（麻醉学专业论文）糖尿病神经痛大鼠脊髓背角nmda受体表达变化.pdf

目录 m 1 i i i i l l i l l 0 i i i l l i i i l 哪 y 19 0 0 6 7 0 中文摘要l 英文摘要3 研究论文糖尿病神经痛大鼠脊髓背角n m d a 受体表达变化 前言。6日 j 舌。o 材料与方法7 结果1 0 附图1 2 附表1 6 讨论1 7 结论一2 0 参考文献2 1 综述脊髓背角n m d a 受体和g a b a b 受体相互作用的研究进展2 4 致谢3 4 个人简历3 5 中文摘要 糖尿病神经痛大鼠脊髓背角n m d a 受体表达变化 摘要 目的：随着对糖尿病并发症的重视和诊断技术的发展，糖尿病神经病 变( d i a b e t i cp e r i p h e r a ln e u r o p a t h y ，d p n ) 越来越被重视，但其发生、 发展的病理生理机制并不十分清楚。n m d a 受体作为脊髓兴奋性谷氨酸受 体系统的重要组成部分，在糖尿病神经痛等慢性疼痛状态的形成过程中发 挥着重要作用，通过改变脊髓背角神经元递质释放和受体活性，从而调节 痛觉信息在脊髓背角的整合、传递。 本试验通过腹腔注射链尿佐菌素( s t z ) ，制备糖尿病神经痛大鼠模型， 比较糖尿病神经痛大鼠( d m ) 与正常大鼠( c o n t r 0 1 ) 间体重、空腹血糖和 5 0 缩足反应阈值( p w t ) 的变化；采用免疫组织化学染色方法，测定糖尿病 神经痛大鼠与正常大鼠脊髓背角n m d a 受体的表达变化，从而探讨n m d a 受体在糖尿病神经病理性痛形成中的作用。 方法：健康s d 雄性大鼠3 5 只( 1 3 0 1 5 0 9 ) ，实验前测定所有大鼠的 体重、空腹血糖和5 0 缩足反应阈值( p w t ) 。随机取2 6 只大鼠腹腔注射s t z ( 5 0 m g k g ) 制备实验模型。s t z 注射一周后，2 1 只大鼠测量空腹血糖 1 6 7 m 0 1 l ( 成功率为8 0 ) ，为糖尿病模型，其余5 只大鼠空腹血糖 1 6 7 m o l l ，且p w t 4 9 。 d m 组各时间点取材实验大鼠5 只及c 组大鼠3 只，多聚甲醛灌流固定后， 中文摘要 取胸腰段膨大处脊髓进行免疫组织化学染色，测定大鼠脊髓背角n m d a 受体的免疫阳性神经元细胞数。 所得数据以平均数标准差( 夏s ) 表示，采用s p s s l 7 o 统计软件包 进行单因素方差分析、t 检验，p o 0 5 表示差异有显著性。 结果： l 在s t z 注射后3 周，d m 组大鼠体重、5 0 缩足反应阈值( p w t ) 较c 组下降明显( p o 0 5 ) ，血糖明显增高( p o 0 5 ) ，并且维持至s t z 注射 后的第7 周，与同时点的对照组相比，体重、血糖、p w t 值均有统计学 差异( p o 0 5 ) 。 2 大鼠脊髓背角n m d a 受体的表达变化( 见附表) ：与各时点c 组 正常对照组相比，d m 组注射s t z 后3 周、5 周、7 周的糖尿病神经痛大 鼠脊髓背角n m d a 受体免疫阳性神经元细胞数明显增加( p o 0 5 ) 。 结论：脊髓背角n m d a 受体在脊髓水平参与了大鼠糖尿病神经病性 痛的形成。 关键词：糖尿病神经病理性痛；脊髓背角；n - 甲基d 天冬氨酸受体； 免疫组织化学染色 英文摘要 e x p r e s s i o nc h a n g eo fn m d ar e c e p t o r si nt h es p i n a ld o r s a lh o r n o fr a t sw i t hd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：d i a b e t i cp e r i p h e r a ln e u r o p a t h y ( d p n ) i so n eo ft h em o s t c o m m o nl o n 分t i m ec o m p l i c a t i o n so fd i a b e t e s ，a n dm em o r b i l i t ) ri n c r e a s e s e v e 巧y e 缸w t hp a y i n ga t t e n t i o nt o d i a b e t i c sc o m p l i c a t i o na n dd i a 印o s e d e v e l o p m e n t ，p e r i p h e r a ls e n s o 巧n e u r o p a t h yh a v eb e e nt a k e nm o r ea n dm o r e s e r i o u s l ya n dm o s tc o m m o n 。 t h em e c h a n i s m so fd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i na r ev e qc o m p l e xa u l dr 1 0 t y e tb e e nc l e 筑卜m ar e c e p t o r s ( n m d a 黜) a r ei m p o m m tc o n l p o n e n t so f s y s t e m o fs p i n ee x c i t a t o 巧 g l u t 锄i c a c i d r e c e p t o r s 。 a sc h r o n i ca c h e c o n d i t i o n s ，d p nc a ns h i ras e r i e so fr e l e a s eo fn e u r o t r a n s m i t t e ra n dr e c e p t o r s a c t i v a t i o n ，w h i c hc o n t 曲u t i n gt oa 髓c t i n gf h n c t i o no f 皿a e 晤cr e c 印t o r s ， c o n s e q u e n n yi m p r e s s i n gm en o c i c e p t i v em e s s a g e sn e g r a t i o n 、廿孤s m i s s i o n a n d r e g u l a t i o ni ns p i n a lc o r di n d u c e db yn e u r o p a t h i cp a i n t h ep r e s e n ts t u d yi st oe x p l o r ec h a n g e so fn m d ar e c e p t o r si ns p i n a lc o r d d o r s a lh o mo fr a t sw i md i a b e t i c n e u r o p a m i cp a i n i n d u c e db ys t z c h a u r a c t e r i s t i cb e h a v i o r a lc h a n g e sw e r eo b s e r v e dt 0a 仃i e c th y p e r a l g e s i ao fr a t s b e 似e e nd i a b e t i c 铲o u p a n dc o n t r o l ， i n c l u d i n g 5o p a ww i m d r a w t h r e s h o l d ( p w t ) o fr a t s w i t l ld i a b e t i c n e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d s o f i m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧w a s 印p l i e dt oe x 锄i n em ee x p r e s s i o no fn m d a r e c e p t o r si ns p i n a lc o r dd o r s a lh o m s t u d i e sa b o u tt l l ec h a l l g e so fn d a r e c e p t o r si ns p i l l a l c o r dd o r s a lh o mc o u l dh e l pf i n d i n go u tm o r es p e c i f i c t a r g e t so f 讹a t m e n tf o rd i a b e t i cn e u r o p 砒i cp a i n m e t h o d s ：35m a l es p r a g u e da _ w l e yr a t sw e r er 锄d o m l ys e l e c t e df o rt l l i s e x p e r i m e n t ，w e i g h i n g13o 一15 0 9 b o d yw e i 曲t s ，风t i n gb l o o d 哲u c o s e1 e v e l a n d5 0 p a ww i m d r a wt h r e s h o l do fa 1 1t 1 1 er a t sw e r em e a s w e db e f o r es t z i n j e c t i o n 2 6r a t sw e r em d u c e dw i t has i n g l em 蚀a p e r i t o n e a li n j e c t i o n o f s t r e p t o z o t o c i n ( 5 0 m g l ( 酚a sd i a b e t e s a to n ew e e ka 胁s t z 嫡e c t i o n ，2 1 r a t s 英文摘要 w h o s ef a s t i n gb l o o dg l u c o s e1 e v e li n c r e a s e du pt o16 7 m m o l lw e r e c o n s i d e r e da sd i a b e t i cr a t s ，a n dt h er a t i ow a s8 0 a tt w ow e e ka r e rs t z i n j e c t i o n ，r e s p o n s e st 0t h em e c h a n i c a ls t i m u l u so fd i a b e t i cr a t s 、v e r em e a s u r e d w i t l lv o nf r e yf i l a m e n t ，a n dw h o s e58 p a ww i m d r a wt h r e s h 0 1 d ( p w t ) w e r e d o w nt o4 9w e r ec o n s i d e r e da u sd ia _ b e t i cn e u r o p a t h i cp a i nm o d e l s ( t 1 1 er a t i o 5o ) a n 础e r9r a t sw e r ei n 仃a p e r i t o n e a l i n je c t e do fs a l i n ea sc o n t r o l s 15d i a b e t i cr a t sr a n d o m l ys e l e c t e da n d9c o n t r o lr a t sw e r eu s e dt 0c o m p a r e t h ee x p r e s s i o no f m ar e c e p t o r si nm es p i n a lc o r dd o r s a lh o m 15d i a b e t i c r a t sw e r es 印a r a t e di n t o3g r o u p sb yd i f i e r e n tt i m ep o i n t sa t3 ，5 ，7w e e k sa r e r s t zi n j e c t i o n s od ot h ec o n t r o lg r o u pa n de a c hg r o u ph a s3r a t s b o d y w e i 曲t s ，f a s t i n gb 1 0 0 dg l u c o s el e v e la i l dp w t w e r em e a s u r e di nd i a b e t i ca n d c o n t r o lr a t si ne v e 巧t i m ep o i n t a t3 ，5 ，7w e e l ( sa 舶rs t z 埘e c t i o n ，d i a b e t i c r a t s 、h i c hp w tw e r ed o 、nt o4 9 、r es a c r i f i c e da n di n t u m e s c e n c es e 粤n e n t s o fs p i n a lc o r dw e r ec o l l e c t e df o ra n a l y s i so fn m d ar e c 印t o r si i lt l l es p i n a l c o r dd o r s a lh o mf o ri m m u n o h i s t o c h e m i s 仃y 。t h es a m et o9c o n t r o lm t s d a 协a n a l y s i sa n ds t a t i s t i c d a t aw e r ee x p r e s s e d a sm e 2 i r l 土s e m 1 1 1 er e s u l t sw e r ea n a l y z e db yt t e s ta n da n a l y s i so fv 撕a n c e ( a n o v a ) v a l u e so f p o 0 5w e r ec o n s i d e r e da u ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a m r e s u l t s ： lb e f o r es t zi 内e c t i o n ，t h el e v e lo fb o d yw e i g h t s ，f 瓠t i n gb l o o dg l u c o s e a n d5 0 p a ww i t h d r a wt 1 1 r e s h o l dh a dn os t a t i s t i c a ld i 贷i e r e n c eb e t w e e n d i a b e t i ca n dc o n t r o lg r o u p s t oc o m p a r ew i mc o n t r o lg r o u p ，m e1 e v e lo f5o p a ww i t l l d r a wt h r e s h o l d a n db o d yw e i g l l t si i ld i a b e t i cg r o u pd e c r e a s e d a t i c a l l ya t3 ，5 ，7w e e ka r e rs t zi n j e c t i o n ( p o 0 5 ) ；a n df a s t i n gb l o o d g l u c o s es i g n i f i c a l l t l yi n c r e a s e da r e rs t zi n j e c t i o ni nd i a b e t i cg r o u p ( p o 0 5 ) 。 a n d 也e ya l s oh a ds i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a ld i f j i e r e n c ec o m p a r e dw i mm e y w e r e b e f o r es t zi i l j e c t i o n ( p o 0 5 ) 27 r 0 c o m p a r ew i t l l c o n t r o l g r o u p ， i m m u n o r e a c t i v i t yf o rn m d a r e c e p t o r si nt l l es p i n a lc o r dd o r s a lh o m o fr a t sw i md i a b e t i cn e u r o p a d l i cp a i n s i 鲥f i c 删yi n c r e a s e d a t3 ，5 ，7w e e km e rs t z 硒e c t i o n ( p 1 6 7 m o l l ( 成功率为8 0 ) ，为糖尿病 模型，其余5 只大鼠空腹血糖 1 6 7 m o l l ，且p w t 1 6 7 m o l l 1 2 】的大鼠为成功糖尿病 大鼠模型。然后继续观察，当p 荆g 时，为糖尿病神经痛模型成功。 5 行为学测定 根据c h a p l a n 等1 3 】1 9 9 4 年报道的“u p a i l d d o w n ”方法，将大鼠置于金 属网上，盖以透明的有机玻璃罩。首先让大鼠适应环境1 5 m i n ，待大鼠梳 理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的v o nf r e yh a i r s 垂直刺激大 鼠后肢足底中部，使其弯曲成s 形，持续6 8 s ，观察缩足反应，在刺激 时间内或在移开v o nf r e yh a i r s 时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反 应，而身体活动引起的缩足反应不记做阳性，再向下连续测定4 次。如测 试完最小或最大力度的v o nf r e yh a i r s 均不出现阳性反应，则大鼠的5 0 缩足反应阈值算作o 2 5 9 或1 5 9 。应用d i x o n ( 1 9 8 0 ) 州报道的方法推算出 5 0 缩足反应阈值。5 0 缩足反应阈值采用下列公式计算：5 0 缩足阈值 研究论文 ( g ) = 1 0 f x 件k 6 1 ，其中x f 为末次应用的v o nf r e yh a i r s 的力度的l o g 值，6 为相邻v o nf r e y 探针力度l o g 值之间差值的平均值( 即o 2 2 4 ) ，k 为阳性和 阴性反应类型的查表值。1 5 9 是本法可能达到的最大5 0 缩足反映阂值， o 2 5 9 是本法可达到的最小5 0 缩足阂值。本研究中5 0 缩足阈值低于4 9 的大鼠列为糖尿病神经痛大鼠。 6 观察指标 于腹腔注射前、注射后3 周、5 周、7 周测量d m 大鼠和正常大鼠体 重及空腹血糖，并且利用v o nf r e y 针测定大鼠5 0 缩足反应阈值( p w t ) 。 分别于注射后3 周、5 周、，7 周，取两组大鼠脊髓背角组织，d m 组每次 取5 只大鼠，正常组每次取3 只大鼠用于免疫组织化学染色，检测大鼠 脊髓背角n m d a 受体的免疫阳性神经元细胞数。 7 实验方法 7 1 标本取材 大鼠腹腔注射1 戊巴比妥钠4 0 m g i ( g ，将大鼠仰卧，迅速开胸暴露 心脏，用一个前端磨钝的输液针头经左心室进入升主动脉，同时在右心房 剪开一小口，灌注生理盐水约1 0 0 m l ，看见流出的血液为清亮，并且肝 脏变白后，随后用含4 多聚甲醛的磷酸缓冲液( o 1 m o l l ，p h 7 4 ) 先快后 慢灌注固定1 h 。灌注固定后，从大鼠的颈部剪开脊柱后侧的椎弓板，往 尾端方向分离，充分暴露整条脊髓，然后取胸腰段膨大处脊髓，于4 多聚甲醛固定液中固定1 2 小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡 包埋，切片厚5um 。 7 2 免疫组织化学检测方法 1 ) 载玻片用a p e s 防脱片处理，捞片后置烤箱5 8 6 0 3 0 6 0 m i n 2 ) 切片脱蜡至水( 二甲苯5 m i n 2 次，无水酒精l m i n ，9 5 酒精1 m i n ) 3 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ) 5 m i n 3 次 4 ) 擦干切片，滴加3 的h 2 0 2 封闭内源性过氧化物酶，3 7 孵育1 5 m i n 5 ) p b s 液洗5 m i n 3 次 、 6 ) 滴加适当一抗( 觚i n m d a r s ，多抗) ，3 7 i 小时左右。o 0 1m p b s 漂洗2 分钟3 次。 7 ) 滴加生物素化兔抗鼠i g g ，2 0 3 7 2 0 分钟。o o lm p b s 漂洗2 分 钟3 次。 研究论文 8 ) 滴加试剂s a b c ，2 0 3 7 2 0 分钟。o 0 1m p b s 洗5 分钟4 次。 9 ) 蒸馏水洗5 m i n 3 次 l o ) 滴加新鲜配置的d a b 液，镜下控制显色 1 1 ) 自来水冲洗终止显色 1 2 ) 苏木素复染细胞核2 m i n 1 3 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明2 m i n 2 次 1 4 ) 中性树脂封片 为保证免疫组化染色的特异性，以p b s 代替一抗溶液作为阴性对照 实验，其余染色步骤( 包括滴加二抗溶液) 完全相同。 8 图像采集与分析 免疫组织化学染色采用m o t i cd i g i t a li m a g e 病理图像采集与分析软 件，在显微镜l o 2 0 高倍视野下计数n m d a r l 脊髓背角的阳性表达量， 每组大鼠随机抽取6 个视野后计算其平均值。 9 统计学处理 计量数据以平均数标准差( 襄s ) 表示，采用s p s s l 7 o 统计软件包 进行组内单因素方差分析、组间t 检验，p o 0 5 表示差异有显著性。 结果 ld m 大鼠行为学变化 1 1 一般观察；c 组大鼠毛色光滑，饮食尿量正常，性格温顺，反映灵敏， 尾静脉采血血量多，较快愈合；而d m 组大鼠则毛发稀少，毛色暗淡， 每日饮食饮水及尿量均明显增多，性格暴躁，反映迟钝，尾静脉采血血量 少，愈合缓慢，甚至出现烂尾现象。 1 2 体重、血糖、p w t 变化：d m 组在s t z 注射后3 周后，5 0 缩足反应 阈值较c 组各时点下降明显( p o 0 5 ) ，并且维持至s t z 注射后的第7 周， 与注射前相比，注射后各时间点p w t 值均有统计学差异( p o 0 5 ) 。 2 免疫组织化学染色 显微镜下观察，n m d a r l 主要分布于细胞膜及胞浆。与n r l 多克隆 抗体结合后，经d a b 显色，使细胞膜及胞浆呈棕黄色。阳性细胞形状不 规则。细胞膜及细胞浆均着色。 l o ( p o 0 5 ) 。 研究论文 附图 f i g 1h n m i h l o r e a c t i v 时o f 删m c e p t o r s i i ls p 池lc o r dd o f s a l h o mm 舳l g r o u p a t5 、e e k ( 2 0 0 ) f i g 2i i t 蚰u n o r e a 曲v i 够o f n m d ar e c e p t o r s 证s p i n a lc o r dd o r s a lh o m i i ld ia b e t i c 印u pa t3w e e ka 胁s t z e c t i o n ( 2 0 0 ) 净惨鼍一产一l一曩漕 p ，。 ，。一r。虬 一，一一，气一一一。一，一泌一一 论 啦 气 。xo，一一一。一菇 弋， - 毋 ， r i， 产- 一。 一 。 一，一 静 + 。钆“ 一一一一一一一，一榛氍一 吩 。 。磬 ， 呤鳓 矿_ 嘟。 一。，一簟 。 。， 。 、j ， 确 jf卜r犷 囊 妒 旃 ， - -， ，b 嗨 f i g l 3i n l m l m o r e a c 吐v 时0 f i n d i 删cg r o u p a t i i ls p i n a lc o r d d o r s a lh o m 5w e e k 加s t z 硒e 幽0 n ( x 2 0 0 ) f i g 4i i l l 删a c t i v 时0 f ? ? 、， 一， ， 声 童 e i i 孽。- j 。& 一4 蝴r e c e 岬i 1 1 徊a l 硎舾a l h o m i i l d i a b e t i c 印u pa t7 w e e km e rs t zi n j e 砸o n ( 2 0 0 ) t 。 r 、 ，。：。0。，“ 一y 0 h 沁一。l。，_。矗k， 。，：，。 一一一小。一协 一 0 0 q：-；， ， 气、 一， 巷、r ， 勺，r l ： ，p-摩，。 爹， ， h ， _ 对 ， p ，。 r一。，& 一。 、。 移 0 i 睾|一孝 研究论文 4 5 0 4 0 0 3 5 0 萋3 0 0 三2 5 0 邑2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 o l m _ 一 p 一 唑 网吐f 嘎 1 一 一 工 了 j i _ 一 阿臻 i 习 i i 4 i a 瑚 j舅 j k 一虹浏 t ot 3t 5t 7 畦m e - c o n t r 0 1l o n t r o 上 一d m c o m p a 陀dw i t hc o n t r o lg r o u p ，搴p o 0 5 f i 9 5t h ec o m p a r - s i o no nw e i g h tb e t w e e n d i c b e t i ca n dc o n t r o ig r o u p t ot 3 缸眦r 5 t 7 ：c o n t r 0 1 著订毗 c o m p a r e d w i t hc o n t r o lg r o u p ，p 0 0 5 f i g 6t h e m p a r s i o no nf a s t i n gb i o o dg l u s eb e t e e nd i c b e t i ca n d c o n t r o ig r o u p 1 4 5 0 5 0 5 0 2 2 1 1 c c o o 研究论文 t o f 。十1 山 虫 r 礴 p 啊 k 盘叠j g l b 。 i_l 缸 t 3t 5t 7 缸e 圈c o n t r o l _ d m c o m p a r e dw i t hc o n t r o ig r o u p ， 宰p o 0 5 f i g 7 t h em p a r i s i o no n5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l db e 心 脱n d i c b e t i ca n dc o n t r o ig r o u p l o o 8 0 o o = 6 0 4 0 2 0 o t ot 3t 5t 7 ti m e 图c o n t r 0 1 一d m c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ， p 1 6 7 m o l l ) ， 体重降低，2 周开始出项机械缩足阈值的显著下降( p w t 4 9 ) ，这种状态 持续至第七周。d m 组不同时点机械缩足阈值“g ，且明显低于c 组，提 示d n p 模型制备成功。 糖尿病作为一种系统性疾病，可影响全身各个组织和脏器，神经系统 也常常受累，约5 0 的糖尿病人易患糖尿病神经病变。糖尿病神经病变包 括植物神经系统，中枢神经系统，运动神经系统，周围神经系统等等。其 中糖尿病性周围神经病变是糖尿病最常见合并症。这种疼痛呈持续性，常 表现为自发性疼痛( s p o n t a n e o u sp a i n ) 、痛觉过敏( h y p e r a l g e s i a ) 、异常性疼 痛( a 1 1 0 d y n i a ) 【5 】。然而，即使血糖控制在正常范围内，采用综合治疗措施， 也只能降低和延缓糖尿病神经痛的发生和发展。顽固性疼痛成为医学领域 里一大难题。所以，建立与人类糖尿病的发病机制、病理变化相似的动物 模型非常重要。 目前糖尿病的实验动物模型主要分为诱发性动物模型、遗传性动物模 型和转基因动物模型。遗传性动物模型的发病受环境和基因突变的影响， 与胰岛素缺乏有关，更接近于人类糖尿病的自然起病及发展，适用于研究 病因学；但是来源较少，培养条件高，动物昂贵限制了科学研究应用。转 基因模型的动物可研究靶基因在体内的功能，为研究单个蛋白提供了条 件，但很难揭示糖尿病的根本机制；且培养比较困难，目前尚处于成熟完 善阶段；诱发性动物模型则主要包括化学药物和手术等方法，其中链脲佐 菌素( s t z ) 对一定种属动物的胰岛b 细胞有选择性破坏作用，可诱导动 物产生糖尿病，其对组织毒性相对较小，动物存活率高，是目前国内外使用 较多的一种建立糖尿病动物模型的方法。其导致糖尿病的可能的机制有： 直接破坏胰岛b 细胞；通过n o 和自由基途径损伤胰岛b 细胞；自身免疫 链 气平。 研究论文 s t z 诱导的胰岛素依赖的啮齿类动物糖尿病模型可用来研究糖尿病 并发症糖尿病神经痛( d p n ) 是其中一种d p n 在啮齿类动物和人类都以 早期的温度痛敏和机械痛敏为特征【6 ，大鼠注射s t z 后，出现了与糖尿 病患者相似的“三多一少 症状。糖尿病神经病变可单侧，可双侧，可 对称，可不对称。突出表现为双下肢麻木、胀痛、伴有针刺样、烧灼样异 常感。本实验模型的疼痛阈值变化也符合人类糖尿病神经病理性疼痛的特 点，大鼠的疼痛部位多为肢体远端，如后足，表现为对称性的机械性痛觉 异常等。为研究形态学变化奠定了基础。 2 糖尿病神经病理性痛大鼠脊髓背角n m d a 受体的表达变化 本实验免疫组化结果表明：糖尿病神经痛大鼠脊髓背角n m d a 受体免 疫阳性神经元细胞数明显增加。 糖尿病状态下，p k c 通路的激活与n m d a 受体的变化密切相关【8 一。 研究表明：d n p 大鼠脊髓背角投射神经元具有明显的高活性和对伤害性 刺激的超敏反应【lo n 1 ；同时，该模型大鼠脊髓背角神经元释放兴奋性谷氨 酸递质也显著增加【1 2 1 ，导致兴奋性、抑制性递质失衡，引起疼痛。而过多 的谷氨酸递质将激活脊髓背角神经元突触后膜的n m d a 、a m p a 瓜a 受 体，这些受体均为钙离子通透性受体，使神经元细胞内钙离子浓度进一步 迅速增高，从而触发一系列钙依赖性第二信使级联反应【1 3 1 ，其中蛋白激酶 c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 是疼痛信号传递过程中重要的钙依赖性第二信 使i l 引。近年来研究已证实：糖尿病可特异性地影响脊髓背根神经节、谷氨 酸能神经元及其突触前膜( 初级传入神经末梢) 的g a b a b 。1 a ) 亚基的表 达和转运，也使兴奋性谷氨酸递质释放增多，促发d n p 的形成【8 ，9 ，1 2 】。而 q 惦a b 受体也可通过磷酸化g a b a b l 受体亚型c 末端8 6 7 位点上的丝 氨酸( s 8 6 7 ) ，活化兴奋性谷氨酸n m d a 受体，该位点正是蛋白激酶c ( p k c ) 作用的主要部位【1 3 】。而n m d a 受体的激活也可改变s 7 8 3 的磷 酸化状态，从而减少神经元细胞膜上的g a b a b 受体的表达【1 5 】。抑制p k c b 亚基不仅可以阻止或逆转氧化应激，还可以使血流和神经传导功能恢复 正常【1 6 】，另外，p k c 抑制剂还可阻断高血糖引起的内皮细胞中n f kb 的激活，从而减少活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的生成，抑制神 经元和周围神经的发生退行性变【1 7 1 。 研究论文 脊髓背角是疼痛信息传递和整合的初级中枢。当外周神经损伤时将兴 奋传递伤害性刺激的初级神经元，使其在脊髓背角大量的释放兴奋性递质 氨基酸( 比如谷氨酸) ，谷氨酸可直接激活突触后的n m d a 受体，使之激 活而产生兴奋性突触后电位【1 8 】，一方面增加了n a + 和k + 的通透性，更多 的则是增加了c a 2 + 通透性，最终导致钙离子大量内流，随着细胞内钙离子 超载，从而产生一系列与c a 2 + 相关的生化级联反应，包括激活蛋白激酶( 如 蛋白激酶c ) 、磷脂酶a 2 、磷脂酶c 和一氧化氮合酶；这些反应进一步促 进突触前膜释放大量兴奋性氨基酸，激活突触后的n m d a 受体，使突触 后受体门控离子通道开放增加，更多的钙离子内流。另外n m d a 受体是 一种离子通道复合体，过度激活后，相偶联的c a 2 + ，n a + ，k + 的通透性也 随之增加，c a 2 + 内流增加，又加速了钙依赖性兴奋性氨基酸释放，从而引 起脊髓的可塑性变化，使信号得以长时间维持，导致中枢敏感化。这种正 反馈途径在持续性疼痛中的中枢敏化和神经元可塑性两方面具有重要的 作用。 n - 甲基d 。天冬氨酸( n _ m e t h y l d a s p 抓a t er e c e p t o r s ，m 皿a ) 受体 是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质谷氨酸受体的一种，属于离子型受 体。它广泛分布于中枢神经系统，在许多重要的生理、病理过程中发挥关 键作用，如神经发育、学习和记忆、神经退行性变、癫痫与疼痛。n m d a 受体也是脊髓传导伤害性刺激一个重要的受体。n m d a 受体是由 n m d a r l 亚基与不同的n m d 嘁亚基组成的异聚体。4 个n m d 川r 2 亚基 ( r 2 a ，r 2 b ，r 2 c ，r 2 d ) 不具备离子通道活性，不能单独形成功能性受体， 需通过与r l 亚型形成不同的异聚体加强n m d a r i 的活性。s o u t l ls m 研 究在给小鼠脊髓局部注射腺相关病毒后，发现在n m d a r l 砌a 下降 8 0 时，脊髓背角i i 层神经元通过n m d a r 通道的离子流下降8 6 8 8 ，此时小鼠趾内注射甲醛诱导的疼痛下降7 0 【i 州。n r l 是n m d a 受 体的主要功能亚单位，其表达上调，提示n m d a 的功能增强j 。s h i m i z u 等 利用基因敲除技术研究发现，n r l 基因敲除的小鼠其海马c a l 区n m d a 兴奋性突触后电位消失【2 ，这些说明r l 亚型是仍a 受体具有离子通道 活性的关键，因此我们通过测定脊髓背角的n m d a r l 免疫反应阳性来反 映n m d a 受体在伤害性传递中的作用。 研究论文 国内外对于n m d a 受体在急慢性神经痛中的作用有较多的研究。 机体受到伤害性刺激，c 类神经纤维反复传入促使脊髓背角神经元的“发 条拧紧 效应，即痛觉过敏，而这一效应和n m d a 受体的激活关系密切。 研究证实糖尿病的发病机制中，持续增长的伤害性的谷氨酸能输入 ( g l u t 锄a t e 皤ci n p u t ) 可能起重要作用【1 2 2 2 1 。同时阻断n m d a 受体可减 少糖尿病导致的神经痛，这在动物模型和人类患者都有效【1 2 2 3 2 5 】。在糖尿 病神经痛中增加的谷氨酸作用于脊髓背角的n m d a 受体，引发神经元的 高兴奋性和中枢敏化【i o 1 2 1 。最终导致痛阈降低，产生异常性疼痛和痛觉过 敏。本试验证实注射s t z 诱导产生神经痛后5 周和7 周，阳性神经元增 多，脊髓背角的n m d a 受体表达增多，与正常比较有统计学意义。 总之，本实验通过腹腔注射s t z 诱导糖尿病神经痛大鼠模型，采用 免疫组织化学染色观察正常对照组与实验组大鼠脊髓背角n m d a 的表达 变化，结果显示糖尿病神经病理性痛大鼠组脊髓背角n m d a 受体的免疫 阳性神经元量明显增多，这表明，n m d a 受体在脊髓水平参与了糖尿病 神经病理性痛的调节。在疼痛的形成过程中，n m d a 受体的激活发生在神 经传导轴的各个层面，在这些层面应用药物可能是较好的治疗途径，为广 大慢性疼痛患者解除痛苦提供更广阔的前景。 结论 脊髓背角n m d a 受体在脊髓水平参与了大鼠糖尿病神经病理性痛的 形成。 参考文献 1 j o l i v a l tc g ，l e ec a ，黜【m o skm ，e ta 1 a l l o d y n i a a n dh y p e r a l g e s i ai 1 1 d i a b e t i cr a t sa r em e d i a t e d b y g a b aa n dd e p l e t i o n o f s p i n a l p o t a s s i u m c h l o r i d ec o - 仃a j l s p o n e r s 砌加2 0 0 8 ；1 4 0 ( 1 ) ：4 8 - 5 7 2 r e e dm j ，m e s z a r o sk ，e n t e sl j ，e ta 1 an e wr a tm o d e lo f t y p e 2d i a b e t s ： t 1 1 ef a t - f e d ，s t r e p t o z o t o c i n t r e a t e dr a t m e t a b o l i s m ，2 0 0 0 ，4 9 ( 11 ) ： 】3 9 0 】3 9 4 研究论文 3 c h 印l a ns r b a c hf w ，p o g r e lj w ，e ta 1 q u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n to ft a c t i l e a l l o d y n i ai 1 1m e r a tp a w jn e u r o m e t h o d s ，19 9 4 ，5 3 ( 1 ) ：5 5 6 3 4 d i x o n ，w j ， e ta 1 e 伍c i e n t a n a l y s i s o f e x p e r i m e n t a lo b s e r v a t i o n s ， r e v p h 鲫m a c 0 1 t o x i c o l ，1 9 8 0 ，2 0 ：4 4 1 4 6 2 5 k h a ng m ，c h e ns ra 1 1 dp a nh l ，e ta 1 r o l eo f p 而m a 巧a f f e r e mn e r y e si n a l l o d y n i a c a u s e db yd i a b e t i c n e u r o p 甜l yi nr a t s n e u r o s c v i e n c e ，2 0 0 2 ， 11 4 ：2 9 1 2 9 9 6 c o u r t e i xc ，b a r d i nm ，m a s s o lj ，e ta 1 d a i l yi n s u l i nt r ea _ t m e n tr e l i e v e s l o n g t e mh y p e r a l g e s i ai ns | 吮p t o z o t o c i nd i a b e t i cr a t s n e u r o r e p o r t ，19 9 6 ， 7 ( 1 2 ) ：1 9 2 2 1 9 2 4 7 s u g i m o t ok ，m u r a k a 、张y ，s i m aa a d i a b e t i cn e u r o p a t h y ac o m i 肌i n g e n i g m a d i a b e t e sm e t a b r