（分析化学专业论文）半导体纳米材料的制备及其在生物分析中的应用.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 半导体量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 是近年来被广泛研究的一类发光物质，当 其直径小于其激子玻尔直径( 一般小于1 0n m ) 时，就会表现出特殊的物理和化 学性质。半导体量子点的这种特殊结构导致它具有量子尺寸效应、介电限域效应、 表面效应、宏观量子隧道效应等特性，并由此派生出半导体量子点独特的发光特 性。这些特性使它们在生命科学、分析科学、材料科学、免疫医学、检验检疫等 传统及新兴领域中发挥着越来越重要的作用。与传统的有机荧光染料相比，量子 点具有宽激发、窄发射、发射峰较窄并且对称、发射波长可通过控制它的尺寸大 小和组成来调节、荧光强度及稳定性是普通荧光染料的1 0 0 倍左右、生物体系中 几乎没有光漂白现象、生物相容性好等优点，可以用作荧光探针对生物样品和细 胞进行染色。近年来在纳米技术方面所取得的研究进展使得纳米材料可以设计为 高灵敏度的化学或生物传感器。纳米粒子与生物识别物质或结构相结合能够对某 一特定的分析物产生响应，从而形成了纳米生物传感器。一维纳米材料( 纳米棒、 纳米带、纳米管以及纳米线) 由于其在介观物理及纳米器件制造领域独特的应用 潜力而逐步成为新的研究热点，同时一维半导体纳米材料也因本身所具有的许多 独特的光学性质而获得了快速发展。理论研究比较成熟的是c d s e 纳米棒，与球 形半导体纳米粒子相比，c d s e 纳米棒的斯托克斯位移要大的多，并且在沿聚乙 烯一丁烯整齐排列的长轴方向上出现极化发射现象，这对于半导体纳米棒用于生 物材料标记时确定标记材料的取向很有帮助。c d s e c d s z n s 纳米棒作为探针用 作荧光标记就要比半导体量子点亮的多。最近相继报道了很多一维半导体材料的 合成，然而，合成一维纳米管却并不多见，究其原因是因为空心结构的形成条件 比较苛刻。 众所周知，花菁是一类可以通过改变共轭链的长度来调节吸收和发射波长的 荧光染料。花菁5 是其中一个斯托克斯位移较大且发射在近红外的成员。花菁5 在6 0 0 姗左右的吸收较强，可以与c d t e 量子点的发射峰位置重叠，两者相结合 可以组建荧光共振能量转移体系( f r e t ) 。f r e t 因其对距离的敏感性，广泛地 被应用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。酶性 d n a 是近年来发展比较迅速的、与蛋白质酶和酶性1 l n a 作用相似的酶家族新成 员，另外金属离子作为辅助因子可以增强酶性d n a 的活性。利用这个性质，可 山东师范大学硕士学位论文 以通过体外选择来筛选合适的d n a 链检测金属离子。 本文综述了半导体量子点在生物检测中的应用、空心纳米结构的制备以及潜 在的应用价值、酶性d n a 作为检测金属离子探针的应用。在此基础上，分别开 展了以下几方面工作：1 、利用半导体纳米粒子在水油界面的自组装合成了油溶 的一维c d t e 纳米管和纳米线，克服了传统油相合成法的缺点。研究中分别考察 了多个影响因素从而得到了最优合成条件；2 、设计组装了以c d t e 量子点( q d s ) 和花菁5 ( c y 5 ) 之间的荧光共振能量转移( f r e t ) 为基础的纳米生物传感 器：q d s d n a z y m e c y 5 ，预期目标是实现生物体内铜离子的直接测定。在没 有铜离子存在的情况下，花菁5 猝灭c d t e 的荧光。一旦加入铜离子后，铜离子特 异性打断d n a 结合位点，d n a 链不可逆断开，花菁5 远离c d t e 使得荧光共振能 量转移现象消失，c d t e 的荧光恢复从而达到测定铜离子的目的。 关键词：合成，c d t e 纳米管和纳米线，花菁5 ，c d t 纳米颗粒，量子点，荧光 共振能量转移，酶性d n a n 山东师范大学硕士学位论文 a b s 仃a c t i nr e c e n t y e a r s q u a n t u md o t s h a v eb e e nw i d e l yi n v e s t i g a t e d 嬲ac l a s so f l u m i n e s c e n tm a t e r i a l w h e nt h e i rs i z ei sc o m p a r a b l et ot h es i z eo fb o h rd i a m e t e rf o r e x c i t o n ，t h e ye x h i b i ts p e c i a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sw h i c hp o s s e s st h e q u a n t u ms i z ee f f e c t s ，d i e l e c t r i cc o n f i n e m e n te f f e c t s ，s u r f a c ee f f e c t s ，m a c r o s c o p i c q u a n t u mt u n n e l i n ge f f e c ta n ds oo n s ot h eq u a n t u md o t sw i t ht h e s es p e c i a lo p t i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa p p l i e di nt h ef l u o r e s c e n tb i o l o g i c a la n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n s h a v e b e c o m eaw i d er e s e a r c hf o c u s c o m p a r e dt oc o n v e n t i o n a lo r g a n i cd y e s ，q d sp o s s e s s m a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha sn a r r o w e re m i s s i o ns p e c t r a ，t u n a b l em a x i m u me m i s s i o n w a v e l e n g t hw i t hc h a n g e a b l es i z e sa n dc o m p o s i t i o n s ，p h o t o s t a b i l i t y , h i g hb r i g h t n e s s ， l o n gf l u o r e s c e n c el i f e t i m ea n db i o c o m p a t i b i l i t y , w h i c hh a v eb e e ns u c c e s s f u l l yu s e da s f l u o r e s c e n tp r o b eo rs e n s o ri nt h ei m a g i n go fb i o l o g i c a ls a m p l e sa n dc e l l s f o l l o w i n g t h ed e v e l o p m e n to nt h en a n o t e c h n o l o g y , s e n s i t i v ec h e m i c a la n db i o l o g ys e n s o rc a nb e d e s i g n e df r o mn a n o m a t e r i a l n a n o p a r t i c l e s a n db i o l o g i c a lm a t e r i a lc o m p o s et h e l l a n o b i o l o g i c a ls e n s o rw h i c hc a nr e s p o n dt os p e c i a la n a l y t e o n e - d i m e n s i o n a l ( 1d ) n a n o m a t e r i a l s ( n a n o r o d s ，n a n o b e l t s ，n a n o t u b e sa n dn a n o w i r e s ) h a v ed r a w nm o r e a t t e n t i o np a r t i c u l a r l yi nv i e wo fp h y s i c a la n dn a n o a p p a r a t u sa p p l i c a t i o n s i nt h e m e a n t i m e ，1ds e m i c o n d u c t o rn a n o m a t e r i a l sa p p e a r sd i f f e r e n to p t i c a lp r o p e r t i e s ， w h i c hh a v ea t t r a c t e dm o r ei n t e r e s t t h ep h o t o e m i s s i o no fc d s en a n o r o d si sh i g h l y p o l a r i z e da l o n gt h el o n g e ra x i sa n ds u r f a c e m o d i f i e dc d s e c d s z n sc o r e s h e l lq r s a sab i o l o g i c a ll a b e lc a nb eu s e di nav a r i e t yo f b i o i m a g i n ga p p l i c a t i o n s f u r t h e r m o r e ， f o rs i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n g ，t h e ya r em u c hb r i g h t e rt h a nq d s r e c e n t l y t h es y n t h e s e so f1ds e m i c o n d u c t o rn a n o m a t e r i a lh a v eb e e nw i d e l yr e p o r t e d h o w e v e r , t h es y n t h e s i so f1ds e m i c o n d u c t o rn a n o t u b ew a sr a r e l yr e s e a r c h e d i ti sw e l lk n o w nt h a tc y a n i n ei sak i n do ff l u o r e s c e n c ed y ew h i c hm o d u l a t e dt h e w a v e l e n g t ho fa b o r t i o na n de m i s s i o nb ya l t e rt h el e n g t ho fc o n j u g a t e dc h a i n c y - 5i s t h em e m b e ro ft h ef a m i l yw h i c hh a sa l la b s o r p t i o nb a n dc e n t e r e da t6 0 0a m t h e f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) p r o c e s si sh i g h l ye f f i c i e n tw h e nt h e r e i sa na p p r e c i a b l eo v e r l a pb e t w e e nt h ee m i s s i o ns p e c t r u mo ft h ec d t eq d sd o n o ra n d i i i 山东师范大学硕士学位论文 t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo ft h ec y - 5a c c e p t o r t h u s ，f r e ti sw i d e l yu s e df o rt h e r e s e a r c hi nm o l e c u l es t r u c t u r e s ，p r o p e r t i e s ，r e a c t i o nm e c h a n i s ma n dq u a n t i t a t i v e a n a l y s i s d n aw a sc a r r i e do u tc a t a l y t i cf u n c t i o n s ，a n dt h u sb e c a m et h en e w e s t m e m b e ro ft h ee n z y m ef a m i l ya f t e rp r o t e i n sa n dr n a m e t a li o na sc o f a c t o r i n c r e a s e dt h ea c t i v eo fd n a z y m e u t i l i z i n gt h ep r o p e r t y ，a p p r o p r i a t ed n ac h a i nb y n v i t r os e l e c t i o nc a nb eu s e dt od i r e c tm e t a li o n i nt h i ss t u d y , r e v i e w sw e r eg i v e no nt h e a p p l i c a t i o no fq d si nm u l t i p l e x e d b i o l o g i c a ld e t e c t i o n , t h es y n t h e t i cm e t h o d sa n d t h ep o t e n t i a lb i o l o g i c a la p p l i c a t i o no f s e m i c o n d u c t o rm a t e r i a l sw i t hh o l l o wn a n o s t r u c t u r e s ，a n dt h ed e t e c t i o no fm e t a li o r s b yd n a z y m e o nt h eb a s e so fm e n t i o n e da b o v e ，w ec a r r i e do u tt w oa s p e c t so f i n v e s t i g a t i o n ：1 ，h i 曲a s p e c t r a t i oc d t en a n o s t r u c t u r e sw e r ef a b r i c a t e d b y h i e r a r c h i c a la s s e m b l yo fn a n o p a r t i c l e sa tt h ew a t e r - - o i li n t e r f a c e t h en e wm e t h o d o v e r c o m e st h e d i s a d v a n t a g e so ft r a d i t i o n a lo r g a n i cs y n t h e s i s i na d d e n t i o n , w e i n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to fs e v e r a lf a c t o r s ，i n c l u d i n gr e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ， a d d i t i o n a lc o m p o n e n t s ，a n dr e a c t a n tr a t i o f i n a l l y , o p t i m a ls y n t h e s i sc o n d i t i o n sh a v e b e e nc h o s e di nr e s e a r c h 2 ，an e wn a n o b i o s e n s o rq d s - d n a z y m e - c y 5w a s a s s e m b l e df o rt h ed i r e c td e t e r m i n a t i o no fc o p p e ri o n s ( c u 2 十) b a s e do nt h e f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) b e t w e e nc d t eq d sa n dc y 5 t h e s e n s i n gm e c h a n i s mi sb a s e do nt h es w i t c h i n go f ff r e tt h r o u g ht h eh i g l ls p e c i f i c r e c o g n i t i o no fd n a z y m et oc o p p e ri o n s i nt h ea b s e n c eo fc o p p e ri o n s ，c y 5a s e x c e l l e n tf l u o r e s c e n ta c c e p t o ri nc d t e q d s - d n a z y m e c y 5c o m p o s i t e s f r e t s w i t c h e so f fb yt h ef a c t o ro fc o p p e ri o n s - i n d u c e ds t r a n db r e a k si nd n a z y m e ，w h i c h r e s t o r e st h ef l u o r e s c e n c eo ft h ec d t eq d s k e y w o r d s ：s y n t h e s i z e ，c d t en a n o t u b ea n dn a n o w i r e ，c y - 5 ，c d t en a n o p a r t i c l e ， q u a n t u md o t s ，f r e t , d n a z y m e i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏 可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 3 - 沽 新擀气枷沙乏 导师签字： l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 丁；吉 签字日期：2 0 0 7 占月fe t 导师签字：_ 锄之 签字日期：2 0 0 尹年6 月日 山东师范大学硕士学位论文 第一章前言 第一节量子点生物探针在生物检测中的应用 半导体纳米材料在生物传感领域的应用主要体现在新型荧光探针的开发以 及与生物医学的结合上，这类探针一般是由半导体量子点与生物识别分子的特 异性结合形成的。这些纳米尺寸的共轭体具有水溶性和生物适应性，具有比以 往的染料探针和镧系探针更优良的性能。具体来说，此类探针具有以下的光学 优点：量子点纳米晶的发射波长可以通过改变粒子尺寸进行连续调节；单一光 源可以同时激发尺寸不同的量子点：高质量的量子点具有很强的抗光漂白能力； 吸收光谱宽、发射光谱窄、峰型对称等。这些独特的光学性质使得量子点可用 作应用于分子生物技术和生物工程的超灵敏、多色、多通路的理想荧光团。 近年来尺寸为2 - 6 r i m 的半导体纳米粒子引起了学界的广泛关注，究其原因 是因为他们与生物大分子相类似的独特的尺寸效应【l 卅。这种尺寸的类似性使得 纳米材料与生物科学结合的更加紧密，可使量子点广泛应用于医学诊断、靶向 治疗、分子生物学和细胞生物学等领域。把胶体纳米粒子与缩氨酸、蛋白质或 d n a 等生物大分子结合起来进行生物检测引起了多个课题组的广泛关注。这些 纳米粒子一生物大分子共轭体己被用于组装新物质、发展同质生物实验和合成超 、 灵敏检测及成像的多色荧光探针。 量子点一般是由周期表中i i 一族或一v 族的原子组成，被定义为物理半 径小于激子玻尔半径的粒子，对于球形c d s e 粒子来说，粒子半径小于l o n m 可 称为量子点。量子限效应赋予了量子点独特的光学和电学性质，而离散原子和 大块固体是没有这些性质的。在过去几十年中，对此类物质的研究主要集中于 纳米粒子的光物理学性质及其在微电子学和光电子学领域的应用上【1 棚。但是研 究表明，量子点的第一次突破性应用是在生物学和医学领域上【5 。促进这些应 用迅速发展的关键因素包括高质量量子点的合成、表面化学的合理解释、水溶 性和生物适应性纳米晶的合成以及将多色量子点与微珠和纳珠相结合用于实现 生物分子的多元光学编码。 一、量子点的合成 i i 一族量子点( 如c d s e ，c d t e ，c d s 和z n s ) 和i v 族量子点( 如i n p 山东师范大学硕士学位论文 和i n a s ) 的合成在过去数十年中已被充分研究。1 9 9 3 年前主要是通过在水溶 液中添加稳定剂( 如毓基甘油或多磷酸盐) 束制各量子点。此种方法合成的量 子点的质量较低、荧光较弱而且具有较大的粒子分散度( 相对标准偏差 r s d ： l 碱) 。1 9 9 3 年，b a w e n d i 等人”】通过有机金属的高温反应合成了c d s e 量 子点。这个纳米晶具有近乎完美的晶体结构和窄的尺度分布( r s d 3 0 0 ) 。目前m a 等人 改进了s i 纳米粒子的合成，制备了s i 空心纳米球【”1 ，提高了s i 的循环寿命 和比率容量( 图1 1 ) 。很多空心纳米物质都可咀促进锂的储存性质，在此就不 一一累述了。 o 舅：鲤 图1 l c y c l i n gb e h a v i o ra n dc o u l o m b i ce f f i c i e n c yo f n e s t l i k es ih o l l o wn a n o s p h e r e s a tt h ec o n s t a n tc u r r e n td e n s i t yo f2 0 0 0 m ag _ lf i l l e dc i r c l e s ：d i s c h a r g ec a p a c i t y ； o p e nt r i a n g l e s ：c h a r g ec a p a c i t y ；f i l l e dt r i a n g l e s ：c o u l o m b i ce f f i c i e n c yi n s e ti sat e m l m a g e ( 二) 催化和传感 空心粒子合成方法的进展为它们在催化反应中的广泛应用提供了机会。k i m 等人8 荆用空心钯纳米球作为s u z u k i 耦台反应的异质催化剂。这些p d 空心球 被证明具有很高的催化活性( 甚至在七个循环之后还有9 0 产率) 。这种高活 性主要归功于空白材料具有大的比表面积( 如n i os d t 0 ，：的比表面积是 1 0 5 m 2 9 - 1 ) 而大的比表面积则是因为它们具有敞丌的空心结构可使空心球内 部和外部表面的催化剂都与反应物接触，为催化过程提供了更多的便利。 空心纳米粒子催化剂在电催化和光催化反应中扮演着日益重要的角色。已 有为数众多的课题组报道了将金属或金属氧化物的空心球应用于甲醇乙醇蚁 酸的电镀氧化。例如，l i a n g 等人i 明己证明同尺寸的p t 空心纳米球催化甲醇氧 化的能力是实心p t 纳米球的两倍。 空心微纳米结构物质的高比表面积也有利于进行化学传感。化学传感广泛 应用于工业过程的控制和反应安全的增加。最近的研究主要集中在金属氧化物 空心结构的气体传感上。这些物质的传感主要是通过观察目标分析物在氧化物 表面的吸附一解吸附产生的电导率变化来进行的。很多课题组已经报道了应用金 属氧化物空心纳米微米结构进行气体传感的方法【”9 ”叫6 ”。 ( 三) 生物医学应用 ， 一。te-=_u 山东师范大学硕士学位论文 纳米粒子在生物医学中的应用，例如药物传输、细胞成像和生物分子的传 感等已被多个课题组广泛研究。硅是用于药物基因传输的“大众 物质，这源 于它的无毒性、生物适应性和硅化学良好的生物共轭性【1 6 2 1 6 4 1 。多孔空心硅纳 米粒子可作为模拟药物控制性释放行为的载体1 6 2 , 1 6 3 , 1 6 5 】。药物负载进入空心纳 米粒子的空腔和表面，通过表面修饰硅空心粒子得到特殊的性质。空心纳米粒 子也可将基因物质传输到细胞中。s o k o l o v a 等人报道了负载d n a 的多层磷酸钙 纳米粒子的合成【1 6 6 。这些粒子的转染效果远高于简单包覆的磷酸钙纳米粒子。 空心的无机纳米粒子如金或磁性纳米壳由于它们独特的光学磁学性质可 用于光磁成像和医学诊断。c h e n 等人【1 6 刀报道了利用金纳米笼( 多孔壁的空心 纳米结构) 作为光学一致x 线断层摄影术( o c t ) 的光学成像对照试剂。可以调 节金纳米笼在近红外区( n i r ) 发生强烈吸收，而近红外区是组织光学传输最优 化的。 四、结论 在过去数十年中，空心微米纳米结构的合成和应用得到了极大的发展。发 展主要分为两部分，一部分为空心结构的合成；另一部分是空心结构的应用。 这两部分都处于幼年期，需要我们进行更系统更完整的研究。 第三节酶性d n a 检测金属离子 、 长期以来d n a 都是作为遗传物质来研究的，不过在1 9 9 4 年发现d n a 也具 有催化功能，这一发现使d n a 成为继蛋白质和r n a 之后酶家族的新成员。自此， d n a 分子( 这里称为d n a 酶，也可称为脱氧核酸酶或酶性d n a ) 可以像蛋白质酶 或r n a 酶一样催化相似的反应，包括r n a d n a 的分裂、结合、磷酸化、氨基磷 酸酯骨架的分裂和卟啉金属化。d n a 酶的催化效率和反应机理类似于r n a 酶和 蛋白质酶。在实例中，1 0 2 3 d n a 酶的催化效率是1 0 9 m j m i n - 1 ，与蛋白质酶、 核糖核酸酶相似。因而对d n a 酶结构和功能的研究处于化学和生物研究的前沿 领域。 d n a 酶在生物化学和临床医学的有效性与其他生物催化剂的效率和多样性 相类似。与具有二十种天然氨基酸基本单元的蛋白质酶相比较，d n a r n a 酶 只有四种核苷可用，限制了其结构的多样性。与r n a 酶相比较，d n a 酶上2 - o h 官能团的缺乏使d n a 酶的应用更加局限。生物学上，解决这种效率和多样性缺 1 9 山东师范大学硕士学位论文 乏的途径是使用辅助因子，如n a d h 、卟啉，尤其是金属离子。蛋白质酶利用 这些辅助因子拓宽了反应领域、增加了催化效率，很好的调节了“困难 反应。 d n a 酶由于较少构建单元，更需要辅助因子的参与。 金属离子是最重要的酶辅助因子，它们可以拓宽和调节酶反应。实际上， 除了极个别的d n a r n a 酶是由一价离子和氨基酸辅助因子激活之外，在生理学 条件下二价金属离子如m 9 2 + , m n 2 + 或c a 2 + 对d n a r n a 酶功能的提升是最关键 的。d n a 的体外筛选使d n a r n a 酶对金属离子的选择性响应成为可能，下面 的内容从不同的离子出发简要的介绍利用酶性d n a 检测金属离子的原理和方 法。 一、p b 2 + 铅是一种常见的环境污染物，低浓度的铅就可以对身体产生不利影响。血 液中的铅含量达到4 8 0 n m 时，就可判为铅中毒。目前用于铅监测的方法有离子 吸收光谱法、诱导耦合等离子质谱法和阳离子脱模伏安法，这些方法往往需要 复杂的设备或样品处理。即时检测p b 2 + 的简单、方便的方法在环境监测、临床 毒学、污水处理和工业过程监测领域具有重要意义。光学法作为近几十年来发 展迅速的方法，与酶性d n a 相结合检测金属离子实现了以上要求。 ( 一) 酶性d n a 高灵敏性和高选择性的检测p b 2 + l u 等人【1 6 8 2 0 0 0 年发表在j a c s 上的用酶性d n a 检测p b 2 + 是第一篇将酶性 d n a 合成的荧光传感器应用于检测金属离子的文章。金属离子荧光传感器研究 面临的最大挑战是设计和合成的传感器需要具有离子的特异性识别能力和强的 金属结合能力。金属结合位点的建构是有限的，研究传感器结合的方法具有重 要意义。从这方面来说，d n a j r _ n a 的体外筛选为传感器的构建提供了很好的 条件。与化学传感器和缩氨酸传感器的组合相比较，d n a r n a 的体外选择能 够筛选出很多的序列，再通过聚合酶链反应( p c r ) 扩增出理想的序列、通过 诱导有机体突变物质的p c r 来促进性能的突变。例如，原位选择法可以用于获 得d n a f r n a 核糖适体和核糖适体酶，它们对小的有机分子有响应。类似地， 对金属离子高度特异性响应的核糖酶脱氧核糖酶也可以通过此法获得。脱氧核 糖酶通过对金属离子的分子识别和金属离子的水解分裂来转换信号。 通过体外筛选，脱氧核酸酶( 1 7 e ) 能够分裂d n a 底物( 1 7 d s ) 上唯一的 山东师范大学硕士学位论文 一个刚a 连接点。具体的p b 2 _ 荧光传感器是由两条d n a 链组成，其中底物的5 端标已着6 一羧基四甲基罗丹明( t a m r a ) 、酶链的3 端标记着荧光猝灭剂4 一 ( 4 - 二甲基氨苯基) 安息香酸( d a b c y l ) 。初始的荧光光谱是在5 6 0r t m 激发样 品，扫描范围为5 7 0 7 0 0 r i m 。当底物( r h - 1 7 d s ) 与酶链( 1 7 e - d y ) 杂交后， t a m p a 的荧光被靠近的d a b c y l 猝灭( 图1 2 ) 。加入p b p 后，猝灭消失t a m p a 的荧光增加约4 0 0 。将p b 2 卞加入到单独的底物或酶与不可断裂的d n a 底物的混 合物中时，荧光信号变化很小。这就证明r h 一1 7 d s 1 7 ed y 荧光信号的变化来自 脱氧核糖酶的催化断裂。应用此法p b 2 + 的检测限可达到1 0 删，其他的二价金 属离子不干扰。这种方法具有很高的选择性和灵敏度，开创了酶性d n a 检测 金属离子的先河，此后酶性d n a 应用于金属离子的检测受到了极大的关注。 8 。y 一夕一5 l ! ie l ：l i ；“：i ：i ：l e ： 心：、，： 。 口c 5 7 0 e 图1 2 ( a ) s e q u e n c ea n dp r o p o s e ds e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h ed e o x y r i b o z y m e s u b s t r a t ec o m p l e x ( b ) s t e a d y - s t a t ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f t h es u b s t r a t e ( r h 1 7 d s ) a l o n e ( i ) ，a f t e ra n n e a l i n gt ot h ed e o x y r i b o z y m e ( 1 7 e - d y ) ( 1 i ) ，a n d1 5r a i na f t e ra d d i n g 5 0 0n mp b ( o a e ) 2 ( 1 i d ( 二) 分子间和分子内猝灭的结合提高酶性d n a 生物传感器的效率 上述体系虽然可以即时、方便的检测p b ”，但是如果温度升至室温，则由于 高背景荧光的影响，传感器的性能大幅度下降。对传感器体系进行认真的分析， 包括对融化曲线的测绘和单独底物的共振能量转移( f r e t ) 的研究，表明荧光素 标记的底物链片段从酶链上解离f 柬，导致室温下背景荧光的增强。为了解决这 个问题，l u 等人 1 删通过引入分子间和分子内猝灭剂设计了一个全新的传感体系。 这个| 殳计( 图1 3 ) 得益于对f r e t 的研究，解离的底物保持着尾尾距离为3 9a 的随 意盘绕构造，这远短于d n a 的伸展长度。由于这个新设计，背景荧光受到了极 it一|32 山东师范大学硕士学位论文 大的压制，室温下荧光强度有6 6 0 的增强而原来的设计仅有6 0 的增强。新设计 为探针在宽的温度范围内的实际应用提供了可能。 ” 蓠一 拶 、一 r 。_ 、弋! - 一 5 。一一 。： ：墨：二一 “m“w1 图1 3 c o m p a r i s o no ft h eo n e a n dt w o q u e n c h e rd n a z y m e - b a s e dp b ”s e n s o r d e s i g n ( a 1 ) t h ep r e v i o u s s g i l $ o rd e s i g nw i t ho n eq u e n c h e r ( a 2 ) s c h e m a t i c l l l u s t r a t i o no ft h et w os u b s t r a t ep o p u l a t i o n s a tr o o m t e m p e r a t u r e( a 3 ) r o o m t e m p e m m r es t e a d y - s l a t ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f b a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e ( s o l i d l i n e 】a n da f t e rc o m p l e t ec l e a v a g eo fs u b s t r a t e ( d a s h e dl i n e ) ( b 1 ) t h en e ws e n s o r d e s i g n w i t ht h et w oq u e n c h e r sr b 2 ) n l ef r e es u b s t r a t ef l u o r e s c e n c ei sp a r t i a l l y q u e n c h e db yt h ei n t r a m o l e c u l a rq u e n c h e rr b 3 、t h es t e a d y - s t a t ef l u o r e s c e n c es p e c t r a o fb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e ( s o l i dl i n e ) ，m a di u o r e s e e f l c es i g n a la f t e rc o m p l e t e c l e a v a g eo fs u b s l r a t e ( d a s h e dl i n e ) ( 三) 酶性d n a 诱导金纳米粒子组装比色法测p b 斗 简单的比色传感器与传统的仪器和荧光检测相比能够减少或最小化费用， 实现原位、即时检测。另外，具有可调动力学范围的金属离子传感器可以广泛 应用于不同的浓度范围。l u 等人i ”o 】基于酶性d n a 诱导金纳米粒子进行组装， 利用了它们灵敏、有选择地检测和量化金属离子，特别是含铅油漆中的铅的能 力。之所以选择余纳米粒子作为比色通讯基团是因为之前的研究表明金属纳米 粒子不同的聚集态呈现不同的颜色。因此，这种方法在基因研究中引起了浓厚 的兴趣，它把纳米粒子形态学的应用从d n a 检测扩展到其他分析物，如金属 离子。具体的探针设计展现在图1 4 中。 ( 四) 通过酶性d n a 的构建加速金纳米粒子组装从而简单、快速的检测p b 把酶性d n a 对金属离子的特异性选择与金属纳米粒子依赖距离的光谱性 质相结台为设计比色传感器检测金属离子提供了的条件。之前研究的探针需要 。也 劫 山j 、师范大学硕士学何论文 加热到5 0 c ，再在2 h 内冷却才能观察到颜色变化。l u 等人【”。1 在之前研究的 基础上做了改进，能够较快( _ 薯? 3 ”m ，b l y f i g 2 ac r o s s - s e c t i o n a ld i a g r a mo f n a n o p a r t i c l ea s s e m b l ya t aw a t e r d r o p l e t - s o l u t i o n i n t e r f a c eias m a l lu a t e rd r o p l e tc o n d e n s e so n t ot h en a n p p a n i c l e d d ta n da c e t o n e s o l u t i o n i i t h ep a r t i c l e sa g 笋e g a t et ot h es o l u t i o n u a t e ri n t e r f a c e l l la f t e rt h e e v a p o r a t i o no f t h ea c e t o n ea n d ，s u b s e q u e n d 3 t h ew a t e r ，t h en a n o p a n i c l e sa r et r a p p e d a tt h ei n t e r f a c ebf o r m a t i o nm e c h a n i s mo f c d t en a n o t u b ea n dn a n o i r eb a s e do n n a n o p a r t i c l es e l f - a s s e m b l i e s i h o l l o wn a n o s p h e r e ；i ih o l l o u n a n o c y l i n d e r ：i i i n a n o t u b e ；i xf r a g m e n t ；v n a n o w i r e c o n f u s i o nd e g r e ea n dh i g h e ri n n e re n e r g yo f n a n o t u b e s t h e r e f o r et h ew a l l so f t h e n a n o t u b e sb r o k ei 1 1 0f r a g m e n t sa n ds e l f - a s s e m b l e dt on a n o w i r e s w h i c hw a st h eg a m e a s i h e f o r m a t i o no f n a n o t u b e s 【o ：8 i t h ei n s i g h ti n t ot h em o r p h o l o g i c a lc h a n g ef r o mt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e mjg a v ef o u rd i f f e r e n tg r o 、, t hs t a g e so f c d t en a n o t u b e st h ep r o c e s sb e g a nu i t h f o r m a t i o no fc d t en a n o p a n i c l e st l u o u g hp h a s et r a n s f e rw i t h i nt y p i c a l l ys e v e r a l m i n u t e s ( f i g2 a ) a st h er e a c t i o np r o c e e d e dn a n o s p h e r e su i t hh o l o us t r t l