（微生物学专业论文）高温α—淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究.pdf

四川大学硕士论文 2 4 影响产酶因素的研究4 4 2 5 高温o 【一淀粉酶的应用4 6 2 6 高温0 c 一淀粉酶的发展趋势5 0 3 耐酸性高温0 【一淀粉酶5 1 3 1 耐酸性高温0 l 一淀粉酶的特性5 1 3 2 耐酸机制5 1 3 3 酶的应用5 2 3 4 酶的研究进展5 2 3 5 酶生产菌株的育种进展5 3 参考文献5 5 致谢6 0 在读期间科研成果简介6 1 声明6 2 图形目录 图1 ：菌株在筛选培养基上产生的水解圈1 9 图2 ：菌株孢子扫描电镜照片2 0 图3 ：菌株生长曲线2 1 图4 ：种龄及接种量对产酶的影响2 2 图5 ：培养基初始含水量对菌株产酶的影响2 3 图6 ：培养基初始p h 值对产酶影响2 4 图7 ：培养温度对产酶的影响2 4 图8 ：三角瓶固态发酵产酶曲线2 5 图9 ：在不同p h 值下的酶活比较2 5 图1 0 ：在不同温度下的酶活比较2 6 图1 1 ：酶的热稳定性2 6 图1 2 ：酶的p h 稳定性2 7 图1 3 ：c a 2 + 浓度对酶耐热性的影响2 7 图1 4 ：酒精对酶活力的影响2 8 i i i 四川大学硕士论文 表格目录 表1 ：菌株在不同培养基上的培养特征 表2 ：菌株的生理生化特性 表3 ：不同氮源对产酶的影响 表4 ：碳氮比例考查 表5 ：a 一淀粉酶主要的微生物来源 i v 加加勉为弘 四川大学硕士论文 高温0 【一淀粉酶产生茵的筛选及酶学性质研究 微生物学专业( 工业微生物) 研究生：朱何东指导教师：王忠彦副教授 摘要 从酒厂高温曲中筛选到一株产高温q 一淀粉酶的野生菌株，通过 对其形态、培养特征、生理生化特性及生态特性的研究，初步鉴定为 链霉菌，命名为s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 。 该菌菌落较小，中央有皱褶，气生菌丝白色，基内菌丝微黄色， 较发达。孢子丝直，孢子柱状、杆状，表面光滑。革兰氏染色阳性。 菌株可在2 0 - - 5 0 c 之间生长，最适温度在4 0 - - 4 5 ，菌株对大肠杆 菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌均无抗性。在各种培 养基上培养无色素产生，该菌能水解淀粉，能使明胶液化，不能使牛 奶胨化和凝固，不能水解纤维素，硝酸盐还原阳性，不能产生h 2 s ， 能利用阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖，棉子糖、甘露醇、肌 醇、半乳糖、乳糖、麦芽塘、山梨醇，不能利用鼠李糖、卫茅醇、菊 糖。 通过对菌株固体发酵条件优化研究，发现该菌株最适产酶条件 为：培养基以麦麸为主要原料，按照麦麸：豆饼粉比例为1 ：1 加入 豆饼粉补充氮源，培养基固态物与水的比例为l ：1 5 ，自然p h 值， 培养温度为4 5 ，接种种龄为7 2 h ，接种量为5 m l 瓶。该菌株固体发 四川大学硕士论文 酵产酶活力最高可达到2 0 7 5 9 u g 。 菌株所产生的高温a 一淀粉酶最适反应温度为8 5 c ，最适p h 为 6 5 ，具有较高的热稳定性，c a 2 + 能增强酶的耐热性，当c a 2 + 浓度在 0 0 2m o l l 时作用最大。在p h 值6 0 - - 7 0 范围内该酶稳定性较好。 该酶对酒精具有一定的抗性，当酒精浓度达5 时，酶活力几乎不变。 关键词：高温0 【一淀粉酶；链霉菌；筛选；发酵条件；酶学性质 2 四川大学硕士论文 s c r e e n i n g o fat h e r m o s t a b l e a - a m y l a s e - p r o d u c i n gs t r a i na n ds t u d yo n i t se n z y m o l o g y p r o p e r t i e s + m a j o r ：m i c r o b i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t ：z h uh e d o n g t u t o r ：w a n gz h o n g - y a n at h e r m o s t a b l e a a m y l a s e - p r o d u c i n g s t r a i nw a ss c r e e n e df r o m h i g h - t e m p e r a t u r ed i s t i l l e dy e a s t ，w h i c hw a si d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e t e f o r ms t u d y i n gi t sc e l l s h a p e ，c u l t u r e ，p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a l a n d e c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a n dn a m e ds t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 t h ec o l o n yo fs t r a i ni ss m a l l ，t h e r ea r eg o f f e ri nt h ec e n t e r a e r i a l m y c e l i u ma r ew h i t e , s u b s t r a t em y c e l i u ma r ey e l l o w i s ha n df l o u r i s h i n g t h em y c e l i u ma r e s t r a i g h t ，s p o r e a r es m o o t h ，a n dc o l u m n e do r b a c i l l i f o r m t h ec e l lo fs t r a i na r eg r a m p o s i t i v e s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 c a ng r o wi nt h et e m p e r a t u r eb e t w e e n2 0t o5 0 c ，a n dt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r er a n g ei s4 0t o4 5 i th a sn oa n t a g o n i s t i ca c t i o nt o e s c h e r i c h 缸 c o l i ， b a c i l l u s s “6 d z 括， s t a p h a f d c o c c “$ a u r e u sa n d p s e u d o m o m u sa e r u g i n o s a i tc a rn o tp r o d u c ep i g m e n ti nv a r i o u sc u l t u r e m e d i u m t h es t r a i nc a l lh y d r o l y z es t a r c h ，l i q u e f yg h t i n ，d e o x i d i z en i t r a t e ， b u tc a n tp r o d u c eh 2 s i na d i t i o n ，i tc a l lm a k eu s eo fa r a b i n o s e ，x y l o s e ， f r u c t o s e ，g l u c o s e ，s u c r o s e ，r a f f m o s e ，m a n n i t o l ，i n o s i t o l ，s o r b i t o l ，g a l a c t o s e ， 3 四川大学硕士论文 l a c t o s ea n dm a l t o s e ，b u tc a l ln o tm a k eu s eo fr h a m n o s e ，d u l c i t o l , i n u l i n b ys t u d y i n gc o n d i t i o no p t i m i z a t i o nu n d e rs o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o no f t h es t r a i n , i t so p t i m u mc o n d i t i o n st op r o d u c ea - a m y l a s ew e r ef o u n d t h e c o n d i t i o n sw g r ea sf o l l o w s ：t h ep r o p o r t i o no fb r a nt ob e a nc a k ei s1 ：l ： t h ep r o p o r t i o no fs o l i dt ow a t e ri s1 ：1 5 i n i t i a lp hi sn a t u r a l , i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r ei s4 5 5 m l f l a s ki n o c u l u ms i z e a n ds e e d sa g ef o r7 2 h u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s 。t h ea c t i v i t yo fa a m y l a s ep r o d u c e db yt h es t r a i n w a s2 0 7 5 9 u g t h ee n z y m ew a sp r o d u c e db yt h es t r a i nw a st h e r m o s t a b l ea n di t s o p t i m u mt e m p e r a t u r e a n d p hw e r e d e t e r m i n e da s8 5 a n d6 5 r e s p e c t i v e l y c a 2 g a l li m p r o v et h et h e m o s t a b i l i t yo fe n z y m e ，a n d i tr e a c h t h eb e s te f f e c tw h e nc a 2 + w a s0 0 2 m o l lt h ee n z y m ew a sm u c hs t a b l ei n t h ep hr a n g e6 0 7 0 a n di ta l s os t a b l ei nt h ea l c o h o li nac e r t a i ne x t e n t ， w h e na l c o h o lc o n c e n t r a t i o nw a s5 t h ea c t i v i t yo fa a m y l a s en e a r l yn o t c h a n g e s k e yw o r d s ：t h e r m o s t a b l ea - a m y l a s e ；s t r c p t o m y c e t e ； s c r e e n i n g ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ；e n z y m o l o g yp r o p e r t y 4 四川大学硕士论文 高温0 【一淀粉酶产生菌的筛选 及酶学性质研究 刖旨 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生 物中。也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广，产量最大的酶 制剂品种。人类对淀粉酶的应用开始于几千年前，但是酶提取出来使 用是从十九世纪开始的。1 8 3 3 年，p a y e r 从麦芽提取液中加酒精沉淀 获得淀粉酶，1 8 9 6 年日本人高峰让吉用麸皮培养米曲霉，用水提取再 以酒精沉淀得到淀粉酶作为消化剂，并在美国设厂从事微生物酶的生 产和研究。1 9 2 0 年左右，法国人b i o d i n 和e f f r o n t 等又先后发现枯草 杆菌可以分泌耐热并且活性更高的a 一淀粉酶，于1 9 2 6 年在德国设厂 生产，为微生物酶的工业生产奠定了基础1 1 】。在工业高度发达的今天， 淀粉酶占据了工业化酶制剂市场约2 5 的市场份额1 2 1 1 3 1 。 高温a 一淀粉酶( t h e r m o s t a b l ea a m y l a s e ，e c3 2 1 1 ) ，是一种内 切淀粉酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的伽l ，4 葡萄糖 苷键，是淀粉酶中的一种【4 1 。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速降低， 变成液化淀粉，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖【研。其最适反应 温度为9 0 9 5 、热稳定性在9 0 以上，比解淀粉芽孢杆菌产生的 中等耐热性a 一淀粉酶高i o 一2 0 。与一般细菌a 一淀粉酶相比，用 高温a 一淀粉酶液化淀粉具有以下优点：在9 0 以上高温液化淀粉 反应快，液化彻底，可避免淀粉分子胶束重排形成难溶性的团粒，因 此过滤容易，可节省能源。对c a 2 + 依赖性小，液化时不需添加c a 2 + ， 故糖化液的精制大为省力，成本可以下降。 酶的稳定性好【6 l 。自7 0 5 四川大学硕士论文 年代商品化成功后，双酶糖化法才在发酵行业中广泛应用，高温a 一 淀粉酶也因此成为广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织和环境治理等 行业的重要酶类。 微生物中许多种类都能产生淀粉酶，b u c h a n a n 7 】和t a m u r i 等人描 述了数百种嗜热真菌和上千种细菌，仅b a c i l l u s 属4 8 个种中就有3 2 个种能产生a 一淀粉酶，但产生高温a 淀粉酶的菌种较少。c a m p b e l l 8 】 等首先从凝结芽孢杆菌( b a c i l l u s c o a g u l a n s ) 纯化出高温a 一淀粉酶，接 着从芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌m s u b t i l i s ) 、嗜热芽孢杆菌僻 s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i o r m i s ) t g l ，古细菌的 t c y r o c o 、c 傲c u s 血r i o s u s ，毋，d c 。c c u sw o e s “，t h e r m 。c o c c u s p r o f u n d u s 【1 0 】， 及高泣簖线菌属的t h e r m o a c t i n o m y c e st h a l p o p h i l u s 等菌株中也分离得 到该酶。 从5 0 年代开始，人们就着手从高温土壤中筛选出发菌株来研究 高温a 一淀粉酶。自1 9 7 3 年m a d s e n 等1 1 1 1 报道了采用常温地衣芽孢杆 菌得到了一种新的耐高温a 一淀粉酶开始，人们尝试从中温菌，特别 是地衣芽孢杆菌中获得高温a 一淀粉酶，这给高温a 一淀粉酶的研究 开辟了一条新途径。近年来人们对高温土壤中，特别是温泉附近土壤 中，筛选到了产高温a 一淀粉酶的凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、 嗜热芽孢杆菌。可见高温菌在高温a 一淀粉酶研究中仍然十分重要。 本研究从酒厂高温曲中分离得到一株能向胞外分泌高温a 一淀粉 酶的菌株，初步鉴定为链霉菌，命名为s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 。其分泌 的高温a 一淀粉酶具有较高的热稳定性和耐酒稽性能，具有一定的工 业应用价值。论文中报道了该菌株筛选、鉴定、发酵条件及所产高温 a 一淀粉酶酶学性质的研究结果。 6 四川大学硕士论文 材料与方法 1 实验材料 1 1 样品来源 四川某白酒酿造企业高温曲 1 2 菌种 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌( 本实验 室保藏) ；s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 ( 本实验筛选) 1 3 培养基【1 2 1 5 】 1 3 1 平板筛选培养基： 可溶性淀粉2 ，k n 0 30 1 ，n a c l0 0 5 ，k e h p 0 4 3 h 2 00 0 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ，f e s 0 4 7 1 - 1 2 00 0 0 1 ，琼脂2 ，p h7 o 一 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 后，加入已灭菌的一定量的重铬酸钾 浓溶液，使培养基重铬酸钾浓度达2 5 m g l 。 1 3 2 斜面培养基： 蛋白胨1 ，可溶性淀粉2 ，k n 0 30 1 ，n a c io 0 5 ， k 2 h p 0 4 3 h 2 00 0 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ，琼 脂2 ，p h 7 o 一7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 3 种子培养基： 蛋白胨o 5 ，酵母膏o 5 ，可溶性淀粉3 ，c a c l 2 2 h 2 0 0 0 5 ，m n c l 2 4 h 2 00 0 5 ，m g c l 2 7 h 2 0o 0 5 ，k h 2 p 0 4o 1 ，p h 7 0 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 7 四川大学硕士论文 1 3 4 产酶液体培养基： 同种子培养基。 1 3 5 产酶固体培养基： 麦麸：水为1 ：1 _ 5 ，2 5 0 m l 三角瓶装量2 5 9 ，自然p h 值，1 2 1 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 3 6 分类鉴定培养基： 1 3 6 1 高氏一号琼脂： 可溶性淀粉2 ，k n 0 30 1 ，n a c l0 0 5 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 00 0 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ，f e s 0 4 ，7 h z o o 0 0 1 ，琼脂2 ，p h 7 0 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 6 2 查氏琼脂： 蔗糖3 ，n a n 0 30 2 ，k 2 h p 0 4o 1 ，m 庐0 4 7 h 2 00 0 5 ， k c lo 0 5 ，f e s 0 4 7 i - 1 2 00 0 0 1 ，琼脂2 ，p h7 2 。 1 1 5 c 高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。 1 3 6 3 葡萄糖天门冬素琼脂： 葡萄糖1 ，天门冬素0 0 5 ，k 2 h p 0 40 0 5 ，琼脂2 ，牛 肉膏0 2 ，p h7 2 。 1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 1 3 6 4 淀粉水解试验培养基： 蛋白胨1 ，牛肉膏o 3 ，n a c l 0 5 ，可溶性淀粉2 ，琼脂 1 5 ，p h7 2 7 4 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 8 四川大学硕士论文 1 3 6 5 无机盐淀粉琼脂： 可溶性淀粉1 ，n a n 0 30 1 ，m g c 0 30 1 ，k 2 h p 0 40 0 3 ， n a c l0 0 5 ，琼脂2 ，p h 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 6 6 葡萄糖酵母膏琼脂： 葡萄糖1 ，酵母膏1 ，琼脂1 5 ，p h 7 2 a 1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。 1 3 6 7 酪氨酸琼脂( 产色素用) ： l 一酪氨酸0 1 ，n a c l 0 8 5 ，酵母膏o 1 ，琼脂1 6 ，p h 7 2 。 1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 1 3 6 8 马铃薯块： 马铃薯去皮去芽眼，切成斜面状长方块，用水洗净，装入无菌试 管( 试管内应先放入湿棉花球，使马铃薯块保持湿润) 。 1 2 l 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 6 9 明胶液化培养基： 蛋白胨0 5 ，明胶2 0 ，葡萄塘2 ，p h 7 2 7 4 。 1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 1 3 6 1 0 牛奶凝固胨化培养基： 牛奶( 脱脂鲜牛奶) 1 0 0 0 m l ，c a c 0 30 0 2 9 。 间歇灭菌3 次，每次3 0 r a i n 。 1 3 6 1 1 纤维素水解培养基： m g s 0 4 0 0 5 ，n a c l 0 0 5 ，k 2 h p 0 4 0 0 5 ，k n 0 30 1 ，p h 9 四川大学硕士论文 7 2 。 滤纸片( 长5 e m ，宽o 8 e m ) ，1 2 1 c 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 6 1 2 硝酸盐还原培养基： m g s 0 4 0 0 5 ，k 2 h p o , o 0 5 ，k n 0 3 0 1 ，蔗糖2 ，n a a 0 0 5 ，p h 7 2 。 1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 1 3 6 1 3 柴斯纳琼脂( t r e s n e r ) ( 产生h 2 s ) ； 蛋白胨1 ，柠檬酸铁0 0 5 ，琼脂1 5 ，p h 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 1 3 6 1 4 碳源利用培养基( p r i d h a m & g o t t l i e b ) ： ( m - 1 4 ) 2 s 0 40 2 6 4 ，k h 2 p 0 40 2 3 8 ，k z h p 0 4o 5 6 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 1 ，c u s 0 4 5 h 2 00 0 0 0 6 4 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 0 1 1 ， m n c i 4 h 2 0 0 0 0 0 7 9 ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 0 1 5 ，琼脂1 5 ，p h 7 2 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 4 溶液与试剂f 1 6 1 9 l 1 4 1 酶活测定用溶液 原碘液：称取o 5 9 碘和5 o g 碘化钾研磨溶于少量蒸馏水中，然 后定容到1 0 0 m l ，贮于棕色瓶中备用( 每月制备一次) 。 稀碘液：取l m l 原碘液用蒸馏水稀释1 0 0 倍( 每天制备一次) 。 缓冲液( p h 6 o ) ：称取磷酸氢二钠( n a z f i p 0 4 - 1 2 h 2 0 ) 4 5 2 3 9 和 柠檬酸( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ) 8 0 7 9 ，用蒸馏水溶解定容至1 0 0 0 m l ，配好后 以酸度计校正p h 值为6 0 。 0 5 可溶性淀粉溶液：用p h 6 0 的磷酸缓冲液新鲜配制。 1 4 2 分类鉴定用溶液 1 0 四川大学硕士论文 1 ) 革兰氏染色液 a ) 结晶紫液 甲液：结晶紫2 9 ，9 5 乙醇2 0 m l 。 乙液：草酸铵0 8 9 ，蒸馏水8 0 m l 。 将甲、乙两液相混，静置4 8 h 后过滤使用，染色液应放置棕色瓶 中保存。 b ) 碘液 碘片1 9 ，碘化钾2 9 ，蒸馏水3 0 0 m l 。 先用少量( 3 - - 5 m 1 ) 蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶 解后，加入水稀释至3 0 0 m l 。放置棕色瓶贮存数月。 c ) 复染液( 番红2 5 的乙醇溶液) 蕃红2 5 9 ，9 5 乙醇1 0 0 m l 。 复染液保存于棕色瓶中用复染液与蒸馏水1 ：4 混和& 口得到革 兰氏染色所需的0 5 蕃红水溶液。 2 ) 硝酸盐还原试验试剂 a ) 格里斯( g r i e s s ) 试剂 a 液：对氨基苯磺酸0 5 9 ，稀醋酸( 1 0 左右) 1 5 0 m l 。 b 液：a 一萘胺0 1 9 ，蒸馏水2 0 m l ，稀醋酸( 1 0 左右) ，1 5 0 m l 。 b ) 二苯胺试剂 二苯胺0 5 9 溶于1 0 0 m l 浓硫酸中，用2 0 m l 蒸馏水稀释。 l4 3 调用p h 酸碱液 1 ) l m o l l 盐酸 量取3 6 的浓盐酸8 6 2 m l ，用水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 2 ) 0 1 m o l l 盐酸 l m o i l 盐酸1 0 m l ，蒸馏水9 0 m l 。 四川大学硕士论文 3 ) l m o l l 氢氧化钠 称取氢氧化钠4 0 9 ，用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 4 ) 0 。l m o l l 氢氧化钠 l m o l l 氢氧化钠1 0 m l ，蒸馏水9 0 m l 。 1 4 4 主要试剂 主要试剂均为国产分析纯。 1 5 仪器 l g l 0 2 4 a 型高速离心机：北京医用离心机厂； l d 4 2 型离心机：北京医用离心机厂； 三用恒温水箱：江苏教育玻塑厂； a i b 型洁净工作台：北京半导体设备一厂： y b 型电子天平：上海力能电子仪器公司； h z 0 c 型空气浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司； p h s 一2 c 酸度计；上海康仪仪器有限公司： 光学显微镜：日本o l y m p u s 光学显微镜； 扫描电镜：h n a c h i - - 4 5 0 型； 7 2 1 分光光度计：上海第三分析仪器厂。 2 实验方法 2 1 高温a 一淀粉酶产生菌的筛选 2 1 1 菌种初筛 称取样品5 9 加入装有5 0 m l 无菌水的小三角瓶中，振荡均匀后 静置，取上清液做浓度梯度稀释，取一定量涂布于平板筛选培养基， 4 5 c 倒置培养若干天，待长出菌落后挑取有明显透明圈的单菌落，转 接，经平板划线法得到纯种。 四川大学硕士论文 2 1 2 菌种复筛 初筛菌种接种于种子培养基，4 5 ，1 5 0 r r a i n 摇床培养7 2 h 。种 子液以1 0 接种量接种于产酶液体培养基，相同条件培养7 2 h 后，发 酵液1 0 0 0 0 r l m i n 离心5 m i n ，取上清液测酶活。 2 2 高温a 一淀粉酶酶活测定f 1 6 。1 7 1 1 2 0 - 2 2 1 2 2 1 液体发酵酶液提取 发酵液1 0 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，取上清液，即粗酶液。 2 2 2 固体发酵酶液浸出 称取固体培养基5 9 ，加入p h 6 0 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 ( 0 5 n a c i ) 2 0 m l 浸泡3 h ，过滤，1 0 0 0 0 r r a i n 离心5 分钟取上清液， 即粗酶液。 2 2 3 酶活测定方法 取5 m 1 0 5 可溶性淀粉溶液，在7 0 水浴中预热1 0 r a i n ，加入适 当稀释的酶液d 5 m l ，准确反应5 r a i n 后，用5 m l 0 1 m o f l h 2 s 0 4 终止 反应。取o 5 m l 反应液与5 m l 稀碘液显色，在6 2 0 r i m 处测光密度。以 0 5 m l 水代替0 5 m l 反应液为空白，以不加酶液( 加同体积的缓冲液) 的管为对照。 酶活力根据下式计算： 酶活力= ( r o - - r ) r o x 5 0 x d x 4 式中r 0 、r 分别表示对照和反应液的光密度，d 为酶的稀释倍数。 调整d 使( r o - - r ) 在0 2 0 7 之间。 酶活定义：在7 0 c 、p h 6 0 条件下，5 r a i n 内水解l i n g 淀粉的酶 量为一个活力单位。 2 3 分类鉴定实验【1 4 1 1 1 8 1 1 2 3 l 2 3 i 革兰氏染色 四川大学硕士论文 1 取无油迹的干净载波片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑 取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。 2 自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。 3 滴加结晶紫液，染一分钟。用水冲净结晶紫液。 4 滴加碘液冲净残水，并覆盖约l m i n 。用水冲去碘液，将片上 的水甩干 5 滴加9 5 乙醇液脱色约2 0 - - 3 0 s e e ，并立即用水冲净乙醇。 6 用蕃红液染1 2 m i n 。用水洗净番红，风干，用显微镜淮镜观 察涂片。 7 菌体红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。 2 3 2 淀粉水解试验 取菌种点种于淀粉水解实验培养基平板上，适温培养2 4 d ，形 成菌落后，再平扳上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落周围为度。平板 呈蓝色。菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解。 2 3 3 硝酸盐还原试验 将实验菌株接种于硝酸盐液体培养基中( 需傲不接种的对照管) ， 适温培养1 ，3 、5 d 。取两只干净的试管倒入少许培养液，然后在其中 分别各加一滴格里斯氏试剂a 液和b 液，在对照管中同样加试剂。 当培养液变成粉红色、玫瑰红色、橙色和棕色时，表示有亚硝酸盐存 在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可滴加1 - - 2 滴二苯胺试 剂，此时若培养液为蓝色，则表示培养基中仍有硝酸盐，若不呈蓝色， 表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都已经还原成其他物质，故按硝酸盐 还原阳性处理。 2 3 4 明胶水解试验 将测试菌接种于明胶水解培养基中，在适温温度下培养1 5 - - 2 0 d ， 放入4 c 冰箱，观察培养基还能不能凝固，不能凝固者明胶水解为阳 1 4 四川大学硕士论文 性，能凝固者为阴性。 2 3 5 牛奶的凝固与胨化 将菌种接种在脱脂牛奶管中，于适温培养，分别在第3 、6 、1 0 、 2 0 、3 0 天各观察一次，如果牛奶形成凝块，为凝固现象，系放线菌产 生凝乳酶引起蛋白质凝固。再继续培养，则凝固被分解，那是菌种产 生蛋白酶，使蛋白质水解成可溶性状态，称为胨化现象。 2 3 6 纤维素水解试验 将菌种接种在试管中一般浸在无碳源合成培养基内的滤纸条上， 于适温培养，第3 0 天时观察结果，如果菌种能在滤纸片上生长，并 分解纸条，表示该菌株产生纤维素酶，若纸条不被分解，则该菌株不 产生纤维素酶。 2 3 7 产h 2 s 试验 将普通滤纸剪成0 5 1 c i n 宽的纸条，长度根据试管与培养基高 度而定，用5 一l o 的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于 培养皿中灭菌备用。用新鲜斜面培养物接种培养基，接种后，用无菌 镊子夹取一条醋酸铅纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接近培养 基表面，不接触液面，适温培养。于接种后3 、7 、1 4 天观察。纸条 变黑者为阳性，不变者为阴性。 2 3 8 碳源利用试验 将灭菌后的碳源利用培养基冷却至5 0 c 左右，倒入无菌培养皿 内，每皿约1 5 2 0 m l ，凝固后备用。将菌种的孢子制成孢子悬液， 在上述基础培养基上，每皿加0 2 m l 孢子悬液，用无菌涂布捧均匀涂 布，然后在这个培养皿上划分若干小区，并用小刀挖沟为界，用灭菌 牙签分别将各种糖挑加在各小区上( 必须每一种糖换1 根牙签) ，每 个培养皿必须留一无塘对照区。将培养皿置适温培养7 1 4 天，分别 四川大学硕士论文 观察记录生长情况，如菌种在加碳源的地方生长，则表示该菌株能利 用这种碳源，如果菌株不生长，与对照区相同，则表示菌株不利用碳 源。 2 3 9 扫描电子显微镜观察 1 菌液用0 1 m o l l 磷酸缓冲液( p b s ) ( p h 7 2 ) 洗三次 2 最后一次悬于适量的p b s 中。浓度以滴在3 4 m m 2 小玻片上 密度均匀，菌落不重叠为宜( 稍多为宜，因为在固定和脱水过程中要 掉许多) 。 3 将菌悬液稀释到适当浓度后，滴在小玻片上，室温静止十分 钟。 4 细胞面朝上把玻片放入小称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓熳加 入1 冷却的戊二醛溶液，加的量只要淹过样本即可，4 固定过夜。 5 用p b s 液洗三次。 6 逐级脱水：3 0 ，5 0 ，7 0 ，8 5 ，9 5 乙醇各一次，1 0 0 两次，每次1 0 - - 1 5 r a i n 。 7 用醋酸异戊酯逐级替换乙醇：3 0 ，5 0 ，7 0 ，8 5 ，9 5 醋酸异戊酯各一次，1 0 0 两次，每次1 0 1 5 m i n 。放入临界点干 燥仪进行干燥。 8 以碳，金分别喷镀。 取出样品，扫描电镜观察。 2 4 发酵条件的研究f 2 * 2 5 1 2 4 1 生长曲线测定 2 5 0 m l 三角瓶盛放5 0 m 1 种子培养基，从斜面接入1 环菌体，置 于旋转式摇床上，1 5 0 r r a i n ，4 5 培养，每隔6 小时用预先烘干的 滤纸过滤培养液，滤纸烘干至恒重，称取该滤纸重量，减去原先滤纸 重量，即为菌体质量，作出菌体质量与时间相应的曲线。 1 6 四川大学硕士论文 2 4 2 产酶条件研究 出发菌株在斜面上活化一代，然后挑接一环接入种子培养基，4 5 条件下，摇床培养一定时间，再按一定接种量接入2 5 0 m l 三角瓶固 体发酵培养基。 2 4 2 1 种龄及接种量对产酶的影响 选取处于对数生长期不同时候的菌液作为种子，保持培养基含水 量为麦麸：水为1 ：1 5 不变的情况下，按照不同量接入固体培养基中， 培养7 2 h ，测定酶活，根据试验数据选择对产酶最佳的种龄和接种量。 2 4 2 2 培养基碳氮比对产酶的影响 培养基的氮源和碳氮v c ( c m ) 对微生物的生长和产酶有一定的影 响，通过在主要原料麸皮中添加豆饼粉、尿素、( n h 4 ) 2 s 0 4 、( n 1 4 ) 2 c 0 3 等不同氮源进行发酵产酶实验，培养7 2 h ，测定酶活，选择出对产酶 影响较大的氮源。然后再配制其与麸皮不同的比例，培养测定酶活， 考查碳氮比对菌株产酶的影响。 2 4 2 3 培养基初始含水量对产酶的影响 配制不同初始含水量即固态培养基与水不同比例的培养基进行 发酵产酶试验，培养7 2 h ，测定酶活，根据测定数据选择最佳的初始 含水量。 2 4 2 4 培养基初始p h 对产酶的影响 用不同p h 值的缓冲溶液配置培养基，进行发酵产酶试验，培养 7 2 h ，测定酶活，根据测定数据选择最佳的初始p h 值。 2 4 2 5 培养温度对产酶的影响 以上面确定的培养基，分别在不同温度下发酵培养，培养7 2 小 时后测定酶活，确定最佳培养温度。 1 7 四川大学硕士论文 2 4 。3 发酵产酶曲线的确定 以上面确定的培养条件，进行发酵产酶试验，在不同时间段测定 酶活，测定结果与时间相关可得到产酶曲线。 2 5 酶学性质研究【砌l 2 5 1 酶反应最适p h 值 用p h 值范围为4 - - 8 的缓冲液配制不同p h 值可溶性淀粉溶液， 测定相应的酶活力，确定酶反应最适p h 值。 2 5 2 酶反应最适温度 在不同温度下测定相应的酶活力，温度范围为4 0 0 一1 0 0 c ，确 定酶反应最适温度。 2 5 3 酶的温度稳定性 将粗酶液在7 0 、8 0 、9 0 水浴保温不同时间，立即置于冰水中冷 却，在7 0 下测定残余酶活，确定酶的耐温性能。 2 5 4 酶的p h 稳定性 用0 1 m o t l 的h a 或n a o h 调节粗酶液p h 至3 0 9 0 ，在室温 下放置l h 后，测定残余酶活，确定酶的p h 稳定性。 2 5 5c a 2 + r t 酶耐热性的影响 取粗酶液添加不同浓度的c a 2 + ，浓度范围为0 0 1 0 0 5 m o i l ，在 9 0 水浴保温3 0 r a i n ，立即用冰水冷却，测定残余酶活，确定c a 2 + 对 酶耐热性影响关系。 2 5 6 酶的耐酒精试验 用酒精和缓冲液配制不同浓度的可溶性淀粉溶液，测定相应的酶 活力，确定酶的耐酒精性能。 1 8 四川大学硕士论文 结果 1 高温c 【一淀粉酶产生菌的筛选 从样品中筛选得到一株产酶较高的野生菌株s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 ，液体发酵酶活为5 6 4 7 u m l ，固态发酵酶活为2 0 7 5 9 u g 。 2 菌种鉴定结果 该菌菌落较小，中央有皱褶( 见图1 ) ，气生菌丝白色，基内菌丝 微黄色，较发达。革兰氏染色阳性。孢子丝直，孢子柱状、杆状，表 面光滑( 见图2 ) 。菌株可在2 0 一5 0 之间生长，最适温度在4 0 4 5 ， 菌株对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌均无抗 性。该菌在不同培养基上的培养特征见表1 ，在培养过程中均无可溶 性色素产生。该菌生理生化特性见表2 。综合以上结果，将该菌初步 鉴定为链霉菌，命名为s t r e p t o m y c e ss p 1 1 0 9 。 图1 菌株在筛选培养基上产生的水解圈 1 9 四川大学硕士论文 图2 菌株孢子扫描电镜照片 表1 菌株在不同培养基上的培养特征 培养基 气生菌丝 基内菌丝 高氏1 号琼脂 白色微黄色 查氏琼脂 灰白亮白 葡萄糖天l - j 冬素琼脂 微白色 黄色 无机盐淀粉琼脂白色 灰黄色 葡萄糖酵母膏琼脂 微白 微黄 酪氨酸琼脂 白色乳白色 马铃薯块 灰白 乳脂色 表2 菌株的生理生化特性 项目 特征项目 特征项目特征 明胶液化+木糖+ 半乳糖+ 淀粉水解+ 葡萄糖+ 乳檐+ 牛奶凝固一 果搪+ 麦芽糖+ 牛奶胨化一 鼠李糖一 卫茅醇一 纤维素水解一 蔗糖+菊糖一 硝酸盐还原+棉子耱+ 山梨醇+ 产生h 2 s 一 甘露醇+ 阿拉伯塘+ 肌醇+ 2 0 四川大学硕士论文 3 发酵条件的研究 3 1 生长曲线的确定 以菌体质量为纵坐标，以培养时间为横坐标做出相应的曲线，见 图3 。从图中可以看出，菌株的延迟期是0 1 2 小时，对数生长期为 1 2 6 4 小时，6 4 小时后进入稳定期。 0 6 o 5 o 4 翟o 3 盖o 2 0 1 0 061 2 培2 43 0 3 6 4 24 8 弱6 47 2 7 8 时间( h ) 图3 菌株生长曲线 3 2 种龄及接种量对产酶的影响 选取处于对数生长期不同时候的菌液作为种子，按照不同量接入 固体培养基中，培养7 2 小时，测定酶活。结果表明：当种龄为7 2 小 时，接种量为5 m l 瓶时，酶产量较高，随着接种量的增加，酶活在增 加不多之后减少，分析原因可能时接种的液体种子量过大，菌体量大 在生长过程中形成竞争，从而影响了菌体的生长。 四川大学硕士论文 2 0 0 o1 5 0 已1 0 0 羹5 0 o 0 接种量( m l 瓶) 图4 种龄及接种量对产酶的影响 3 3 培养基碳氦比对产酶的影响 通过在主要原料麸皮中添加豆饼粉、尿素、( n h 4 ) 2 s 0 4 、( i , n b ) 2 c 0 3 等不同氮源进行发酵产酶实验，培养7 2 小时，测定酶活，结果如表3 所示。 表3 不同氮源对产酶的影响 根据衷3 可以看出培养基加入豆饼粉后，对菌株产酶有较大提高。 分别按照麦麸：豆饼粉的比例为i ：0 2 5 ，1 ：0 5 ，i ：0 7 5 ，1 ：1 和1 ：1 2 5 考查碳氮比对菌株生长和产酶的影响，结果如表4 所示。 四川大学硕士论文 表4 碳氦比例考查 根据表4 可以看出，培养基中麦麸：豆饼粉的比例为1 ：1 相对产酶 较高。 3 4 培养基初始含水量对产酶的影响 在固态发酵培养中，培养基的含水量对菌体生长和产酶很重要， 培养基中含水量过低，麸皮培养基过于干燥，一方面在灭菌中麸皮中 的淀粉不易糊化，另一方面菌体接入后不易生长繁殖，对于发酵产酶 产生不利的影响。而培养基含水量过高，灭菌后麸皮会粘成一团，通 气性差，接种后静置培养时也对产酶不利。 实验结果( 图5 ) 表明：培养基初始含水量在6 0 左右即固态培养基 水比例为1 ：1 5 时，菌株产酶比较高。 1 2 0 ，、1 0 0 琶8 0 烘6 0 孽4 0 莓2 0 0 4 0 5 06 07 08 0 培养基初始含水量( ) 圈5 培养基初始含水量对菌株产酶的影响 3 5 培养基初始p h 值对产酶的影响 四川大学硕士论文 实验结果( 图6 ) 表明：在p h 值6 - - 8 范围内即接近自然p h 值条件 下，菌株产酶量比较高，所以选择自然p h 值作为培养基的起始p h 值，这样既操作简便，产酶又高。 1 0 0 霎8 0 丢6 0 程4