（基础兽医学专业论文）牛、鸡和猪γ干扰素的克隆表达与单克隆抗体的研制.pdf

y 9 8 3 3 5 s 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进 行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指 导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中暖确 说明。本声明的法律责任麦本人承担。 本人完全了解出东农业大学有关保留和使用学位论 文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机 构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 赵尘一 暇 盏沙 出末农业大举鞭士论文 i f n p c r l p 善g s d s p a g 毫 k d i f a e l i s a e l l s 药o | f c m v s v g f p m d b k e e f p k i u a p c m h c n k d n a r n a u t r l a l s 罩a t a t p i l m c a b 1 1 1 t e 舶r o n 英文编略表 干扰素 p o l y l n e r a s ec h 血f e a c t i o n聚合酶链式反应 l s o p f o p y 筘一d 一盎i o g 文a c t o s i 如吴嚣基- d 一骧代半孚i 糖萤 s o d i d o d e 嘲s u l 懿ep 。l y a c r y i a 碰d e 斟e l e e 缸h e f e s i s 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 瞄1 0 d a l t o n干道尔顿 i i r l i n _ u i l o n u o r e s c e n c ea s s a y免疫荧光测定 e n 搿m e i i n k e di m m u n o s o r b e 嫩a s s a y 辩联免疫吸隧测定 e 蹴y 擞e l i 呔艇i m 辩豫。蹄o la s s a y酶淡免疫斑点爨定 f l o wc m o m e 拄y流式细胞术 v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s水泡性口炎病毒 g r e e nn u o r e s c e n c ep m t e i n绿色荧光蛋白 m a d i 静d a f b yb o v i n ek i d n e y ( c e l l s )马一达氏牛鹭( 细胞) c 撼文e 融b r y o 懿r o b l 鑫s _ e l l s )鹋怒裁纾维细蘧 p o r c i n e 甄d n 彰( c e l l s )猪肾细胞 i n t e m a t i o n a l1 1 i l i t国际单位 a n t 豫e np r e s e m i n gc e l l抗原递呈细胞 m a j o rh i s t o c o m p 曲i l i t yc o m p l e x 主要缝织穗容瞧( 捩骧) 复台穆 n a 撇越黼l i e fcell巍然杀侥绍魏 d e o x 蜘b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 硒b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 u n t r a n s l a t e dr e 西o n不翻译区 j a n u sk i n a s e门神激酶 s 毽黻 重r 醵s d 珏e 嚣越d 韪e 垃v 毅o fo f 妇n s 藤p t i o 娃 信号传导和转录激活因子 a d 棚o s i n et r i p h o s p h a t e三磷酸腺昔 i n 协r l o u k i n白细胞介素 m o n o c l o l l a la n t i b o d y单克隆抗体 秦立廷：牛、鸡和猪y 干扰素的克隆表达与单克隆抗体的研制 p v d f i c k t s t p p d k a n a a m d g e n t t e t l b e d t a p b s p e g d m e m h b s h r p s v 4 0 l a c z d m s o d a b h t h a t n c p f u x 唱a l r n a s e a 0 p d p o l w i n v l i d e n ed 讯u o r i d e聚偏( 二) 氟乙烯 i h t r a c e l l u l a rc v t o k i n e细胞内细胞因子 t u b e r c u l o s i ss h nt e s t结核菌素皮内试验 p 诚矗e d 口m t e md 谢v a t i v e结核菌素纯化蛋白衍生物 k 蝴v c i n卡那霉素 a m d i c i l l i n氨苄青霉素 g e n t m n i c i n庆大霉素 t e 打a c v c l i i l e四环素 l 谢a b e r t a l l il b 液体培养基 e t h y l e n e d i 跚i n et e 打a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 p h o s d h a t eb u f 怡r e ds 0 1 u t i o n磷酸盐缓冲溶液 p o l y e t h y l e n e 垂y c o l 7 7 聚乙二醇 d u l b e c c o sm o d i f l e de a g l e sm e d i m 达尔伯克改良伊格尔培养液 h a i l l ( sb a l a l l c e ds a l ts o l u t i o n汉克( 氏) 平衡盐溶液 h o r s e r a d i s hd e r o x i d a s e辣根过氧化酶 s a r c o m av i m s肉瘤病毒4 0 l a c t o s eo p e r o nzp 半乳糖酶 d i m e t h y ls “p h o 】( i d e 二甲基亚砜 3 3 一d i a i i l i n o b e i l z i d 洫二氨基联苯胺 h y p o x a t h i n e a n dt h y m i d i n e 次黄嘌呤与胸苷 h y p o x a t h i n e ，a m i n o p t e r i n ，a n dt h y m i d i i l e ， 黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷 n i t r o c e l l u l o s e硝酸纤维素 p l a q u ef o r m i n gu i l i t 蚀斑形成单位 5 溴一4 氯一3 吲哚b d 一半乳糖营 r n a 酶a 联苯二胺 2 山东农北大学硕士论文 牛、鸡帮猪￥干扰素的克隆表达与 单克隆抗体的研制 摘要 二 魏素( i 瓣蕊珏，麟) 怒巍特定赘诱叟蘩豫鼷下，交缀憨产生 的一种具有赢艘生物活性的糖蛋囱，在同种动物纲脆上舆有广谱抗病毒 活性。根据i f n 蛋白的氨基酸序列、细胞来源以及它们所结合受体的不 同，将其分为i 型i f n 和i i 溅i f n ，i i 型i f n 主要是v 干扰素 ( i n t 钟f e r o n 峨a m m a ，i f n y ) ，除具有i 型i f n 抗瘸毒活性外，还具 畜疆特敦免痰调节功麓霹抗秘痰器建。由于l f n 一￥对税传免疫系统其 有极大静谲节律稻，是祝俸发撂受疫葫能，r 清豫钵两瘸原俸不可缺少靛 成分，因此，i f n y 在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起 着重大作用，是现代分子生物学，免疫学和临床医学研究的热点之一。 。本研究通过p c r 扩增出不包含信号肽的牛、鸡和猪i f n y 的基 毽，分裂构建了原核表这质粒蟥黔b o i f n y 、p e 孓e h 王f n 一￥帮p e 孓 p o l 瓠一￥，转凭b 弛l 宿主营，缀l p 蕈g 诱导，表这簪、鹃葙猪i f n ￥ 的重组蛋白。乳化后免疫兔子获褥抗i f n y 特异饿免疫血清，抗牛、 鸡和猪i f n ，y m 清抗体效价分别为：1 ：1 1 0 4 、l ：l 1 0 6 和1 ：1 1 0 5 。 为了探讨牛、鸡和猪i f n ，v 在真核细胞中的表达，从而获得具有 高效抗病毒活性的重组i f n y ，本研究构建了包含完魁o r f 的重组真 接表达矮粒p e a g g - b o 秘 一￥、p c a ( 港一e h l f n 一￥秘费c a g g _ p o l f n ￥，转染2 9 3 下缁胞，瞬时表达牛、鸡和猪i f n y 熏缝蛋白，从而证蜜 i f n y 基因可以在哺乳动物细胞中发达，并能借助于自身的信号肽分泌 到细胞外，通过v s v 4 g f p - m d b k ( c e f 、p k 1 5 ) 系统细胞病变抑制 法，测定重缀i f n y 具有高效抗病毒活性，牛、鸡湖猪y 干扰索抗病 毒活毪均为：2 | 0 彤抽1 。 为了大爨获得在结梅帮功麓簿方瑟更接近天然，并显其存一定稿寐 应用价值的熏组i f n v ，本研究构建了包含完整o r f 的重组杆状病毒 r b a c b o i f n y 、r b a c c h i f n y 和r b a c p o i f n y 。间接i f a 和间接 秦立廷：牛、鸡和猪y 干扰索的克隆表达与单克隆抗体的研制 e l i s a 证实：牛、鸡和猪i f n y 在重组杆状病毒感染的s f 9 细胞中获得 表达，并且重组i f n y 与天然i f n y 一样借助自身的信号肽分泌到细 胞外，通过细胞病变抑制法，测定重组i f n y 具有高效抗病毒活性， 牛、鸡和猪y 一干扰素抗病毒活性分别为：2 1 0 3 i u m l 、2 1 0 5 m m l 和 2 1 0 4 r u m l 。 本研究利用纯化的大肠杆菌表达的重组i f n y 免疫b a l b c 小鼠， 通过细胞融合，以重组杆状病毒表达重组n y 为筛选抗原，获得分 泌抗b o i f n y 、抗c h i f n y 和抗p o i f n y 单克隆抗体阳性杂交瘤细胞 株各1 株，分泌抗体均为i g g l 亚型。经连续传代，杂交瘤细胞株分泌 抗体的能力保持不变，并且在冻存3 个月、6 个月后，复苏杂交瘤细 胞，生长状态良好、分泌抗体能力不变。 本研究通过几种表达系统对i f n y 进行表达，并对其抗病毒活性 进行了初步测定。结果表明：几种系统均能对i f n y 进行表达，而且 表达产物均具有抗病毒活性，以真核细胞表达活性较高，为临床应用奠 定了基础；同时我们制备出了抗b o i f n y 、抗c h i f n y 和抗p o i f n y 单克隆抗体，为以后建立e l i s a 、e l i s p o t 、f c m 方法定性、定量检 测i f n y 提供了有利保障。 关键词：干扰素：表达；抗病毒活性；单克隆抗体 4 山东农业大学硕士论文 c l o n i n ga n 娃e x p r e s s i o 娃o fb o v i h e ，c h l c k e 珏，p o r c i 珏e i n t e r f b r o n g a n i i n aa n dp r o d u c t i o no f m o n o c l o n a la n t i b o d i e s a b s l r a c 鼍 i r l t e r 癌r o n ( i f n ) ，髀n e r a t e db ys p e c i 蠡cc e l l si n d u c e db yi 蚶娃c e r ，i sa k i i 试 o fg l y c o p r o t o i nm a tp o s s e s s e sl l i g hb i o a c t i v i t ya n db r o a d s p e c 仃l 瑚a 工l t i v i r a l a c t i v i 毋o nt h eh o m o g e n e i 可a n i m a lc e l l s i ti sm a i m yd i v i d e di m ot 、v ot y p e s ， t y p eia n d 娜e h ，a c c o r d i n gt oi t s 蛐oa c 讨s e q u 。n c e ，r e s o u r c ea i l d 矗餐毫嚣n tf 。c e p t o t 殛珏i si 瓣e r 怒f 。珏g a 翔璜a g f n 一￥) 凌雒圭l 豁式s i 蚤e t i m 秘u n o l o 垂。采f e g 癌藤。珏 繇莲矗藤一咖ff 畦e t i o 拄。d 黼t o 酝e 珏。懿矗u s r e g l l l a t i n g 内n c t i o ni ni m m u n es y s t e m ，i f n - yi san e c e s s a r yc o m p o s i t i o ni n e l i m i n a t i n gp a m o g e nb yo 唱a i l i s i m a c c o r d i l l g l y ，i f n ，vp l a y sa ni i n p o r t a n t r 0 1 ei nt h ea s p e c t so f d i a g o s i s ，1 e r a p ya n dd e t e c t i n gv a c c i n ee 疏c ta t l di t i s o n eo f 趣eh o ts p o t si n 也e 瑚o d c mm o i e c u l a rb i o l o g y ，妇u n o l o g y 强d c l i 蠢e 畦强e 越c 娃# r e s e a h 。 王壬l t 蕊s c x p e 打m e n t ， r e c o 搦b i n a n t p r o k a r y o t i ee x p f e s s i o np l a s m i d s p e t 3 0 a i f n yc o m a 证i n gb o v i n o ，幽i c k e na n dp o r c i n ei f n yg e n et h a tw a s a m p l 试e db yp c rw e r ec o n s t n l c t e d t h e s ep r i m e r sw e r ed e s i g n e d t o e l i m i n a t es i g n a 王r e g i o n so fm eb o v i n e ，c h i c k e na n dp o r c 汛ei f n yp r o t e i n a fa 氆p l i f i c a 蛀o n p e t 3 0 争i f n - yw a s 拄a n s f o 衄e d 触bh o s tb a c 溆主ab l 2 l h 基w 程e 谯。疆i 娃纛珏e e d 努i p 粥s d s p a g ew 勰e 鑫r 蠢e 硅奄毫s s 戳 r e c o m k n a n tp r o t 。i ne x p r e s s e db yb l 2 la 矗e rp 诚n c a t o nu s i n gn i 求t a r e s i n t h er e s u l tw a sc o n f i m e dt l l a tb o v i n e ，c h j c k e na i 】dp o r c i n ei f n - yw e r e e x p r e s s e di nb l 2 la n da l lt h e 聪c o m b i n a mp m t e i sw e r ea b o u t2 5k d r a b i t sw e 南i m m u n i z e dw i t ht h er c c o m b i n a mp r o t e i ne m u l s i f i e d 枥t hf r e u n d 喇h v 强t 。t h e 粼i b 。d yt i t e r so fs e 黼w e r ed e 圭e 滩攮e d 磅i n d i r e e te n 驷e l 越e 莲i 狂黼娃鞋o s o 如e 贰勰s a y 潼l l s 釉t 沁f e s u l t sw o f et 蕊t 醅a 盎畦b o 白 t i t e r so fr a b i ts e r u mi m m u n i z e db yb o v i n e ，c h ；c k e na n dp o r c i n ei f n - ￥ c o m b i n a l l tp m t e i n 、牝r e1 ：1 1 0 4 ，1 ：1 1 0 6a i l dl ：1 1 0 5 秦立廷：牛、鸡和猪ym 干扰素的克隧袭达与单克媵抗体的研制 e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d sp c a g g - i f n yw e r ec o n s t r u c t e d t h e y 融槲e 胁s & 翘i 越o2 粥te i s 谤e a l c i 眦鑫c i d 砖。警h 鑫捃撼e 8 f 翠。越 t 雠m s i e n t e x p r e s s i o n i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c ea 1 1 a i y s i s ( i f a ) a n d n d i t e c te l i s aw e r ec a n i e do u tt od e t e c tt h e s e “p r e g 对o nu s i n 叠r a b i ta n t i l f n - ￥s e 蝴。羹l ef o s 溱sw e f ee 鑫f m 醛氇8 tb o v 纛e ，越e 沁藏a 硅莲帮瞄i 黼 i f n yw e r ee x p r c s s e di n2 9 3 tc e l l sa n dm em a t l l r ep r o t e i nw a ss e c r e t e do u t o fc e l l sb ys i 泓a lp e p d d e 1 1 l e 黼t i v i r a la c t i v i t i e so ft h es u p e 趣a n a n to f2 9 3 t c e l i s 台a 珏s f e e 据db yp c a g g l f n 一￥w a sm e a s u r e d 盼v s v 4 g f p m d b k ( c e f 、p k - 1 5 ) c e l l ss v s t e m t h er e s u n sw e r et h a ta n t i v i 蒯a c t i v i t i e so f 糟c o 翔b 汤a n tb o v i n c c 攘c k e 珏a n dd o 羚i 矗el f n ￥w e 羚艇il l 扩i u 删， t h r e ed o n o rp l a s i i l i d s ，p f a s t b a c t 吃b o i f n 一￥，p f a s t b a c t m c 1 1 i f n v a n dd f a s t b a c l m p o i f n v ，w e r ec o n s t r u c t e da n dt r 彻s f o n n e di n t oh o s t b 穗畦鑫d 差| 0 b 阮e o m b 囊a 继建珏拄l ep l 嚣接i 丞转a e m 诞一l f 猜￥w 嚣辩 e x 妇c t e d 舶md h l 0 b a c 趾dt h e nt m s f e c ti n t oi n s e c tc e l l s ( s f 9 ) b yl i p o s o m e r e c o m b i n a n tb a c l l l o v i n l s e s ( r b a c i f n y ) t h a tw e r e 嬲坤e df b ms u p e m a 玎黼t o fs 零c e l l s 扭越s 受e t 。dw i t l lb 8 c m i 玉i n ￥i n f e c t 艇s 园c l st oe x d 端s s m c o m b i l l a n td r o t e i l l i n d i r e c ti f aa i l di n m r e c te l i s aw e r ec a r r i e do u tt 0 d e t e e t 吐端s ee x p 辩s s i o nu 西n gr a b i ta m o l f 冬卜￥s t h e 瓣s u l t sw 尊r e c o n f i m l e d 搬a b o v i n 。c 璇c k 麟a n dp o r c i n ei f n yw e r ee x p r o s s e d 主ns f 9 c e l l sa n dt h em a t u r ep r o t e i nw a ss e c r e t e do u to fc e l l sb ys i 印a lp e p t i d e t h e 越娃i v 矗曩a 文v 至t i e so f 谯es 嘲臻鞠勰to fs 移c e l l si n c t e db y 撼a c l f n * ￥ w e r em e a s u r e db vv s v + g f p m d b k ( c e f 、p k * 1 5 ) c e l l ss v s t e m t 1 1 e r e s u h sw e r e 也a ta n t i v i t a la c t i v “i e so fr e c o m b i n 越nb o v i n e c m c k e n 曲n d p o 强i 巷el f n 一￥w e f el l l 毛影m l ，l 0 i 毛舅辩l 勰d l 妒王u ，辩l ， r e s p e c t i v e l y b a l b cm i c ew e r ei m m u n j z e db yr e c o m b i n a n tp r o t e i ne x p r e s s e db y 嚣。c o l i s p 轮e 菇e e l l so f 越锄s ei 黼强i z e dw e f e 是s e 莲w 至氇s p 2 国糙y e l o 热a c e u sa n dt h r e eh y b r i d o m ac e l ll i n e ss e c r e t i n gm o n o c l o n a l 姐t i b o d y ( m c a b ) ， a n t i b o i f n ，y m c a ba n t i c b i f n ya n dm c a ba n t i p o i f n yw e s 式e e t 毒db yi n 鑫i i r e e te 己l s au s 斑g ! 罄c o l n b i n a i 娃辩毪噜一￥e x p f e s s o db y r e c o m b i n a n tb a c l l l o v m l si ns f 9 t h ea b i l i t i e so fh v b r i d o m ac e l ll i n e s 6 山东农北大学硕士论文 s e 氍e 蠹培醚e a b 煳蠹n e 矗氇es a m e 鑫蠡e rs e v e f 越g e n e r a 缘) 髓so f 叠e e z e d 氇r e e m o n m sa n ds i xm o n 吐l s1 a t e r hn l i ss t u d y ，廿1 r e ee x p r e s s i o ns y 8 t e m sw e r eu s e dt oe x p r e s s e di f n y 她dt i l e s ea i l t i 们r a ia c t i v i t i e so ft 1 1 e s ep m d u c t sw e r er 咖黛hd e t e m l i n e d t h e r e s u i 招，o ft b i ss 搬d y8 r ec o l 曲眦e dt h a ti f n yc a nb ee x p r e s s e di i lb o t h 翠o k 麓y 。 泌e 文l s 黼de 呔敬y o t i ce e s ，疆氇ea 琏t i v i f 越掀 v 秘l 礤￥ e x p r e s s 蠢趣e 呔a r y o t cc e l l si sm u c hh i 尊e r 磕a 珏谊p f o 鬏a r y o t i cc e 王l s ，w l l 主_ 出 m a k e saf b u n d a t i o nf o rc l i n i c a l a p p l i c a t i o n t h e s em o n o c i o n a la n t i b o d i e s w e r ed e v e i o p e d ，w m c hm a k e si tc o n v e n i e mt od e t e c ti f n - yi nt 1 1 eq u a n t i t y b ye l i s a ，e l i s p o ta n df c m x 帮w 8 砖s ：l 棘托r 撙珏；e x p 獬s i 。弼拜矬t i v i 糙la c 耋v i 撂；瓣。毪o e l o 拄a l a 拄t 渤o d y 7 秦立廷：串、璃窝猿y 于撬素的藏臻淡这与单克瀣按体浆辑镬l 引言 干扰素( i n t e r 怒r o n ，i f n ) 是在特定的诱生剂刺激下，e 妇细胞产生的 一类具有高度生物滋髓的糖蛋白，在嘲罩孛动物细胞上其鸯广谱撬病毒活 瞧，豫瑟之夕 还鸯免疫镶节、捧毒l 缓翘分裂彝撬骚瘗等叟携学活毪。2 0 1 鼓j 纪3 0 年代，人们发现机体感染菜一瘸毒后会对另辨一种抗原性毫无 关系的病毒产生干扰现象，直到1 9 5 7 年，i s a a c s 和l m d e r h n 籼利用鸡 胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时才发现病毒感染细胞时，细胞产生一 摊能干扰其它病毒嶷制的细胞园子，劳命名为干扰素( 1 s a s ，】9 5 乃。于 羧素薯逮存在予垒貔器中，嚣蔻瑟戋羹，掰毒嚷襄费秘襄大多数禽类臻疑 产生干扰素。司附簇函序列的研究结巢袭明，该序歹| j 早瓷5 。l o 亿年前就 存在于生命细胞的菸因序列中，是生物体内的一种古老的保护因子 ( r o b e n s 砌订，1 9 9 8 ) 。根据i f n 蛋白的氮潦酸序列、细胞来源以及它们所 结合受体的不同，将篡分为i 型r f n 和i l 型i f n 。i 型i f n 常分淹n 、 两个耍型，分裂灏囊缨藏窝残纤维缀熬产生，它镅终耀予霹一受薅， 可乎审制病毒d n a 笈铡秘蛋白质合成，灏他n k 细怼，程邋溜ci 类分 予提呈抗原，另外牛、羊怀孕时滋养屡细胞分泌的与胚胎植入发育和母 体识别有关的i f n 吖( 牟红梅，2 0 0 2 ) 、猪怀孕时滋养层细胞分泌的i f n - 6 ( l e f e v r e ，1 9 9 8 ) 、人自细胞分泌的天然l f n e 、角质层细胞分泌的i f n - k 迄属于i 型i 羚；。l | 型墨n ，器掰n ，￥，又称为免疫涮，主要壶 c d 4 + 镌l 、c d 矿繁缁照渡及n k 缎激产生，它豫了其蠢抗瘸毒，莸黪 瘸活性外，更重要的是它还具有促进m l ci i 类抗原的表达，增强抗原 提呈细胞( a p c ) 与t 细胞的相互作用，增强辅助t 细胞和细胞毒性t 细胞产生的能力等诸多免疫调节活性。由于i f n y 具有独特的免疫调 节和抗病毒，抗瓣瘸终用，在临床上有缀好的应用翦景和潜力，关于其 本震、葵i 及箕俸翔方式一壹蹩纲赡生物学、兔疫学及瘸毒攀磷究中最 令人兴奋的课题之一。在上个世纪八十年代以前，人们主蒙通过诱导培 养外周血淋巴细胞溅其他细胞系生产l f n 。y ，但是这种方法产量低， 纯化工序繁琐，限制了其研究的发展。随着分子生物学的发展和基因工 程技术的兴起，1 9 8 0 年，d e r y n c k 秘r a 嫩q u c h i 分别克隆融了人的l f n - 山东农北大学碗士论文 ￥，1 9 8 2 零，转e 豫g e r 等稷掘入干貔素氨萎酸痔歹l l 繁一令人工合袋了 i f n y 基因，并克隆成功。随詹各种动物的i f n y 相继被克隆成功， 1 9 8 6 年d o u g l a s 等克隆出牛i f n y ，1 9 9 0 年d u k m a n s 克隆出猪i f n v ，1 9 9 5 年d i 鐾b y 克隆出鸡i f n y 。本文就i f n - y 的分子结构，合成 及其调控，僚号传导的途径及其分子机制，主要生物活性及其作用机 爨，杰蕊寨弱磺究孛赘痤爱 蕈以练遴。 1i f n y 理化特性及分子缡构 i f n 是一炎糖蛋白，分子鬣约为2 0 l o o k d ，沉降系数低， 1 0 0 0 0 0 9 不熊使蕻沉淀，不能通道普通透析膜，可通过滤菌器。一般由 1 5 0 1 7 0 令氨基酸组成，含有1 7 耱潋上氨基酸，其中天冬氨酸，谷氨 酸帮蹇氨酸含鬣鞍高，不含毒孩酸，所以不能被d n a 酶释r n a 酶酸 坏，但易被胰獭白酶、木瓜酶、乙醚、氯仿等破坏。 i f n y 由宿主细胞基因组编粥，人i f n y 基因定位于第1 2 号染色 体长臂上，慕因均含有3 个内含予茅口4 个外显子，第一个外显子包括5 瞒u t r ( u 涨a 珏s l a t e dr e g i o n ) 和缡鹦信号敦以及郝分成熟氨基酸韵基 鑫，筻二霸第三令终显子编强成熬簸耱部分氨鏊酸，簿瓣个矫显子卺含 编码终止密碣予部位氨基酸的基圆及3 u t r 。不同动物的外显子和内含 子核苷酸数燃不同，如鸡的i f n v 基因的前两个内含子长于哺乳动 物，而第三个内含子显著短于哺乳动物( k a i s e rp ，1 9 9 8 ) 。i f n y 都属于 分泌性蛋自，葵基因结构与其它分泌性蛋自豹基因绻构有相似之处，即 塞5 褒 绫羁嚣、售号获缡玛嚣、多获缡羁区窝3 潦薅绫玛区组藏。 人、猪和牛l f n 。y 蓠体为1 6 6 个鬣基酸残基，其中蘸2 3 个氨基酸为德 号肽，成熟鬣臼大小为1 4 3 个氨熬酸，鸡i f n y 前体由1 6 4 个氨基酸残 基，其中前1 9 个氨基酸为信号脓，成熟蛋白大小1 4 5 个氨基酸。各种 动物i f n 糖熬化位点数目不同，糖錾化位点对i f n 的抗病毒功能是非必 零豹，毽与l 羚 在薅内兹半衰期有关。藏熟i n 一￥瓣蠢嚣个耱基往斑 点，不同动物耱基亿位点位置鞘有不鞫( c e r r e 壤p p ，1 9 8 6 ；j o s e 两c ， 1 9 9 8 ) ：不同i f n 半胱氨酸的数濑和位置也不同，因弼形成不同数目的 二硫键，二硫键的形成对于i f n 的生物学活性和结构稳定性等是十分重 9 寨巍惩：牛、鸡和猪y - 干扰豢的克隆表达与单克隆抗体的研制 要豹。l f x 一羧篱要其套完整弱分子缝成方翼有完夔鹣囊穆学溪程，毽 是也有研究发现朝融￥在羧基端躐氨基端缺失几个氨麓酸仍能保持其 全部活性( m i c h a i s k iw p ，1 9 9 9 ) 。尽管氨基酸序列存猩差异，i 型i f n 与i i 型i f n 具有相似的三维结构，都由紧密排列的a 螺旋结构域构成， 并表现出相似的缴理、生化特征，如对p h 的稳定蛀和对同类细胞表面 受舞嚣莰爨。 粼。￥遂霉形残分予遗兔3 4 l 二聚铬澎式，足孚攫难狻 测出萁单体形式，两且单体形式没有生物学活性。霉一个单体含六个g 螺旋，其中四个装配成短链螺旋细胞因子，但不含8 折燕结构。这两个 亚单位以一种威平行方式相互作用。 2l f n y 信号传导的分子机制 长赣敬寒，关于翠n j l f 班及葵稳缁脆匿予分泌产黧器魏 霹作瘸子靶 细胞并发挥其擞物学活性一直是分子生物学和免疫学研究的热点，有着 各种各样的假说和争论，国内外研究者一度曾认为与激索和多肽一样通 过细胞内第二信使( c 煳心，c a 2 + 离子等) 发挥作用。9 0 年代后，随着 入和鼠珏n ￥爨俸分离与纯化、蒸嗣豹克隆及其功能的遴一步研究， 关予翻￥与受傣兹终震及萁缀熬蠹信号绩罢遘疆瑗邑戮究夔稳当清 楚，并且由此发现了3 0 多种细胞因子及其受体普遍用j a k s t a t ( j a k ，j a l l u sk i n a s e 或j u s ta l l o t h e rh n a s e 门神激酶；s t a t ，s i 鲫a l t r a n s d u c e ra i l da c t i v a t o fo ft r a i l s c r i p t i o n 信号传导和转渌激活因子) 途径 ( s t a r kg r ，1 9 9 8 ) ，而且已成为细胞内信号传导的经典摸式之一；除了 弘x s t a t 薅号传导途径之舞，逅卷纛发甏了l f n y 戆s t a 羊菲菝赣懿 信号传导途径( d 溅e ，1 9 9 8 ；r a n es g ，2 0 0 0 ) 。 i f n v 通过与细胞膜上广泛表达的特异性受体发挥作用，i f n y 受 体由两条链组成( m a r s t e rs a ，1 9 9 5 ) ：i f n g r - 1 及i f n g r 2 。i f n g r - 1 也 叫i f n yr - l 或i f n y r a ，分子膝爨为9 0 k d a ，为结合飘体所需，其基 嚣定谴于人染色髂6 q 1 每2 2 或氯1 6 号染色俸( b a c he a ，1 9 9 7 ) ；l f n g 王破 又蠲i f n ￥r ，主要参与信号转簿，其基因定位予入染色体2 l q 2 2 。l 或鼠1 6 号然染色体。j a k l 与i f n g m l 胞质结构域近膜区中的l e u p r o ， l y s s e r 序列发生作用，j a k 2 与i f n g r _ 2 结合( s a k a t s u m em ，1 9 9 5 ) 。 0 由奉农业大学 疆士论文 职n y 为二聚体，所以i f n y 的结合可以诱导i f n g r 1 二聚化，进一 步与i f n 饼0 2 结合。所以，功能性i f n y 受体应该包含两分予i f n g r _ l 和一分子i f n g r ，2 。 j a k s t a 下遴黪作为一秘将细熬膝痿号逐速传至缨臌拨豹援制丽特 秘受至l 重褫( z i 德l i e e 菇a ，1 9 舛； 酗黼髓c m ，1 9 9 7 ) 。b 甄j 盛激酶是 j a n u s 家族酪氨酸激酶，s t a t 蛋白怒信号传导因子以及j a k 激酶底物的 转录活化因子。现有大量有关j a k 与s t a t 的资料证实它们在细胞发 育、分化、增殖、转化及肿瘤发生中谢蘑要作用。i f n 。y 与受体结合后 主要通过j a k s t a t 途径进彳亍信号传嚣帮启动樱应基因的转录。i f n g 戳 与l 豫g r 2 在泰受到i f n 一￥裁激斡绥藏表嚣著不是耱互繁密联系戆，蓑 是较松散的，当鳓胞分泌产生的形成二聚体的i f n y 与受体的n 链结 合即被激活。一个i f n y 二聚体两端与两个i f n g r l 链相结合，导致另 两个i f n g r 2 分别向相应i f n g r l i f n y 复合物靠近并结合，i f n g r l 腿内区相结合的j a k l 与i f n g r 2 胞内医结合的j a l ( 2 相嚣熬近，j a k l 祁 j 越发生垂动磷羧伲露转移磷酸纯，激活夔j 呔l 露瑚0 又导致 i f n g r l 末端的4 4 0 a a 处豹酪氨酸磷酸纯，形成磷酸纯的y d k p h 位点 ( b a c he a ，1 9 9 7 ) ，两条i f n g r l 形成两个并列的酪氨酸磷酸化位点。由 于细胞胞浆内的9 1 k d a 的s t a t l 分子含有识别y d k p h 位点的s h 2 ( s r ch o m o l o g yd o m a i n2 结构( g r r e 耐a n da c ，1 9 9 5 ) ，两个s t a t t 分子 藏缝合到蘸个著别熬l f n 一￥疆f n g 袋l 复核甥i f n g r l 您内医鳇y d k p 缱煮上，著澈活了酪氨酸激酶，导致s t a t l 分子e 末滚的7 0 l a a 楚的 y 位点发生自身磷酸化，磷酸化的s t a t l 分子随即从i f n ，y i f n g r l 复核物上解离下采，形成s t a t l 二聚体( 又称g a f ，g a m m a i n t e r f e m n a c t i v a t i o nf a c t o r ) 。s t a t l 二聚体在依赖r a n ，r c4 的g t p a s e 的活性机 制作用下从胞浆转移到细胞核内，与l f n ￥所调控基翻的庙动子部位 瓣祷定g a s ，( g a s ，g a 珏臻8 粼t i v a 缱d 蘸把，孩棼酸_ 亭甍： 邯n c n n a a ) 序捌结合，启动该基戮的转录，引起机体辩i f n y 的初 次应答( d 啪e l lj r ，1 9 9 4 ) ，或与初次成答后产生的干扰豢调节因子i r f ( 1 1 1 t e 彘m nr e g u l a t o r yf k t o r ) 家族的i r f 9 或p 4 8 结合成三聚体 l s g f 3 ，进一步与所调控基因的i r s e ( i s r e ，i n t e r r o ns t j m u l 或e d 秦立廷：牛、鸡和猪y 干扰鬻的克隆表达与单克隆抗体的研制 r e g 越采o f ye l e 激e 髓孩昔酸枣磋：a g 霸曙c n n 讯c n e 理) 序裂结合， 驱动相应基因的表达，产生二次应答，发挥相应的擞物学活性( b o e h m u ，1 9 9 7 ) 。 i f n y 与受体结合引起信号传鼯后，i f n y i f n g r l 复合物被细胞 内在证，在细臌内相互鳃离，大多数纲胞内静i f n g r l 又重薪回至缨骢 表垂，荠麓蔽缡脆重瑟秘爝，蕊己诞实i f n g r l 稔区瘸第2 7 0 2 7 l 签夔 氨基酸l l 位点对于i f n y 枉f n g r l 复合物的内在化秘i f n g r l 的再循 环非常重要，假其机制尚不清楚( f a r r a rm a ，1 9 9 3 ) 。般认为胞浆内解 离产生游离的1 f n y 在细胞中棱柱被融酶体所降解，但在鼠的l 1 2 1 0 细胞系和其他一些细胞中却发现l f n ￥能被转运至l 缎胞核内，这种转 运斧建羞绥骢孩蠹基因夔转录溪豫掰产生。于是，入稻接溺，照浆中 i f n 一￥的存夜对其生物学活性可熊舆有一定的意义，这种推涮也逐渐被 一些实验所证实，如通过脂质体将i f n y 导入鼠巨嗽细胞内可以加强 其对肿瘤细胞的杀伤力，鼠巨噬细胞显微注入i f n y 可以诱导其i a 抗 原表达( f i d l e ri j ，1 9 8 5 ) 、在鼠成纤绒细胞表达非分泌f 匀人i f n y 可以诱 导萁建立菝癃毒状态等f s e 蕊e a l ij ，1 9 8 乃。近年寒磅究发凌，久i 烈一ye 末端存在一段碱性的核定位序列，滚攉测，i f n - ￥霹熊俸为一释绥麓痰 的分子伴侣，通过其核定位序列加快本身缺乏核定位序列的s n 蛆1 分 子转移到核内与g a s 结合，但这种推测还谢待进一步证实 ( s u k 吼姐i a mp s ，1 9 9 9 ) 。 j a k s t a t 信号传导存在反馈调节，翔在i f n ￥诱导静s o c s 1 ( s u p p r e s s o f 盛c y 缸斑n es i g 珏蘸i 娃g 1 ) 辩售号传导遘器瓣受反馈调节，再 如胞浆内磷酸化的s t a t l 分子可以很快被细胞内的鬣臼酶所降解，其 浓度在受体结台后1 5 3 0 m i n 到达高峰，随后在1 2 h 后降到最低( 弛m t k 9 6 ) i f n 。y 可以抑制t 细胞的i f n g r 2 的表达水平来降低其对n ￥的敏感性，与i f n 一￥结合的i f n g r l 可以快速发生去磷酸纯，i f n y 可淤诱导辍髂会残一些与j 矗绥会焉捧裁l 蠢活赣蕊黉鑫瑗霞缓憝对其 脱敏等，这照已知的和未知的途径起对信号传导移由此产生的枫体反 应进