（生药学专业论文）琼胶酶βagaa结构和功能关系的研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵! 翅趁直墓丝重要挂趔岂瞪数：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：昙希隔 签字日期：川年1 月b 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：娶荐蕊 新槔j 如 沙穹、6 弋 i l j l 刖吾 广阔的海洋占地球总面积的7 1 ，其中蕴藏着巨量的生物资源。随着经济活 动全球化的进一步进行，海洋资源的开发日益重要。2 0 世纪6 0 年代以来，美、日、 法等先进国家先后投入巨资在开发海洋资源的同时，重视开发海洋生物活性物 质，各国的科学家大力开展从海洋开发新药物的研究计划。因此，对海藻、海藻 多糖及其多糖类代谢产物进行大规模的化学分离、结构确定和生物活性筛选研究 具有重要的意义。世界海洋中估计有8 0 0 0 多种海藻，可以分成蓝藻、绿藻、红藻 和褐藻四大类【l 】。各种海藻已成为人类在食品、工业和药用方面的重要来源。至 今，已经从海藻中分离到具有抗菌、抗肿瘤等活性的多糖类代谢产物。海洋中资 源丰富的三种多糖一褐藻胶、琼胶和卡拉胶广泛应用于医药及食品工业中。海藻 多糖降解酶应用的重要趋向足着力于海藻寡糖的酶法生产。为新药、新功能食品 的开发提供了新的手段。其中，琼胶的降解酶一琼胶酶还具有许多其他的应用价 值。首先，琼胶酶可以用作海藻遗传工程的工具酶：某些海藻的细胞壁中存在着 大量的天然琼胶，琼胶酶能够水解琼胶多糖，在这些海藻的单细胞分离、酶解破 壁制备原生质体等过程中具有重要的使用价值；同时，琼胶酶在分子生物学方面 也多有应用。因此，琼胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。 1 琼胶与琼胶酶 1 1 琼胶 琼胶主要是有石花菜、江篱、鸡毛菜等红藻加热水提取出来的一种多糖，和 卡拉胶、褐藻胶是目前世界上用途最广泛的三大海藻胶。它在食品工业、医药工 业、日用化工、生物工程等许多方面有广泛的应用，主要作为糖果、果冻、羊羹、 罐头、火腿肉、灌肠等的胶凝剂和稳定剂；各种果汁、饮料的分散悬浮剂和稳定 剂；酒、酱油、醋等澄清剂。琼胶用于食品中，能明显改善食品的品质、提高食 品的档次；加上它的诸多明显的优点，例如它本身属于海洋天然多糖物质，含有 丰富的水溶性食物纤维、低热量、具有排毒养颜和降血糖等保健效果，对人体有 琼胶酶1 3 a g a a 结构和功能关系的研究 许多保健作用，例如降血脂、整肠、排霉和美容美肤等作用，因此备受人们的欢 迎。此外，琼胶在医学、农业和生物工程中广泛用作细菌培养基和微生物载体。 还可以进一步制成琼脂糖，它是很好的免疫扩散的介质，在临床诊断、生物化学、 微生物学、免疫学的分析和研究上应用很广。 习惯上，人们认为琼胶由琼脂糖( a g a r o s e ) 和硫琼脂( a g a r o p e c t i n ) 组成【2 1 ， 琼脂糖是由( 1 3 ) 0 d d 半乳吡喃糖残基和( 1 - 4 ) 0 3 ，6 内醚一a l 半乳 吡喃糖残基交替组成的线形链状分子【3 4 】：其结构如下图所示： o h 图0 1 琼脂糖的链状结构图 硫琼胶由包含多种取代基如硫酸基、丙酮酸、甲基等复杂的长短不一的半乳 糖残基的多糖链组成。但近年来，人们通过对琼胶的不均匀性研究，得知琼胶 并不是由琼脂糖和琉琼胶两个部分组成，而是由琼二糖骨架组成的中性糖( 含不 同量的甲基) 经由一系列含低电荷( 硫酸基) 和丙酮酸的琼脂糖过渡到具有高电 荷、呈酸性的取代基较复杂的一系列连续的琼脂糖衍生物分子组成。 1 2 琼胶酶 琼胶酶是能够降解琼脂糖的水解酶。近年来，随着越来越多的性质不同的琼 胶酶的发现以及对琼胶酶的结构和功能特别是降解琼脂糖的作用机制进一步研 究，使得琼胶酶的应用日益广泛。 1 2 1 琼胶酶的来源 琼胶酶的主要来源是微生物和海洋软体动物，其中微生物来源的琼胶酶主要 来自于变形细菌门的细菌，变形细菌门分为q ，p ，7 ，6 ，五个亚l - j ，能够产琼 胶酶的假单胞菌属、交替单胞菌属、单胞菌属和弧菌属等均属于丫变形亚门，只 2 琼胶酶b a g a a 结构和功能关系的研究 有一株细菌a s t i c c a c a u l i ss p s a 7 ，来自于a 变形亚门，和一株来自于p 变形细 菌门的细菌, l a n t h i n o b a c t e r i u ms p s y l 2 。软体动物如海兔属、鲍属、滨螺属、冠 海詹属中均存在复杂的多糖水解酶，包括琼胶酶、纤维素酶、几丁质酶，软体动 物产生的琼胶酶主要是其消化道中的微生物产生的。 1 2 2 琼胶酶的分类 琼胶酶的分类方法众多，可以根据作用方式、作用机制、氨基酸序列等进行 划分。 1 2 2 1 根据作用方式的分类 根据其作用方式不同啼1 ，可以把琼胶酶分为两类：a 琼胶酶和p 琼胶酶。q 琼胶酶切割琼脂糖的a 1 ，3 糖苷键，生成以3 ，6 内醚a l 半乳糖为还原性末端 的的琼寡糖系列；p 一琼胶酶切割琼脂糖的p 1 ，4 糖苷键，生成以p d 一半乳糖为 还原性末端的新琼寡糖系列。目前所发现的二十多种琼胶酶中，除了有四种是n 琼胶酶以外，其它都是b 琼胶酶。 1 2 2 2 根据作用机制的分类 根据作用机制将琼胶酶可以分为内切型琼胶酶和外切型琼胶酶两类。已报道 的琼胶酶多数是以内切的方式作用于琼脂糖，琼胶酶在琼脂糖链上的结合模式是 随机的，一条链上可以同时有多个酶结合。目前只有一种来源于d e g r a d a n s 的 a g a 8 6 e 属于外切型琼胶酶6 1 ，琼胶酶从底物链的一端，以渐进式对底物进行切割。 1 2 2 3 根据氨基酸序列和三维结构分类 水解两个和多个糖苷之间的糖苷键，或者是糖与一个非糖成分之间的糖苷键 的酶统称为糖苷水解酶g h ( g l y c o s i d eh y d r o l a s e ) 。1 9 9 1 年，根据氨基酸序列和三 维结构的特征确立了一种新的糖苷水解酶的分类方法 7 1 。 大多数序列已测定的琼胶酶被归属在糖苷水解酶家族中的g h l 6 ，g h 5 0 ， g h 8 6 和g h 9 6 ，另外还有几种琼胶酶因无序列相似性有待于进一步划分。其中， 对归属于g h l 6 家族中的琼胶酶的研究最深入，它包括来自于p s e u d o a l t e r o m o n a s s p c y 2 4 、v i b r i os p p o 3 0 3 、p s e u d o m o n a ss p n d l 3 7 、p s e u d o a l t e r o m o n a sa t l a n t i c a 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 a t c c19 2 6 2 和z o b e l l i ag a l a c t a n i v o r a n sd s i j 等小同菌的p 一琼胶酶；g h 5 0 家族 中包括五种琼胶酶，它们来自于v i b r i os p j t 0 1 0 7 、a g a r i v o r a n ss p 和a l t e r o m o n a s s p e 1 菌属；g h 8 6 家族中的琼胶酶来自于p s e u d o a l t e r o m o n a sa t l a n t i c a 、 s a c c h a r o p h a g u sd e g r a d a n s2 - 4 0 和m i c r o b u l b i f e ，s p j a m b a 9 4 三种不同菌。以上 三个家族的琼胶酶都是b 一琼胶酶，而已知的a 一琼胶酶来源于a l t e r o m o n a s a g a r i l y t i c ag j1b 和t h a l a s s i m o n a ss p j a m b - a 3 3 ，属于糖水解酶家族g h 9 6 。 1 2 3 琼胶酶的研究现状 。自从1 9 0 2 年g r o l e a u 8 】第一次从海水中分离到琼胶的分解细菌一琼胶假单胞 菌( p s e u d o m o n a sg a l a t i c a ) 以来，人们已经从海水系统中分离到多种琼胶分解菌， 并对天然琼胶酶进行纯化，对其酶学性质进行了研究。 1 9 7 5 年，v a nd e 一9 】等将噬细胞菌属( c y t o p h a g af l e v e n s i s ) 在初始p h 6 6 7 o 的范围内，以琼胶作为唯一碳源、硝酸铵为氮源的2 0 。c 下培养。在分批培养液 中，葡萄糖抑制酶的合成；在连续培养中随着生长速度的提高，酶的产量降低。 在含有1 3 m m o l lc a c l 2 、0 0 3 水解酪蛋白氨基酸以及诱导物的存在下，在p h 6 9 的磷酸缓冲液及2 0 c 的条件下，酶产量最高。酶产量在1 5 和2 0 时相同，而 在2 5 时产量为原来的5 0 ，当温度达到3 0 时酶失活。在0 0 3 水解酪蛋白 氨基酸和1 3 m m o l lc a 2 + 存在下，酶的产量提高。琼二糖和新琼低聚糖是有效 的诱导物，且新琼四糖是最好的诱导物。诱导物浓度过高或加入葡萄糖会抑制分 解代谢，且这种抑制不能被c a m p 拮抗。 1 9 7 7 年，g r o l e a n 和y a p h e 8 1 从大西洋假单胞菌( p s e u d o m o n a sa t l a n t i c ) 中 分离得到的p 琼胶酶，产生聚合度为4 、6 、8 和1 0 的新琼低聚糖。此p 琼胶酶 可降解新琼四糖的p 糖苷键以及新琼六糖和新琼八糖非还原端的d 糖苷键，产 生新琼二糖。p 一新琼四糖水解酶可以被n a c l 、k c l 、c a c l 2 、m n c l 2 和m g s 0 4 激 活，新琼四糖的k m ( 米氏常数) 为3 4 x 1 0 0 m ，不受p 琼胶酶和静新琼二糖水 解酶活性的影响，也没有转糖苷酶活性。 1 9 8 3 年，m o r t i c e l l o 】等对大西洋假单胞菌( p s e u d o m o n a sa t l a n t i c ) 产生的琼 胶酶系进行研究时发现：大西洋假单胞菌不仅具有分泌于细胞外的p 一琼胶酶 i ，还有一种连接在细胞膜上的p 一琼胶酶i i ，它们共同作用，可以水解琼脂糖 4 琼胶酶1 3 一a g a a 结构和功能关系的研究 和某些带有取代基的琼脂糖。这两个p 一琼胶酶都能降解琼脂糖产生新琼二糖。 1 9 9 0 年，a o l d 1 1 】等分离出一株弧菌( v i b r i os p a p 一2 ) ，它产生的琼胶酶是 b 一琼胶酶，酶在低于4 5 。c 时酶活性保持稳定。这种p 一琼胶酶可作用于琼胶和 长链的琼胶寡糖，以新琼二糖作为主产物，对1 c 一卡拉胶无水解作用。 1 9 9 2 年，l e o n l l 2 】等筛选出一株交替假单胞菌( a l t e r m o n a ss p c - - 1 ) 并提纯 了其胞外琼胶酶。此酶是p 一琼胶酶，低于4 5 c 时酶活性保持稳定。它降解琼胶， 以新琼四糖作为主产物。 1 9 9 3 年，s u g a n o 1 3 】等分离和提纯了弧菌( h b r i os p j t 0 1 0 7 ) 的胞外琼胶酶， 此酶分子量为1 0 7 k d a ，是一种内切型的p 一琼胶酶，在大约p h 8 时降解琼胶的 p l ，4 糖苷键，产生新琼四糖和新琼六糖，酶作用最适温度为3 0 。随后的研 究发现此p 一琼胶酶不但降解琼胶，而且降解琼四糖产生琼二糖。 1 9 9 8 年，a r a k i t l 4 1 等研究发现海洋弧菌( h b r i os p p o - - 3 0 3 ) 能产生3 种胞 外琼胶酶a 、b 、c ，这3 种琼胶酶通过硫酸铵沉淀和逐级的柱层析得到纯化，分 子量大约为8 7 5 k d a 、11 5 k d a 、5 7 k d a 。琼胶酶a 水解琼胶的主要产物是新琼四 糖和新琼六糖。琼胶酶b 的主要水解产物是新琼二糖和新琼低聚糖。琼胶酶c 的 主要产物是新琼八糖和十糖( 但没有后续的报道和基因的克隆) 。 1 9 9 8 年，v e r a 1 5 】等从南太平洋近岸分离出一株可降解琼胶的革兰氏阴性细 菌，经鉴定为p s e u d o a l t e r o m o n a sa n t a r c t i c as t r a i nn 一1 。它产生的胞外琼胶酶是 b 一琼胶酶，酶分子量为3 3 k d a ，最适p h 在7 0 ，在3 0 c 以下酶活性保持稳定。 2 0 0 3 年，褚艳【1 6 1 等从来自青岛近海的一株假别单胞菌c y 2 4 中克隆了一个b 一琼胶酶。经重组表达及酶学性质研究后发现，酶分子量为5 1 k d a ，主要水解产 物是新琼四糖和新琼六糖。 2 0 0 4 年，o h t a 【1 7 ，1 8 1 9 】等从深海中分离到一株m i c r o b u l b i f e ，s t r a i nj a m b - - a 7 ，从这个菌株克隆了三个p 一琼胶酶基因a g a a 7 、a g a a 和a g a o ，它们分别编 码了4 8 9 8 9 d a 、4 8 2 0 3 d a 和1 2 6 9 2 1 d a 的三个蛋白r a g a a 7 、r a g a a 和r a g a o 。 r a g a a 7 的最适p h 和温度分别为7 0 和5 0 。c ，它的温度稳定性好，在5 0 c 的条 件下，其半寿期为5 0 2 m i n 。该酶的降解方式表现为内切，降解琼脂糖的主要终 琼胶酶1 3 一a g a a 结构和功能关系的研究 产物是新琼四糖。r a g a a 的最适p h 和温度分别为7 o 和5 5 。c ，6 0 。c 以下保持了 较高的剩余酶活，以新琼四糖作为主要的终产物。r a g a o 也以内切的方式作用于 琼脂糖，它由两个碳水化合物结合模序和一个催化模序组成。经序列相似性分析 发现，该酶属于糖水解酶家族8 6 ，以内切的方式作用于琼脂糖和聚合度高于新 琼六糖的寡糖片断，产生新琼六糖作为主产物。 2 0 0 5 年，j 锄【2 0 1 等从海洋细菌z o b e l l i ag a l a c t a n i v o r a n sd s i j 中克隆到两种p 一琼胶酶a g a a 和a g a b 的基因，其编码蛋白的理论分子量分别为6 0 k d a 和 4 0 k d a 。它们有相同的催化区域，都属于糖水解酶家族g h - - 1 6 。然而，a g a a 表 现为多模块蛋白，包括一个催化区域和两个c 末端未知功能区域；与之相对照， a g a b 表现为单模块蛋白，由n 末端的信号肽和催化区域组成。经分子排阻和质 谱分析发现，a g a b 在溶液中以二聚体形式存在，a g a a 催化区域是单体蛋白。 两个琼胶酶都随机切割p 一( 1 _ 4 ) 糖苷键，a g a a 降解琼脂糖的终产物是新琼 四糖和六糖，a g a b 降解琼脂糖的终产物是新琼四糖和二糖。另外，研究发现a g a a 对固体状态的琼脂糖的降解能力要远远高于a g a b 。 2 0 0 6 年，w a n gj 等【2 1 1 从中国南海分离得到可降解琼脂糖的革兰氏阴性菌 a l t e r o m o n a ss p s y3 7 一1 2 ，其分泌产生的为b 一琼胶酶，分子量为3 9 5 k d a 。该 酶的最适反应温度为3 5 ，最适p h 为7 0 ，降解琼脂糖得到的终产物为新琼四 糖和六糖。 2 0 0 7 年，张维维等从海洋弧菌v 1 3 4 中克隆得到p 一琼胶酶a g a v 的基因， 该酶的最适反应温度为4 0 ，最适反应p h 为7 0 ，降解琼脂糖的终产物是新琼 四糖和六糖。 2 0 0 7 年，马翠萍等嘲从来自青岛近海的一株假别单胞菌c y 2 4 中克隆了一 个p 一琼胶酶a g a b 的基因，其编码的蛋白质分子量为5 0 4 k d a 。降解琼脂糖的 主要产物是新琼八糖和新琼十糖。 从以上各种p 一琼胶酶的酶学性质可以看出，虽然各种p 一琼胶酶的分子量 存在很大的差异，但是它们的最适反应温度为3 0 - - 4 5 c ，以内切的方式作用于 琼脂糖及其寡糖片断，产生新琼二糖、四糖和六糖作为其主要产物【2 4 1 。 6 琼胶酶1 3 a g a a 结构和功能关系的研究 相比之下，仅有少数几种a 一琼胶酶得到研究和报道【2 5 1 。 1 9 7 8 年，y o u n 9 1 2 6 1 等从一种革兰氏阴性海洋细菌中分离出一种q 一琼胶酶。 此酶经硫酸铵沉淀、d e a e 一纤维素柱进行提纯。它断裂琼脂糖的a l ，3 糖苷 键，生成以p d 一半乳糖为非还原性末端和以3 ，6 一内醚一a l 一半乳糖为还 原性末端的琼四糖和琼六糖，这是第一次被提纯的a 一琼胶酶。 1 9 9 3 年，p o t i n 2 7 1 等分离纯化出一个a 一琼胶酶，所用菌种是交替假单胞菌 a l t e r m o n a sa g a r l y t i c sg j l b 。此酶被提纯，经s d s - - p a g e 电泳测得其分子量为 18 0 k d a ，然而通过亲和层析得到的酶经过n a t i v e 电泳显示其分子量为3 6 0 k d a ， 表明此酶是一个二聚体。它的最适作用p h 在7 2 ，在p h 6 0 9 0 范围内酶活性 较高，酶活性依赖于c a 2 + 的存在，长时间处于低于p h 6 5 或高于4 5 条件下， 都会导致酶活性的丧失。 2 0 0 3 年，从微生物t k r l 7 a g a 和t k r 4 3 a g a 中分别分离到a 琼胶酶1 7 和琼胶酶4 3 ，其分子量分别微9 5 k d a 和8 5 k d a 。它们作用于琼脂糖和六糖以上 的琼寡糖，产生二糖和四糖。a 琼胶酶1 7 和琼胶酶4 3 反应的最适p h 分别为 中性和微酸性，最适温度使3 7 4 2 ( 2 1 2 引。 1 2 4 琼胶酶的作用机理 k o s h l a n d 首次提出了糖苷水解酶的水解反应是典型的酸碱和亲核水解反应。 在糖苷水解过程中，产物相对于底物而言可以是保持糖基c 1 位的差向异构体构 型，也可以转变底物异头碳构型，即保持异头构型的两步置换反应和形成倒位异 头构型的一步置换反应 2 9 , 3 0 , 3 1 1 。反应中作为亲核基团和质子供体的氨基酸通常 是酸性氨基酸如g l u 、a s p 和t y r 等。 保持型的两步置换反应的过程如下：催化反应的第一步是活性中心的g l u 残基的羧基作为质子供体，将一提供给c l 为的o ，这样，c 1 0 4 键断裂，并产 生具有环内正碳离子的过渡物。第二步产生的糖片段从活性部位移去。第三步正 碳离子的形成促使初始还原糖的环发生变形，并通过与离子化的g l u a s p 的羧基 的静电作用而稳定。第四步水分子从糖苷的氧侧进入，被第一步产生的离子化的 g l u 羧基解离，导致o h 离子与正碳离子反应，同时g l u 羧基重新质子化被还原。 7 琼胶酶b a g a a 结构和功能关系的研究 这种机制中，质子化的g l u 先是作为普通酸碱催化剂，激活进入的水分子，因此， 反应可保持异头构型。 倒位型的一步置换反应是由一个普通g l u ，一个普通碱g l u a s p 和亲核水分 子的攻击一次完成，在这个过程中酸催化剂g l u 羧基提供h + 给0 4 ，碱催化剂 g l u a s p 。作用于亲核试剂h 2 0 ，使h 2 0 中的o h 。与正碳离子作用，加入羟基，使 羟基的异头构型发生倒置。另外，产生的h + 通过扩散与离子化的酸催化剂结合， 恢复质子状态。 1 9 9 3 年，p o t i n 2 7 1 等报道g h l 6 家族b 一琼胶酶的催化机制采用了保持型的 两步置换反应，其水解产物的异头碳构象没有发生变化。1 9 9 4 年，j u n c o s a , m 3 2 1 等证实参与水解反应的关键氨基酸均为g l u 。g h 5 0 和g h 8 6 家族的琼胶酶的作 用机制均推测为保持型机制，g h 9 6 家族的水解机制和活性中心的信息还未见报 道。迄今为止只有一株归属于新家族的来源于p s e u d o a l t e ! r o m o f l 姐ss p c y 2 4 中的 琼胶酶a g a b 降解琼脂糖的产物为a 异构体【2 3 】，由于该酶降解琼脂糖的p - z ，4 糖苷键，故该酶是采用了倒位型的降解机制，序列的新颖性和三维结构的缺乏， 阻碍了该酶催化中心氨基酸的鉴定。 1 2 5 琼胶酶的催化区和碳水化合物结合区的晶体结构的研究 和众多的糖水解酶一样，已报导的多数琼胶酶除了包含一个具有催化功能的 结构域( c d ) ，还同时含有一到两个甚至多个碳水化合物结合域( c b m 或c b d ) 。 c d 区和c b m 区之间靠柔性较强的铰链区连接，在三维结构上形成相对独立的结 构。关于琼胶酶的三维结构研究比较少，直至u 2 0 0 3 年才首次报导了g h l 6 家族来 e i = j z z o b e l l i ag a l a c t a n i v o r a n sd s i j 的1 3 琼胶酶b 和a 的催化区的晶体结构f 3 3 】。晶体 结构显示与g h l 6 家族其它已知结构的酶类似，为两个反向平行的高度缠绕的d 一片层组成的“三明治”结构，呈p 一果冻环结构( 1 3 - j e l l y - r o l l ) ，其中每一个p - 折叠 片层由7 个p 一链组成，整个催化腔为开放的裂隙( c l e f t ) 状。根据其降解不同聚 合度的寡糖推测两种酶均有八个底物结合位点，4 个占据还原端，4 个占据非还原 端，按照1 9 9 7 年qj d a v i e s 和b h e n r i s s a t l 3 4 】等人建立的糖水解酶的底物结合位点 命名法规则被命名为4 到1 和+ l 到“，两个催化活性氨基酸g l u 分别占据。l 和+ l 位点。2 0 0 4 年，j u l i e a l l o u c h 等【3 5 1 报道了z d 6 p 刀砌g 口肠c ，口玎，v d 阳瑚d s i j 的1 3 琼胶酶a 8 琼胶酶1 3 a g a a 结构和功能关系的研究 的突变体e 1 4 7 s 与新琼八糖的共晶体的衍射数据，详细描述了1 到4 位点参与底 物结合的氨基酸，这些氨基酸有的通过与底物形成氢键，有的依靠疏水堆积作用 而将底物固定在催化腔中。在底物和酶发生结合时，琼脂糖链呈双股螺旋状与酶 靠近，一端先打开，文章同时证明在平行于活性位点的对面亦有另一条糖链的结 合。迄今所报导的催化腔最大的琼胶酶是来自于p s e u d o a l t e r o m o n a ss p c y 2 4 的 a g a b ，该酶有1 2 个底物结合位点命名为4 到+ 8 ，可以容纳至少1 2 个糖单元。结 构如图0 2 和0 3 所示。 盈 图0 2 琼八糖的前四个糖环占据的四个底物结合位点1 到一4 9 琼胶酶b a g a a 结构和功能关系的研究 图0 - 3 z o b e l l i ag a l a c t a n i v o r a n sd s i j 琼胶酶a 与未解链的双螺旋琼脂糖结合的构造模型 1 2 6 琼胶酶的应用 天然琼胶主要存在于某些海藻的细胞壁中，琼胶酶能够水解琼胶多糖，可用 作大型海藻酶解的工具酶；用于海藻多糖结构的研究；用于琼胶寡糖的制备；同 时，琼胶酶在分子生物学方面也多有应用。因此，琼胶酶的研究具有重要的理论 意义和应用价值【3 6 1 。 1 2 6 1 用作海藻酶解的工具酶l a t i 琼胶是某些红藻细胞壁的重要组成成分，利用琼胶酶能够水解琼胶多糖的性 质，可以用其来分离海藻的单细胞、酶解破壁制备原生质体。由此来进行海藻细 胞生理生化的研究，进行目的基因的导入，进行细胞间的融合，创造优良杂交品 种等工作。 用酶法分解大型分解大型海藻获取单细胞是比较理想的方法。过去所有的海 藻解壁酶多是从海洋动物消化系统中分离制各的，动物源的海藻解壁酶是一种复 1 0 琼胶酶b - a g a a 结构和功能关系的研究 合酶，琼胶酶是其中的主要成分之一。从海洋动物中提取海藻解壁酶要受到诸多 条件的限制，难以进行大规模生产。因此，开发微生物源的海藻解壁工具酶具有 重要应用价值。 在目前的海水养殖中，为养殖动物育苗期提供充足的优质饵料一直是制约生 产的一个关键因素。贝类育苗通常是以天然单细胞藻类作为饵料，但在现代化大 规模工厂化育苗中，单细胞藻类远不能满足需要。酶解大型海藻，分离成单细胞， 作为海洋养殖动物的饵料，具有营养全面、材料易得、生产加工简便等优点。因 而，采用酶解大型海藻生产单细胞饵料这一技术，对于海水养殖业的发展有着重 要的实际意义。 a r a k it i l 4 1 等利用海洋弧菌( v i b r i os p p o - - 3 0 3 ) 生产的琼胶酶，配合纤维素 酶及其他酶种，水解红藻获得大量海藻单细胞。戴继勋等【3 8 】应用海藻解壁酶从 大型海藻中分离单细胞，用作替代饵料投喂扇贝，扇贝发育完全正常。 1 2 6 2 在分子生物学方面的应用 利用琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收d n a 和r n a ，已经被证明是最好的方法之 一。s u g a n o 利用弧菌( v i b r i os p j t 0 1 0 7 ) 产生的p 一琼胶酶进行了从琼脂糖凝胶 电泳中回收d n a 的研究。目前，已经有成熟的技术方法进行d n a 的回收： 利用高等级低融点琼脂糖进行电泳，切下包含目的d n a 片断的的琼脂糖，将其 放入小管里融化，加入适量琼胶酶，4 0 。c 左右保温直至琼脂糖完全液化，d n a 样品即可进一步纯化使用。 1 2 6 3 用于琼胶寡糖的制备 琼胶寡糖一般是指聚合度为2 一1 0 的低聚糖。近年来随着糖生物学和化学研 究的飞速发展，以及对琼胶寡糖结构的进一步了解，人们对琼胶寡糖的生物活性 进行了深入研究。日本e n o k i 3 9 - 删等人对琼胶使用了多种方法降解，并对产物中 的寡糖的体外及体内的抗肿瘤、免疫调节活性进行了研究，认为他们具有细胞调 亡、抑制n o 等作用。此外，人们逐渐发现琼胶寡糖具抗氧化 4 0 - 4 3 1 、抗炎、促 进双歧杆菌生长m 】、预防糖尿病等多种生理功能。并且研究发现，这些活性与 寡糖的聚合度( d p ) 有着密切的关系f 4 5 】。比如，d p 在2 4 的寡糖可以抑制前 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 列腺素e 2 ( p g e 2 ) 和肿瘤坏死凶子( n 师一q ) 的产生，从而抑制癌细胞的发生； 可以通过阻止可诱导性n o 合成酶( i n o s ) 的表达来抑制过量n o 自由基的产 生，从而消除n o 过量造成的损伤【蛔。而六至八糖在植物生物工程方面能起到一 定的作用，是植物特别是藻类防御体系中重要的激发子，当高等植物受到外界因 素侵扰时，寡糖会作为信号去激发植物体内的防御系统，增加分子氧的消耗量， 释放过氧化氢 4 7 1 。由此可见琼胶寡糖在作为药物方面具有很大的潜力，并且在 植物的病害防御研究方面的也起着很重要的作用。另外，琼胶寡糖在食品生产中 有广泛的应用，如可用于饮料、面包及一些低热量食品的生产。近年来，在日用 化工领域又发现了琼胶寡糖的一些新用途，日本以琼胶寡糖为添加剂生产的化妆 品对头发有很好的调理效果【4 引，日本k o b a y a s h i 等人发现，低分子量的中性新琼 二糖具有一定的吸湿和美白双重功划4 9 1 。 然而，寡糖的制备仍是一个世界性的难题，目前琼胶的降解方法主要包括： 物理降解、酶法降解和化学法降解。琼胶寡糖的制备一般采用化学法和酶法 两种。( 1 ) 化学法包括酸降解、衍生化降解和羟基自由基降解：衍生化降 解主要用于多糖的组成结构分析，用于合成寡糖时，其过程较为费时费力。 羟基自由基降解又称氧化还原降解，利用反应中产生的羟基自由基使糖链发 生非专一性的断裂，但同时糖分子受到氧化，使产物中含有非常多的副产物， 其反应专一性差，不利于寡糖的制备。酸法降解中使用的酸包括盐酸、硫酸、 醋酸、柠檬酸等。目前，普遍采用的方法是稀酸水解法，这种方法存在降解速 度慢，且需高温高压，操作较复杂，产物不均一性，而且重复性差的弊端，严重 阻碍了琼胶寡糖规模生产和推广应用。( 2 ) 酶法：酶作为一种特殊的生物催化 剂，具有极强的底物和产物专一性，可选择性地酶解切断特定糖苷键获得特定的 寡聚糖，还有催化效率高、反应条件温和、降解过程易于控制、对环境友好等优 点【5 0 f5 n 。酶法中使用的酶有q 一琼胶酶和b 一琼胶酶，二者得到的产物不同， 前者为琼寡糖，后者为新琼寡糖。由于海洋环境中以p 一琼胶酶为主，所以 在文献中报道的多为酶法得到的新琼寡糖。不足之处是酶制剂分离困难，产 量有限，成本较高。 目前为止，实现产业化生产的却只有从风e u d o m o n a sa t l a n t i c a 中分离的d 一琼 胶酶，并且价格昂贵，应用范围也仅限于科研工作中，大大阻碍了琼胶低聚糖的 1 2 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 开发应用。而利用琼胶酶制备的新琼寡糖更少，只有s i g m a 公司的新琼四糖和新 琼六糖两种，价格昂贵，严重阻碍了琼胶寡糖的构效关系研究乃至应用开发 的进一步开展。因而高活性琼胶酶和更多种类琼胶寡糖的制备研究具有重要 的理论应用和广阔的应用前景。 1 2 6 4 用于多糖结构的研究 尽管对糖缀合物糖链的认识和研究始于1 9 世纪，但因其结构的复杂性和研究 手段的局限性，使糖的研究远远滞后于蛋白质和核酸。从2 0 世纪7 0 年代开始，糖 化学( c a r b o h y d r a t ec h e m i s t r y ) 和生物化学两个传统专业的结合使糖链的细胞和 分子生物学研究成为可能，糖的研究也得到了复兴。日本、美国、德国等政府及 国家级信息中心和生物技术部门纷纷设立了专业机构进行重点研究。9 0 年代以 后，各种糖研究的国际合作、国际信息网络的技术与产品的交流更是蓬勃兴起。 目前，糖生物学及糖工程研究已成为继基因工程、蛋白质工程之后的第三大生物 工程，是当今最前沿的生物学科之一【5 2 t5 3 1 。 2 0 世纪6 0 年代发现在细胞表面密布有糖缀合物，推测这些糖缀合物糖链在生 命过程中担负分子识别的功能，但当时由于研究手段的限制不能进行实验确认。 7 0 年代由于物理化学测定方法的建立以及特异的内切和外切糖苷酶在结构测定 中的应用，使结构测定成为可能，揭示出糖链惊人的复杂性和多样性，所包含的 信息量比蛋白质和核酸要大几个数量级。8 0 年代末，负责糖链合成的糖基转移酶 的克隆发现糖链多样性是在基因水平和蛋白质水平进行调控的。这些进展为糖链 的结构功能研究的突破奠定了坚实的基础，并直接导致了在1 9 9 0 年发现选择素 ( s e l e c t i n ) 与s l e x 糖链识别的生理功制5 4 j 。 经过近2 0 多年的研究，糖链的生物学功能正被不断揭示，已有证据表明，糖 链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的。在分子内， 糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等；在分子 间，通过糖缀合物( g l y c o c o n j u g a t e ，包括糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖) 糖链与蛋 白质的相互作用介导细胞的专一性识别和调控生命过程。糖脂的糖链不仅是蛋白 质受体的配体，其本身也是信号传导分子。糖与糖之间的相互作用介导细胞一细 胞相互作用也被证实【5 5 】。归根结底，无论受精、发生、发育、分化、神经系统、 琼胶酶1 3 一a g a a 结构和功能关系的研究 免疫系统恒态的维持，还是在炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转 移、病原体感染、植物与病原菌相互作用等过程中都涉及糖链的参与，糖链在这 些生命和疾病过程中起特异性的识别和介导作用。 糖缀合物在发挥生物学功能的过程中起决定作用的往往就是其寡糖残基。重 要的寡糖一般由葡萄糖( g l u c o s e ) 、果糖( f r u c t o s e ) 、半乳糖( g a l a c t o s e ) 、木 糖( x y l o s c ) 、阿拉伯糖( a r a b i n o s e ) 和甘露糖( m a n n o s e ) 等组成。寡糖由于单 糖分子结合位置、结合类型和衍生化修饰的不同，种类繁多，功能各异。 鉴于寡糖的重要药理活性和重要的信息分子，研究其空间结构就具有很高的 理论价值。用琼胶酶水解某些多糖，测定其水解产物的结构，进而推测多糖的结 构，是行之有效的方法。m o r t i c el m 等利用大西洋假单胞菌生产的高纯度b 一琼 胶酶降解紫菜聚糖，然后用n m r 光谱法测定其降解产物结构，从而推知紫菜聚 糖的结构。 2 蛋白质的结构和功能的关系 蛋白质序列结构功能的关系问题是结构分子生物学的核心问题之一。大量 研究表明，虽然在同源蛋白质家族中，相似序列的蛋白质具有相似的结构和功能， 但是，在许多超家族中，序列差异很大的蛋白质分子却也有明显类似的结构和功 能，或者许多序列同源性很高的蛋白其功能有着很大的差异，这就使得单纯的“序 列决定结构，结构决定功能”的传统观念受到严峻的挑战。许多研究显示，蛋白 质序列及其结构的保守性，既是其分子功能约束的结果，也是其分子进化的结果。 因此，研究蛋白质的结构和功能之间的关系的问题变得日益复杂。 由于蛋白质结构尤其是高级结构决定蛋白质的功能，因此要充分研究蛋白质 的功能，就要把结构研究清楚。生物信息学发展到现在已经有能力对一个未知结 构的蛋白质序列作出一系列分析，最终得出一个三级结构模型，这样就可以大大 减少研究人员的工作量，而且对于可信度比较高的预测，如同源模建等，对研究 蛋白质的生物学活性中心有很好的指导作用。蛋白质结构的分析比对在设计突变 实验、设计新药等分子生物学领域具有指导作用，它提供了十分重要的参考信息。 现在，限制蛋白质工程发展的因素主要不在核酸技术方面，而在于蛋白质分子结 1 4 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 构的设计和预测方面，使基因重组与定位突变的目标基因的表达产物合乎预期的 要求。 生物资讯于近年来非常快速地发展，尤其基因组计划的进行更增加了资料库 中的数量，包括核酸、蛋白质及结构等资料库。一般来说，蛋白质三维结构主要 以实验方法来决定，例如x - 射线绕射法( x - r a yc r y s t a l l o g r a p h y ) 或n m r 光谱法 ( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o s c o p y ) 。事实上，技术上的困难使得蛋白质三 维结构决定的速度相当地缓慢，因此在蛋白质三维结构未知的情况下，我们可以 利用生物信息学预测分析蛋白质的结构进而推测它们在功能上的变化，从而探讨 结构和功能之间的关系。 生物信息学主要包括以下几个主要研究领域： 1 序列比对 基本问题是比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性。序列比对是 生物信息学的基础，非常重要。两个序列的比对有较成熟的动态规划算法，以及 在此基础上编写的比对软件包b a l s t 和f a s t a ，可以免费下载使用。这些 软件在数据库查询和搜索中有重要的应用。有时两个序列总体并不很相似，但某 些局部片断相似性很高。s m i t h w a t e r m a n 算法是解决局部比对的好算法，缺点是 速度较慢。两个以上序列的多重序列比对目前还缺乏快速而又十分有效的算法。 2 结构比对 基本问题是比较两个或两个以上蛋白质分子空间结构的相似性或不相似性。 已有一些算法。 3 蛋白质结构预测 包括2 级和3 级结构预测。从方法上来看有演绎法和归纳法两种途径。前者 主要是从一些基本原理或假设出发来预测和研究蛋白质的结构和折叠过程。分子 力学和分子动力学属这一范畴。后者主要是从观察和总结已知结构的蛋白质结构 规律出发来预测未知蛋白质的结构。同源模建和指认( t h r e a d i n g ) 方法属于这 一范畴。虽然经过3 0 余年的努力，蛋白结构预测研究现状远远不能满足实际需 要。 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 4 计算机辅助基因识别( 仅指蛋白质编码基因) 基本问题是给定基因组序列后，正确识别基因的范围和在基因组序列中的精 确位置这是最重要的课题之一，而且越来越重要。经过2 0 余年的努力，提出了 数十种算法，有十种左右重要的算法和相应软件上网提供免费服务。原核生物计 算机辅助基因识别相对容易些，结果好一些。从具有较多内含子的真核生物基因 组序列中正确识别出起始密码子、剪切位点和终止密码子，是个相当困难的问题， 研究现状不能令人满意，仍有大量的工作要做。 5 非编码区分析和d n a 语言研究，是最重要的课题之一 在人类基因组中，编码部分进展总序列的3 5 ，其它通常称为“垃圾”d n a ， 其实一点也不是垃圾，只是我们暂时还不知道其重要的功能。分析非编码区d n a 序列需要大胆的想象和崭新的研究思路和方法。d n a 序列作为一种遗传语言， 不仅体现在编码序列之中，而且隐含在非编码序列之中。 6 分子进化和比较基因组学，是最重要的课题之一 早期的工作主要是利用不同物种中同一种基因序列的异同来研究生物的进 化，构建进化树。既可以用d n a 序列也可以用其编码的氨基酸序列来做，甚至 于可通过相关蛋白质的结构比对来研究分子进化。以上研究已经积累了大量的工 作。近年来由于较多模式生物基因组测序任务的完成，为从整个基因组的角度来 研究分子进化提供了条件。可以设想，比较两个或多个完整基因组这一工作需要 新的思路和方法，当然也渴望得到更丰硕的成果。这方面可做的工作是很多的。 7 序列重叠群( c o n t i g s ) 装配 一般来说，根据现行的测序技术，每次反应只能测出5 0 0 或更多一些碱基 对的序列，这就有一个把大量的较短的序列全体构成了重叠群( c o n t i g s ) 。逐步 把它们拼接起来形成序列更长的重叠群，直至得到完整序列的过程称为重叠群装 配。拼接e s t 数据以发现全长新基因也有类似的问题。已经证明，这是一个n p 完备性算法问题。 8 遗传密码的起源 1 6 琼胶酶1 3 - a g a a 结构和功能关系的研究 遗传密码为什么是现在这样的? 这一直是一个谜。一种最简单的理论认为， 密码子与氨基酸之间的关系是生物进化历史上一次偶然的事件而造成的，并被固 定在现代生物最后的共同祖先里，一直延续至今。不同于这种“冻结”理论，有人 曾分别提出过选择优化、化学和历史等三种学说来解释遗传密码。随着各种生物 基因组测序任务的完成，为研究遗传密码的起源和检验上述理论的真伪提供了新 的素材。 9 基于结构的药物设计 人类基因组计划的目的之一在于阐明人的约1 0 万种蛋白质的结构、功能、 相互作用以及与各种人类疾病之间的关系，寻求各种治疗和预防方法，包括药物 治疗。基于生物大分子结构的药物设计是生物信息学中的极为重要的研究领域。 为了抑制某些酶或蛋白质的活性，在已知其3 级结构的基础上，可以利用分子对 接算法，在计算机上设计抑制剂分子，作为候选药物。这种发现新药物的方法有 强大的生命力，也有着巨大的经济效益。 1 0 其他 如基因表达谱分析，代谢网络分析；基因芯片设计和蛋白质组学数据分析等， 逐渐成为生物信息学中新兴的重要研究领域。 3 定点突变i s 6 1 定点突变( s i t ed i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，s d m ) ，是指在基因的特定位点引入突变。 通过定点突变可以在体外改造目的d n a 分子，进而研究基因的表达以及蛋白质 的结构与功能之间的关系。该方法比使用化学因素该方法比使用化学因素、自有 因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核 苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能关系之外，还能够通过改变特定 的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状 态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。该技术在生物和医学领域中的应用非 常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、p c r 介导 的定点突变及盒式突变。 3 1 寡核苷酸引物介导的定点突变 1 7 琼胶酶1 3 a g a a 结构和功能关系的研究 其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动 d n a 分子进行复制。主要的过程如下：l 将待突变基因克隆到突变载体上；2 制备 含突变基因的单链模板；3 引物与模板退火5 端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待 突变的核苷酸形成- d , 段碱基错配的异源双链的d n a ，4 合成突变链：在d n a 聚 合酶的催