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桂林工学院硕士学位论文 金属酞菁羧酸衍生物的合成及其在蛋白质分析中的应用 中文摘要 酞菁是一类在结构上与卟啉、叶绿素很相似的化合物。由于酞菁对光、热的稳定性好， 在染料、颜料、光电材料、催化剂、光动力学疗法、荧光分析等方面得到愈来愈广泛的应 用。本文在前人研究的基础上，继续开拓酞菁化合物在蛋白质分析中的应用。本论文共分 三章。 第一章为绪论，首先综述了酞菁化合物的结构、性质、合成和应用，着重介绍了它在 生物分析中的应用：同时结合本文研究所涉及的领域，对蛋白质分析的研究现状作了综述， 重点介绍了蛋白质光度分析法，如分光光度法、荧光光度法、共振散射法等方法研究的现 状。然后提出了论文设想。 第二章以4 羧基邻苯二甲酸酐为主要原料，钼酸铵作催化剂，煤油作溶剂，在1 8 5 1 9 5 c 条件下，液相法合成了三个具有代表性的四羧基金属酞菁衍生物( c o c 4 1 c 、a l c f f ) c 、 m n c 4 p c ) ，并用紫外光谱、红外光谱对其进行表征。 第三章运用共振散射法研究了三种四羧基金属酞菁衍生物与蛋白质的相互作用： ( 1 ) 根据蛋白质在弱酸性条件下对c o c 4 p c 散射信号的增强作用，建立了一种基于共振 散射技术检测蛋白质的新方法。实验结果表明，在p h 3 0 的b - r 缓冲溶液中，反应体系最 大r l s 位于3 3 2 n m 。在最佳实验条件下，b s a 、h s a 、t l g g 、e a 的线性范围分别是0 0 一1 7 9 昭 m l 、0 0 1 5 0 嵋m l 1 、0 - 1 7 5 i _ t g m l 一、0 - 2 0 “g m l l ，检测限分别是1 7 7 2 n g m l 一，1 6 0 2 n g m l ，1 6 8 4n gm l 、1 9 2 0 n gm l 1 。该方法用于人血清样品中总蛋白的检测，分析结果与 临床数据相吻合。 ( 2 ) 在p h 3 5 的b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲介质中，适量蛋白质能增强a 1 c , p c 的共振散射 信号，最大r l s 位于3 8 8 n m 处，由此建立了共振散射法测定蛋白质的方法。b s a 、h s a 、y i g g 、 e a 、t p h s 线性范围分别为0 1 7 5 1 x gm l 1 、o - 1 5 0 喀m l 、0 - 2 0 0 1 l gm l 1 、0 - 2 5 0 t t gm l 一、 o 1 6 3 t t g m l 一，检测限分别为1 5 7 1n g m l 、1 5 7 9 n g m l 、1 6 6 1n g m l 一、1 4 8 0 n g m l 1 、 1 7 8 9 n g m l ，用t p h s 为标准检测人血清样品中总蛋白，检测结果与双缩脲法结果相符。 ( 3 ) 在p h 3 0 的b f i r o n r o b i n s o n 缓冲介质中，适量的蛋白质能够增强m n c 4 p c 的共振散 射信号，反应体系最大r l s 位于3 8 5 n m 处，且增强的散射信号与蛋白质的浓度在一定范围 内呈正比。据此建立了m n c 4 p c 共振散射法检测微量蛋白质的新方法。在最佳条件下，测 桂林工学院硕士学位论文 定b s a 、h s a 、3 - i g g 、e a 的线性范围分别是0 2 0 9 9m l l 、0 - 2 0 t t gm l 1 、0 - 1 7 5 1 t gm l 一、 o 1 7 5 t t g m l ，检测限分别是1 6 3 7 n g m l 一、1 7 6 2 n g m l 1 、1 9 4 1n g m l 1 、2 0 7 2 n g m l 。 方法用于人血清总蛋白和尿蛋白检测，结果与临床数据相符。 4 以上实验均讨论了离子强度、表面活性剂对反应体系的影响，对反应机理也作了初步 探讨；研究还发现各种有机酸、多数金属离子和其它共存物基本不影响测定。三种方法均 具有反应速度快、反应体系稳定、灵敏度高等优点。所建立的方法能够直接用于实际样品 分析。 关键词：四羧基金属酞菁，合成，蛋白质，应用 1 i 桂林工学院硕士学位论文 s y n t h e s i so ft e t r a c a r b o x ym e t a lp h t h a l o c y a n i n e a n dt h e i ra p p l i c a t i o ni np r o t e i na n a l y s i s a b s tr a c t p h t h a l o c y a n i n e sa r eac a t e g o r yo fc o m p o u n d sw h i c ha r es i m i l a rt ot h a to fp o r p h y r i n sa n d c h l o r o p h y l li ns t r u c t u r e d u et ot h e i rg o o ds t a b i l i t yt ol i g h ta n dh e a t , p h t h a l o c y a n i n e sh a v eb e e n w i d e l ya p p l i e di nd y e s ，p i g m e n t s ，p h o t o e l e c t r i cm a t e r i a l s ，c a t a l y s t s ，p h o t o d y n a m i ct h e r a p ya n d f l u o r e s c e n ta n a l y s i s o nt h eb a s i so ff o r e f a t h e r s r e s e a r c h ，t h i sw o r ki sg o i n gt oe x p l o i tt h e a p p l i c a t i o no f p h t h a l o c y a n i n e si np r o t e i na s s a y t h i sd i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e d o f t h r e ec h a p t e r s i nc h a p t e r1 ，t h es y n t h e s i s ，s t r u c t u r e ，p r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n so fp h t h a l o c y a n i n e c o m p o u n d sa r eb r i e f l ys u m m a r i z e d e m p h a s i si sp a i do n t h e i ra p p l i c a t i o n si nt h ed e t e r m i n a t i o no f b i o m a c r o m o l e c u l e s c o n s i d e r i n gt h a tw i l lb ei n v o l v e dw i t hi nt h ew o r k b r i e fr e v i e w sa r ea l s o m a d eo nt h ea p p l i c a t i o ni nd e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n sb ys p e c t r o p h o t o m e t r i c ，f l u o r o s p e c t r o - p h o t o m e t r i ca n dr e s o n a n c el i g h ts c a r e r i n gm e t h o d s t h e n ，t h er e s e a r c hp r o p o s a lf o rt h i s d i s s e r t a t i o ni sp r e s e n t e d i nc h a p t e r2 ，t e t r a c a r b o x ym e t a lp h t h a l o c y a n i n es u c ha sc o c 4 p c ，a 1 c 4 p ca n dm n c 4 p cw a s p r e p a r e df r o m t r i m e l l i t i ca n h y d r i d e ，u s i n ga m m o n i u mm o l y b d a t ea sc a t a l y s t ，k e r o s e n ea ss o l v e n t ， a t1 8 5 1 9 y c t h ea b o v ec o m p l e x e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu v - v i sa n di n f r a r e ds p e c t r a i n c h a p t e r3 ，t h r e em e t h o d sb a s e d o nr l se n h a n c e m e n tw e r ep r e s e n t e df o r t h e d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n ( 1 ) ah i g h l ys e n s i t i v em e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nb yt h e r e s o n a n c el i g h ts c a r e f i h g ( r l s ) t e c h n i q u eo nac o n l i t l o ns p e c t r o f l u o r i m e t e r , b a s e do nt h ef a c tt h a t t h ew e a kr l so fc o c 4 p cc a nb eg r e a t l ye n h a n c e di nt h ep r e s e n c eo fp r o t e i n t h em a x i m u m s c a t t e r i n gw a v e l e n g t ho fc o c 4 p c - p r o t e i ni sl o c a t e da t3 3 2n i l l u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e l i n e a rr a n g eo ft h ec a l i b r a i o nc u r v e sw e r e0 0 - 1 7 9 陷m l 1f o rb s a ，0 0 1 5 0p - gm l f o rh s a ， 0 - 1 7 5 gm l f o ry - i g ga n d0 - 2 0 gm l f o re a ，w i t hd e t e c t i o nl i m i t so f1 7 7 2n gm l “f o r b s a ，1 6 0 2n gm l f o rh s a ，1 6 8 4n gm l f o ry - i g ga n d1 9 2 0n gm l f o re a t h em e t h o d h a sb e e na p p l i e dt ot h ea n a l y s i so f h u m a ns e r u ms a m p l e sc o l l e c t e df r o ma h o s p i t a la n dt h er e s u l t s w e r ei ng o o da g r e e m e n tw i t ht h o s er e p o r t e db yt h eh o s p i t a l 一i i i 桂林工学院硕士学位论文 ( 2 ) an e wm e t h o dw a sp r o p o s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n sb yu s i n gar l s t e c h n i q u e t h ew e a kr l so fa 1 c 4 p cc a l lb ee n h a n c e dg r e a t l yi nt h ep h3 5b yt h ea d d i t i o no f m i c r oa m o u n t so fp r o t e i n s a tt h em a x i m u mw a v e l e n g t ho f38 8n l n ，t h ee n h a n c e dr l si s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n si nt h er a n g e0 - 1 7 5l x gm l f o rb s a ，0 1 5 0 嵋m l 。1 f o rh s a ，0 - 2 0 0i x gm l f o r7 - i g g , 0 2 5 0 腭m l f o re aa n d0 - 1 6 3 嵋m l f o rt p h s t h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r e1 5 7 1n gm l 。1 、1 5 7 9n gm l 。1 、1 6 6 1n gm l 。l 、1 4 8 0n gm l l 、1 7 8 9n gm l 。1 f o rb s a ，h s a ，y i g ge aa n dt p h s ，r e s p e c t i v e l y t h ec a l v eo ft p h sw a ss e l e c t e dt o d e t e r m i n a t et o t a lp r o t e i n si nh u m a ns e r u ms a m p l e s t h eo b t a i n e dr e s u l t sw e r ei ng o o da g r e e m e n t w i t ht h o s eo b t a i n e db yt h eb i u r e tm e t h o d ( 3 ) i ti sf o u n dt h a tt h er l si n t e n s i t yo fm n c 4 p cc a nb eg r e a t l ye n h a n c e db yp r o t e i n si nt h ep h 3 0 t h em a x i m u mw a v e l e n g t hi sl o c a t e da t38 5n n l t h ee x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tu n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo fr l si sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n si nt h er a n g e0 - 2 0l x gm l f o rb s a ，0 - 2 0 鹇m l f o rh s a ，0 - t 7 5l x gm l 。l f o r7 - i g g , 0 - 1 7 5l x gm l 。1f o re a t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e1 6 3 7n gm l 。l 、1 7 6 2n gm l 。l 、1 9 4 1n gm l 。1 a n d2 0 7 2n gm l f o rb s a ，h s a ，) - i g ga n de a ，r e s p e c t i v e l y t h i sm e t h o dh a sb e e nu s e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft o t a l p r o t e i n si nh u m a ns e r u m ，u r i n es a m p l e s t h er e s u l t sw e r ei ng o o d a g r e e m e n tw i t ht h o s er e p o r t e db yt h eh o s p i t a l t h ee f f e c to fi o n i cs t r e n g t ha n ds u r f a c t a n t sw e r ea l s os t u d i e di na b o v em e t h o d s r e a c t i o n m e c h a n i s m sw e r ea l s op r e l i m i n a r i l ye x p l o r e d i tw a sf o u n dt h a ta m i n oa c i d sh a r d l yi n t e r f e r ew i t h t h ed e t e r m i n a t i o na n dm o s to fm e t a li o n sa n dc o e x i s t i n gs u b s t a n c e sd on o ta f f e c tt h e d e t e r m i n a t i o na tt h et e s tc o n c e n t r a t i o nl e v e l c o m p a r e dt os o m eo t h e rm e t h o d s ，a l lt h e s em e t h o d w e r er a p i d ，s i m p l e ，a n ds e n s i t i v e i tw a sp r o v e dt h a ta l lt h e s em e t h o d sc a l lb eu s e df o rt h ed i r e c t d e t e ：r m i n a t i o no ft o t a lp r o t e i ni nh u m a ns e r u ms a m p l e s k e y w o r d s ：t e t r a c a r b o x ym e t a lp h t h a l o c y a n i n e ，s y n t h e s i s ，p r o t e i n ，a p p l i c a t i o n - i v 桂林工学院硕士学位论文 p c m p o d b u d m a e c o c 4 p c a i c , p c m n c 4 p c r l s b s a h s a t - i g g e a t p h s b r 缓冲溶液 c 1 1 籼 c p b d b s s d s o p a g p ， 符号与缩写 无金属酞菁 金属酞菁 l ，8 二氮杂二环【5 ，4 ，o 】十一7 烯 n 、n 二甲基乙醇胺 四羧基钴酞菁 四羧基铝酞菁 四羧基锰酞菁 共振散射 牛血清白蛋白 人血清白蛋白 y 球蛋白 卵蛋白 人血清总蛋白 b r i t t o n - r o b m s o n 缓冲溶液 十六烷基三甲基溴化铵 溴化十六烷基吡啶 十二烷基苯磺酸钠 十二烷基硫酸钠 聚乙二醇辛基苯醚 阿拉伯胶 蛋白质等电点 v 1 1 1 桂林工学院硕士学位论文 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在唐宁莉副教授指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并致以了谢意。 学位论文作者( 签字) ：j 绉篮：客 签字日期：芷! z ：生：! ! 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求 提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目 录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印，数字化或其它复制手段保存论文；在不以 赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者( 签字) ：j 必鱼：丞 指导教师签字： 盈壶药 签字日期： 0 2 ： ：在 桂林工学院硕士学位论文 第一章绪论 1 1 酞菁的性质和应用研究进展 酞菁是一类人工合成的物质，与被称为“天然生命色素”的卟啉类( 如血红素、叶绿 素) 具有相似的结构( 如图1 - 1 ) 。 血红素( h e m e )无金属酞菁( m e t a l 妇p h t h a l o e y a n i n e ) 图卜l 血红素无金属酞菁( p c ) 及金属酞菁配合物( m p c ) 的分子结构示意图 f i 9 1 1t h e o f h e i n e ，m e t a l f r e ep h t h a l o e y a n i n e ( p c ) a n dm e t a l l o p h t h a l o c y a n i n e ( m p e ) 其实酞菁的发现纯属偶然，b r a u n 和t c h e m i a c 两人于1 9 0 7 年在一次实验中偶然得到酞 菁。2 2 年后。苏格兰染料公司申请了世界上第一个有关酞菁专利。1 1 9 2 9 年，在英国i c i 桂林工学院硕士学位论文 公司资助下，当时任伦敦大学教授的l i n s t e a d 和他的学生开始从事酞菁化合物的结构测定 工作，1 9 3 3 年以后，他们的工作成果开始陆陆续续对外报道，从此，酞菁以及金属酞菁的 化学结构才为世人所知，对酞菁类化合物的研究开发开始进入了一个崭新的阶段”1 。酞菁 一经问世，便以其独特的颜色，较低的生产成本、非常好的稳定性及着色性，受到人们的 关注，并被用作染料和颜料，由于酞菁环内可以与许多金属或非金属络合，周边四个苯环 上的十六个氢又可以被许多原子或基团所取代，所以可以形成形形色色的酞菁衍生物，到 目前为止，人们已经合成了数千种酞菁化合物“】 1 1 2 酞菁的合成 酞菁虽然同天然存在的卟啉化合物结构非常相似，但自然界中并不存在酞菁化合物， 酞菁必须通过人工合成。有关酞菁合成的文献很多，酞菁化合物的合成方法主要有：苯酐一 尿素法、邻苯二腈法、邻氰基苯甲酰胺法、1 ，3 二亚胺基异吲哚啉法和金属酞菁置换法， 但采用最多的还是前两种方法。在制备上，又可分为固相法和液相法。固相法即将反应物 混合均匀，在加热熔融状态下反应。此法操作简便，反应速度快，毒性小，但产率相对液 相法低。液相法则是将反应物于高沸点溶剂中，如硝基苯、三氯化苯等溶剂中反应或者在 催化剂d b u ( 1 ，8 - - 氮杂二环 5 ，4 ，0 十一一7 一烯) 存在下，在醇类溶剂中反应，此法可 实现均相反应，产率较高，但费时较长，且需使用有毒有机溶剂。以下是合成酞菁常用的 方法： 1 1 2 1 邻苯二腈( p h t h a l o n i t r i l e ) 法 早期的研究发现，在醇中加热邻苯二腈与醇钠可得到二钠酞菁，它经硫酸处理会脱去 金属钠而得到空心酞菁“一。在d m a e ( n 、n 一二甲基乙醇胺) 介质中，加热邻苯二腈和氨可 直接得到空心酞菁( 见反应式1 - 1 ) ，不需要经过酸处理步骤，产率高。利用这个方法，以 取代的邻苯二睛为反应试剂可制得各种取代的酞菁。 n + n i - 1 3 n 里竺竺p反应式e 1 - 1 反肚氏 加热 1 1 2 2 苯酐一尿素法 苯酐一尿素合成路线“1 是以邻苯二甲酸酐( p h t h a l i ca n h y d r i d e ) 、邻苯二甲酸 ( p h t h a l i ca c i d ) 或邻苯二甲酰胺( p h t h a l a m i d e ) 等衍生物为。碎片”，以尿素为氨合剂，以 2 桂林工学院硕士学位论文 钼酸铵或氯氧化钒或硼酸作催化剂，在1 3 5 - 2 9 4 c ，熔融过程中或在高惰性高沸点溶剂如 硝基苯、三氯苯或二元醇中合成酞菁化合物，反应方程式见卜2 。杨树卿等利用这种方法， 以苯酐、均苯四甲酸二酐、尿素、钼酸铵和金属卤化物于高温下反应制备平面双核金属酞 菁( 见反应式卜3 ) 嘲。 o + m x +h ，n 蜘h ， 塑墼丝- m p c + 城+ h 2 n 州h 2 一慨砒式l 一2 + 钼酸铵 - - - - - - - - 熔融 + m x n l o h 2 n c n h 2 1 1 2 3 邻氰基苯甲酰胺( o c y c l o b e n z a r n i d e ) 法 反应式1 - 3 起初，酞菁可以在乙醇中加热邻氰基苯甲酰胺制得，但产率低。后来l i n s t e a d 改进了 这个合成方法，将金属镁( 或锑) 或它们的氧化物( 或碳酸盐) 与邻氰基苯甲酸酰胺混合 后一起加热到2 3 0 ，得到金属酞菁( 见反应式1 - 4 ) 。将金属酞菁溶解于十倍重量的硫酸中， 在一3 c 下保温一段时间，再通过砂芯漏斗过滤，用冷硫酸洗涤，最后将滤液慢慢倒入由蒸 馏水制成的冰水中，析出蓝色沉淀为无金属酞菁，产率可达4 0 嗍。 3 反应式i - 4 晖 桂林工学院硕士学位论文 1 1 2 41 ，3 一二亚氨基异吲哚( 1 ，3 - d ii m i n o is o i n d o l e n i n e ) 法 室温下，在甲醇钠的存在下，将氨气通入邻苯二腈的甲醇溶液中，则邻苯二腈会很容 易地转变成1 ，3 二亚胺基异吲哚啉，它在n 、n 一二甲基乙醇胺介质中经回流可以得到酞菁， 产率为8 5 ，反应式见图卜5 “”。利用这种方法还可以制各双核或多核的空心酞菁化合物 【l 卜i 町 o 反应式1 - 5 除此之外，金属酞菁化合物还可以由置换反应或空环酞菁与金属盐反应制得： l i 2 p c + m x 2 m p e + l i x h 2 p e + m x 2 m p e + h x 以上几种合成酞菁的方法中，“苯酐一尿素法”因原料易得，成本最低，操作最方便， 收率也高，在一般的实验室和工业生产上也都采用此方法，本文拟用此法进行金属酞菁的 合成与研究。 1 1 3 酞菁的性质 1 1 3 1 基态光谱性质 分子轨道理论认为酞菁分子的光谱主要来源于大环的“一跃迁。酞菁分子在可见光 区的主要的两个吸收带为：6 0 0 8 0 0 姗的q 带及其附近的振动吸收带，3 2 5 - 4 2 5r l m 的b 带 ( 又称s o r e t 带) ，另外还有几个比较强的紫外吸收来自包括更低能级的轨道到轨道 的跃迁“”。酞菁的大多数应用都与其在可见光区的特征( q 带) 吸收有关。通过适当的化 学设计，其q 带吸收可以扩展到近红外区，甚至达到i 0 0 0a m “”。 一般b 带受中心金属及酞菁环取代等的影响较小；相反，q 带受这些因素的影响较大。 取代基对酞菁q 带光谱性质的影响主要有以下几点o ”： 1 ) d 位和8 位取代基对q 带吸收峰位置的影响显著不同。q 位对q 带最大吸收峰位 置的影响大于b 位取代基对q 带最大吸收峰位置的影响。这是因为根据分子轨道理论计算 的结果，酞菁的前线轨道中n 位c 原子的l c a o 系数比b 位c 原子的l c a o 系数大。并且， a 位引入取代基对q 带最大吸收峰位置的影响与1 3 位的相反。如：在q 位引入供电子取 4 桂林工学院硕士学位论文 代导致q 带显著红移；在p 位引入供电子取代，q 带一般仅仅略有蓝移。 2 ) 取代基数目与最大吸收波长之间存在一种加和关系，但不一定是线性的。 3 ) 不同类型的取代基团的影响不同。如，给电子能力强，可与环发生共轭的原子引起 的q 带位移大，其顺序为：n s o “”。 4 ) 异构体的光谱性质有一定差异。一般情况是：四取代酞菁配合物的d 2 h 异构体的q 带是与无金属酞菁类似的双峰；而其它三种异构体为单峰，仅是吸收峰位置和峰宽略有区 别。 5 ) 中心金属对q 带波长也有影响。一般的二价金属的酞菁配合物中，铁酞菁的吸收最 蓝而锰酞菁的最红，它们之间的差别可超过l o o n m “”。那些轴向有给电子配体的中心金属， 如v o ，t i o 等，其酞菁配合物的q 带也比普通的酞菁配合物有显著的红移o “”。 6 ) 酞菁的存在状态也对其光谱性质有影响。聚集一般引起酞菁q 带吸收峰展宽，吸收 强度变小，峰位置移动“。 1 1 3 2 激发态性质 酞菁配合物激发态光物理和光化学过程可用图卜2 的能级图来说明“”。以闭壳层结构 的分子为例，当吸收了适当波长的光时，电子由基态s 。跃迁到激发单线态( s ) ( 图1 - 2 中 的过程l ，相应于分子的电子吸收光谱u v v i s ) 。酞菁的s 寿命短，在纳秒范围，它的能量 可通过与周围分子相碰撞以无辐射方式衰减( 图卜2 中的过程3 ) ，也可能以光的形式发射 出去( 相应于发射荧光，图1 - 2 中的过程2 ) ，或通过系间窜越( 即电子自旋方向发生了变 化) 到能量略低的亚稳的三重态t 。( 图卜2 中的过程4 ) 。t 可通过无辐射方式衰减( 图i - 2 中的过程6 ) 或辐射方式衰减( 发射磷光，图1 - 2 中的过程5 ) 的方式回到s 。而且，由 于t 。态寿命较长，一般在微秒( u s ) 范围内，可能与周围分子发生光化学反应。t 。态能通 过电子转移产生活性自由基( 图卜2 中的过程7 ) ，或将其能量传递给基态分子3 倪产生激发 单重态氧分子1 0 2 ( 图i - 2 中的过程9 ) 。活性自由基和重态氧分子可与底物作用而发生化学 反应。对于开壳结构的分子，其基态与第一激发态为二线态，与闭壳层分子的单线态对应； 而二线态发生系间窜越后，变为四线态，与闭壳层分子的三线态对应。 酞菁分子的激发态性质受到中心金属电子构型的强烈影响。无金属酞菁和中心金属为 d o 或d ”闭壳层结构酞菁通常有荧光。其配合物的荧光寿命和量子产率以第3 周期的最强( 如 m g ，a 1 ) ，其次是第4 周期的( 如z n ) ，而第5 周期的由于旋一轨偶合作用强烈，荧光寿命 和量子产率都显著降低。“”旋轨偶合作用可加强系间窜跃，一方面可以促进s 。态到t 态的 发生，同时也会促进t i 态回到s 。态( 释放出磷光) ，是一个竞争的过程。不同重原子的引 入所促进的过程不同汹1 。根据发光( 荧光或磷光) 性质的不同，开壳层的中心金属可以分 5 桂林工学院硕士学位论文 3 类：一类是第5 和第6 周期的过渡金属离子，如r u ( i i ) 、p t ( i i ) 、p d ( i i ) ，它们为抗 磁性，有强的荧光；第二类主要是第4 周期的过渡金属离子( 如c u ) ，它们为顺磁性，发 光；第三类是不发光的n i ( i i ) 、c o ( i i ) 、f e 等，它们不发光，是由于激发态通过系间窜 跃或是无辐射方式回到基态的份额大所致“”“。 图卜2 光激发过程示意图 f i g1 - 2t h e m e c h a n i s mo f p h t h a l c o y a a i n e 1 1 3 3 红外光谱( i r ) 金属酞菁特征吸收带主要分布在3 个区域。1 6 0 0 1 6 1 5c m - 1 和1 5 2 0 - 1 5 3 5c m l 都各 有一个吸收峰，这是由酞菁内环骨架上c = c 和c = n ，及芳香环上c = c 的伸缩振动引起的。 在以邻苯二腈衍生物合成酞菁时，常以腈在2 2 4 0c m - 附近的c n ( 氰基) 特征振动吸收消 失，而在这个区域出现吸收，作为成功环合酞菁的标志。在低频区9 0 0c m - 附近，可看 到与金属酞菁的m n 键相应的吸收。对于不同金属配合物的，其振动频率次序为： n i c o f e z n 以及p t p d 。在约7 5 0e f t 1 处有强度不等的一个p c 环振动吸收带盟“。 1 1 4 酞菁的某些应用 酞菁的高稳定性奠定了其作为染料和颜料的基础，这已被很多分子物理学家所证实圳。 除了可以作为染料和颜料，酞菁还具备一系列优良的功能性质，这使它成为形形色色的分 子材料中最耀眼的一颗明星。 二十世纪四十年代，b r i s t o l 大学的d a n i e le l e y 通过对酞菁铜的实验初步证明有机 固体可以做分子半导体滔1 。o r t h w e a s t 大学的m a r k s 和b r i a nh o f f m a n 证实，有酞菁和碘 6 桂林工学院硕士学位论文 组成的晶状电荷转移化合物具有类似金属的导电性嘲1 。1 9 4 8 年a t v a r t a n y a n 报导，酞菁 在光照下同样可以提高其电导率，显示了酞菁作为光电导材料的巨大潜力。当今，酞菁的 光电导性质已经应用到静电复印机和激光打印机中嘲。酞菁类染料也是很好的光记录材料， 用酞菁染料制备的盘片保存寿命长( 可达1 0 0 年以上) ，刻录时数据稳定性好，因此，现在 绝大多数的c d r 盘片中所采用的存储材料都是酞菁染料。此外，酞菁具有稳定的电子 共轭体系，可以作为很好的有机非线性光学( n l o ) 材料。最近，t o r r e s 及其合作者对酞 菁的非线性光学性质做了一番综述。酞菁的另一种非线性光学性质( 光限制性) 极有可 能在保护眼睛免受红色和红外激光的伤害方面得到应用。酞菁化合物还是一类光氧化还原 反应的有效光敏剂，近年来在光动力治疗癌症以及抗h i v 等疾病方面已引起人们越来越多 的兴趣”1 。1 9 3 8 年，人们第一次发现了酞菁化合物的催化性质。磺化酞菁钴是炼油厂用于 催化氧化法脱硫生产中的优质催化剂。酞菁可以成为热致型液晶材料o ”。1 9 8 2 年，j a c q u e s i m o n 和c h r i s t a j a np i e c h o k i 报导，周边位置带有链状烷基取代的酞菁可以在加热的情 况下形成柱状液晶。几年以后，m i k ec o o k 的研究组证明，非周边位置带有链状烷基取代 的酞菁同样可以表现出液晶特性。目前，人们正在对酞菁的电学、光学、电致变色、光电 转换、液晶。”等各种性质作全面深入的研究，探索它们在电子、光电子、太阳能利用1 、 光动力治疗1 、气体传感、催化等各个领域的应用前景。 近年来，酞菁配合物作为一种新的荧光试剂而受到分析化学家们的关注，董润安嘶1 等 在t r i s 缓冲溶液中，固定激发波长为2 8 0m 条件下，研究了水溶性四磺酸基锌酞菁与牛 血清白蛋白结合反应，发现z n p c s 滴定b s a 的过程中，b s a 的荧光在3 3 0 姗处有不同程度 的猝灭，其猝灭的原因可能有动态和静态猝灭。通过比较z n p c s 。的吸收光谱和b s a 的发射 光谱，表明两者有较大的重叠，说明两者之间存在着能量的传递过程。这与胆红素、血卟 啉等卟啉化合物一样，其与蛋白质的结合过程是通过能量传递机制而实现的。金属酞菁化 合物中，中心配体原子为反磁性的酞菁化合物具有优良的荧光性质，而中心配体原子为顺 磁性者则不发荧光，酞菁化合物的荧光量子产率除了受中心配位原子性质的影响外。取代 基和介质的影响也很明显。许金钩研究小组利用四磺基铝酞菁作为红外区荧光探针，建立 了测定血清中自蛋白以及白蛋白与球蛋白连续测定的方法伽，并考察了酞菁化合物与牛 血清白蛋白的相互作用情况汹1 ；以及在p h3 0 的酸度条件下，蛋白质的加入能显著提高 四磺酸基铝酞菁的共振散射信号，由此建立了一个检测蛋白质的新方法。h s a 和y i g g 的 线性范围是0 0 5 - 2 0p g m l ，检测限分别为1 2 7 ，1 6 1n g m l 侧。李永新“0 1 等将m n t s p c 用 于催化鲁米诺一过氧化氢化学发光反应，在合适条件下，h s a 、b s a 和y 球蛋白可猝灭此发 光反应，结合流动注射技术，建立了一种高灵敏的测定蛋白质的猝灭化学发光新方法，将 此法应用于人血清样品中总蛋白的测定，结果满意。李永新等“”在p h3 6 的c l a r k l u b s 7 桂林工学院硕士学位论文 缓冲溶液中，四磺基锰酞菁( m n t s p c ) 和蛋白质的共振瑞利散射( r r s ) 均十分微弱，当两者形 成复合物时能使r r s 信号急剧增强，在3 3 0 - 3 7 0h i l l 范围内呈现较高的散射强度，其最大散 射波长为3 4 4n m ，各种蛋白质，包括牛血清白蛋白( b s a ) 、人血清白蛋白( h s a ) 、y 一球蛋 白( y 1 9 6 ) 及卵蛋白( e a ) 的线性范围分别为0 卜3 0 、0 0 - 1 6 、0 0 5 2 0 及0 0 - 1 0 m g l ； 相应的检出限分别为5 7 、8 3 、1 3 和1 3 0m g m l ，用此法对人血清样品进行了测定，结 果满意。高建华等1 在p h 为2 0 的c l a r k - l u b s 缓冲溶液条件下，人血清白蛋白与四磺基 金属酞菁类染料结合，使共振光散射急剧增强，并产生新的共振光散射光谱。不同体系在 质量浓度o 一3 0m g l 范围内，共振光增强，与人血清白蛋白浓度呈线性关系，检出限为 0 0 3 3 - 0 1 0 0m g l 。表明四磺基金属酞菁类染料都可以作为共振光散射试剂测定人血清白 蛋白。还考察了某些共存物质的影响，初步讨论了反应机理。高建华等1 在p h2 0 的 c l a r k l u b s 缓冲液中，人血清白蛋白与四磺基铁( ) 酞菁结合而使二级散射和反二级散射 急剧增强，在0 - 2 3m g l 和o 3 4m g l 浓度范围内，二级散射和反二级散射的增强与人 血清白蛋白浓度呈线性关系，检出限分别为0 4 0m g l 和0 1 6m g l ，还考察了某些共存 物质的影响，讨论了反应机理。高建华还研究了四磺基铜酞菁与人血清白蛋白作用的共振 光散射光谱1 ，p h1 0 - 3 0 的范围内，人血清白蛋白的加入导致四磺基铜酞菁共振散射的 增强，在4 0 7r i m 处存在一共振光散射强峰，其强度增加值与人血清白蛋白的浓度呈线性关 系，据此建立了一种用共振光散射光谱测定人血清白蛋白的方法，该方法的线性范围为o _ 1 7 m g l ，检出限为0 0 5 0m g l ( n = 6 ，r s d 为1 8 ) 。陈洪渊1 等研究了蛋白质与四磺酸基钴酞 菁的瑞利散射信号，p h4 0 时蛋白质的加入能使四磺酸基钴酞菁的瑞利散射信号显著增强， 在最佳条件下，测定牛血清和人血清白蛋白的线性范围为0 卜3 4 3 嵋i i l l ，检测限分别为 1 6 5 和1 3 9n g m l 。 近年来羧基酞菁也应用于核酸定量分析”。1 等。 1 2 蛋白质定量分析现状 蛋白质是重要的生命物质，它与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动有着密切的 联系。由于蛋白质在体液中的含量可作为人体营养健康、疾病诊断的重要指标，因此蛋白 质的定量测定在生命科学、临床医学和化学研究中占有十分重要的地位。蛋白质定量分析 的方法很多，诸如浊度法、凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法、共振瑞利散射光度法、 高效液相色谱法和毛细管电泳分析法。在这些分析方法中，光度法( 吸光光度法、荧光光度 s 桂林工学院硕士学位论文 法、共振散射光度法) 对仪器要求相对简单，操作过程简便，因而研究最多，应用最广。本 节综述了近年来吸光光度法、荧光光度法、共振散射光度法在蛋白质定量分析中的应用。 1 2 2 吸光光度法 测定蛋白质的吸光光度法包括紫外吸收光谱法、金属探针法、染料探针法和染料一金属 配合物探针法。 1 2 2 1 紫外吸收光谱法 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残基的芳香结构对紫外光有吸收作用， 其最大吸收峰在2 8 0n m 附近。当蛋白质浓度在0 1 1 0m g m l 之间时，其紫外吸光度与 浓度成正比，故可用于蛋白质含量的定量测定“”。该法操作简单、快速，低浓度盐类不干 扰测定，在蛋白质和酶的生化制备中应用较为广泛。但若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫 外光的物质，则会出现较大的干扰，而且不同种类蛋白质的上述氨基酸残基含量不同，差 异较大，这就决定了紫外吸收光谱法的局限性。 1 2 2 2 金属探针法 a ) 双缩脲法 双缩脲法咖1 是基于蛋白质的双缩脲反应而建立起来的一种测定蛋白质的经典方法。含 有两个或两个以上肽腱的物质( 如蛋白质) 在碱性条件下能与c u 2 + 形成紫色的络