（病原生物学专业论文）p38mapk介导fasfall凋亡信号通路在大鼠抗gbm肾炎中作用的研究.pdf

论文图片3 7 参考文献4 8 综述5 2 攻读硕士学位期间发表学术论文题目6 4 致谢6 5 论文声明6 6 论文评定审阅书6 7 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 a c r a p b c 口 b i s b s a b u n a c r y l a m i d e 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 英文全称 a l k a l i n ep h o p h a t a s e 丙烯酰胺 中文全称 碱性磷酸酶 5 b r o m - 4 c h l o r o - 3 - i n d o l y l p h o s p h a t e 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚磷酸 b i s a c r y l a m i d e b o v i n es e l t l ma l b u m i n b l o o du l e an i t r o g e n 甲叉双丙烯酰胺 牛血清白蛋白 血尿素氮 c a s p a s e 一3c y s t e i n y la s p a r t a t e s p e c i f i cp r o t e a s e 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶3 d t td l d i t h i o t h r e i t o l d m s o e b e d t a f a s f a s l g l y g b m i h c d i m e t h y ls u l f o x i d e 二硫苏糖醇 二甲亚砜 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 e t h y l e n e d i a m i n e t e r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸二钠 d i s o d i u m a p o 1o rc d 9 5 f a s l i g a n d g l y c i n e f a s 受体 f a s 配体 甘氨酸 g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e肾小球基底膜 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y免疫组织化学 m a p k s m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s丝裂原活化蛋白激酶 l 徐州医学院硕士学位论文 n b t o d p a g e p b s p m s f s d s n i t r o b l u et e r a z o l i u mc h l o r i d e氮兰四唑 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p o l y a r c y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 temedn ，n ，n ，n t e t r a r n e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四乙基乙二胺 tris t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲烷 t u n e lt e r m i n a lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd n a 脱氧核糖核酸末端转移酶介 n i c k e n dl a b e l i n g t w e e n 2 0t w e e n 2 0 洚君朊s t e mb l o t 2 导的缺口末端标记法 吐温2 0 免疫印迹 徐州医学院硕士学位论文 p 3 8 m a p k 介导f a s f a s l 凋亡信号通路在大鼠 抗g b m 肾炎中作用的研究 中文摘要 目的 复制大鼠抗肾小球基底膜( g b m ) 肾炎模型，探讨p 3 8 m a p k 介 导的f a s f a s l 凋亡信号通路在大鼠抗g b m 肾炎中的作用，为进一步阐明人类 新月体性。肾炎的致病机制及其防治提供理论基础。 - 方法1 复制大鼠抗g b m 肾炎模型，实验分为肾炎模型组和正常对照组， 肾炎模型组大鼠一次性注射兔抗大鼠g b m 血清，j 下常对照组大鼠尾静脉注射等 量正常兔血清，剂量均为1 m l 1 0 0 9 。肾炎模型组于实验前l w 足垫皮内注射正常 兔血清进行预免疫。于实验第2 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 、2 8 d 行如下处理：收集2 4 h 尿液检测2 4 h 尿蛋白，收集血清样本检测血肌酐及血尿素氮含量；取肾组织经光 镜观察肾组织病理变化。2 应用w e s t e r nb l o t 法检测第2 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 、2 8 d 肾组织标本中p 3 8 m a p k 、p - p 3 8 m a p k 、f a s 、f a s l 蛋白的表达情况。3 运用阻 断剂s b 2 0 3 5 8 0 阻断p 3 8 m a p k 磷酸化，观察抗g b m 肾炎大鼠的生化指标、病 理改变、细胞凋亡等情况。实验随机分为三组：阻断剂组，溶媒组，肾炎模型组。 阻断剂组于注射兔抗大鼠g b m 血清后3 h 、第3 d 、5 d 、7 d 、9 d 、ll d 、1 3 d 腹腔 注射s b 2 0 3 5 8 0 ，l m g k g ；溶媒组用相同的方法注射等量d m s o 。于实验第2 d 、 7 d 、1 4 d 行如下处理：收集2 4 h 尿液和血清样本检测2 4 h 尿蛋白、血肌酐及血 尿素氮含量；第1 4 d 取肾组织行如下处理：光镜观察肾组织病理变化；t u n e l 法检测大鼠肾组织细胞凋亡情况；w e s t e r nb l o t 和免疫组织化学法检测肾组织 p 3 8 m a p k 、p - p 3 8 m a p k 、f a s 、f a s l 蛋白表达情况； 3 徐州医学院硕士学位论文 结果1 与正常对照组相比，肾炎模型组大鼠尾静脉注射兔抗大鼠g b m 血清后，2 4 h 尿蛋白、血肌酐和血尿素氮含量均明显升高沪 o 0 5 ) ；而p - p 3 8 m a p k 肾炎模型组于各时间点均 明显高于j 下常对照组( 尸 0 0 5 ) ；f a s 、f a s l 蛋白表达量从第2 d 开始升高，到第 1 4 d 达到峰值，随后有下降趋势，但仍高于正常对照组( p o 0 5 ) 。3 阻断剂 组大鼠尿蛋白、血肌酐和血尿素氮含量均明显低于溶媒组及肾炎模型组( 尸 o 0 5 ) ；光镜观察到肾小球内细胞数目低于溶媒组及肾炎模型组，肾小管内未见 蛋白管型；t u n e l 法显示凋亡细胞阳性率明显低于溶媒组及肾炎模型组( p 0 0 1 ) ；w e s t e m b l o t 及免疫组化结果显示，p - p 3 8 m a p k 、f a s l 、f a s 蛋白表达量 均低于溶媒组及肾炎模型组( 氏o 0 5 ) 。 结论1 成功复制大鼠抗g b m 肾炎模型；2 p 3 8 m a p k 介导的f a s f a s l 凋亡信号通路参与大鼠抗g b m 肾炎的发病机制；3 阻断剂s b 2 0 3 5 8 0 可以减轻 大鼠抗g b m 肾炎肾组织病理学损伤，为临床防治抗g b m 肾炎提供了实验依据。 关键词大鼠；抗g b m 肾炎；p 3 8 m a p k ；f a s f a s l ；细胞凋亡 4 徐州医学院硕士学位论文 s t u d y o fp 3 8 m a p k i n d u c i n gc e l la p o p t o s i st h r o u g h f a s f a s lo na n t i - g l o m e r u l a r b a s e m e n tm e m b r a n e n e p h t i t i si nr a t s a b s t r a c t o b j e c f i v es u c c e s s f u l l yr e p r o d u c e dt h ea n t i g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ( g b m ) n e p h r i t i sm o d e li nr a t sa n d t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fa p o p t o s i sm e d i a t e db y p 38 m a p k o na n t i g b mn e p h r i t i si nr a t s m e t h o d s 1 r e p r o d u c e dt h ea n t i - g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ( g b m ) n e p h r i t i sm o d e l t h er a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ：n e p h r i t i sg r o u pa n d n o r m a lc o n t r o lg r o u p t h er a t si nn e p h r i t i sg r o u pw e r ep r e i m m u n i z e ds u b c u t a n eo f n o r m a lr a b b i ts e r u m7d a y sb e f o r et h ei n j e c t i o no fr a b b i ta n t i r a tg b ms e r u m t h e r a t si nn o r m a lc o n t r o lg r o u pw e r ei n j e c t e do fn o r m a lr a b b i ts e r u m a l lr a t sw e r e o b s e r v e df o r2 4 hu r i n a r yp r o t e i n ，s e r u mc r e a t i n e ，s e r u mu r e an i t r o g e no nt h e2 n dd a y , t h e7 t hd a y , t h e14 t hd a y , t h e21s td a ya n dt h e2 8 t hd a y a tt h es a m et i m e ，t h ek i d n e y s p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e da ti n t e r v a l sf o rt h eo b s e r v a t i o no ft h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e s 2 t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fp 38 m a p k , p - p 38 m a p k , f a s ，f a s l w e r ed e t e c t e db y w e s t e r n b l o t 3 b a s e do nt h ep r e v i o u sr e s u l t ，w eu s es b 2 0 3 5 8 0t ob l o c kp 3 8 m a p k t h er a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ：p 38 m a p kb l o c kg r o u p 、s o l v e n t c o n t r o lg r o u pa n dn e p h r i t i sg r o u p t h r e eg r o u p sw e r ep r e i m m u n i z e ds u b c u t a n eo f n o r m a lr a b b i ts e r u m ，a n dt h e na l lt h er a t sw e r ei n j e c t e dt h er a b b i ta n t i - r a tg b ms e r b m 7d a y sl a t e r t h er a t si np 3 8 m a p kb l o c kg r o u pw e r ei n j e c t e dt h es b 2 0 3 5 8 0t ob l o c k p 3 8 m a p k o nt h e1 s th o u r ，3 r dd a y , 5 t hd a y , 7 t hd a y , 9 t hd a y , l l t hd a ya n d1 3 t hd a y a f t e ri n j e c t i n gt h er a b b i ta n t i - r a tg b ms e r u m ，t h er a t si ns o l v e n tc o n t r o lg r o u pw e r e i n j e c t e dt h ed m s oa n dp h y s i o l o g i c a ls a l i n ea tt h es a m et i m e a l lr a t sw e r eo b s e r v e d f o r2 4 hu r i n a r yp r o t e i n , s e r u mc r e a t i n e ，s e r u l t lu r e ao nt h e2 n dd a y , t h e7 t hd a y , t h e 1 4 t hd a y a tt h es a m et i m e ，t h ek i d n e ys p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e dt oo b s e r v et h e p a t h o l o g i c a lc h a n g e s ；t h ee x p r e s s i o no fp 3 8 m a p k ，p - p 3 8 m a p k ，f a sa n df a s lb y i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o da n dw e s t e r nb l o t ；t h en u m b e ro fa p o p t o t i cc e l l s d e t e c t e db yt u n e lm e t h o d r e s u l t 1 c o m p a r e dw i t ht h o s ei nt h ek i d n e y so f c o n t r o lg r o u p ，t h e2 4 hu r i n a r y 5 徐州医学院硕士学位论文 p r o t e i n ，s e r u mc r e a t i n ea n ds e r u mu r e an i t r o g e nw e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e di nt h er a t s i n j e c t e dw i t hr a b b i ta n t i g b ms e r u m ( p 0 0 5 ) g l o m e r u l a rh y p e r c e l l u l a r i t y , p r o t e i n c a s t sw e r eo b s e r v e di nt h en e p h r i t i cr a t s 2 t h e r ea r en od i f f e r e n c eo ft h ee x p r e s s i o n o fp 38 m a p kb e t w e e nt w og r o u p s ( 胗o 0 5 ) b u tc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o l g r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fp - p 38 m a p k ，f a sa n df a s lw e r ed e c r e a s e d ( p o 0 5 ) 3 t h e 2 4 hu r i n a r yp r o t e i n ，s e r u mc r e a t i n ea n ds e r u mu r e an i t r o g e nw e r eo b v i o u s l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) i nt h ep 38 m a p k b l o c kg r o u pc o m p a r e dw i t ht h en e p h r i t i sg r o u pa n ds o l v e n t c o n t r o lg r o u p ；t h e r ea r el e s sc e l l si nt h eg l o m e r u l u sa n dn op r o t e i nc a s t si nt h e p 38 m a p k b l o c kg r o u pc o m p a r e dw i t ht h en e p h r i t i sg r o u pa n ds o l v e n tc o n t r o lg r o u p ， a n dg l o m e r u l a rh y p e r c e l l u l a r i t y , c r e s c e n t s ，l o t so fp r o t e i nc a s t s ，s e r i o u sl y m p h o c y t e i n f i l t r a t i o nw e r eo b s e r v e dt h en e p h r i t i sg r o u pa n ds o l v e n tc o n t r o lg r o u po nt h e14 t h d a y ；t h en u m b e ro fa p o p t o t i cc e l l si nt h ep 38 m a p k b l o c kg r o u pi so b v i o u s l yl e s s t h a nt h a to ft h et h en e p h r i t i sg r o u pa n ds o l v e n tc o n t r o lg r o u p ( p 0 o1 ) ；t h en u m b e ro f c e l l se x p r e s s i n gp p 38 m a p k ，f a s l ，f a si nt h ep 38 m a p kb l o c kg r o u pi so b v i o u s l y l e s st h a nt h a to f t h et h en e p h r i t i sg r o u pa n ds o l v e n tc o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o ni s u c c e s s f u l l yr e p r o d u c e dt h ea n t i g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ( g b m ) n e p h r i t i sm o d e li nr a t s 2 p 3 8 m a p ki n d u c ec e l la p o t o s i sb ya c t i v a t i n gd e t h r e c e p t o rs i g n a l i n gp a t h w a y si n v o l v ei na n t i g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ( g b m ) n e p h r i t i s 3 t h er e n a lp a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa n t i - g b mn e p h r i t i sc a nb er e d u c e db y s b 2 0 3 5 8 0 ，a n dp r o v i d e de x p e r i m e n t a lb a s i sf o rc l i n i c a lc o n t r 0 1 k e yw o r d sr a t ；a n t i g b mn e p h r i t i s ；p 38 m a p k ；f a s f a s l ；a p o p t o s i s 6 徐州医学院硕士学位论文 上 刖 看 人类新月体性。肾小球肾炎是人类肾小球肾炎中常见病、多发病。临床上多数 患者起病急、病情凶险、病程迅速、预后较差。近年来研究认为，该病是一种自 身免疫性疾病，其发病撇0 较为复杂，其病理特征为大部分肾小球伴有新月体形 成，早、中期肾小球内可见大量免疫细胞( 如t 细胞、巨噬细胞等) 浸润，各种 炎症介质和细胞因子的释放，肾组织固有细胞( 如肾小球内皮细胞、系膜细胞和 上皮细胞等) 过度增殖；在新月体形成的晚期，肾小球内细胞明显减少，直至成 为无细胞玻璃样小球( 即纤维化) ，最终肾功能完全丧失【1 捌。因此深入研究新月 体性肾小球肾炎的发病机制及可能的防治策略已成为急需解决的关键问题。 p 3 8 m a p k 由b r e w s t e r 等于1 9 9 3 年发现【3 1 ，属于丝裂原活化蛋白激酶 ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，m a p k s ) 家族，是细胞内重要信号转导系统。 它通过转录因子而改变基因表达水平，参与细胞内信息传递过程。介导细胞生长、 发育、分化、凋亡等全过程。近年来研究发现，p 3 8 m a p k 在肾小球肾炎的发生 及发展过程中有着重要作用。 p 3 8 m a p k 在肾脏中主要定位于肾脏的实质细胞包括足细胞、内皮细胞、肾 小管细胞，浸润细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞等，p 3 8 m a p k 的表达量与节段 性增生、巨噬细胞的浸润以及蛋白尿的水平密切相关【4 】。在增生性和非增生性肾 小球肾炎中，p p 3 8 m a p k 在肾小球以及肾小管中表达量显著提高。同时 p 3 8 m a p k 信号分子对t g f p 1 和血管紧张素i i 介导的足细胞凋亡也是必需的。 阻断p 3 8 m a p k 信号通路后产生的效应包括抑制内皮素的表达从而减少中性 粒细胞的浸润，抑制m c p 1 的表达从而抑制肾脏巨噬细胞的浸润以及肾脏的病 理损伤【5 6 】。这些保护性效应和肾脏巨噬细胞以及t 细胞浸润减少，m c p 1 、 t n f a 表达降低以及i g g 在肾小球沉积减少有关川。 但是此前有关p 3 8 m a p k 相关信号通路的研究大多在i g a 肾病，狼疮肾炎， 糖尿病肾病等疾病当中，并且多数集中于对单个细胞比如系膜细胞，肾小管上皮 7 徐州医学院硕士学位论文 细胞的研究 7 - 9 】。而在大鼠抗g b m 肾炎动物模型中，对于p 3 8 m a p k 是否能够 通过f a s f a s l 信号通路参与细胞凋亡，运用阻断剂阻断此信号通路之后能否对 抗g b m 肾炎产生保护性效应，此类研究少见报道。 大鼠抗肾小球基底膜( g b m ) 肾炎，又称肾毒血清性。肾炎，是利用异种抗 大鼠g b m 抗体直接诱导后发生的具有典型人类新月体性肾炎病理变化的动物模 型【1 0 】，其病变如细胞增生、炎症细胞的浸润、纤维蛋白的渗出及新月体的形成、 g b m 不规则增厚和断裂等病理变化均与人类新月体性肾小球肾炎相似。由于该 模型是目前发病机制、病理改变和病变经过唯一类似于人类抗g b m 肾炎的实验 动物模型，具有起病急、病变重、重复性好和制作容易等特点f l l 】，在研究人类新 月体性肾小球肾炎的发病机制及探讨疾病的防治措施等方面，一直被广泛采用。 本实验在成功复制大鼠抗g b m 肾炎模型的基础上，运用p 3 8 m a p k 阻断剂 s b 2 0 3 5 8 0 进行干预处理，予不同时间点检测尿蛋白，血肌酐，血尿素氮的水平， 并于第1 4 d 处死大鼠后采用t u n e l 法观察不同处理组细胞凋亡情况，采用 w e s t e r nb l o t 、免疫组织化学方法检测不同处理组p - p 3 8 m a p k 、p 3 8 m a p k 、f a s 、 f a s l 的表达情况，从而探讨p 3 8 m a p k 与大鼠抗g b m 肾炎的关系，为阐明新月 体肾小球肾炎的发病机制提供实验依据，同时为寻找治疗人类肾小球肾炎的手段 提供新的思路。 8 徐州医学院硕士学位论文 第一部分 大鼠抗g b m 肾炎模型的复制及p 3 8 m a p k 介导的 凋亡信号通路相关蛋白的表达情况 大鼠抗g b m 肾炎是利用异种抗大鼠g b m 抗体直接诱导发生的具有典型的 人类新月体性肾炎病理变化的动物模型。由于该模型具有起病急、病变重、重复 性好和制作容易等特点，在研究人类新月体性肾炎的发病机制及探讨疾病的防治 措施等方面，一直被广泛的运用。 丝裂原活化蛋白激酶是细胞内重要的信号传递者，参与多种生理过程调节。 目前m a p k 亚家族主要包括e r k 亚家族、j n k s a p k 亚家族、p 3 8 m a p k 亚家 族及b m k l 。p 3 8 m a p k 信号转导途径是m a p k 家族中的重要组成部分， p 3 8 m a p k 可以由细胞外的多种应激包括紫外线、放射线、热休克、促炎因子、 特定抗原所活化。p 3 8 m a p k 在炎症、凋亡、细胞因子产生及缺血再灌注损伤中 起重要作用。深入研究p 3 8 m a p k 在大鼠抗g b m 肾炎中的作用有助于进一步解 释抗g b m 肾炎的发病机制，有助于为抗g b m 肾炎的防治提供临床依据。 本实验参考文献制备大鼠抗g b m 肾炎模型【1 0 , 1 2 】，随后，定期比较大鼠肾炎 模型组和正常对照组在生化指标及肾组织病理学方面的变化，证实大鼠抗g b m 肾炎可产生类似于人类新月体性肾炎的病理损害，同时检测p 3 8 m a p k 、 p p 3 8 m a p k 、f a s 、f a s l 在肾炎模型中的表达，为第二部分实验奠定基础。 9 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 1 材料 1 1 动物 正常健康s d 大鼠，雌雄不限，3 4 月龄，体重1 8 0 - 2 2 0 9 ；家兔，雌雄不限，体 重2 5 - 3 0 k g ，由徐州医学院动物实验中心提供。 1 2 主要试剂 i v 型胶原酶美国s i g m a 公司 完全弗氏佐剂美国s i g m a 公司 尿蛋白定量测试盒南京建成生物工程研究所 血肌酐测试盒南京建成生物工程研究所 血尿素氮测试盒南京建成生物工程研究所 h e 染液 b e y o t i m ei n s t i t u t eo fb i o t e c h n o l o g y 多聚赖氨酸武汉博士德生物工程有限公司 g o a tp o l y c l o n a la n t i r a tp 38 m a p ka n t i b o d y美国s a n t ac r u z 公司 r a b b i tp o l y c l o n a la n t i - r a tp - p 38 m a p k a n t i b o d y 美国s a n t ac r u z 公司 r a b b i tp o l y c l o n a la n t i - r a tf a sa n t i b o d y美国s a n t ac r u z 公司 r a b b i tp o l y c l o n a la n t i - r a tf a s la n t i b o d y美国s a n t ac r u z 公司 b c i p n b t 碱性磷酸酯酶显色试剂盒 b e y o t i m ei n s t i t u t eo f b i o t e c h n o l o g y 碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔l g gb e y o t i m ei n s t i t u t eo f b i o t e c h n o l o g y b c a 蛋白浓度测定试剂盒 b e y o t i m ei n s t i t u t eo f b i o t e c h n o l o g y 1 3 主要仪器 s w - c j i f 型净化工作台苏州净化设备厂 台式高速离心机 e p p e n d o r f 公司 5 8 0 4 r 高速冷冻离心机 e p p e n d o r f 公司 b i o p h o t o m e t e r 生物分光光度计e p p e n d o r f 公司 1 0 徐州医学院硕士学位论文 7 5 2 紫外分栅分光光度计 5 0 目、8 0 、3 0 0 目不锈钢筛网 3 x 5 代谢笼 各种规格加样器 l e i c a 2 3 5 5 型组织切片机 k e d e ek d b m 生物组织包埋机 b x5 1 正置荧光显微镜 m e t t l e ra t 2 61 电子天平 2 方法 上海第三分析仪器厂 苏州吴县辐射制品厂 苏州吴县辐射制品厂 e p p e n d o r f e p p e n d o r t 公司 公司 德国l e i c a 公司 科迪仪器设备有限公司，浙江 德国o l y m p u s 公司 瑞士m e t - t i f f 公司 2 1 提取s d 大鼠g b m 抗原 正常s d 大鼠经乙醚麻醉，无菌生理盐水( n s ) 心脏灌注后，无菌取肾组织， 剥除肾包膜，提取肾皮质并称重。将肾皮质剪碎放入5 0 目无菌不锈钢筛网中研 磨，边研磨边加无菌n s ，待筛网上只留下白色筋膜样物，取滤液；放入3 0 0 目 无菌筛网中，继续加无菌n s 研磨，取滤渣；用无菌双蒸水洗涤，4 ，3 0 0 0 r p m m i n ， 离心1 0 m i n ，洗涤3 次，取沉淀，即为不溶性的g b m 抗原。不溶性的g b m 抗 原经超声破碎后，加入胶原酶( 肾皮质净重6 9 0 6 5 9 加2 0 0 m g 胶原酶) 【1 3 】，3 7 。c 孵育2 4 h ，6 0 水浴2 h ，即得到可溶性的g b m 抗原。经b c a 法测得可溶性g b m 抗原含量为4 0 m g m l 。将可溶性g b m 抗原置无菌容器中，- 2 0 c 保存备用。 2 2 制备兔抗大鼠g b m 血清 用大鼠可溶性g b m 抗原反复免疫家兔制备兔抗大鼠g b m 血清。初次免疫 g b m 抗原的用量为2 m g k g ，与等量弗氏完全佐剂充分混匀( 完全达到油包水) ， 在家兔背部多点皮内注射。第3 w 以相同方法加强免疫1 次。第5 w 经耳缘静脉 抽血2 埘，收集血清，采用双向琼脂扩散法测血清效价为1 ：1 6 。g b m 抗原不加 佐剂，用量减为0 2 m g k g ，经耳缘静脉再加强免疫1 次。第6 w 再次测血清效价 为l ：3 2 。心脏穿刺采血，收集血清，分装冻存备用。 2 3 大鼠抗g b m 肾炎模型的复制及不同病期标本的采集 】1 徐州医学院硕士学位论文 正常s d 大鼠4 0 只，雌雄不限，1 8 0 , - , 2 2 0 9 ，实验前在本实验室饲养4 d ，以 适应环境。在此期间单笼收集大鼠2 4 h 尿，测2 4 h 尿蛋白含量，心脏穿刺采血收 集血清检测血肌酐和血尿素氮含量，4 0 只大鼠上述指标均无异常。随机将大鼠 分为两组，每组2 0 只，肾炎模型组大鼠一次性尾静脉注射兔抗大鼠g b m 血清； 对照组大鼠尾静脉注射等量币常兔血清，剂量均为l m l 1 0 0 9 。肾炎模型组于实验 前lw 足垫皮内注射j 下常兔血清进行预免疫。分别于实验第2 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 和2 8 d ，收集2 4 h 尿检测2 4 h 尿蛋白含量，心脏采血收集血清检测血肌酐和血尿 素氮含量，每组随机抽取4 只s d 大鼠，活体无菌取肾皮质，通过光镜观察肾脏 病理变化( 实验过程中大鼠无意外死亡情况) 。 2 4 生化指标检测 2 4 12 4 h 尿蛋白含量的测定采用c b b 法 将大鼠分别置代谢笼内仅供饮水，2 4 h 后收集尿液，测尿量。2 4 h 尿蛋白含 量的测定按试剂盒说明书进行。空白管加入5 0 1 d 双蒸水，标准管加入5 0 1 t l 蛋白 标准液，测定管加入5 0 9 l 待检尿液；每管均加入3 m lc b b 试剂，充分混匀后， 室温放置5 m i n 。7 5 2 紫外分光光度计( x = 5 9 5 n m ) 测o d 值，空白管调零。根据 计算公式计算出尿蛋白浓度，结合2 4 h 总尿量，计算出实验动物2 4 h 尿蛋白总量。 样本尿蛋白浓度= 测定管o d 值标准管o d 值】x 蛋白标准浓度( 标准品浓度 为7 5 0 m g l ) 。 2 4 2 血肌酐含量的测定采用苦味酸除蛋白法 样本的收集及处理：大鼠经乙醚麻醉后，心脏穿刺采血，大鼠胸腔壁比较薄， 心脏搏动很容易触及。抽取2 m l 血液，3 7 水浴l h ，4 cl h ，1 0 0 0 0 r p m ，离心 1 0 m i n ，收集血清。取0 2 m l 血清加入2 m l 钨酸蛋白沉淀剂中，充分混匀，3 0 0 0 r p m ， 离心1 0 m i n ，取上清，为血清除蛋白上清液。 血肌酐的测定按试剂盒说明书进行。空白管加入1 6 m l 双蒸水，标准管加入 1 6 m l 肌酐标准液，测定管加入1 6 m l 血清除蛋白上清液。上述各管均加入苦味 酸溶液0 5 m l 和0 7 5 m o l l 的氢氧化钠溶液o 5 m l ，充分混匀后，3 7 c 水浴1 0 m i n ， 徐州医学院硕士学位论文 取出后流水冷却。7 5 2 紫外分光光度计( 九= 5 1 0 n m ) 测o d 值，空白管调零。 样本肌酐含量= 测定管o d 值标准管o d 值】标准品浓度( 标准液浓度为 1 0 i _ t m o l l ) 1 1 ( 血清稀释倍数) 。 2 4 3 血尿素氮含量的测定采用二乙酰一肟法 样本的收集：大鼠经乙醚麻醉后，心脏穿刺采血，血样置3 7 水浴l h ，4 0l h ， 1 0 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ，收集血清。 血尿素氮的测定按试剂盒说明书进行。空白管加入5 0 9 l 双蒸水，标准管加 入5 0 1 t l 尿素氮标准液，测定管加入5 0 9 l 待检血清。每管均加入2 5 m ll g l 肟溶 液和2 5 m l 酸溶液，充分混匀后，沸水水浴1 5 r a i n ，立即用自来水冷却。用7 5 2 紫外分光光度计( l = 5 2 0 n m ) 测o d 值，双蒸水调零。 样本尿素氮含量= 测定管o d 值标准管o d 值】x 标准品浓度( 标准品浓度为 1 0 m m o l l ) 。 2 5 肾组织病理学检查 2 5 1肾脏组织处理及制片 s d 大鼠经2 戊巴比妥钠麻醉后，无菌切取肾皮质标本立即放入4 多聚甲 醛溶液固定4 8 h ，流水冲洗4 h ，依次浸入7 5 酒精6 h 、8 5 酒精2 h 、9 5 酒精 2 h 、1 0 0 酒精1 h 梯度脱水；脱水后浸入二甲苯进行透明2 0 m i n ；肾组织透明后 移入浸蜡缸浸蜡，蜡温6 2 , , 6 4 。c ，时间2 - 3 h ；最后石蜡包埋；制成3 1 t m 的石蜡 切片。 2 5 2h e 染色 2 5 2 1 切片至恒温箱烘烤过夜后，常规脱蜡至水：二甲苯i ( 1 0 m i n ) ，二甲苯 i i ( 1 0 m i n ) ，1 0 0 酒精( 1 0 m i n ) ，9 5 酒精( 1 0 m i n ) ，8 5 酒精( 1 0 m i n ) ，7 5 酒精 ( 1 0 r a i n ) ，双蒸水( 2 0 m i n ) ； 2 5 2 2 苏木素染色5 1 0 m i n ，自来水冲洗； 2 5 2 3 伊红染色1 - 2 m i n ，自来水冲洗，滤纸吸干水分； 2 5 2 4 常规梯度酒精脱水：依次进行7 5 酒精( 5 r a i n ) ，8 5 酒精( 5 m i n ) ，9 5 徐州医学院硕士学位论文 酒精( 5 m i n ) ，1 0 0 酒精i ( 2 m i n ) ，1 0 0 酒精i i ( 2 m i n ) ，二甲苯i ( 2 m i n ) ，二甲苯 i i ( 2 m i n ) 后进行中性树胶封片。光镜观察肾小球体积大小、肾小球内细胞数、新 月体形成及肾小管内蛋白管型等情况。 2 6 肾组织p - p 3 8 m a p k 、p 3 8 m a p k 、f a s 、f a s l 蛋白表达情况检测 采用w e s t e r nb l o t 法检测肾炎模型组，阻断剂s b 2 0 3 5 8 0 组和d m s o 组大鼠 肾组织p - p 3 8 m a p k 、p 3 8 m a p k 、f a s 、f a s l 蛋白表达情况。 2 6 1 蛋白样品制备 2 6 1 1 取所需样品1 0 0 m g 加入匀浆液4 0 0 p l 在冰浴中进行匀浆，后于1 2 0 0 0r p m ， 4 c ，2 0 m i n 进行离心，取清亮液体即为组织中的总蛋白质。 2 6 1 2b c a 法测定蛋白浓度，进行蛋白定量。 2 6 1 3 含相同蛋白量( 4 0 0 p g ) 的样品中加入等体积2 x 蛋白处理液，置沸水浴 中5 m i n 变性处理，取等量的变性蛋白质样品( 1 0 0 9 9 ) 上样，剩余样本一8 0 。c 保 存备用。 2 6 1 4s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 6 1 4 1 1 2 5 分离胶及4 浓缩胶的配制 分离胶 d d h 2 0 2 5 9 m l 3 0 a c r - b i s3 3 3 m l 1 5 m 聪s c l 1 0 s d s 1 0 过硫酸铵 t e m e d d d h 2 0 3 0 a c r - b i s o 5 m t r i s c l 浓缩胶 2 0 m l 0 0 8 m l 0 0 4 m l 0 0 0 4 m l 1 2 3 m l 0 5 3 m l l m l 徐州医学院硕士学位论文 1 0 s d so 0 4m l 4 0 蔗糖 1 2 m l 10 过硫酸铵0 0 2 m l t e m e d0 0 0 4 m l 先配制1 2 。5 分离胶，混匀后加入凝胶板中，用d d h 2 0 作为压线液，约3 0 m i n ， 倾去上层液体，用滤纸吸去残余液体，再配制4 浓缩胶，灌注上层，加成型梳 后3 7 聚合3 0 m i n 。 2 6 1 4 2电泳 拔去成型梳，加入电泳缓冲液，每凝胶孔加入3 0 1 t l ( 1 0 0 1 , t g ) 制备好的样品， 留一孔加标准蛋白。8 0 v 电泳2 0 m i n ，待样品电泳至浓缩胶分界线处时改换电压 1 2 0 v ，电泳8 0 m i n 。 2 6 1 5 转膜 2 6 1 5 1 剪与胶相同大小的p v d f 膜，先浸于甲醇中5 秒，然后放于半干转液 中，浸泡2 0 3 0 m i n 。 2 6 1 5 2 剪与胶相同大小的滤垫，在半干转液中浸透。 2 6 1 5 3印在半干式电转仪中进行。取下安全盖和阴极装置，在阳极上放一张 浸湿的滤垫，将浸湿的膜放在滤垫上，胶放在膜上，再放