在植物中表达。 1 2 轮状病毒疫苗的研究进展 1 9 7 3 年，澳大利亚的r b i s h o p 等首次在患急性胃肠炎的幼儿粪便中发现轮 状病毒。由于在电子显微镜下，病毒呈车轮状，因此将其命名为轮状病毒【4 1 7 】( r v ) 。 轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属【4 8 j ，是引起人和动物肠胃炎的一种病原 微生物，轻者表现为自限性的轻度水样便，重者可出现发热、呕吐、恶心、腹泻， 进而导致脱水，电解质紊乱和酸中毒，使新陈代谢失去平衡甚至死亡。据统计， 世界上每年有1 亿4 千万以上的儿童患轮状病毒腹泻，其中8 7 万儿童死亡【4 9 】， 无论是在发达国家还是在发展中国家，3 岁前的婴儿约有9 0 都会受轮状病毒感 染。目前，治疗轮状病毒的特效药物尚未出现，因此预防显得尤为重要。另外， 流行病学的研究表明自然感染r v 后可降低随后感染的发病率和严重程度【5 0 l 。因 此，世界卫生组织将轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，指出疫苗预 防接种是遏制轮状病毒腹泻唯一有效的手段。 1 2 1 轮状病毒的结构特征 轮状病毒无囊膜，呈2 0 面体，由内外3 层同心衣壳蛋白组成。电子显微镜观 察显示出一个6 0 - - 一8 0 n m 带有辐射状突起的车轮。病毒基因组包含1 1 个双链r n a 基因片段，多数片段包含一个长的o r f ( 除基因1 1 片段外) 。人类和动物病毒株多 数属于a 组，b 组和c 组在人和动物身上也有，d 、e 和f 组仅在动物上有。 v p 7 蛋白是一种糖蛋白，位于成熟病毒的最外层，占病毒蛋白的3 0 与病毒 毒力及免疫保护性有关，可刺激机体产生保护性中和抗体，是主要的特异性中和 抗原，具有血清型特异性，由7 ，8 或9 基因片段编码而成，但会因不同毒株而不 同。v p 6 蛋白由第6 基因片段编码而成，位于中层衣壳的表面，是亚组特异性蛋 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 白，占轮状病毒颗粒的5 1 ，具有很强的免疫原性，能诱导机体在血清中产生i g a 和i g g 抗体，在粘膜组织的分泌液中产生s l g a 抗体，外层衣壳的脱落可激活转录 酶或r n a 聚合酶，转录酶作用于每个片段使其产生对应的m r n a5 端帽子结构， 但不包括3 端多聚核苷酸尾。v p 4 也位于成熟病毒的最外层，形成突起，由第4 基因片段编码，为一种非糖蛋白，对蛋白水解酶敏感，可被胰蛋白酶水解成v p 5 和v p 8 两个亚单位，从而导致病毒感染力的增强。v p 4 也可刺激机体产生中和抗 体，具有血清型特异性，但与v p 7 蛋白刺激产生的中和抗体是相对独立的【5 l 】。 v p 2 是内层衣壳蛋白，直径为51 n m ，厚度约为3 5 n m ，含有非活化的转录酶，由 第2 基因片段编码。 1 2 2 轮状病毒的致病机理 轮状病毒主要感染宿主小肠绒毛中部或者尖端的成熟黏膜上皮细胞【5 2 1 ，被 感染的细胞可观察到内质网池肿胀，微绒毛变短稀少，上皮细胞死亡脱落，绒毛 变短，造成吸收不良而引起腹泻【5 3 】，脱落的绒毛上皮细胞被补偿性的增生的微 囊细胞所替代，分泌过多者进一步加剧了腹泻的严重程度5 4 1 。 受轮状病毒感染的m a l 0 4 细胞表明，轮状病毒在代谢过程中会引起n a + ，k + ， c a 抖等电解质的改变5 5 6 1 ，n s p 4 中疏水胞质结构域中含有一段2 2 个氨基酸的多 肽，能够引起c a r 的释放，进而促进c l 。的分泌，最终导致腹泻的发生【5 7 羽l 。 1 2 3 轮状病毒疫苗的研究现状 自轮状病毒体外培养成功后，轮状病毒疫苗的研制进入了新的阶段，几种临 床可用的疫苗已经研制成功，还有一批疫苗的研究正处于动物模型试验阶段，但 其潜在价值不可估量。 1 2 3 1 单价减毒动物轮状病毒疫苗 轮状病毒疫苗的研究始于上个世纪7 0 年代，单价减毒动物轮状病毒疫苗属于 第一代轮状病毒疫苗，包括w i s t e r - m e n e u x 牛株疫苗( w c 3 ) 、恒河猴r v 疫苗 ( m m v - 1 8 0 0 6 ) 等，但由于疫苗株型单一，在婴幼儿接种中诱发的主要是同型免疫 保护作用，保护性非常有限。 1 2 3 2 多价重配疫苗 从人的四种血清型的轮状病毒中选择编码保护性抗原的基因，与对人无害的 动物病毒基因组杂交成人动物重配疫苗，口服疫苗以后，病毒可以在消化道中 4 甘肃农业大学2 0 1 0 屑硕士学位论文 进行复制，以达到抵抗野生病毒侵袭的目的。如四价恒河猴人重配株r v 疫苗 ( r o t a s h i e l d ) ，对g 1 g 44 个血清型引起的r v 腹泻均有保护作用，在美国、芬兰、 委内瑞拉的临床实验中显示了很好的免疫原性【5 9 1 。对r v 腹泻的保护效果为 4 8 6 8 ，对重型r v 腹泻的保护效果为7 5 1 0 0 ，效果可持续两年。而这4 种 血清型引起的胃肠炎占1 9 7 3 2 0 0 3 年间所有r v 感染的9 0 。因此，疫苗效力大大 增强，具有比较好的免疫原性和免疫保护作用。该疫苗商品名定为r o t a s h i e l d ， 1 9 9 8 经美国食品药品监督管理局批准上市，但接种后约有1 1 2 0 0 0 接种婴儿发生 肠套叠，上市9 个月后退出市场。经多年的研究，默克公司和g s k 公司分别研制 出t r o t a t e q 和r o t a r i x 两种新型r v 重配减毒活疫苗，经过广泛的临床试验，证明 这两种疫苗是安全有效的。 1 2 3 3 亚单位疫苗 轮状病毒的空壳是天然的亚单位疫苗，是轮状病毒感染宿主细胞后产生的不 含基因组r n a 的结构蛋白，形状类似轮状病毒的颗粒。大多数轮状病毒亚单位 疫苗的研究是通过基因重组技术制备轮状病毒抗原的相关蛋白。亚单位疫苗可以 被抗原决定基，配基或多肽等修饰以提高其免疫原性，保护力及机体吸附能力 6 0 - 6 1 1 。但在粘膜递呈反应中不能复制，可通过加入粘膜免疫佐剂解决该问题【6 2 1 。 e s t e s 等研制r v 亚单位疫苗，采用分别表达牛r vp f 株的v p 2 ，猴r v s a l l 株 的v p 4 ，v p 6 ，v p 7 的重组杆状病毒，同时感染昆虫细胞，表达产物组装成病毒 样颗粒( v l p ) ，用v p 2 4 6 7 或v p 2 6 7v l p 免疫小鼠和家兔，可产生高滴度的病 毒特异的血清抗体和肠i 为i g g ，能保护同型r v 的攻击。 1 2 3 4 基因工程疫苗 轮状病毒严格在上皮细胞内复制，可以用大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、腺病 毒、杆状系统病毒等作为表达轮状病毒目的基因的载体。轮状病毒的主要中和抗 原v p 4 ，v p 7 及亚组蛋白v p 6 基因已克隆并实现了抗原在病毒体外的表达，为基 因工程疫苗的研究提供了技术和物质基础 6 3 】。 1 2 3 5d n a 疫苗和微囊化疫苗 g r e e n b e r g d 、组从1 9 9 6 年开始研究轮状病毒d n a 疫苗，先后制备了v p 4 、v p 6 、 v p 7 的d n a 疫苗，通过基因枪注射和口服免疫小鼠，用鼠轮状病毒e d i m 攻毒， 结果表明免疫的小鼠获得了保护【“击引。由于d n a 疫苗中注入的d n a 是在细胞内 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕：学位论文 表达，不仅可以通过表达产物激发免疫应答，产生体液免疫，而且可以诱导细胞 免疫，调动整个免疫系统。具有亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗的有效性，与 传统的蛋白质疫苗相比较有很大的优势。孙茂盛等( 1 9 9 8 ) 以r v s a l l 株d s r n a 为模 板，获得v p 4 全基因并进行修饰，以p c m v 2 为载体，构建成表达质粒，裸露质 粒d n a 在辅佐剂的条件下经肌肉注射豚鼠，质粒可以在豚鼠体内转录、表达目 的蛋白，诱导机体产生特异性免疫应答，产生对亲本r v 具有一定中和能力的抗 体。 微囊化d n a 疫苗综合了d n a 疫苗和和微囊化疫苗的优点。c h e n 等将微囊化 技术应用于r vd n a 疫苗的研究，将r vv p 6d n a 疫苗微囊化并口服免疫小鼠， 四周后小鼠血清抗体滴度升高，六周后达到高峰，肠道s l g a 明显升高，受同种r v 攻击后大便排毒量明显减少，对小鼠显示出了一定的保护性。微囊化d n a 疫苗 为d n a 疫苗的给药方式开创了一条新的途径【碣1 。 1 2 3 6 植物可食疫苗 目前转基因植物疫苗的研究主要集中在烟草、马铃薯、拟南芥等模式植物， 但烟草含有生物碱，食用后有害人体健康。马铃薯不能生吃，烹饪后会造成重组 蛋白的变性，致使疫苗失活。因此利用可食性植株生产疫苗是近年来研究的热点， 如利用特异启动子在番茄、香蕉、胡萝卜中表达疫苗，通过食用果实达到防病的 目的。m a t s u m u r a 6 9 j 等( 2 0 0 2 ) 在马铃薯植株中表达了a 组牛轮状病毒( g a r ) 阡6 基 因，用转基因马铃薯块茎抽提物和弗氏免疫佐剂同时经腹膜免疫小鼠，在小鼠血 清中检测到g a r 抗体。y ua n dl a n g r i d e 9 1 4 5 1 ( 2 0 0 3 ) 在马铃薯植株中表达了鼠的轮状 病毒v p 6 基因，在马铃薯叶片和块茎中，重组v p 6 蛋白的表达量占可溶性蛋白的 0 0 1 。w h 【4 6 】等( 2 0 0 3 ) 在转基因马铃薯中表达了人轮状病毒v p 7 基因，在马铃薯 叶片中，重组v p 7 蛋白的表达量占植物可溶性蛋白的0 0 1 8 0 3 8 4 。用转基因马 铃薯块茎( 含v p 7 蛋白4 2 p g ) 和免疫佐齐u ( c t l o p g o rc t b l o p g ) 同时口服免疫小鼠， 在小鼠体内检测到抗v p 7 的抗体，最高血清i g g 滴度为1 6 0 0 ，最高粘膜s i g a 滴度 为1 1 0 0 0 。植物基因工程疫苗经历了2 0 多年的发展，已经到了相对成熟的阶段， 也从初期对抗原蛋白是否表达的期望到了抗原蛋白表达量的多少，免疫活性的维 持及对动物免疫活性高低的研究。 究的目的与意义 6 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 胡萝b 是种两年生草本植物，伞形科胡萝卜属。其营养丰富，被称为健康 的功能食品。胡萝卜含有大量的p 胡萝卜素，含量比其它蔬菜高出3 0 4 0 倍，经 常食用胡萝b 可促进生长发育、维持正常视力、防治夜盲症、干眼病、上呼吸道 疾病，同时保证上皮组织的健康、防治多种类型上皮肿瘤的发生和发展，提高人 体的免疫力。而且胡萝b 在全球都可种植，可生吃也可加工成饮品，含有丰富的 蔗糖、淀粉、葡萄糖、脂肪、纤维素、多种维生素以及多种矿质元素，同时直根 中含有1 的蛋白，是一种理想的生物反应器【_ 7 0 j 。 轮状病毒对人类危害严重，v p 6 ，v p 7 基因属于轮状病毒外壳蛋白基因，与 病毒毒力及免疫保护性有关。世界上每年感染轮状病毒的儿童可达l 亿4 千万以 上，其中儿童死亡人数达到8 7 万，世界卫生组织将轮状病毒疫苗列为最优先发 展的疫苗项目之一，并指出疫苗预防接种是遏制轮状病毒腹泻唯一有效的手段。 本实验以胡萝b 为受体，通过农杆菌介导法转入轮状病毒外壳蛋白基因，并从基 因水平到蛋白水平进行检测，确定目的基因在蛋白水平上的表达。同时采取皮下 注射和灌胃两种免疫方式，用表达有v p 7 抗原的胡萝卜蛋白免疫小鼠，并检测 小鼠血清中i g g 含量同时分析其变化。期望通过食用转人源轮状病毒胡萝b 而达 到预防腹泻的目的。 7 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌株 p b l l 2 1 s e v p 7 构建图：其启动子为3 5 s 启动子，v p 7 基因前有一段烟草s p 。 n d e i h i i l d i i ie c o r i p b l l 2 1 1 n v i ipv p 6 构建图：其启动子为胡萝卜直根特异启动子i n v i i ，p 为导 肽。 n c o i h i n d l i ie c o r i 2 1 2 动植物材料 胡萝卜材料：黑田五寸种子( 购自中国农业科学院华耐种子公司) ，转基因 萝卜种子( 北京市农科院蔬菜研究中心) ，b a l b c 小鼠( 购自中国农科院动物 中心) 。 2 1 3 主要试剂 p c r 试剂( 购白天根生化和全式金) ，r t - p c r 试剂盒( 购p r o m e g a 和全式 金公司) ，蛋白m a r k e r ( 购自经科宏达公司和天根生化) ，弗氏佐剂( 购自s i g m a 公司) ，v p 7 ，v p 6 兔抗血清( 中科院微生物所赠送) ，羊抗g i g g - h r p ( 购自博 士德公司) ，羊抗兔i g g - h r p ( 购自中杉金桥公司) ，可溶性t m b ( 购自天根生化) ， b s a ( 购自s i g m a 公司) ，d a b ( 购自天根生化) 2 1 4 引物合成及目的基因的测序 引物合成及目的基因的测序：奥科公司 2 1 5 主要仪器 8 2 2 方法 2 2 1 转基因植株基因组d n a 的提取 c t a b 法提取胡萝卜植株基因组d n a ( 1 ) 采集o 1 克新鲜胡萝卜叶片放在1 5 m l 灭菌离心管中。 ( 2 ) 叶片组织的破碎。将灭菌小钢珠分别加入1 5 m l 灭菌离心管中，然后加入 5 0 0 9 l 预热的2 x c t a b 缓冲液( 含0 1 巯基乙醇) ，组织破碎仪上破碎，3 0 0 r p m ， 1 5 m i n 。 ( 3 ) 叶片组织的孵育振荡。恒温振荡器上振荡，6 5 。c ，3 0 0 r p m ，4 5 m i n 。 ( 4 ) 配平离心。1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，1 5 m i n 离心，取上清3 0 0 - 4 0 0 9 l 。 ( 5 ) 抽提。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，轻轻混匀，静置1 0 m i n 。 ( 6 ) 配平离心。1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，1 5 m i n 离心，取上清。 ( 7 ) 沉淀。加入2 倍体积的无水乙醇，上下翻转7 8 次( 更轻微) ，- 2 0 。c 静置l h 。 ( 8 ) 配平离心。1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，1 0 m i n 离心，弃上清。 ( 9 ) 洗涤。加入5 0 0 1 t l7 0 的乙醇，翻转两下，静置5 m i n 后1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，5 m i n 离心。 ( 1 0 ) 重复步骤9 。 9 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕七学位论文 ( 1 1 ) d n a 的溶解。弃上清，在超净工作台上吹干后，根据d n a 的量加2 0 - 3 0 p l d d h 2 0 ，溶解后置2 0 。c 冰箱保存。 2 2 2 转基因植物的p c r 扩增 以阳性细菌质粒为阳性对照，黑田五寸基因组d n a 为阴性对照，利用各基 因的特异引物对转基因植株基因组d n a 进行p c r 扩增反应。 v p 6 基因引物： 上游引物f5 a a t t c c a t g g a g g t t c t g l j a c t c a r t g t c - 3 下游引物r5 aa t t g a ( 蛇t c g g c a g t l a c t c t a c g t a g c g 一3 v p 7 基因引物： 上游引物f5 a g g a t c a a t g g a c a c t g - 3 下游引物r5 a r t ag a g c c a c c a a c l v r g 3 v p 7 - u 基因引物： 上游引物 f5 a g g a t c l a t g g a c a c t g 3 下游引物 r5 a 订a g a t c c a c c a a c t t g 3 反应体系： 体系材料体积 d d h 2 0 10 * p c rb u f f e r d n t p ( 2 5 m m ) p r i m e rf ( 1 0 l s m ) p r i m e rr ( 1 0 1 a m ) t a gp o l y m e r a s e ( 2 5u 仙1 ) d n a s a m p l e 1 8 9 l 2 5 1 1 o “l o 5 “l o 5 p l 0 8 x l 0 8 “l v p 7 基因，v p 6 基因和v p 7 - u 基因p c r 扩增条件： 9 4 ( 2 预变性5 m i n ，然后进入以下循环： 9 4 c 变性5 0 s 5 0 复性6 0 s 1 0 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 7 2 延伸l m i n 3 5 个循环后，7 2 延伸1 0 m i n 。 阳7 和v p 7 - u 基因预期的p c r 产物长度为6 2 1 b p ，v p 6 基因预期产物长度 10 7 6 b p 。扩增产物用1 0 的琼脂糖凝胶电泳检测。 2 2 3 对各基因p c r 产物进行基因测序，并利用d n a m a n 比对软件对测出的基 因进行比对分析。 2 2 4 转基因植物r n a 的提取 ( 1 ) 将0 5 9 植物叶片在液氮中磨成粉末后，加入l m lt r i z o l 混匀，注意样品总体 积不能超过所用t r i z o l 体积的10 ，室温放置5 m i n 。 ( 2 ) 1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，1 5 m i n 离心，取上清。 ( 3 ) 加入0 2 m l 的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管1 5 s 。 ( 4 ) 1 3 0 0 0 r p m ，4 c ，1 5 r a i n 离心，取上清。 ( 5 ) 加0 5 m l 异丙醇，室温放置1 0 m i n ，1 3 0 0 0 r p m ，4 。c ，1 0 m i n 离心，弃上清。 ( 6 ) 加入0 5 m l7 5 7 , 醇，涡旋混匀，4 。c ，7 5 0 0 9 离心5 m i n ，小心弃去上清液。 ( 7 ) 室温或真空干燥5 1 0 m i n ，然后溶于3 0 9 ld e p c 水中并于7 0 c 保存。 2 2 5 转基因植株的r t - p c r 利用p r o m e g a 公司生产的反转录试剂盒进行反转录。 2 2 6 转基因植株w e s t e r nb l o t 的检测 2 2 6 1 转基因植株蛋白的提取 ( 1 ) 取材：取新鲜的转基因胡萝卜根0 4 9 ，无菌水洗净后擦干。 ( 2 ) 研磨：液氮冷冻后研磨成粉末，转移到无菌离心管中。 ( 3 ) 溶解样品：, 口a 2 0 0 9 l 蛋白提取缓冲液，置冰上l h 左右，使样品充分溶解。 ( 4 ) 离心取上清：4 c ，1 2 0 0 0 r p m ，2 0 r a i n 离心。取上清液备用。 2 2 6 2s d s p a g e 和蛋白质的电转印 ( 1 ) s d s p a g e 的配置：8 的s d s p a g e 分离胶和5 的s d s p a g e 浓缩胶。 ( 2 ) 胡萝卜蛋白样品的制备：取一定体积的上清液与载样缓冲液( 1 0 0 n u n o l l t r i s h c l p h6 8 ) ，4 s d s ，0 2 溴酚蓝，2 0 甘油，2 0 0 m m o l ld t t ) 等体积混 合，9 5 ，8 m i n 待用。 ( 3 ) 胡萝卜蛋白的垂直电泳：恒定电流2 0 m a ，2 h 。 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕十学位论文 ( 4 ) 转膜：提前将滤纸和醋酸纤维素膜( n c 膜) 浸泡在转膜缓冲液中，保证其完 全浸湿。在伯乐电转仪电压6 0 v 的条件下，冰上转膜3 h 。 ( 5 ) 封闭：将n c 膜放在新配制的3 b s a ( t b s t 稀释) 封闭液中，4 c 过夜。 ( 6 ) 特异性免疫反应：将封闭液倒出后，t b s t 洗涤三次，每次8 m i n ，加入兔抗 轮状病毒v p 7 血清( 1 ：4 0 0 t b s t 稀释) 孵育，3 7 ，2 h ，轻摇。将膜取出后置 t b s t 溶液中，洗涤三次，每次8 m i n ，加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔孵育， 3 7 ，2 h ，轻摇。t b s t 洗涤三次，每次8 m i n 。 ( 7 ) 显色：室温下用d a b 显色液进行显色。 2 2 7 轮状病毒v p 6 ，v p 7 蛋白在大肠杆菌中的提取及检测 2 2 7 1 轮状病毒v p 6 ，v p 7 蛋白在大肠杆菌中的提取 ( 1 ) 接种：随机挑取构建好并转入大肠杆菌中的阳性单克隆，接种至u 6 0 m l 含有与 固体培养基中抗生素浓度相同的新鲜l b 培养基中。 ( 2 ) 培养：3 7 c ，培养6 h ，至o d 6 0 0 = 0 6 。 ( 3 ) 诱导：加入i p t g 并做终浓度为0 1 m m o l l ，0 3 m m o l l ，o 5 m m o l l ，0 8 m m o l l ， 1 o m m o l l 的五个梯度，诱导5 h 。 ( 4 ) 收集并悬浮菌体：5 0 0 0 r p m ，4 c ，1 5 m i n 离心，弃上清收集菌体。加入l m l1 * p b s 悬浮菌体。 ( 5 ) 裂解菌体：8 0 。( 2 至常温反复冻融裂解菌体，每次1 h ，连续三次。1 0 0 0 0 r p m ， 4 ，3 0 m i n 离心，取上清备用。 2 2 7 2 轮状病毒v p 6 ，v p 7 蛋白s d s p a g e 和蛋白质的电转印 利用s d s p a g e 和v p 6 ，v p 7 蛋白的电转印( 步骤同2 2 6 2 ) 2 2 8 转基因胡萝卜蛋白免疫原性的检测 ( 1 ) 抗原包被：以细菌中提取的轮状病毒v p 7 蛋白为阳性对照并按一定倍比稀释 ( 1 4 0 0 ，1 8 0 0 ，1 1 6 0 0 ，1 3 2 0 0 ，1 6 4 0 0 ，1 1 2 8 0 0 ) ，同时按1 5 0 比例稀释样 品蛋白，将稀释好的抗原溶液加入至9 6 孔板中，每孔5 0 1 t l ，每个样品三个重复， 置4 c 冰箱过夜或3 7 孵育2 h 。 ( 2 ) 封闭：p b s t 溶液( p b s ，0 0 5 t w e e n 一2 0 ) 洗涤9 6 孔板三次，加入3 b s a ， 每孔1 0 0 p 1 ，3 7 c 孵育1 h 。 ( 3 ) 特异性免疫反应：p b s t 溶液洗涤9 6 孔板三次，加入一抗兔抗轮状病毒，7 1 2 ( 1 ) 样品制备：选择e l i s a 数值高同时w e s t e r nb l o t 阳性的胡萝卜植株，提取胡 萝卜根部蛋白。步骤同2 2 6 1 。 ( 2 ) 可溶性蛋白浓度的测定：利用b c a 试剂盒测定胡萝卜可溶性总蛋白浓度。 步骤同2 2 9 。 ( 3 ) 乳化：将提取的胡萝卜蛋白与弗氏佐剂等体积混合，置冰上，用注射器反复 推拉，使水油充分混合。 ( 4 ) 皮下注射：将小鼠分为未注射，注射转单基因植株蛋白，注射转双基因植株 蛋白，注射阴性植株蛋白四组，每组三只。采用皮下多点注射。