（农药学专业论文）新型酰腙类活性化合物筛选及作用机制初步研究.pdf

j ， 。 j j 飞。 7 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 摘要 酰腙类化合物具有较高的杀菌、除草、抗病毒，抗肿瘤等生物活性没食子 酸是农药、医药的重要中间体，以它为原料合成的一系列化合物具有一定的抗肿 瘤活性，贵州拥有丰富的没食子酸资源。本中心以没食子酸为先导化合物合成了 一系列酰腙类新化合物进行绿色新农药、新型医药的联合开发。抑菌实验未见 该类化合物有理想的抑菌活性，抗肿瘤活性实验表明，在细胞水平具有较好的抗 肿瘤的活性 以培养细胞为实验模型，采用m ，r r 、s r b 等实验方法。筛选出化合物0 5 0 4 0 在较低浓度下能较强地抑制雄性非依赖性前列腺癌细胞p c 3 ，人乳腺癌细胞 b c a p - 3 7 、人胃癌细胞b c - c 8 2 3 、表皮癌细胞a 4 3 1 等肿瘤细胞的增殖井对其抗 肿瘤作用机制进行了初步探讨，为酰腙类药物的研制和开发提供科学依据 实验结果表明，化合物0 5 0 4 0 对p c 3 细胞的半数抑制浓度o c 妨为0 4 6 1 0 p m o 儿，低于阳性对照药物顺铂( 1 9 2 8 1 , t m o i l ) 顺铂作用于p c 3 细胞后，苏 木素伊红染色( 既染色) ，显微镜下面矾察到明显的凋亡小体，0 5 0 4 0 作用p c 3 细胞后也观察到凋亡小体，但数量没有顺铂的多。细胞培养液上清中乳酸脱氢酶 ( l d 哟活性测定表明，顺铂作用于p c 3 细胞2 4 小时即有大量的l d h 由细胞内 渗透至胞外。0 5 0 4 0 即使作用4 8 小时也只有少量u ) h 渗透至胞外初步推测， 0 5 0 4 0 对p c 3 细胞膜的损伤较顺铂小，抑制p c 3 细胞增殖的活性高于顺铂，毒 力小，可能能通过诱导p c 3 细胞凋亡途径抑制其增殖 关键诃；酰腙，药物筛选，抗肿瘤，作用机制 图书分类号tt q 4 5 0 , 1 ， 、协， t ， e k l ， t 卜 责州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 a b s t r a c t a c y l h y d r a z o n ed e r i v a t i v e sp o s s e s sh i g hf u n g i c i d a la c t i v i t i e s , h e r b i c i d a la c t i v i t i e s ， a n t i v i r u sa c t i v i t i e sa n da n t i t u m o ra c t i v i t i e s g a l l i ca c i di st h ei m p o r t a n ti n t e r m e d i a t e o fs y n t h e s i z i n gt h ep e s t i c i d ea n dm e d i c i n e ；t h ec o m p o u l l d ss y n t h e s i z e df r o mi t p o s s e s sa n t i t u m o ra c t i v i t i e s p r o v i n c ec j u i z h o ui sr i c hi nr e s o u r c e so fg a l l i ca c i d a s e r i e so fn e wa c y l h y d r a z o n ed e r i v a t i v e sw e l ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e df r o mg a l l i c a c i d 勋t h ej o i n td e v e l o p m e n to ft h en e wt y p eg r e e np e s t i c i d ea n dm e d i c i n ei no l 1 l a b o r a t o r y t h ep r e l i m i n a r yb i o a s s a ys h o w e dt h a ts o m eo ft i t l ec o m p o u n d sd on o t p o s s e s sf u n g i c i d a la c t i v i t i e s b u tp o s s e s sh i g ha n t i t u m o ra c t i v i t i e s 跏v t r o w i t ht h em e t h o d so fm t ta n ds r ba s s a y s , as e r i e so fc o m p o u n d sw f r et e s t e d u s i n gc u l t l l r e dc e l ll i n e sa st h es c r e e n i n gm o d e l s rw a sf o u n dt h a t0 5 0 4 0i n h i b i t e dt h e g r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no f p c 3 ，b c a p - 3 7 ，a n da 4 3 1c e l ll i n e ss i g n i f i c a n t l ya tal o w c o n c e n t r a t i o n w ee x p a t r i a t e du p o nt h em e c h a n i s mo fa c t i o no f0 5 0 4 0i no r d e rt o s u p p l yv a l u a b l er e f e r e n c ef o rt h ed e v e l o p m e m to f a c y l h y d r a z o n ed e r i v a t i v e s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em e d i a ni n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n0 c 5 0 ) o f 0 5 0 4 0w a so 4 6 1 0p m o l l , w h i c hw a sl o w e rt h a ni c 5 0o fp o s i t i v ec o n t r o ld d ri n h e m a t o x y l i na n de o s i ns t a i n i n gc o l o r a t i o n ( h e ) e x p e r i m e n t ，a p o p t o s i sb o d yw a s o b s e r v e d h o w e v e r , t h eq u a n t i t yo f a p o p t o s i sb o d yi n0 5 0 4 0 - t r e a t e dg r o u p sw a sf e w e r t h a nt h a ti nd d p - t r e s t e dg r o u p s t h ed e t e c t i o no fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) a c t i v i t yo fc e l l - f r e ec u l t u r es o p c r a a t a l 吐s h o w e dt h a td d pl a i dp l e n t yo fl d ho u to f t h ec e l la f t e r2 4h o u r st r e a t m e n t , b u t0 5 0 4 0l a i dl e s so u te v e na f t e r4 8h o u r sl r e s t m e n t i ti sp r e s u m e dt h a t0 5 0 4 0d o e sl i t t l eh a r mt ot h ec e l lm e m b r a n e , i tp o s s e s s e sb e t t e r i n h i b i t o r ye f f e c ta n dl o w e rt o 菇c 时o i lp c 3i nc o m p a r i s o nw i t hd d p , a n di sl i k e l yt o i n h i b i t i n gt h ec e l lp r o l i f e r a t i o nt h r o u g hi n d u c i n ga p o p t o s i si np c 3 k e yw o r d s , a c y i h y d r a z o n e , d r u gs c r e e n i n g , a n t i t u m o r , a c t i o no f n c h a n i s m 2 ， t 芒 钆 ， ? 乞 i ： 责州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 前言 酰腙是具有较高的生物活性和较强的配位能力的一类化合物。因含有亚胺 基，敬属于s c h i f f 碱s e h i f f 碱及其配合物以其良好的抑菌、抗病毒和抗肿瘤等 生物活性。而倍受人们关注( 砌n i a n 马1 9 7 2 ) 大量的研究表明，酰腙作为一种 特殊的s c h i f f 碱，具有较好的抑菌、除草，抗病毒、抗肿瘤、抑酶等生物活性 f n a w a r , 2 0 0 0 ) 。对酰腙类化合物进行深入研究已成为当今农药界热点之一 没食子酸或焦性没食予酸是从五倍予中分离出的天然化合物，五倍予在贵她 地区有大面积种植生产及加工以没食子酸或焦没食予酸为原料，合成出异黄酮 类衍生物已有一些用作杀菌、抗肿瘤，抗氧化剂的报道，我们的前期研究也报道， 以没食予酸为先导化合物，合成的噻二唑杂环衍生物具有较好的抗肿瘤活性( 宋 宝安等。2 0 0 5 ) 本中心以没食子酸为先导化合物合成了一系列新型酰腙类化合物，进行绿色 新农药、新型医药的联合开发前期抑菌实验表明，该系列化合物未有明显的抑 菌活性，本论文主要是对该系列化合物进行抗肿瘤活性的筛选及机理研究 抗癌活性酰腙类化合物的筛选是整个活性研究过程中重要的一个环节而筛 选首先离不开合理的筛选方法和系统，纵观近年的抗肿瘤药物筛选方法，m t t 和s r b 法已成为筛选具有抑制肿瘤细胞增殖化合物的最简便、快捷，可靠的方 法而对于筛选工作中肿瘤细胞的选取，查阅文献表明。前列腺癌目前临床上没 有很有效的治疗药物，胃癌和乳腺癌为常见多发癌症。苏术素伊红染色 法是一种可用普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法 ( 魏文科等，2 0 0 3 ) 。测定细胞培养液中的l d h 活性，可以得出药物作用后细胞膜 通透性变化，判断细胞受损的程度( 李云波等，1 9 9 0 ；杨春生等，1 9 9 8 ；杜青平等， 2 0 0 3 ) 。 故本论文以雄性非依赖性前列腺癌细胞系p c 3 细胞、乳腺癌细胞系b c a p - 3 7 细胞、人胃癌细胞系b g c 8 2 3 细胞为筛选模型，以m r r 和s r b 法对中心合成的 新化合物进行了抑制肿瘤细胞体外增殖的活性筛选研究酰腙类化合物浓度及作 用时间与其活性之问的关系，将h e 染色和改良2 ，4 二硝基苯肼法溯定l d h 活 性，用于酰腙类化合物抗肿瘤活性作用机制的研究，为没食子酸衍生物研究领域 的拓展及酰腙类活性化合物的研制和开发提供科学依据 3 t “ ， 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 一综述 酰腙为一类人工合成的化合物的通称，含有共同的结构3 。5 = 苄氧基苯甲 酰，如连接的化学集团不同，可合成不同酰腙类化合物从结构上看。酰腙含有 羰基、次胺基，亚胺基，因它含有亚胺基。故属于s c h i f f 碱。s c h i f f 碱及其配合 物以其良好的抑菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性，而倍受人们关注，引起化学家 和生物学家的极大兴趣，成为越来越活跃的研究领域之一( w i l l i a m s , 1 9 7 2 ) 酰 腙作为一种特殊的s c h i f f 碱，以其很强的配位能力，良好的生物药理活性及其备 方面的优越的性能，成为很有潜力的治疗药物和功能材料f n a w a r , 2 0 0 0 ) 。 本中心合成的一系列酰腙类化合物经抑菌实验，未表现出较好的抑菌活性， 本论文主要对该系列化合物进行抗肿瘤活性的测试，旨在进行农药和医药的联合 开发研究抗癌活性酰腙类化合物的筛选是整个活性研究过程中很重要的一个环 节，而筛选首先离不开合理的筛选方法和系统本文主要对酰腙类化合物生物活 性研究进展及抗肿瘤药物的筛选方法和发展趋势进行了简要综述 1 1 酰腙类化合物生物活性研究进展 j o h n s o n 和他的合作者( 1 9 8 2 ) 报道：芳酰腙表现出奇特的抑制d n a 合成效 果，并能抑制啮齿细胞的增殖，在医药学领域可用作镇定药，降压药、抗菌药等 a i n s c o u g h 等人( 1 9 9 8 ) 报道，水杨醛苯甲酰腙0 2 s b ) 能有效地抑制人和啮齿动 物d n a 的合成和细胞的生长，其配合物 c u 饵s b ) c 1 h 2 0 的活性明显更强。 酰腙是许多酶催化反应的强烈的抑制剂，h u s z t i 等人( 1 9 8 3 ) 报道，一系列 含哒嗪基的酰腙能够抑制酪氨酸羟化酶和多巴胺争羟化酶大量的研究表明，酰 腙形成配合物后的活性比配位前明显地增加。一般认为，由于具有强配位能力。 酰腙能与生物体细胞中的金属离子形成稳定的配合物，从而阻止许多由金属离子 催化的有害的酶反应( w a n 岛1 9 9 7 ) 曾昭贤等人( 1 9 9 4 ) 合成了l o 个苯甲磺酰腙衍生物，对其进行体内，体外 抗癌活性筛选，证明有s 个化合物为具有抗癌活性的化合物，其中尤以结构属几 茶酚类的化合物作用最强该化合物体外对人自血病h l - 6 0 细胞有较强杀伤作 用，它能明显抑制人胃癌细胞s g c 7 9 0 1 ，小鼠骨髓瘤细胞s p z o 的增殖能力 采用流式细胞术，观察该化合物对小鼠白血病l 1 2 1 0 细胞周期动力学的影响，表 明它可使癌细胞集中在g l 期，s 期细胞数减少。故推测该化合物可能为主要作 ； ； + 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 用于g i 期细胞的药物。 马磊等人( 1 9 9 7 ) 设计合成了1 1 种新型噻吩硫羰基腙衍生物，抑菌活性结 果表明，部分化合物对9 种受试菌株具有较强的抑菌活性，设计合成的中间体噻 吩硫酰肼对多数受试菌种有较强的抑菌作用，表明噻吩环与n c s 结构结合对此 类化合物的抑菌活性有重要意义 李正名等人( 1 9 9 7 ) 报道，毗唑甲酰肼与芳酮反应合成的酰腙类化舍物具有 除草活性和抑菌活性。杨光富人( 2 0 0 0 报道，s ，7 - 二甲基- l ，2 4 - 三唑并【i ，5 - a 嘧啶2 乙酰腙类衍生物表现出不同程度的除草及杀菌活性 何玉林等人( 2 0 0 3 ) 报道，3 。5 二苄氧基苯甲酰香草醛腙，3 ，5 = 苄基苯甲 酰2 4 - - 羟基苯甲醛腙和3 ，5 二苄氧基苯甲酰水杨醛腙，均对金黄色葡萄球菌 有较明显的抑菌作用，对大肠杆菌无明显抑菌作用兰个化合物结构与抗结核药 异烟肼相似，其作用机制可能与影响细菌的细胞壁有关，但其详细作用机制有待 做进一步研究 黄明智等人( 2 0 0 3 ) 采用2 甲硫基1 取代苯基乙酮与取代苯甲酰肼反应合 成了1 1 个2 甲硫基1 - 苯基乙酮苯甲酰腙类化合物，生物活性实验结果表明，部 分化合物具有杀菌或杀虫活性，如2 甲硫基1 降甲基苯基) 乙酮4 氯苯甲酰腙 在5 0 0m g l 时对黄瓜灰霉病菌、小麦赤霉病菌具有良好的杀菌活性，其抑制率 达到9 5 以上 邹霞娟等人( 2 0 0 3 ) 以1 取代苯基3 羰基肼1 ，4 - 二氢6 _ 甲基4 哒嗪酮为原 料，进行衍生化，合成了哒嗪酮的酰腙，酰氨基取代脲、n - 乙氧基羰基羰基肼， n - 氯乙酰基羰基肼等五类新型化合物，并研究其生物活性。初步生物活性测试表 明目标化合物对烟草花叶病毒f f m v ) 、水稻纹枯病( p e l l i c u l a r i as a s a k i 0 和小麦 锈病( p u c c i n i ar e c o n d i t et r i t i c z 3 具有一定的抑制作用 龙德清等人( 2 0 0 5 ) 以5 氨基一1 h - i ，2 ，禾三唑- 3 羧酸为起始原料，设计合成 71 3 个新型的5 ，7 - 二甲基1 ，2 ，4 三唑并【l ，5 嵋1 嘧啶善甲酰腙类化合物初步 的生物活性测试结果表明，所合成的化合物均表现出不同程度的除草及杀菌活 性，其中苯环邻，对位引入氯院子的化合物活性最好，对水稻纹枯病菌 ( r h l t o c t o n i as o l a n o 的抑制率达到9 0 以上 马敬中等人( 2 0 0 4 ) 合成了1 3 个新化合物l ，4 _ 氧喹喔啉。甲醛酰腙，并用 5 责州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 这些化合物对稗草和油菜进行了除草活性研究研究结果显示，化合物在质量浓 度为5 0m 班时株防效大都在2 0 以下，质量浓度为5 0 0m g 几时株防效才会达 到2 0 - - 3 0 i ，4 - - 氧喹喔啉2 一甲醛于羟基丁酰腙在质量浓度为5 0 0m g ，l 时对 油菜和稗苹的株防效分别达到7 4 和5 6 散修饰或改变二氧喹喔啉甲醛酰腙 分子中酰基的r 基团的结构，可能有希望发现有商业价值的除草剂。 陈琼等人( 2 0 0 6 ) 以5 。扎二甲基- l 。2 ，4 - 三唑并【1 ，5 卅嘧啶- 2 甲硫醚为起 始原料，设计合成了1 5 个新型的5 ，7 - - - 甲基- l ，2 ，4 _ 三唑并【1 ，5 田嘧啶2 一氧乙 酰腙及l o 个0 t ) - 5 ，7 - - - - 甲基1 ，五4 _ 兰唑并f l ，s 卅嘧啶- 2 氧妇甲基) 乙酰腙 类化合物初步生物活性测试结果表明，部分化合物表现出不同程度的除草及杀 菌活性目标化合物引入手性中心有利于生物活性的提高，具有进一步的结构修 饰潜力 杨健国等人( 2 0 0 6 ) 合成了2 - ( 1 - 萘亚甲基) 2 羟基苯甲酰腙，并对其进行 了抑菌活性测试，研究表明，化合物对枯草芽孢杆菌，肺炎克氏菌、铜绿脓杆菌 和金黄色葡萄球菌没有明显的抑菌活性，但对大肠杆菌具有一定的抑菌活性 有关酰腙类化合物的结构和性质已有大量的报道，但对其中羧酸类酰腙的研 究报道较少麻宝成等人( 2 0 0 5 ) 合成了4 种新的含羧基酰腙类化合物，化合物 4 、b ，c ，d 具有相似的化学结构，其差别主要在于羧基的位置不同，随着羧基 位置的不同，他们表现出的抑菌活性也不尽相同，化合物a 和b 的羧基与之相同， 二者的抑菌活性差别不大，都较弱对于金黄色葡萄球菌和枯草杆菌而言，化合 物d 的抑菌活性明显高于化合物a ，b 和c b td 图1 - 1 含羧基的酰腙化合物 f i g 1 - 1a 椭士砸崩”c o m p o u n d sc o n t a i n i n g , - b o x yg r o u p 综上我们可以看出，酰腙类化合物具有杀菌、除草、抗植物病毒、抗肿瘤， 抑酶等比较广泛的生物活性，近几年的研究主要集中在其较强的杀菌和除草活性 上，有些化合物兼具杀菌和除草的活性此类化合物在农药、医药等方面有着广 泛的研究和重要的应用，具有广阔的开发前景 6 咚 枞铆q 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 1 2 抗肿瘤药物筛选研究进展 1 2 1 抗肿瘤药物筛选方法的历史及现状 用实验动物移植瘤寻找具有抗癌作用的化合物曾是抗癌药物研究的主要方 法自5 0 年代中期起；美国国家癌症研究中心( n a t i o n a lc a n c e ri n s t i t u t e ，n o ) 就 开始有组织，系统的抗肿瘤药物的筛选。且对筛选模型和方法进行7 不断改进 1 9 7 5 年。实体瘤模型被引入到n c i 的药物筛选模型中。小鼠自血病p 3 8 8 被保 留作为第一轮的初筛，能通过初筛的化合物才能被允许进入第二轮，在体内用4 种小鼠尸体瘤1 6 黑色素瘤，c d 8 乳腺癌，结肠癌3 8 、l x i 肺癌和m x - i 乳腺 癌) 和小鼠白血病l 1 2 l o 进行更深入的试验，但它有一个明显的缺陷就是一些在 临床上有活性的药物将被筛选掉( a n s l e ye ta 1 1 9 9 0 ) 筛选流程如下： 匿囹 小鼠肿瘤人肿瘤异种移植 l e w i sc 3 8c d 8d ( 1c x 1m ) 【- l l 1 2 1 0b 1 6 肺癌结肠癌乳腺癌肺癌结肠癌乳腺癌 l 1 2 l om 5 0 7 6 肉瘤b 1 6 黑色素瘤m x - i 乳腺癌 巨少一种筛选阳删 r 陈统评价与毒理学研列 圈1 - 2 美国n c i 筛选策略( 1 9 7 5 - 1 9 8 5 ) 啦! - 2s c r e e n i n gs t r a t e g y o f n c i ( 1 9 7 5 - 1 9 8 5 ) 鉴于体内以鼠自血病淋巴瘤为基础的筛选系统存在的缺陷，n c i 于1 9 8 5 年 重新调整了筛选策略由针对化合物的筛选模式完全转变为针对疾病的筛选。放 弃体内小鼠筛选，以体外各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。此筛选体系有 三个特点：一是高通量筛选；二是有可能筛选出肿瘤特异性药物；三是尤其适合 7 贵州大学20 0 6 届硕士研究生学位论文 复杂天然产物提取物有效成分的证实，且用量少，可进一步指导有效成分的进一 步分离纯化( b o y de ta 1 ，1 9 8 9 ；c u r te ta , ，1 9 9 4 ) 其筛选流程如下l 匿圃 第一阶段 体外人类肿瘤细胞株板块( 1 0 一2 0 株傲块) 筛选 肺癌、结肠癌、脑瘤、卵巢癌、自血病、黑色素瘤，肾癌 体外又抗癌活性的化合物 l 体内裸鼠人类肿瘤异种移植研究i l 睦盛查鲎壁煎蕉适丝塑些盒捌工 陈统评价与毒理学研究以及随后的临床i l l 期试划 圈l - 3 美国n c i 筛选策略( 1 9 8 5 - 现在) f i g 1 - 3s c r e e n i n gs t r a t e g yo f n c l ( 1 9 8 5 o a r e u ) 任何方法都很难达到十全十荚的境界，新的n c i 筛选系统的运转过程也必 然要不断发展和完善，科学的发展离不开技术的进步，随着组织培养方法的发展 及普及，采用体外培养的癌细胞寻找新抗癌药物的研究已经逐渐成为最重要的初 筛手段( w u 田a ，1 9 9 2 ) 。 1 2 2 抗肿瘤药物筛选的方法 1 2 2 1 应用荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 荧光素测定法是由f u n a 等人予1 9 8 6 年设计提出的一种的药物敏感性测定方 法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成分进行染色或标记其 细胞活性检测可分为一下几个方面 1 ) 通过测定细胞中酶的活性从而确定活细胞数现在普遍采用一种特殊的荧 光染料f d a ( f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ) ，正常情况下它不具有荧光，但当它加入到具 有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，f d a 水解释放出具有强烈荧光的荧光素死亡细胞的机能受到抑制或破坏，f d a 水 解水平大大降低，通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而 l 、 责州大学2 0 0 6 届碰士研究生学位论文 测定出药物对细胞的作用。推测其抗肿瘤的效果( 郑晓飞等，2 0 0 2 ) 。此外，还可 通过测定细胞中过氧化氢酶的活性确定细胞的活性。葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化 下可产生过氧化氢，过氧化氢可把非荧光性的二氯荧光速前体( l d c f ) 氧化成 具有强烈荧光的二氯荧光素，通过测定荧光素d c f 的荧光强度就可测出 活细胞的数量( f e r r e te t0 2 1 9 9 0 ) 此法可测定含量极低的酶解物或过氧化物的 浓度，可准确测出细胞的活性 2 ) 通过测定细胞的d n a 含量测出活细胞的数量，其原理是采用一种特殊的 荧光染料h o e c h e s t3 3 2 5 8 ( 二苯并咪唑) ，其可被活细胞核中的d n a 吸收而使其 染色死亡的细胞机能下降，核中染色的合成也下降活停止。一般不吸收荧光染 料h o e c h e s t3 3 2 5 8 通过测定细胞核中荧光强度的大小，则可测得活细胞得数量 此法非常简便、易行，结果准确可靠，现已经广泛应用于肿瘤细胞研究得各个方 面( r a g oe t a l 1 9 9 0 ) 此法现在被改进后，经常用与凋亡细胞形态学的观察 荧光素测定法具有快速、灵敏、准确性高和重现性好的特点其细胞测定范 围宽，线性好，适用于多种细胞系( r o s se t0 2 ，1 9 9 0 ) 。其毒性低测定后的细胞 仍具有生长活性，可应用于活组织中药物抑制率的测定，并能够定量地观察药物 的作用以利子进行抗肿瘤药物的筛选但荧光速测定法需要专业操作人员，且荧 光容易粹灭，存在数据不稳定的现象 1 2 2 2 应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物 结晶紫染色测定法是由g i l l i e s 等人于1 9 8 6 年提出的，它是一种单层细胞培 养的体外药物敏感性测定方法，结晶紫染色可通过细胞的特定摄取法而选择性地 被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。而被核( d n a ) 吸收的结晶 紫又可为有机溶剂提取，通过测定提取液的光密度值，就可测定活细胞的数量 经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定它具 有能使细胞株停止生长的固定步骤，故能准确测定不同时间点的细胞增殖情况， 适用于各种生长因子对细胞增殖影响的测定，且灵敏度高、重现性好的特点，因 此具有广泛的应用前景但此法只适用于单层培养细胞，后处理过程比较复杂， 繁多，且只能测定细胞活性不能区分药物对细胞生长是抑制还是细胞毒性作用 1 - 1 2 3 以端粒酶为活性作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒酶是使端粒延伸的反转录d n a 合成酶，由心魄和蛋白质组成的核糖 贵州大学2 0 0 6 届碰士研究生学位论文 核酸蛋白酶。以其r n a 组分为模板，蛋白组分具有催化活性，以端粒3 末端为 引物，合成端粒重复序列端粒酶与恶性肿瘤的发生有着密切的关系，端粒酶在 恶性肿瘤细胞中表达率占8 0 - 9 0 ，而正常体细胞内不表达。它能使肿瘤细胞 维持端粒长度而无限生着，故抑制端粒酶的活性有可能抑制肿瘤的生长t r a me t a 1 ，t 9 9 4 ) 因而端粒酶被认为是恶性肿瘤诊断和治疗的新靶标，在分子水平上筛 选针对端粒酶的抑制剂能够获得特异性高，针对性强，毒副作用小的新型广谱 的抗肿瘤药物，适于大规模的药物筛选( s h a y e ta 1 1 9 9 7 ) 已有研究表明。反义 核酸、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、诱导分化药、蛋白酶抑制剂、蛋白抗体及 细胞毒性药物等均可不同程度地抑制端粒酶活性，导致端粒酶缩短或癌细胞死亡 ( 李宜明等，2 0 0 5 ) 。 n o r t o n 等人( 1 9 9 4 ) 针对端粒酶r n a 模板区试剂合成了不同长度的反义硫 代寡核苷酸0 p ) 和肽核酸( p n a ) ，p s 和p n a 对细胞抽屉物中的端粒酶和细胞 内的端粒酶均有不同成都的抑制效果。勋m z a w a 等人( 1 9 9 6 ) 设计了一种锤头型 核酶( t d o r z ) 抑制端粒酶的活性s t r a h l 等人( 1 9 9 6 ) 的实验表明。逆转录酶抑 制剂d d g 、a z t 和c a r b o v i r 可以抑制端粒酶的活性x u 等人( 1 9 9 6 ) 用细胞分 化诱导荆全反式视黄素( a t r a ) 和l 口 2 ，s 二羟维生素d 3 ( v d 3 ) 分别诱导 m 肋细胞分化，通过细胞分化途径间接抑制端粒酶。 l 2 2 4 酸性磷酸酶法筛选抗肿瘤药物 酸性磷酸酶法( a c i dp h o s p h a t a s ea s s a y , a p a ) 原理是活细胞内的酸性磷酸酶 在酸性环境下可以分解为磷酸酶底物硝基苯磷酸盐，其产物为淡黄色，可以用酶 标仪在4 0 5 r m 处检测a p a 法最初由c o n o u y 等人在1 9 8 6 年提出，用于内皮细 胞计数，其灵敏度高呵达1 0 0 细胞吼) ，重复性好 很多实验证明m ! a 法可用于体外筛选对肿瘤细胞敏感的化疗药物陈学清等 人( 1 9 9 8 ) 报道，a p a 能准确地检测原位的细胞数，活细胞数与光吸收度呈直线 相关关系( 跚9 9 ) 。化疗药物对细胞地杀伤试验表明，a p a 法能较好地反映化疗 药物地杀伤效应本方法操作具有快速、准确性高的特点适合大规模的体外抗 肿瘤药物筛选 1 2 2 5 以抑制生长调节及信号传导途径为靶标筛选抗肿瘤药物 肿瘤细胞中信号传导经常被癌基因的突变或过量表达等干扰，结果产生不可 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 调节的信号传导。这些信号传导途径可能成为肿瘤治疗的靶点( 张庆林等， 1 9 9 7 ) 根据抑制信号传导途径中关键酶或癌基因产物功能筛选，可能会发现潜 在的抗癌药物。抑制蛋白一酪氨酸激酶( p t g s ) 、蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec 。 p k c ) 和酪氨酸蛋白激酶( t y r o s i n ep r o t e i nk i n a t p k ) 是目前较多采用的筛选 天然抗癌药物的方法，其中以t p k 研究的最多 t p k 在细胞增殖及分化过程中具有重要的调控作用，大多数t p k 能增强肿 瘤细胞的能力和特征表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r , e g f r ) 是t p k 受体超家族中的重要一员，以e g f r 为靶点的抗肿瘤治疗已成为了当前 分子靶向治疗的热点刘刚等人( 2 0 0 4 ) 报道，4 ( 4 _ 三氟甲基苯胺基) 喹唑啉在 初步的体外活性试验表明，在2 0m g m l 浓度下对p c 3 细胞的酪氨酸磷酸化抑制 活性达到1 0 0 1 2 2 6 以d n a 拓扑异构酶为靶标筛选抗肿瘤药物 d n a 拓扑异构酶分为t y p el 和t y p e1 i 两个家族，他们均参与d n a 的复制， 基因转录、d n a 重组、有丝分裂等过程，抑制d n a 拓扑异构酶的功能可能成为 发现潜在抗肿瘤药物的有效策略真核生物的d n a 拓扑异构酶l 和已被确 定为多种抗肿瘤药物的有效靶位m i u e t a l ，1 9 s 7 ) 一些现有的重要临床抗癌药 物如柔红霉素、阿霉素、喜树碱、吖啶类化合物、鬼臼毒素类化合物等都能抑制 拓扑异构酶( e o m m i e re ta l ，1 9 9 s ) 。 拓扑异构酶作用于d n a 时，超螺旋状态的d n a 召e 解旋过程中经历不同的过 渡态，每一种状态的d n a 具有不同的电泳位移，从大到小依次为松弛型d n a ， 线性、开环型。用凝胶电泳分析化合物对拓扑酶d n a 复合体的的稳定能力或抑 制松弛能力，能筛选出较好的抗肿瘤药物 1 2 2 彳细胞水平筛选抗肿瘤药物 细胞水平筛选抗肿瘤药物，目前应用最多的方法为m t t 法和s r b 法 m t t ( 3 - 【4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 y z - 2 ，5 d i p h e n y i t e t r a z o l i u mb r o m i d e ) ，化学名 为3 ( 4 ，5 ) 一双甲基- 噻唑- ( 2 5 ) - - 苯基溴化四氮唑蓝，商品名噻唑蓝早在1 9 6 3 年s l a t e r 就发现了m r r 可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色甲腹 ( f o r m a z a n ) 产物而死细胞无此功能，可用于反映活细胞的生存和增殖情况 m o s m a n n0 9 8 3 ) 在免疫学研究中应用于鼠淋巴瘤细胞系研究b 2 等细胞因子对 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 细胞存活和增殖的影响，而建立m t t 方法，随后，d e n i z o t 等( 1 9 8 6 ) 和c a n n i c h a e l 等人( 1 9 8 7 ) 作了进一步改进并获得更好的效果，使之运用于人类肿瘤细胞体外 药敏试验该方法可用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射 敏感性测定等。后经多次改良，现已成为体外细胞水平筛选抗肿瘤药物的主要方 法， s r b ( s u l f o r h o d a m i n eb ) 全称磺酰罗丹明b ，是一种蛋白结合染料，可经与 三氯乙酸( t c a ) 固定后的细胞蛋白质的碱性氨基酸结合而显色。呈现一种明亮 盼粉红色，用酶标仪测定光吸收值，可提供一个敏感的细胞蛋白含量的数值，反 映细胞数量( s k e h a ne t 以，1 9 9 0 ) 。目前s r b 法已作为n c i 筛选抗癌药物的一种 新方法，目前国内还很少采用 谭卫东等人( 1 9 9 9 ) 研究表明，m t t 法和s r b 法作为抗肿瘤药物的体外筛 选中常用的两种方法，各有其优缺点。m r t 操作简便，敏感，可重复性及信号 噪音比好但甲膦的生成受作用时间的影响，样品较多时测定的o d 值随时间而 变，会增加实验误差，最好在l 小时内测定s r b 法用t c a 固定后可随时用s r b 染色做蛋白测定，且s r b 用t d s 溶解后也可稳定一个较长的时期，特别适用于 大规模筛选药物，但s r b 法染色步骤较多，操作较繁琐悬浮细胞经m t t 染色 后，如果用d m s o 溶解，则需将每孔中的细胞吸出，离心去除上清，沉淀用d m s o 溶解后测定o d 值，操作繁琐且易造成认为误差s r b 法将细胞固定后再染色， 故适用于悬浮和贴壁细胞的测定 1 2 2 8 中空纤维法体内筛选抗肿瘤药物 中空纤维法，也称纤维管接种法( h o l l o wf i b e r a s s a y , h o l l o wf i b e rt u m o r m o d e l ) ，是将一定数量的某种肿瘤细胞装入中空纤维管，再将中空纤维管通过手 术接种到裸鼠体内，然后给予受试药物，治疗结束后取出中空纤维管，用m t t 法检测其中的肿瘤细胞活性，从而检测药物在体内的抗肿瘤活性h o l l i n g s h e a d 等首先于1 9 9 5 年用中空纤维法观察药物对接种在裸鼠皮下和腹腔的多种肿瘤细 胞的作用目前，美国国立肿瘤研究所( n a t i o n a lc a n c e ri n s t i t u t eo f t h en i m 已 将箕作为抗肿瘤药物筛查的常规方法我国也将其列为抗肿瘤药物药效学研究鼓 励应用的方法 用该方法进行药物筛选可大大节省时间，人力，实验用药和动物数，同时可 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 获得药物抗肿瘤效果的定量结果，且重复性好，且实验可迸一步进入传统动物实 验阶段，确定供试药物的药效。中空纤维模型提供了体内全真环境。提高了筛选 的准确率，降低了漏筛率，成本低，筛选样本量多。在抗肿瘤药物的筛选中具有 广阔的应用前景 1 2 2 9 高通量筛选( h i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n g , h t s ) 抗肿瘤药物 随着长期药物研究经验的积累和分子生物学，分子病理学，分子药理学，微 电子技术等学科的发展具有潜在治疗作用的靶标越来越多组合化学技术使化 合物库的迅速扩大。形成了药物筛选的新方法，即高通量筛选，高通量筛选又称 为大规模群集式筛选( b r o a c he ta ，1 9 9 6 ；i t h , 1 9 9 乃 高通量筛选通常在9 6 孔板上进行，采用自动化技术对流体进行分配并对微 孔板进行处理，化合物、药物活性的检测在微孔板中进行，现已转向3 8 4 孔板或 孔数更高、体积更小的分析模式( d i v e r s “以1 9 9 9 ；s t a h l , 1 9 9 9 ) 典型的高通量 筛选模式为每次筛选1 0 0 0 个化合物( m a j o r , 1 9 9 8 ) ，而超高通量筛选可每天筛选l o 万多个化合物( s t e v e ne t 口王，2 0 0 0 ) 现今国外许多制药公司已把高通量筛选作 为发现先导化合物的主要手段 l 2 2 1 0 高内涵筛选( h i g hc o n t e n ts c r e e n i n g , h c s ) 抗肿瘤药物 h c s 首先予1 9 9 7 年由美国c c i i o m i c s 公司开发研制成功。h c s 是指在保持 细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长，分化、 迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单试验中获取大量与基 因、蛋白及其他细胞成分相关的信息，确定其生物活性和潜在毒性的过程h c s 是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，旨在获得被筛选样品对细胞产生的多 维立体和实时快速的生物效应信息，在细胞水平上检测多个指标的多元化，功能 型筛选技术平台( g l u l i a n oe t 以，1 9 9 7 g h l i a n o 鲥a ，2 0 0 3 ) h c s 筛选系统筛选 策略如下图： 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 圈l _ 4 高内涵筛选策略 f i g 1 - 4 s t r a t e g y o f h l g h c o n t e n t e e n i n g 1 2 3 抗肿瘤药物筛选的发展趋势 近年来分子肿瘤学的研究所取得的进展为肿瘤治疗提供了许多新的、令人感 兴趣的途径癌基因与抗癌基因、生长因子及其受体、蛋白激酶及信号传导通路、 端粒及端粒酶、d n a 拓扑异构酶和微管蛋白等都是可供利用的抗肿瘤药物作用 的新靶点迄今已确证的药物作用靶点有5 0 0 余个。4 5 为受体，2 8 为酶，s 为离子通道而这些靶点与肿瘤细胞的分化以及肿瘤的转移，血管形成、细胞程 序性死亡等密切相关随着这些靶点在肿瘤细胞中作用的进一步阐明，抗肿瘤药 物的筛选最终将由针对疾病的筛选过渡到针对机理的筛选 1 3 结论 本文对近年来抗肿瘤药物的筛选方法及发展趋势傲了一个简单的介绍，从中 不难看出，在众多的筛选方法中，m t t 和s r b 法无须特殊大型仪器及昂贵试剂， 且筛选结果稳定，可靠，已成为筛选具有抑制肿瘤细胞增殖的活性化合物的最简 一胞一 一胞一 一化一 一绷一 一品一 一胞一 匪 一堑 4 ，一 一a一 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 便，快捷、可靠的方法，适合实验室大规模初筛。 大量的研究表明，酰腙具有较好的抑菌、除草、抗病毒，抗肿瘤、酶抑制剂 等活性，其中以抑菌和除草活性研究最多，而抗肿瘤活性研究较少对酰腙类化 合物在农药和医药领域进行全方位深入研究，进行新型的绿色农药和新型抗癌药 物的联合开发，已成为当今药物研发的热点之一 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 二实验思路 2 1 本实验研究的目的和意义 酰腙类化合物是一类具有高效抑菌、除草、抗病毒、抗肿瘤等生物活性的化 合物。有研究报道没食子酸衍生物具有一定的抗肿瘤活性，贵州拥有丰富的没食 子酸资源。本中心以没食子酸为先导化合物，设计合成一系列新型酰腙类化合物， 进行绿色农药和新型医药的联合开发。关于以没食子酸为先导化合物合成新型酰 腙类化合物的研究未见报道 抑菌实验表明，该类化合物未表现出理想的抑菌活性，本论文对其在医药领 域进行深入研究，旨在寻找高效低毒的新型抗肿瘤药物。并对其抗肿瘤作用机制 进行初步研究，为没食子酸衍生物研究领域的拓展及新型酰腙类活性化合物的研 制和开发提供科学依据 2 2 实验设计思路 以没食子酸为先导化合物，设计合成一系列新型酰腙类化合物，进行抑菌和 抗肿瘤活性筛选，获得具有高效生物活性的化合物，进行作用机制的初步研究 技术路线如下： 圆匦烫巫亟j 亟巫玉至匠巫受亟巫垂圃 l 匾匾麴匦陋圃受垂垂囹 i 匦囹 贵州大学2 0 0 6 届硬士研究生学位论文 2 3 拟解决的问题 对以没食子酸为先导化合物合成的新型酰腙类化合物进行农药和医药的联 合开发筛选出以较低浓度m n m i l 水平) 抑制肿瘤细胞增殖的酰腙类化合物。 在本实验室探讨细胞水平的药物筛选模型，及初步的作用机理实验研究模型对 酰腙类化合物抑制细胞增殖的机制进行初步研究 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 三实验与方法 3 1 实验材料 3 1 1 供试细胞株 雄性激素非依赖型前列腺癌细胞系p c 3 本室保存 人乳腺癌细胞系b c a p - 3 7 细胞购自中科院上海细胞生物学研究所细胞