（森林保护学专业论文）一毛壳菌菌株的分离鉴定及生物防治潜力研究.pdf

论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 力彩年衫鸨加 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签 导师签 刎善b 璎 一z 年z f 7 日 凹川农业大学2 0 0 6 届硕士研究生余应矬学位论文：一毛壳菌苗株的分离拄定发生物防治潜力研究 中文摘要 毛壳菌( c h a e t o m i u ms p p ) 是国内外广泛使用的生物防治菌，对植物病原菌具有很好 的防治效果，但它和其它生物防治菌一样对化学杀菌剂敏感，无法和化学杀菌剂在植物 病害综合防治体系中共同发挥作用。本文对从撑绿杂交竹上筛选出的一株毛壳菌进行了 菌种鉴定，生物学特性，杀菌剂毒力和拮抗能力等系列研究，为进一步提高该毛壳菌的 生物防治效果，构建既对杀菌剂抗性稳定，又能显著抑制植物病原真菌的毛壳菌基因工 程菌株提供依据。推动生物防治与化学防治的结合，实现综合防治思想，促进高效生态 林业的发展。主要研究结果如下： 从杂交竹上分离筛选，对该菌进行培养观察，主要依据该菌的菌落、子囊壳、附属 丝、子囊及子囊孢子的形态特征和量度，进行文献检索，与目前查阅范围内的近2 0 种分 析比较，结果该菌在形态特征或量度上均存在差异，且该菌在国内竹类植物内生菌分离 上还未曾见有报道，故暂定为竹毛壳菌( c h a e t o m i u ms p ) 。 该竹毛壳菌在杂交竹上带菌率存在季节、组织部位与年龄差异。以夏、秋季出现频 率较高，秋季为最高，冬季最低：1 年生幼嫩杂交竹竹秆组织上出现的频率明显低于多 年生杂交竹组织；在沿竹径向半径上依次取组织分离结果该菌带菌率从外部到内部依次 减少。 不同培养基培养表明竹秆煎汁对该毛壳菌生长、产孢速度及产孢量均有促进作用； 同等条件下含蔗糖的培养基对菌的生长和繁殖都优于含葡萄糖的培养基。在5 4 0 的 不同温度下培养，结果表明该毛壳菌生长适宜生长温度为2 0 3 0 。c ，最适宜为2 5 。c 左右， 低于5 或超过4 0 。c 生长不好，甚至停止生长。在p h 值为5 1 1 的p s a 培养基上培养，结果 表明该毛壳菌生长对p h 值的适宜范围较大，影响不显著。在通气性和光照处理2 6 恒温 培养，结果表明该内生毛壳菌对光照敏感，全光照和全黑暗条件下生长差异不大，半光 照半黑暗下较差，而对通气状况要求不严格。 杀菌剂毒力测定表明该毛壳菌在不含杀菌剂的p s a 培养基上能正常生长，但当p s a 培养基中含0 1 0 ，o 2 5 ，0 5 0 ，1 0 0 ，2 o o m g l 不同浓度的6 种杀菌剂时，毛壳菌均受到 不同程度的抑制。毛壳菌对甲基托布津和代森锰锌非常敏感，有效抑制中浓度e c 。分别 为1 2 5 7 2 m g l 和1 9 1 3 8 m g l ，而地菌灵则效果最差，有效抑制中浓度e c 。为 7 7 9 4 7 ll m g l ，敏感程度依次为甲基托布津 代森锰锌 多菌灵 三环唑 百菌克 地菌灵。 研究表明该毛壳菌拮抗能力较强，在对峙培养时病原菌在与毛壳菌的相向生长半径 心川农业大学2 0 0 6 届硕：l 研究生余应硅学位论文：一毛壳苗苗株的分离鉴定及生物防治潜力研究 上受到明显地抑制，作用机制可能是产生拮抗物质和营养竞争。毛壳菌对植物病原菌大 丽轮枝霉( v e r t i c i l l i u md a h l & e ) 抑制效果最好，可覆盖其菌落，最终使其消亡；其次是串 珠镰刀菌( f u s a r i u mm o n i l i f o m p ) ，交接后相向生长停止，串珠镰刀菌菌落萎缩消退；然 后是纹枯病菌( r h & o c t o r n i as o l a n ia g 一4 ) 和核盘菌( s c l e r o l i n i as c l e r o l i o r u m ) ，交接后毛壳 菌只能抵抗其扩展。而对立枯丝核菌( r h & o c t o r n i as o l a n i ) 虽然有一定的抑制作用，但拮 抗效果不理想。与生防菌哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u mf 0 6 0 ) 比较，该毛壳菌在营养 竞争上较弱。 关键词：竹毛壳茵生物学特性杀菌剂毒力拮抗能力生物防治 v _ qj t l 农 大学2 0 0 6 届硕二i j j f 究生余应建学位论文：一毛壳菌苗株的分离箍定发生物防治潜力研究 l 绪论 1 1 研究背景和意义 植物内生菌( e n d o p h y t e s ) 泛指一切生活在植物体内而不使植物组织显示出明显感 染症状的腐生、寄生和共生真菌及细菌等微生物”。1 。近年来，由于发现内生菌对植物具 有促进生长、抗逆境、抗病虫危害等有益影响。5 1 ，有关植物内生菌生物学、生理生态学、 次生产物化学的研究日益增多，并取得了可喜的成果“3 。并且，许多报道己证明在不同 的植物体内都存在大量的内生真菌，是我们挖掘防治病害的生物因素宝库，但对它们的 分离、鉴定以及分布的特异性、生防的潜能知之甚少。这都显示了其重要的研究意义与 广泛的应用前景。 撑绿杂交竹( b a m b u s ap e r v a i a b i l i sm c c l u r e x d a n d r o c a l a m o p s i sd a i ik e n gf ) 是被列 为林业部1 0 0 项重点成果推广的优良竹种之一”1 。但自1 9 9 8 年从广西柳州引种到四川后， 由于重利用，轻管理，经营粗放，使生产力下降，病虫害滋生，特别是单一品种的竹林 种植，加上适宜的气候条件，为林区病虫害的发生蔓延创造了良好的必要条件。目前， 在部分栽培区出现了多种病害，造成不同程度的枯竹毁林现象，而且具有明显传染扩展 趋势”1 “，加上引种范围广，推广速度极快，因此，有效防治杂交竹病害，降低经济、生 态效益损失，便成为当前森保科技工作者的主要研究任务之一。 为了探索病害防治的新技术、新途径，本研究选择杂交竹为挖掘生防因素的对象， 经竹秆组织分离鉴定，筛选得到一种优势内生毛壳菌菌株。毛壳菌( c h a e t o m i u m ) 是一种 子囊菌，它对植物病原菌具有很好的防治效果，是极有发展潜力的生物防治真菌“。在 国外毛壳菌是广泛使用的生物防治菌，国内也开发研制出毛壳菌的生物杀真菌制剂“。 但在生产使用过程中，毛壳菌像其它生物防治菌一样对化学杀菌剂敏感，防治效果不稳 定“，且国内在应用于林果病害防治方面报道尚少。鉴于此，对该毛壳菌的培养条件、 对常见杀菌剂的敏感程度、生物防治能力方面展开研究，以期为进一步改造毛壳菌，开 发具有良好生防作用的遗传工程微生物( g e n e t i c a l t ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n is m s ，g e m ) “”1 提供依据。开发出具有抗药性的毛壳菌菌株，从而达到生物防治与化学防治同时作 用于有害生物，推动生物防治与化学防治的结合，减少化学防治带来的环境污染和对生 态环境的破坏，促进高效生态林业的发展。 心川农业大学2 0 0 6 届硕士研究生余应建学位论文：一毛壳菌菌株的分离鉴定及生物防治潜力研究 1 2 植物内生真菌的研究进展 1 2 1 植物内生真菌的研究简史 1 8 8 6 年d eb a r y 首先提出了内生菌( e n d o p h y t e ) 的概念，指生活在植物组织内的微生 物，以区别那些生活在植物表面的表生菌( e p i p h y t e ) 。按此定义植物的致病菌、菌根菌， 也属于内生菌的范畴。后来，c a r r o ( 1 9 8 6 ) 将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物 组织内而并不引起明显病害症状的真菌，突出强调了内生菌与植物的共生关系，因此， 在这个内生菌概念中不包含植物致病菌和菌根菌。p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 把c a r r o l 的概念范畴 进一步扩展，将内生菌定义为那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植 物组织没有引起明显病害症状的菌，这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面 生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌( l a t e n tp a t h o g e n s ) 和菌根菌。b i l l s 也认为一些类型的菌根菌，如外生菌根菌，杜鹃菌根菌和假菌根菌应属于内生菌。目前 关于内生菌的概念范畴还有争议，在现在的内生菌研究中，p e t r i n i 提出的内生菌概念 被广泛接受“”。 内生菌包括内生细菌和内生真菌。在现在的研究中，大部分为内生真菌，最近也有 植物内生细菌的报道。自1 8 9 8 年v o g l 从黑麦草l o i u mt e m u l e n t u m 的种子内分离出来第一 株内生真菌至今，关于内生真菌的研究己有一百多年的历史，但直n - - 十世纪八十年代 初期，内生真菌的研究才被重视，并且大多数工作集中在温带地区和亚热带地区具有重 要经济价值的植物，最近热带地区的植物开始受到人们的注意“。从二十世纪八十年代 后期开始，人们开始研究内生真菌对植物影响的生理生化机制和内生真菌代谢活性物质 的开发应用。近年来，分子生物学和基因工程技术也应用于内生真菌分类、进化等的研 究中。 1 2 2 内生真菌的研究内容和研究动态 内生真菌的研究可以分为两大类，即生态学、分类学上的理论研究和内生真菌代谢 产物及胞外酶的实际应用研究。其中，生态学研究包括内生真菌多样性( 物种多样性、 遗传多样性、生态多样性) 研究，与宿主之间的共生互惠关系以及其菌种鉴定分类和生 物进化研究。这两方面的研究并不是独立的，而是相互促进的：由于内生真菌与宿主的 特殊生态关系，人们才有可能从植物中筛选出特殊的能产生与宿主相同活性成分的内生 真菌，因此生态学的考察可以为实际应用提供方向指导；同时内生真菌次生代谢产物的 研究对于阐明生物进化的机制，加深对生物体之间竞争、生存关系的了解以及丰富真菌 四川农业大学2 0 0 6 届硕士研究生余应建学位论文：一毛壳菌苗株的分离箍定及生物防治潜力研究 多样性有重要的意义。仅从内生真菌所产生的代谢产物的考察，就可以看出其与宿主之 间复杂的相互影响关系。寄生于同一种宿主的不同内生真菌类群可以产生相同的物质 “，寄生于不同寄主中的相同内生真菌也可以产生相同物质m 1 ，而且分离自不同宿主的 同种内生真菌也可以产生不同的活性物质”。内生真菌一宿主植物的生物学相关性与内 生真菌所产生的次级代谢产物之问究竟有何相联，还在进一步研究讨论之中。 1 2 2 1 内生真菌生态学 ( 1 ) 内生真菌的多样性 从目前己研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断内生真 菌在植物体内是普遍存在的。内生真菌主要由子囊菌及其无性型组成，也包括少数担子 菌和接合菌。根据内生真菌的来源和系统特征可被划分成具有明显区别的两大生态类 群：麦角类系统禾草内生真菌，即从草本植物内分离出来并与宿主具有明显互惠关系的 内生真菌：第二类群为树木和灌丛内生真菌，也被称为非麦草类系统内生真菌，也包括 从禾草分离出来的非麦角类系统内生真菌。 ( 2 ) 分布 不同地理区域的同种植物具有不同的内生真菌类群分布。同一地区内的同种植物上 的内生真菌类群基本相似，但所有内生真菌在不同年龄植株和组织上的丰度和分布却明 显不同，一般情况下，树龄越老，植物内生真菌的种类和数量也越多，内生真菌类群的 分布也受树冠的高度和郁闭度影响，一般而言，在高、密度大、封闭组织的树冠上内生 真菌种类数量和丰度要比在矮、开放、基露的树冠上的高。此外，内生真菌的类群还受 到气候带、湿度、季节、海拔高度、周围其他植物类群和环境污染程度等环境因素的影 响1 。 ( 2 ) 内生真菌的专一性 宿主专一性：最近研究表明l e u c h t m a n n c l a y ( 1 9 8 8 ) 又得知很多种群可以在宿 主种的水平上具有专性。内生真菌的宿主专一性与真菌侵染宿主的过程有关，真菌孢 子吸附到宿主表面并被其识别是由真菌孢子表面的多糖和宿主的调控所决定的，同时真 菌孢子的萌发也受到宿主的专性刺激。 组织专一性：c a n o l 研究了7 种分布在法国和瑞士的针叶树上不同组织的内生真菌 群落，发现叶柄和叶顶端上一些内生真菌种类明显不同，因此，提出内生真菌种类具有 一定的组织专一性的假说。后来许多的研究结果也支持此假说。内生真菌具有一定组织 四川农业大学2 0 0 6 届坝i ：硼f 究生余应建学位论文：一毛壳苗菌株的分离鉴定及生物防治潜力酬究 专一性的原因可能是由于不同的内生真菌具有利用不同基质的能力，从而决定了内生真 菌具有不同的生活方式。 ( 3 ) 内生真菌与宿主植物之间的关系 内生真菌长期生活在植物体内，与宿主协同生活，二者形成了互惠互利的合作关系， 是植物一真菌系统进化的结果。一方面，内生真菌可以从宿主中吸收营养供自己生长需 要；另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要作用。内生真菌的 代谢产物能刺激植物的生长，提高宿主植物对生境的抵抗能力。内生真菌的生物学作用 包括： 促进宿主植物的生长发育，表现在种子发芽，幼苗存活，分集生长，花序，生物 量等多个方面”州。 增强宿主植物的抗逆性，即表现在非生物胁迫上，如抗高温，抗干旱等，又表现 在生物胁迫上，如阻抑昆虫和食草动物的采食等。 产生多种生物碱和真菌毒素，如黑麦草碱、麦角碱、波胺和蕈青毒素等，这些次 生代谢产物因对食草动物和昆虫等具有毒性或能降低宿主植物的适口性，从而提高植物 对多种食草昆虫的抗性。此外，内生真菌也能增强植物对一些病原真菌和腐生真菌的抗 性。 1 2 2 2 内生真菌的开发利用 内生真菌是一个多样性十分丰富的生物类群，其中，有些对宿主某些成分的形成有 重要影响，有些能产生与宿主植物相同或相似的生理活性成分，有些则产生与宿主活性 成分不同的活性物质，如张玲琪，王海昆等人首次从美登木茎、叶内生真菌球毛壳菌 ( c g l o b o s m ) 中分离出与宿主所产美登素不同的抗癌物质球毛壳甲素，还有一些与宿 主只是共生或伴生关系等等。由此可以看出，内生真菌是一有待人类去开发的丰富资源。 ( 1 ) 胞外酶的应用 内生真菌产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、 纤维素酶、酪酶等胞外酶，有些酶具有较高的商业应用价值。女h s t a m f o o r dt l 等人发现 从薯拔属蚕豆中分离出来的内生放射形菌拟诺卡菌可以产生耐热性a 一淀粉酶啪1 。 ( 2 ) 内生真菌与生物防治 植物内生真菌的专一性表现在对宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外， 对其他生物没有直接影响，而且内生真菌可以通过人工接种被导入不同的组织并可通过 四川农业大学2 0 0 6 届颁i ：研究生余应建学位论文：一毛壳菌菌株的分离豁定发生物防治潜力研究 宿主的种子进行遗传，因而具有作为生物农药的优良特性。目前研究的重点是利用内生 真菌双重特性中的有益一面，如将内生真菌人工引入禾草，培育含有内生真菌但对家畜 无害的抗逆性牧草和适应性广的草坪草品种。 对禾草，棉花，花生，甘薯，大豆和小麦等一系列植物的内生真菌的初步研究发现， 农作物上的一些内生真菌可成为拮抗菌。如中国农业大学从棉株中分离到一株内生毛壳 真菌，经人工茎基部注射后有抑制萎蔫镰刀菌扩展的作用”1 。 内生真菌产生的次级代谢产物可以增强宿主对病虫害的抵抗能力。如从北美落叶松 内生真菌发酵液中分离到的h o g e n e s i s 对枞色卷蛾的胃毒致死率为9 6 。胶冷杉内生真 菌，黑云杉内生真菌，附卧自株树内生真菌分别产生新苯并毗咯，苯并呋哺型二萜类活 性成分都对枞色卷蛾有一定的胃毒致死率1 。s t r o b e lg a 发现内生真菌通过产生一种挥 发性混合物，有效地抑制和杀死其了他真菌和细菌。”。2 0 0 2 年西北农林科技大学从苦皮 藤植株中分离到的内生真菌能生物合成苦皮藤素杀虫剂，已经开始准备用于商业化生 产。可见，内生真菌在生态学和实际生物防治中均具有很大的潜在应用价值。 1 3 毛壳属真菌的研究 毛壳属( c h a e t o m i u mk u n z e ) 是腐生子囊菌中数量最多和意义较大的类群之一，是一 类重要的资源真菌，呈世界性分布。该属自建立以来至少有3 0 0 个分类单位被描述过， 目前原有大部分描述种成为异名种或被转并到其他属，至今接受的种共有8 1 种。“。 1 3 1 毛壳属真菌分类研究进展 k u n z e 于1 8 1 7 年建立了毛壳属，同时描述和命名了第1 个种c g l o b o s u m ，并将其归入 球壳科中。当时他对毛壳属某些特征的描述与今天人们的认识是共同的。由于受当时观 察条件的制约，他未能发现子囊，但是注意到了混在胶质团中的孢子，并发现这种胶质 团在湿度增大时能够膨大，而且可从顶端的孔口压挤出来。继k u n z e 之后， c o r d a ( 1 8 3 7 1 8 4 9 ) 年提出胶质团是一种囊状结构，称之为子囊。f r i e s ( 1 8 4 9 ) 提出毛壳 属的孢子是封闭在子囊内，由于许多种类的子囊早期已融解以及其透明或半透明状的质 地，所以子囊在以前被忽视了”“。 像其他真菌一样，毛壳菌的分类地位、种群结构、种群数量和名称，随着人们认识 的不断深入，也在不断的变化。k u n z e ( 1 8 1 7 ) 定名毛壳属时，将该属归于球壳科，而 l i n d a u ( 1 8 9 7 ) 认为应将该属归在核菌目球壳亚目毛壳科。1 9 3 2 年n a n n f e l d t 依据毛壳菌 子囊易消解的特点，提出将毛壳科所有属种转入不整囊目。这提法直盈j 1 9 5 2 年还被部 p q t i & q , a e 大学2 0 0 6 届硕士研究生余应建学位论文：毛壳菌菌株的分离箍定及生物防治潜力研究 分学者认同，但_ w h i t e ( 1 9 6 2 ) 在对a s c o t r i c h a 、c h a e t o m i d i l z m y f = 1 c h a e t o m i u m 3 属的形态学 做过细致的研究后证实，毛壳科种群的子囊果最初都是由菌丝分枝并缠绕弯曲的产囊体 形成，而这一产生方式是真子囊菌的特征，而且其子囊果又是子囊壳，因此其分类地位 应是核菌类，而不是不整囊菌。至此，毛壳属的分类地位仍未取得一致的看法。 a l e x o p u l u s ( 1 9 7 9 ) 等提出应将毛壳属归并到炭角菌目( x y l a r i a l e s ) ，而这一提议早在 1 9 5 1 年l u t t r e l l 就提到过。在众多的研究者尚未对该提议做出评价时，e r i k s s o n 于1 9 8 2 年再次提出毛壳属的最佳归属应是粪壳目毛壳科，这一划分随后得到了绝大多数研究者 的认同1 。近2 0 年来，除相继发现了一批新种外，更为重要的是归并了数量相当的异名 种或把一些误判种类转并到其它属，毛壳属的分类地位再未有任何疑义，发展到今天， 毛壳属由曾经描述过的3 0 0 多种，稳定为8 1 种。 从2 0 世纪8 0 年代起，分子生物学逐渐渗透到系统分类学领域，编码核糖体r n a 的d n a 序列，近年来被广泛用来研究生物间的系统发育关系。s e o n j u l e e ( 1 9 9 9 ) 等研究表明， 毛壳科和粪壳科有密切的关系，毛壳属的祖先曾是粪壳科真菌的一员，毛壳科和粪壳科 为同一祖先，随后它们沿不同的进化路线演化。 毛壳菌建立时曾被定义为具暗色无隔孢子的一类子囊菌。z o p f ( 1 8 8 1 ) 在他的第一部 关于毛壳菌的研究专著中，报道毛壳属有l o 个种，同时将毛壳属分成2 个亚属，即 c h e a t o m i u m ，该亚属由9 个种组成，其子囊果均有孔e l ；c h a e t o m i d i u m ，该亚属仅 由单种c f i m e t if u c k e l 组成，其子囊果缺少孔口1 。s a c c a r d o ( 1 8 8 2 ) 提出应将 c h a e t o m i d i u m 作为一个独立属，这一提议后来被部分研究者接受，但是，仍有相当的研 究者在相当长的时期内坚持c h a e t o m i d i u m 、f f _ 属和种c f i m e t i 。之后，w h i t e s i d e 研究发 现c h e a t o m i u m 和c h a e t o m i d i u m 在壳体结构等特征上有明显的差异，c h a e t o m i d i u m 应单独 作为一个属。 此外，a m e s ，f a r g u s ，宇田川i 俊一等。”认为毛壳属c h a e t o m i u m 这一有性阶段 t e l e o m o r p h 和团丝核菌p a p u l a s p o r a 的无性阶段a n a m o r p h ，组成生活史的完全型 h o l o m o r p h 。 随着研究工作的深入，人们发现子囊孢子的一些特征，如形状、大小、芽孔的位置 和数量是相当稳定和清晰的，子囊孢子的这些特征及子囊的形状更适合于作为分类标 准。自1 8 8 1 年z o p l 根道该属有l o 个种之后，b a i n e r ( 1 9 1 0 ) 报道有2 3 种，c h i v e m ( 1 9 1 8 ) 2 8 种，a m e s ( 1 9 6 3 ) 8 5 种，s e t h ( 1 9 7 2 ) 】5 0 种，y o na r x ( 1 9 8 6 ) 8 2 种，k i r k ( 2 0 0 1 ) 8 1 种“”。毛 壳属种群数量的波动反映出随着研究手段的提高和人们认识的深入，特别是分子生物学 四川农业大学2 0 0 0 届钡：l 研究生余应建学位论文：一毛壳菌苗株的分离餐定及生物防治潜力研究 研究的渗透，原有的部分描述种实为异名种或者其分类地位应隶属其他属。 我国对毛壳菌的分类研究相对较少，仅在2 0 世纪6 0 一7 0 代有部分研究。陈庆涛报道， 中国的毛壳属有1 9 种，1 9 7 3 年他又发现了2 个新种”。根据中国真菌总汇( 1 9 7 9 ) 中 记录，毛壳属在中国共有记载种3 0 种( 含异名种) 。之后再未见任何报道。 1 3 1 1 形态性状分类特征 传统的真菌分类主要依据真菌的形态特征，即以子囊果孔口的有无、子囊果外形、 囊壁的透明度、囊外壁质感、附属丝形状及子囊的排布方式等特征来验证其分类地位。 ( 1 ) 子囊壳 此特征是该属早期分类所采用的主要根据。通过比较子囊果孔口的有无，囊壁的透 明度，子囊果外壁光滑还是具发状附属丝，外部形状球形还是瓶状，以界定分离培养物 的分类地位。随后，子囊壳壁外层的组织结构作为附助鉴别特征也被提了出来，毛壳属 的此类结构常为角胞组织、矩胞组织或交错丝组织。 ( 2 ) 附属丝 毛壳属所有种群的共同特征是子囊果具附属丝或刚毛，因此附属丝，特别是顶生附 属丝，成为分类的主要研究对象。顶生附属丝呈直立的、波浪状、环状、螺旋状或呈尖 部弯曲的弓形。毛壳属种群附属丝的型式可以是上述单一型的，也可能是2 3 种的集 合。附属丝分枝特性及其宽度也曾是分类标准，毛壳属的顶生附属丝可为二叉状分枝或 不分枝。顶生附属丝外壁疣状凸出物曾被当作装饰物研究，并总结出1 0 种类型，作为 附助分类标准，但随着研究工作的深入，人们发现，顶生附属丝的这些特征是不可靠的， 它们受子囊果成熟度和培养条件的影响“。 ( 3 ) 子囊 子囊的结构和形状是相当稳定的，一直作为界定属、种的主要特征。毛壳属类群子 囊总是早期消解，形状为棍棒状、倒卵形、纺锤形或圆柱形，子囊孢子通常不规则排列， 而圆柱状子囊的子囊孢子多为单列排布。 ( 4 ) 子囊孢子 这是毛壳属种群的主要分类特征，特别是在同源分类单元的界定方面。子囊孢子的 形状、大小和芽孔的特征是相当稳定和清晰的，不同种间子囊孢子的形状和芽孔的数量、 着生位置有较大的差异。毛壳属的多数种群具单一顶生芽孔，少数种类则为顶生或近顶 生的双孔。进一步的研究证明“，芽孔的类型不仅与子囊的大小和形状、子囊壳的大小 9 四川i 农业大学2 0 0 6 届颀= e 研究生余应建学位论文：毛壳菌菌株的分离鉴定段生物防治潜力研究 和形状、顶生附属丝的类型、厚垣孢子的有无没有关系，而且与子囊孢子的大小和形状 也无关系。 ( 5 ) 无性型 毛壳属的个别种类，在培养过程中能产生无性的厚垣孢子或分生孢子，这也可作为 一种分类特征“”。 1 3 1 2 生理学分类特征 毛壳属某些种群的子囊孢子，在乳酸溶液中或“m e z e r ”试剂中，可以发生像糊精 那样的反应，其未成熟子囊孢子的颜色会由桔红色变为浅粉红色。这生理特征对种的 鉴定亦有重要作用。 1 3 1 3 生物技术在分类研究中的应用 随着分子遗传学及电子计算机等学科的发展和技术渗透，真菌分类学向真菌系统学 过渡并形成真菌分子系统学。该学科以系统学和进化论为指导，选取真菌的分子性状进 行分类，逐渐把真菌分类引向深入。很好的弥补了传统分类不同的人采用不同的性状或 方法造成的真菌分类系统多、分歧较大的缺点。狭义的真菌分子系统学所采用的分子性 状是核酸数据或基因序列。采用核酸分子研究真菌系统学具有可比性高，严密性强，可 靠性大和趋同性小等优点，这是因为核酸序列的变化基本上是趋异的，其变异的程度与 存在的时间存在着定量关系。如果两种生物从共同的祖先分开的年代越久远，在其核酸 分子中所积累的核苷酸差异就越大，因此物种间核酸序列的相似程度，能够反映它们间 遗传结构的相似性和亲缘关系的远近。目前人们己认识到核酸序列分析的优越性，并日 益广泛地用于真菌的系统发育研究“，其中以核糖体( r d n a ) 序列研究最广，这是因r d n a 作为蛋白质合成的关键成分，具有功能和进化的同源性，而编码r r n a 前体的基因即 r d n a ，包含着更为丰富的遗传变异信息。真菌细胞的核糖体基因簇，由多拷贝的r r n a 基因重复单位即r d n a 串联而成，但这些基因像单拷贝基因那样演化，因而它们具有相 同的序列。一个r r n a 基因重复单位即r d n a 由基因间隔区i g s 、编码5 8 s 、1 8 s 和2 8 s r r n a 基因的拷贝区及内部转录间隔区i t s3 个结构区域组成，分别可被转录成不同的 r r n a 分子，最终成为核糖体的一部分。基因间隔区i g s 由一段与结构基因相邻的非转 录区n t s 和拷贝区的外问区e t s 构成。相比较而言，结构基因即5 8 s 、1 8 s 和2 8 sr d n a 较为保守，适合于较高分类单元的系统分析：而i t s 和i g s 区域易于变化，研究分析该 区域的基因序列，能够方便地确定科、属、种问的系统发育关系。 0 p _ t lj q 撇学2 0 0 6 届碗士 j f 究生余应建学位论立：一毛壳菌苗抹的分离鉴定发生物防治潜力研究 1 3 2 毛壳菌的致病性 目前，报道毛壳菌引起植物病害研究还不多，尤其是国内，仅樟子枯梢病较为突出 “”4 。但对其还只停留在分离鉴定，侵染规律研究上，如贾艳梅等( 2 0 0 3 ) 研究了球毛壳 菌( c h a e t o m i u mg l o b o s u mk u n z e ) 对防护林樟子松枯梢病的侵染规律研究，指出侵染程度 与植被盖度及密度的正相关关系，同时报道其对樟子松侵染循环”“。由于植物中的含有 大量的粗纤维，而粗纤维主要成份是木质素、纤维素、半纤维素和果胶物质“，有人认 为毛壳菌的致病与其具有较高的降解纤维素能力( 中国科学院微生物研究所，1 9 7 3 ) 有 关。张功等“7 1 用毛壳菌菌株( cl l u l o l y t i c u m ) 分解青干草和玉米秸秆，青干草的纤维素 降解率大于玉米秸秆的纤维素降解率，表明青干草的物质组成可能更适合该毛壳菌的分 解。付惠等( 1 9 9 9 ) 通过五种竹材霉变真菌的分离、纯化、回接及鉴定，确认了毛壳属中 的2 种菌株能引起龙竹材霉变“”。 1 3 3 毛壳菌对杀菌剂敏感性的研究 毛壳茵是植物病原菌的生物防治菌且被广泛应用，作为病原物对其进行化学防治研 究尚少见，杀菌剂种类也不多，仅发现毛壳菌对苯并咪唑类杀菌剂异常敏感。多茵灵是 苯并咪唑类杀菌剂中的一种，b h a t 等测定了毛壳菌对多菌灵等五种杀菌剂敏感性表明， 多菌灵等化学杀菌剂能完全抑制毛壳菌菌丝的正常生长，因此导致毛壳菌无法与多菌灵 混合施用“。杨谦等。1 人的试验表明，球毛壳和角毛壳均对多菌灵敏感，且随着多菌灵 浓度的增加其菌落生长半径减小。 1 3 4 毛壳菌作为生防菌研究 植物病害的生物防治是病害综合治理的重要方法之一”。众多的研究表明，利用有 益的微生物菌制剂可以达到减轻或避免使用化学农药控制植物病害的危害。 1 3 4 1 毛壳菌对植物病害的防治 毛壳菌作为生防菌在防治植物病害方面最为突出，早在1 9 5 4 年，m a r t i n 和m o o r e 发 现，巴西的各品种燕麦的种子被cg l o b o s u m ( 球毛壳) 和cc o c h l i o d e s 隍累卷毛壳) 侵染后， 则对维多利亚长蠕孢毒素的作用产生了抵抗力，从而使谷物、燕麦、大麦的幼苗免受 f u s a r i u ms p p ( 镰孢属) 或d r e c h s l e r as o r b k i n i a n a 的侵染。据国外文献记载，毛壳菌对棉 花、甜菜、大麦番茄等多种植物的种子腐烂和种茁猝倒以及番= i ；= 果黑星菌、茄枯萎病、 洋葱白腐病、百合灰霉病等都有明显的抑制作用，并已用于苹果黑星病、苗木猝倒等病 四川农业大学2 0 0 6 届硕士研究生余应建学位论文：一毛壳菌菌株的分离鉴定发生物防治潜力研究 害的田间生物防治试验( k a ye ta 1 ，i 9 9 4 ：k o h le la 1 ，1 9 9 5 ：m i e d t k ee ta 1 ，1 9 9 0 ：p e r e i r ae t a 1 ，1 9 9 7 ：w a l t h e r e ta 1 ，1 9 8 8 ) 5 ”。p n c h r is t i a n ( 1 9 8 3 ) 和d a n i e l ( 1 9 8 4 ) 叶面喷洒球毛壳制 剂能控制v e n t u r i ai n a e q u j j s ( 苹果黑星菌) 所引起的苹果黑星病，如将球毛壳制剂( 5 1 0 6 c p s m 1 ) 喷洒在苹果叶子上，能减少圹i n a e q u l j s 的孢子数而降低叶子的腐烂程度。 w a l t h e r ( 1 9 8 8 ) 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 引起的番茄枯萎病常给生产造成重大 损失，若用毛壳菌和杀菌剂p c n b 配合使用，可使该病的发生率由4 3 降低至u 2 2 嵋3 1 。p i e r r o a d 等( 1 9 9 2 ) 由球毛壳产生的抗真菌物质球毛壳素( c h a e t o m i n ) 在抑制引起甘蔗猝倒病 的病原菌p y t h i u mm t i m u m s i 5 ；面起着重要作用。并认为球毛壳( c g l o b o s u m ) 和卷毛壳 ( c o c h l i o d e s ) 对于多种土传和种传植物病原菌有拮抗作用，因生长速度的限制，毛 壳菌对病原菌的拮抗作用机制主要表现为重寄生和产生毛壳素( c h a e t o m i n ) 等抗生素。 另外，他用球毛壳菌处理南瓜属种子，可以减少因h y l e m y a p l a t u r a 弓 起的种子子实体损 伤和p y 胁i u m5 m 造成的种子腐烂”1 。 国内，原北京农业大学生物防治研究室曾从棉花植株内分离出一种毛壳菌，经人工 茎基部注射后，有抑制致萎镰刀菌扩展的作用( 鲁素芸，1 9 9 3 ) 。刘晓光等在研究毛白杨 内生真菌区系组成基础上，筛选出优势种毛壳菌n d 3 5 对6 种常见林果病害病原菌有较好 的拮抗效果”1 。可见，毛壳菌在自然界植物体内广泛分布，具有广阔的开发应用前景， 但国内在应用在林果病害防治方面报道研究还尚少。 1 3 4 2 毛壳菌防治植物病害的作用机理 ( 1 ) 毛壳菌产生抗生物质抑制植物病原菌的生长 球毛壳( cg l o b o s u m ) 和角毛壳( cc u p r e u m ) 的某些特定菌株就能够产生抗生物质， 从而抑$ 4 p h y t o p h t h o r ap a r a s h i c a 倍生疫霉) ，p p a l m i v o r a ( 棕榈疫霉) p c a c t o r u m ， p y r i c u l a r i ao r y z a e , f u s a r i u mo x y s p o r u m , c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i d e s ( 盘长孢状刺盘孢 霉) ，c o l l e t o t r i c h u md e m a t i u m ( 束状刺盘孢霉) ，s d e r o t i u mr o l f s i i 和r h i z o c t o n i as o l a n i ( 立枯 丝核菌) 等植物病原菌晦2 1 。 ( 2 ) 毛壳菌能竞争性抑制植物病原菌的生长 毛壳菌和植物病原菌一样，在生长过程中都需要营养物质，而营养物质是由植物供 给的，因此毛壳菌和植物病原菌在生长过程中有拮抗作用。 ( 3 ) 毛壳菌可以诱导植物产生抗性 球毛壳菌和角毛壳茵的某些特定菌株代谢所产生的物质，能够诱导植物某些组织抗 四川农业大学2 0 0 6 届颂：l 研究生余应建学位论文：一毛壳菌菌株的分离签定及生物防治潜力研究 氧化能力的增强，从而提高植物的抗病能力1 5 6 1 o ( 4 ) 毛壳菌促进植物生长 球毛壳菌和角毛壳菌的某些特定菌株能够产生麦角甾醇类物质，有助于改善和提高 土壤肥力，从而促进植物的生长且提高农作物的产量，如番茄、玉米、水稻、柑橘、黑 胡椒、榴莲及石竹等5 “。 1 3 4 3 毛壳菌在植物病害防治方面存在的问题 ( 1 ) 毛壳菌的生物控制活性易受一些物理因素的影响 毛壳菌是防治许多植物病害的很重要的生物防治菌，但其生物防治活性易受一些物 理因素的影响。如风、雨等能降低毛壳菌在植物上的附生能力，从而不利于毛壳菌的定 殖和产孢。植物幼苗的根或叶子中水分的变化，会使毛壳菌产生的抗生素活性降低，干 燥和风干都会使植物的叶面暴露于空气中，导致抗生素物质的进一步降解，以至降低毛 壳菌的生物控制活性等时1 。 ( 2 ) 毛壳菌对化学杀菌剂敏感的问题 关于生物防治菌对化学杀菌剂敏感性的问题和生物防治菌与化学杀菌剂同时使用 防治植物病原菌失败的问题已有许多报道。d o u d r e a u 等人将球毛壳菌与黑星菌孢子一起 喷施在苹果树幼苗上，毛壳菌对苹果痂斑病的抑制率达9 0 ，在短期内可明显降低此病 的发生，但在一年内若一次喷施或多次喷施毛壳菌，它对苹果痂斑病的抑制率仅为2 5 。 试验结果表明，球毛壳菌所产生的抗生素通过在苹果叶面上的有效扩散抑制黑星菌的侵 染，同时，此抗生素也能被非生物性物质降解而降低或丧失其生物活性“”。正由于毛壳 菌在使用过程中易出现上述问题，因而大大限制了它的使用范围。 2 材料与方法 2 1 供试材料 2 1 1 主要培养基 马铃薯蔗糖培养基( p s a ) ：马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖l5 2 0 9 ，琼脂i7 2 0 9 ，用水定容至 1 0 0 0 m l 。 2 1 2 主要试剂 蔗糖c ，：h 。0 ( 汕头市光华化学厂) 、葡萄糖c s h 。0 8 h 2 0 ( 四川成都天华科技股份有限公 司) 、麦芽糖c h ：0 h 2 0 ( 沈阳市试剂二厂) 、硫酸二氢钾k p o 。( 四川成都化学试剂厂) 、 四川农业大学2 0 0 6 届硕士研究生余应建学位论文：一毛壳菌菌株的分离鉴定及生物防治潜力研究 硫酸镁m g s o 。7 h ：o ( 四川成都化学试剂厂) 、无水乙醇c h 。c h 。0 h ( 北京益精细化学品有限公 司) 、m e z e f 试剂( 2 5 9 碘，7 5 9 碘化钾，1 0 0 9 水合氯醛，溶于1 0 0 m 蒸馏水) 。 2 1 3 主要仪器 r x z 型智能人工气候箱( 宁波江南仪器厂制造) 、q v3 0 0 0 e x l r 液晶显示数字式相 机( 卡西欧计算机株式会社制造) 、b 1 系列生物显微镜( 麦克奥迪实业集团有限公司) 、 d m b 5 2 2 3 i p l b 数码显微镜及全系列显微图像软件( 麦克奥迪实业集团有限公司) 、 d h g - 9 1 4 6 a 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海桂宏实验设备有限公司) 、手提式不锈钢蒸汽消 毒器( 上海三申医疗器械有限公司) 、h h 一4 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) 、 r o y a l s t a rc d 一2 4 5 f 冰箱( 合肥荣事达冰箱有限公司) 、超净工作台( 苏净集团安泰公司 制造) 、0 o l m m 物镜测微尺( 上海第二光学仪器厂) 、j d 4 0 0 3 电子天平( 沈阳龙腾电子有 限公司) 、t i c t p l 2 a 2 架盘药物天平( 北京医用天平厂) 、电炉( 北京中兴伟业仪器有限 公司) 、p h 酸度仪、培养皿、容量瓶、移液管等。 2 2 分离培养与鉴定方法 2 2 1 菌种分离及培养方法n 分别于在春季( 3 4 月) 、夏季( 5 7 月) 、秋季( 9 1 0 月) 、冬季( 1 2 1 月) 4 个不同 季节自雅安市天全县城郊及始阳镇取撑绿杂交竹1 年生和多年生竹杆用保鲜袋带回实验 室，立即用枝剪、小刀等沿竹径向半径依次取竹青、中部竹黄和竹腔内竹黄组织，然后 剪成4 m i n x 4 m m 方块，厚5 6 唧小块组织，放入7 0 酒精浸3 0 6 0 s 一无菌水冲洗3 次一0 1 的升汞进行表面消毒2 3 m i n 一无菌水冲洗3 次一灭菌滤纸上蘸干一用灭菌刀对组织块 进行外部剪切，置于p s a 平板上，2 6 c 恒温培养，每个平板按梅花型接种5 块，每样品1 0 个重复，3 5 d 内记录不同菌落的分离频率，汰选出优势菌株、次优势菌株和杂菌，挑 取其尖端部分移至新的p s a 平板上，并经纯化后保存于试管斜面上，以待鉴定。 为了检查材料表面消毒的效果，以对照实验做比较。一种对照是把空白平板打开， 摆在超净工作台上】o m i n ；另一种对照是将上述同样表面消毒处理过的材料不作任何剪 切，直接接种于p s a 平皿上，置于相同条件下培养。结果，空白平板内及对照材料周围 均无任何菌长出，多次重复均如此，证明表面消毒是彻底，从而也保证了所分离到的菌 是植株上的内生真菌，而不是表面的附生茵。 p _ l u q 农业大学2 0 0 6 属硕j ：研究生余应建学垃论文：一毛壳菌苗株的分离鉴定及生物防治潜力研究 2 2 2 菌种形态性状观察及鉴定分类” 培养性状观察：将菌种移殖于- p s a 平板，2 6 。c 恒温下进行插片纯培养或贴玻璃纸培 养，根据菌株不同每隔一定时问( 1 2 h 或：者- 2 4 h ) 观察、记录一次各培养物菌落的形状，大 小，色泽及变化，质地、生长速度，是否产生色素情况以及产孢情况。 制片检查：在显微镜下通过观察临时玻片，观察菌丝特征( 是否有隔，是否分枝， 形状，颜色等) 以及产孢体的典型特征，选取理想的插片，以乳酚棉蓝、m e l z e r 试剂或 蒸馏水为浮载剂制成玻片标本，然后在显微镜下检查菌丝体的粗细，子囊壳的着生部位， 形状，类型，大小，色泽等详细情况：附属丝的形状，大小，色泽，纹饰，是否有隔， 是否分枝等；子囊和孢子的大小，形状，表面特点，色泽等：以及产孢细胞的类型，形 状等形态特征。 m e l z e r 试剂反应：检测孢子或者菌丝组织的淀粉和糊精反应。由于溶液中的碘可以 使孢子及其表面的特殊结构( 如疣状突起) 呈现出不同颜色，因而使孢子在显微镜下更加 清晰可辨。 描绘与摄影：显微观察的同时均作文字记录，并要求描述规范得体。选择适当的放 大倍数拍摄显微照片，采用数码相机拍摄清晰的菌落形态。 2 3 培养特性研究 2 3 1 菌种 竹毛壳菌( c h a e t o m i u ms p ) ：本次筛选出的目标测试菌，预先培养到第3 d ，待用。 2 3 2 方法 2 3 2 1 不同培养基对毛壳菌菌落生长的影响” ” “ 用下述九种不同培养基制成平板，每皿定量注入2 0 m l ，将直径5 m m 同质等量的菌饼 移殖于平板中，每处理设3 个重复，置于2 6 。c 下恒温培养，逐日观察菌落形态并测量其 生长直径。 ( 】) p d a 培养基( p d a ) 马铃薯2 0 0 o g 、葡萄糖2 0 o g 、琼脂2 0 0 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 。 ( 2 ) p s a 培养基( p s a