（发育生物学专业论文）拟南芥ft10突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究.pdf

摘要 摘要 现已明确刀基因在拟南芥光周期诱导开花途径中起着关键作用。本研究以 模式植物拟南芥户，口突变体与野生型为材料，通过双向电泳技术和质谱分析等 实验手段，研究t - 者蛋白质水平上的差异表达，有助于深入研究刀调节光周 期开花的作用机制。研究结果如下： ( 1 ) 通过优化植物蛋白质提取方法及与之匹配的蛋白质裂解液，筛选出一种 适合拟南芥叶片全蛋白质分析的双向电泳制样和分析系统：以醋酸铵甲醇沉淀 法提取叶片蛋白质样品，经裂解液 8 m o l l 尿素，2 m o l l 硫脲，4 c h a p s ， 6 0 m m o l l d t t ，2 a m p h o l i n e ，l m m o l lp m s r 裂解后按1 5 r a g 上样，经考染后 获得背景清晰，蛋白分辨率较高的双向电泳图谱。 ( 2 ) 本实验对拟南芥声j d 与野生型叶片全蛋白进行双向电泳对比分析，对差 异蛋白质点进行酶切、质谱分析，最终对其中3 4 个目的蛋白点进行了 m a l d i t o fm s 分析和数据库检索鉴定，共有2 6 个蛋白质得到了鉴定，蛋白质 鉴定的成功率为7 6 。已鉴定的蛋白质中，声j d 突变体与对照相比，1 6 个蛋白 点表达量上调( 点3 ，5 ，6 ，1 0 ，l l ，1 2 ，1 5 ，1 6 ，1 7 ，1 8 ，2 0 ，2 3 ，2 4 ，2 5 ，3 0 ， 3 5 ) ；1 1 个蛋白点表达量下调( 点4 ，7 ，8 ，9 ，1 4 ，2 2 ，2 6 ，2 8 ，3 2 ，3 3 ，3 4 ) ；2 个可能为新合成的蛋白( 点2 1 ，2 7 ) 。它们分别属于转录调控，植物防御有关，信 号传递，能量传递，贮藏蛋白，结构蛋白，细胞生长以及代谢有关的酶或蛋白等 蛋白种类。 关键词：拟南芥：差异蛋白质：双向电泳。 a b s t r a c t a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tf tg e n ep l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np h o t o p e r i o dp a t h w a y r e g u l a t i n gf l o w e r i n g i na r a b i d o p s i s t h u st h ec o m p a r a t i v er e s e a r c h e sb e t w e e n 缸 m u t a n ta n dw tm i g h tp r o v i d eas o u n db a s i sf o rb e t t e ru n d e r s t a n d i n gi nt h em o l e c u l a r m e c h a n i s m so fp l a n tf l o w e r i n g t w od i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n dm a l d i t o fm sa n a l y s i sa r eu s e dt o a n a l y s et h ed i f f e r e n t l ye x p r e s s e dp r o t e i n sb c t w e g nt h e 曩1 0m u t a n ta n di t sw i l dt y p e o f a r a b i d o p s i s i ti sh o p e dt h a tt h e s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sm i g h tb eh e l p f u lt op r o v i d e i n f o r m a t i o nf o rt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fp l a n tf l o w e r i n g t h em a i nr e s u l t ss h o w 勰f o l l o w s ： ( 1 ) t oo p t i m i z et w o - d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s ( 2 - d e e ) s y s t e mf o rt h es e p a r a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no fp l a n tp r o t e i ns p e c i e s ，s u i t a b l e2 - d e e s y s t e m w a sd e v e l o p e db ys e l e c t i n gd i f f e r e n tc o m p o n e n t sa n dc o n c e n t r a t i o n si n i s o l a t i o ns o l u t i o n sa n dl y s i sb u f f e r s s a m p l ew a sp r e p a r e db yu s i n g0 ima m m o n i u m a c e t a t ei nm e t h a n o l ( n f h a c m e t h y l ) t h ei s o l a t e dp r o t e i n sw e r el y s i s e di nl y s i sb u f f e r c o n s i s t i n go f8 mu r e a , 2 mt h i o u r e a ，4 c h a p s ，6 5 m md 1 v r ，2 a m p h o l i n ea n d lm m o l lp m s f t h es e p a r a t e dp r o t e i n so nt h e2 d eg e lw e r ed e t e c t e db yc o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u er 2 5 0s t a i n i n g i th a sh i g h - q u a l i t ya n dq u a n t i t ys e p a r a t i o no fl e a ft o t a l p r o t e i n si n t h i s2 - d ei m a g e ( 2 ) 3 4d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n si nt h el e a ft o t a lp r o t e i n sb e t w e e n f i - l o m u t a n ta n di t sw i l dt y p ew e r ed i g e s t e di n g e lb yt r y p s i na n da n a l y z e db y m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o n - t i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i - t o fm s ) t o t a l l y , t h e r ea r e2 6p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d ，t h es u c c e s sr a t ei s a b s t r a c t 7 6 a m o n gt h e s e ，1 6a r eu p - r e g u l a t e d ( s p o t s3 ，5 ，6 ，1 0 ，i1 ，1 2 ， 1 5 ，1 6 ，1 7 ， 1 8 ，2 0 ，2 3 ，2 4 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ) ；i ia r ed o w n r e g u l a t e d ( s p o t s4 ，7 ，8 ，9 ，1 4 ，2 2 ， 2 6 ，2 8 ，3 2 ，3 3 ，3 4 ) ，a n d28 r en e ws y n t h e s i sp r o t e i n s ( s p o t s21 ，2 7 ) a c c o r d i n gt ot h e i r f u n c t i o n s ，t h e s ep r o t e i n sw e r ed i v i d e di n t ot h ef o l l o w i n gc a t e g o r i e s ：t r a n s c r i p t i o n ， d e f e n s e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，e n e r g y , s t o r a g ep r o t e i n ，c e l lg r o w t ha n ds o0 1 1 k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；d i f f e r e n t l ye x p r e s s e dp r o t e i n s ； t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - d e ) 缩略词表 缩略词表 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为(谨啸) 课题( 组) 的研究成果，获得( 老涛 ) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 啦呛一名，野) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：谅支珍 砸7 年占月弓7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 飞) 2 不保密，适用上述授权。 v ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ： 年月日 拟南芥声j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 第一章前言 高等植物的开花无论对植物本身还是对于人类都是十分重要的。开花是高等植 物活史上的一个质变过程，是植物个体发育过程的中心环节。研究高等植物的开花过 程，阐明其调控机理无论在理论上还在应用上都具有重要意义。分子生物学技术的 日臻完善，加之在微生物及动物发育研中取得的重大进展，使得大批的分子生物学 家、发育生物学家、植物生理学家等运用新概念与技术手段参与到了高等植物开花 研究的领域中。近年来，大量的研究报告展示了高等植物开花研究的成果，这一领 域因之成为植物发育研究的前沿。高等植物的开花研究自1 9 0 4 年k l e b s 的碳氮比 工作至今已有将近1 0 0 年的历史。在期间，以现代分子生物学技术的引入为衡量标 准，1 9 7 0 年以前主要进行的是有关开花生理方面的工作，1 9 7 0 年以后集中于开花过 程的遗传学控制方面的研究。前期的生理学研究为理解植物的开花机理提供了大量 的生理学背景知识。光周期的发现使人们根据植物开花对光周期的反映特点提出了 长日植物、短日植物等概念。分子生物学技术的引入及动物发育研究取得的重大突 破为植物开花的研究提供了新的途径。人们将开花过程中的生理变化、花的形态变 化与基因的表达联系起来，尤其是后者即花的突变体及对应基因的鉴定迅速地推动 了植物开花的研究。 植物开花由多条途径诱导，包括光周期、春化作用、自主途径、赤霉素途径等。 长日能够诱导拟南芥开花。c o 是最早分离克隆的开花调节基因之一，编码锌指蛋 白转录因子，在光周期途径中起促进作用，是感受外界光与开花之间的桥梁。c o 的 表达与花期直接相关，其表达量在长日下比短日下高；f 阿能是作用于c o 下游的 早期基因。f 瑾因产物在茎顶端组织激活f l o w e r i n g l o c u s d ( f d ) 基因的表达， f t 和f d 组成蛋白复合物激活s o c l 、a p l 等基因的表达，最终促使拟南芥开花。 进入2 0 世纪8 0 年代后，植物生理学迎来了更有力的研究工具一分子遗传学 手段。尤其是进入9 0 年代后，采用t - d n a 插入等遗传手段使研究者非常方便地获得 了大量与开花诱导相关的拟南芥突变体株系。那些比亲本开花较迟的突变体类型是 厦门大学硕士学位论文 某些开花正调控因子功能缺失形成的，而早花突变体类型是因为某些开花负调控因 子功能缺失导致的。腱因的突变体表现为晚花。这些突变体为阐明成花分子机制 提供了良好的基础。而从蛋白质水平上探究突变体与野生型的差异能为进一步阐明 成花分子机制提供重要的理论依据。 1 植物蛋白质组学的概念以及研究背景 1 1 蛋白质组学 近年来，基因组学研究取得了重要进展，人类基因组以及水稻、拟南芥等植物 基因组序列相继完成。但是，即使确定了某生物基因组内的全部基因，也不能告诉 人们哪些基因在何时何地以何种程度表达，而生命过程的精确机制很大程度上正是 基于这类基因的精细调控。近年来，为了弥补这一局限性，一系列大规模基因表达 检测技术已相继引进，如微阵列法( m i c r o a r r a y ) 【，d n a 芯片( d n a c h i p s ) 【2 】，s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 【3 】，但由于m r n a 自身存在转运、降解、翻译 调控、及产物的翻译后加工，因而难以准确反应基因的最后总产物基因功能的真正 执行者一蛋白质的质与量。且基因与其编码产物蛋白的线性关系只存在于新生肽而 不是最终的功能蛋白中。所以，基因仅是遗传信息的源头，而功能型蛋白才是基因 的执行者。基因组的绝大部分基因及其功能还都有待于在蛋白质层面予以揭示和阐 述。 蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多。对于某一种生物或有机体来说， 基因组是唯一的，而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状 态而不断变化，因此仅仅从基因的角度来研究是不够的【3 n 。从基因和蛋白质的对 应关系来看，蛋白质的数量远远多于基因数量，一个基因可表达的蛋白质的数目细 菌可能为1 2 1 3 ，酵母则为3 ，而人可达1 0 ，而且m r n a 水平不能完全反映蛋白 质表达水平，基因表达水平与蛋白质之间的相关性通常低于0 5 【4 2 】。另外，蛋白质 的合成、降解、修饰加工、转运定位、蛋白质之间的互作等与细胞自身的生理生化 过程和生物学功能密切联系一个生命体蛋白质的整体水平具有动态性、可变性、 时空性和可调节性。因此，以蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 为核心的功能基因组学研究已 2 拟南芥卢j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 成为当今生命科学的热点。生物种属、器官、组织、细胞、亚细胞以及生长发育时 期的特异性都是多个蛋白质的相互作用的结果。生物某一遗传性状的表现涉及到多 个基因的表达、多个蛋白质的参与，而且这些蛋白质在时空上的特异性和分子间的 相互作用是非常复杂的生命活动过程。要查清生物生长发育、抗逆性、优良性状的 表现，生物个体和生物性状的遗传背景，遗传信息的传递过程和生物体大分子间的 相互作用的机理，必须用系统的、整体的思维和研究方法来研究不同状态下所有蛋 白质的变化规律和功能表现。这是蛋白质组学的中心思想。 蛋白质组( p r o t e o m e ) 一词，源于蛋白质( p r o t e i n ) 与基因( g e n o m e ) 2 个词的组合， 意思是指一种基因组或一种生物、一个细胞( 组织) 所表达的全套蛋白质【4 1 。最初是 由澳大利亚科学家威尔金斯( w i l k i n s ) 和威廉姆斯( w i l l i a m s ) 于1 9 9 4 年提出，并首 次于1 9 9 5 年7 月在国际杂志( e l e c t r o p h o r e s i s ) ) 【4 】发表。蛋白质组学是以蛋白质组为 研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白 质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。蛋 白质组分析主要基于3 条理由：从m r n a 表达水平并不能预测蛋白表达水平； 蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因序列；蛋白质组是动态反映生物系统 所处的状态。 蛋白质组学是功能基因组学的重要组成部分。蛋白质组学技术将基因组序列信 息和在特定组织、细胞或细胞器中执行生命功能的蛋白质有机地联系起来，并能全 面检测不同组织器官所表达的蛋白质及在不同发育阶段、不同条件下蛋白质表达的 差异【5 1 。因而较多的蛋白质组研究工作是将着眼点放在蛋白质组的变化或差异上， 也就是通过对蛋白质组的比较分析，首先发现并去鉴定在不同生理条件下或不同外 界环境条件下蛋白质组中有差异的蛋白质组分。蛋白质组研究领域的另一个特色是， 许多实验室、公司和药厂等很早就已经开始进行与应用前景有关的蛋白质组研究。 如膀胱癌、早老年痴呆症的蛋白质组研究：利用蛋白质组技术筛选疫苗等。 随着蛋白质组学技术的发展和不断完善，植物蛋白质组学研究已相继展开，对 水稻、玉米、小麦等一些重要农作物抗性、品质等蛋白组研究已取得一些进展。 1 2 植物蛋白质组学 3 厦门大学硕士学位论文 植物蛋白质组学( p l a n tp r o t e o m i c s ) 是在基因组学的研究成就和高通量的蛋白质 分析技术得到突破的背景下产生的新兴学科。植物蛋白质组学作为蛋白质组学的一 个的分支，将成为后基因时代的重要组成部分，为研究和发展植物提供了坚实的基 础和理论依据。目前植物蛋白质组学研究的很大部分集中在亚细胞结构的蛋白质组 学和蛋白质复合体相关的蛋白质组学【6 j 。对叶绿体、线粒体等细胞器的蛋白质组学 研究也发现了许多种新的蛋白质，并与其将一些生物功能相应的蛋白质联系起来进 行研究【”，取得了很大的进展。蛋白质组研究的内容包括三个大的方面【8 ，9 】：一是建 立一个细胞或机体在正件下的蛋白质文库，或称参考图谱，即“组成蛋白质组”；二 是研究在各种下的蛋白质变化，注重那些可能涉及到特定功能机制的蛋白质群体， 称为“功白质组”；三是蛋白质组生物信息学的研究，即采用计算机技术和信息论方 蛋白质组学研究中获得的大量而复杂的数据进行采集、储存、传递、检索、和解读， 以揭示并预测重要的生物信息。其中前两者是现阶段蛋白质组学研究的主要内容， 随着研究的深入，积累了大量蛋白质的基本信息后，蛋白质的功能模式将会越来越 受到研究者的重视。 i j 蛋白质组学主要研究方法 蛋白质组学的研究技术蛋白质组学研究主要依赖于3 大技术：蛋白质分离技术、 蛋白质鉴定技术( 如生物质谱技术) 及生物信息学( 包括构建、分析双向电泳凝胶图 谱以及数据库的构建与搜索) 。鉴于蛋白质分离和鉴定技术是本研究中关键所在，故 以此为本文重点做一介绍。 1 3 1 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术( t w od i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o h o r e s i s ，2 d p a g e ) ， 亦称双向凝胶电泳技术，2 - d e 凝胶电泳( t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e i s i s ) 技术 首先是由s mi t h i e a 和p o u l i k 在1 9 5 6 年发明。0 f a r r e l l 在1 9 7 5 年做了改进，并 成为当今研究蛋白质组的核心技术，能将成千上万种蛋白质时分离并展示出来。其 基本原理是利用不同蛋白质具不同等电点( p i ) 和不同分子量大小的特点将它们分离。 他们将高分辨率的等电聚焦电泳( i s o e l e c t r o f o c u s i n g ，i e f ) 和s d s 聚丙烯酰胺凝胶电 泳( s d s p a g e ) 联合成双向电泳，第一向为i e f ，采用经典的两性电解质载体在电流 4 拟南芥声j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 作用下形成p h 梯度，依据蛋白质的p i 点不同进行分离。在此方法中引入固相p h 梯 度技术( i p g ) 可以实现等电点仅有o 0 lp h 单位差别的蛋白质的分离，从而大大提 高了分析的灵敏度。第二向利用s d s p a g e 根据分子量大小进行分离【2 2 1 。2 - d e 凝 胶电泳一般包括样品制备、i e f 电泳、平衡、s d s 电泳、染色和保存。样品制备方 法根据样本蛋白的不同而有所不同，目的主要在尽可能完全获取蛋白质的同时去除 非蛋白成分。样品制备后，在第一向胶上电泳使具有不同p i 的蛋白质分离，然后在 第二胶上向利用水平或垂直的s d s p a g e 使蛋白质按分子量大小分离。经过电荷和 质量两次分离后，具有不同等电点和分子量信息蛋白质分子就具有不同的定位。 2 - d e 电泳自诞生至今，研究者对它进行了诸多方面的改进，特别是1 9 8 2 年固相化 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t s ) 2 3j 的使用，改善了2 - d e 电泳的敏感性、重复性，增 加了上样量，以及不同实验之间的可比性，使得2 - d e 技术有了一个质的改变。目前， 从宽幅到窄幅p h 胶条都已有供应。宽幅p h 胶条主要用于简单物种蛋白质分析，窄 幅和超窄幅主要于复杂蛋白质组的分析。经2 - d e 分离后，通过染色技术要把蛋白 点显现并检测出来，有考马斯亮蓝染色、硝酸银染、荧光染色( 荧光标记) 、负染等方 法。不同的染色法对不同的蛋白质可产生不同的作用。但理想的染色方法必须有以 下几个特点：( 1 ) 具有良好的线性范围，也就是说，染色的强度与蛋白质量成正比； ( 2 ) 具有好的通用性，即对不同蛋白质具有相同的染色能力；( 3 ) 具有高的灵敏度， 只有这样它才能检测出细胞中低拷贝蛋白； ( 4 ) 染色不影响后续的鉴定过程【2 4 】。 般银染是2 - d e 技术常用的染色方法。染色的电泳图经扫描和计算机处理后，就 可以得到相应样品的t 2 d 电泳图谱，【2 5 2 6 。对考染或银染染色胶，一般在可见光下 用扫描仪获得图像，以t i f f 格式保存图像。尽管胶图能被直接检测，但是大多数 蛋白质的客观定量和比较需要计算机的辅助分析。图像分析软件是高通量蛋白质组 学研究的核心。目前常用的图像分析软件有p d q u e s t ( b i o r a d ) 、 m e l a n i e ( s i b ，g e n b i o ) 、i m a g e m a s t e r ( a p b ) 、a d v a n c e d2 - 1 ) s o f l w a r e ( p h o r e t i x ) 和h t i v e s t i g a t o r ( g s l ) 。分析软件能确定并定量2 d 凝胶上蛋白点，去除背景，匹配相关 胶图上相应蛋白点强度，准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息到数据库。将 不同样本分别进行2 - i ) 凝胶电泳，然后将它们的2 - i ) 电泳图谱用分析软件进行比较， 就可以获取样品间有差异的蛋白质的信息，即“比较蛋白质组学”。2 d 电泳后凝胶 厦门大学硕士学位论文 上的蛋白质可以切割分离纯化，用以进一步的分析鉴定t 2 r l 。2 d 凝胶电泳可以使我 们较快地获取样本整个蛋白质组大量蛋白质变化、分布的宏观信息，同时也可以借 助后续的方法进行微观分析。此外，它还具有大通量的优势。但是2 - d e 还是有很 多不足之处，它不易检测出低拷贝的蛋白、极酸或极碱的蛋白质、分子量极大或极 小的蛋白质以及难溶的蛋白质【2 8 1 ，还存在重复性以及规模化和自动化等问题。 1 3 2 质谱( m a s s s p e c t r o m e t r i c ) 技术 过去的几年，生物质谱技术( b i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r y ) 的快速发展使得蛋白 质的鉴定技术发生了革命性的变化【2 9 1 。生物质谱技术由于其高灵敏度、高通量，已 取代了传统的蛋白质鉴定方法，如e d m a n 降解法、氨基酸分析法掣3 0 】。质谱技术是 研究蛋白质表达模式的主要鉴定技术。它的基本原理是将样品分子离子化后，根据 不同离子间的荷质比( m z ) 的差异分离并确定分子量。质谱技术鉴定蛋白质主要是 根据蛋白质酶解后的肽质量指纹谱( p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ，p m f ) 和肽序列标签信息 ( p e p t i d es e q u e n c et a g ，p s t ) 去搜索蛋白质或核酸序列库。一个完整的质谱分析系统 由离子源，质量分析器和检测器3 个部分组成，再辅以进样系统和后续分析系统【3 l 】。 质谱鉴定主要有两种途径： 一是“肽质量指纹谱”( p mf ) 途径。p m f 是指蛋白质酶切位点专一的蛋白酶水解 后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基序列不同，蛋白质被酶水解后， 产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质数亦具特征性，所以称为指纹图谱 ( f i n g e r p r i n t i n g ) 。测量质谱的方法是基质辅助激光解吸附电离法( m a t r i x a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ，m a l d i ) ，通过测定一个蛋白质酶解混合物中肽段的电离飞行 时间来确定分子量等数据，所以也称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法 ( m a l d i t o f m s ) 3 2 】。用一定波长的激光打在样品上，使样品离子化，然后在电场 力作用下飞行，通过检测离子的飞行时间( t i m eo f f l y i n g ，t o f ) 计算出其质量电荷 比从而得到一系列酶解肽段的分子量或部分肽序列等数据，最后通过相应的数据 库搜索鉴定蛋白质。m a l d i 鉴定的成功率也越来越高。m a l d i t o fm s 的主要优 点在于：( 1 ) 操作较为简便。m a l d i t o fm s 是质谱技术中操作最简易的一种；( 2 ) 在与2 d 凝胶电泳联用时，可以从样本的取样处理及上样、分析均实现自动化，保 证了实验的精确性，并符合大通量分析的要求；( 3 ) 灵敏度高，可以检测出m o l 级的 6 拟南芥卢j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 蛋白质；( 4 ) 精确度较高，并随着t o f 的改进而使精确度得到更好保证【3 3 】。而且，现 有数据库中有充足的关于多肽质量电荷比值的数据，因此成为许多实验的首选蛋 白质谱鉴定方法。 二是“多肽片段指纹图谱”( p f f ) 。测定的方法是串联质谱途径( t a n d e mm s ，m s m s ) 。液相分离的肽段经在线连接的电喷雾质谱仪检测，质谱仪可选取肽段母离子 并打碎并行成碎片离子，质量分析器测得碎片离子的质量，即得m s m s 质谱图，根据 m s m s 图谱中不同碎片的质量差，可推测被测肽段的序列。然后利用一些相应的软 件去序列信息库查找并鉴定蛋白质。该技术精度高、分析时间短，可同时处理许多 样品。现已发展出玻璃芯片、3 d 胶芯片、微孔芯片用作该技术的研究【3 5 1 。最近几 年来，生物质谱的最重要应用之一是鉴定蛋白复合物中的组分。大多数重要细胞生 命过程的完成是由许许多多蛋白复合体调控的，蛋白质复合物大多是由大量独特的 蛋白质组成的。由于蛋白质鉴定的困难，许多蛋白复合物还未发现，有些复合物仅 进行了部分的鉴定。蛋白质复合物的鉴定具有生物学和治疗学双重意义。n e u b a u e r 等鉴定了酿酒酵母中的蛋白复合物u l s n r n p 鉴定了凝胶电泳纯化后复合物中含有的 0 5 5 p m o l 的2 0 个蛋白质。l i n k 等人应用二维h p l c e s im s m s 鉴别酵母核糖体中的 组分，在一次实验中鉴定了8 0 个蛋白质，其中的1 0 个在2 d p a g e 分离分析中未观察 到【3 6 1 。这一领域今后将会有更大的发展。 1 3 3 生物信息学 生物信息学( b i o i n f o r m t i c s ) 是伴随着基因组的研究加之计算机信息管理技术的 飞速发展而诞生的- f l 新兴的交叉学科。它以生物大分子( d n a 和蛋白质) 为研究对 象，以计算机为主要工具，发展各种软件，对日益增长的d n a 和蛋白质的序列和结 构进行收集、整理、储存、发布、提取、检索与分析，以达到理解这些生物大分子 信息的生物学意义，可用于寻找蛋白质家族保守序列和对蛋白质高级结构进行测序。 蛋白质组的信息主要包括蛋白质的性质、结构与功能，这也是当前蛋白质组学 研究的主要任务。有关这方面的研究将大大难于以前仅仅序列的研究【3 ”。目前，在 互联网上已经建立了许多d n a 和蛋白质组数据库，如s w l s s p o r t ，y d p 等。这些 数据库的建立使蛋白质快速鉴定成为可能。蛋白质组相关的分析、搜索软件可通过 与e x p as y 蛋白质组学服务器链接而获得( w w w e x p a s y c h w w w t o o l s h t m l ) ，这 7 厦门大学硕士学位论文 些软件可用于查找所需信息，鉴定蛋白质的种类，分析蛋白质的理化特性，预测可能 的翻译后修饰以及蛋白质的三维结构【3 引。通过互联网可以查到的植物蛋白质组数 据库有： h t t p ：l l w w w r s n o d a s u t a c j p k a m o n 2 d e h a p ：l l w w w p i e r r o t o n i n r a f r g e n e t i c s 2 d h t t p ：w w w e d i r e u k s w i s s p r o t h t t p ：p s o r t n i b b a c j p h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s h t t p ：w w w i n r a f r i n t e m e t 7 p r o d u i t a p r e d o t a r h t t p ：h s p i n x r u g a c b e ：8 0 8 0 p p m d b i n d e x h t m l h t t p ：w w w b i o k e m i s u s e c h l o r o p l a s t j 目前，蛋白质组相关数据库主要集中在模式植物拟南芥、重要的粮食作物，如：水 稻、玉米，以及松树等植物上。 1 4 蛋白质组技术在植物生物学研究中的应用 1 4 1 不同组织或细胞器的蛋白质组学分析 蛋白质表达具有组织或器官特异性。根、茎、叶、花粉、种子等是重要的植物 器官，以此作为植物蛋白质表达的研究材料已有很多的报道 4 3 4 7 】。l e o n a r d i a 等【l o 】 比较了两个玉米近交系间3 个器官如中胚轴、叶鞘和3 周幼苗的叶耳的蛋白遗传变异， 发现6 2 9 种蛋白中有2 2 2 表现为器官特异的变异。b a h r m a nn 和p e t i tr 【4 8 】检测了1 8 个海岸松树种的3 个器官如针叶、芽和花粉蛋白的遗传变异性。根据有无变异、染 色强度和位置移动等变异类型，评价t 9 0 2 个多肽，结果发现2 7 2 多肽存在多态 性。对于相同器官的不同类型的蛋白来说，也存在明显的遗传变异性。p o s c ha 等【4 9 1 分析了1 0 个辣椒品系的种子蛋白质的遗传变异性，结果发现水溶性种子蛋白仅有 两种遗传距离指数，而尿素或去污剂溶解性的种子蛋白表现为四种类型的遗传距离 指数。 随着植物蛋白质组的研究深入，生物学家已开始从细胞水平转入到亚细胞结构 水平研究植物蛋白质组。目前，些重要细胞器的表达蛋白组已经被鉴定。目前对 8 拟南芥卢j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 此研究得最多的是叶绿体蛋白质组。大部分叶绿体蛋白是由核基因编码，主要在细 胞质中合成，然后输入到叶绿体中。k l e f f m a n nt 等【删用串联质谱技术鉴定t 6 9 0 个拟南芥叶绿体蛋白质。大部分蛋白质归属于已知蛋白复合体和代谢途径。但是多 于3 0 蛋白质为未知功能的，而且许多蛋白未预测位于叶绿体中。已建立了质体蛋 白组数据库。该库具有多种搜索功能，网址为h t t p ：c b s u s r v 0 1 t c c o m e l i e d u u s e r s p p d b 。线粒体中亦存在许多蛋白质，这些蛋白参与了各种过程，如呼吸作用、柠檬酸 循环、氨基酸和核甘酸代谢、抗氧化保护、线粒体组装、分子运输和蛋白合成。2 0 以上的蛋白在植物线粒体中未曾有报道，这暗示其具有新的线粒体功能。拟南芥 线粒体蛋白质组图谱对分析有关核编码的线粒体基因的敲除突变体非常有用。有关 线粒体蛋白质组的研究数据可通过h t t p ：w w w g a r t e n b a u u n i h a n n o v e r d e g e n e t i k a m p p 网页查询。 此外，已有研究报道发现内质网、细胞核、细胞膜以及细胞壁上存在的蛋白质， 并对其功能有一定的阐述。 目前，对不同植物的亚细胞( 或细胞器) 蛋白质组的研究日益增多，现已建立了一 些亚细胞结构的2 d ep a g e 参考图谱和相应蛋白质组数据库。这些参考图谱和蛋白 质组数据库对进一步研究蛋白质差异表达、功能、定位和翻译后修饰非常有用，其 不仅有利于我们确定差异蛋白质的功能及亚细胞定位，而且可以进一步明确这些细 胞器在上述过程中的重要作用。 1 4 2 植物生理蛋白质组学分析 1 4 2 1 植物非生物逆境相关蛋白质组学分析 植物在生长发育过程中会遭遇各种不利环境因子如高温、低温、干旱和高盐等。 植物感受这些逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而 调整自身的生理状态或形态的改变来适应不利环境。因此，寻找与抗逆相关蛋白( 或 基因) 对了解植物抗逆机制以及提高植物抗逆性能有着十分重要意义。利用分子生物 学技术和基因工程手段可以提高植物抗逆性已有许多成功的报道。但是，目前仅利用 植物少量自身基因的改变来达到改良植物抗逆性目标。利用蛋白质组学技术为我们 寻找更多且更有效的新抗逆相关基因( 或蛋白) 开辟了新的方向。分析研究这些抗逆 9 厦门大学硕士学位论文 相关蛋白对于更好地了解非生物胁迫的伤害机制、植物对非生物环境的适应机制、 生物之间的相互作用机制、植物激素的调节作用等有重要意义。 目前，已有不少研究对高温胁迫、低温胁迫、盐胁迫、氧胁迫、干旱胁迫、机 械伤害、重金属以及除草剂污染相关的蛋白质进行了鉴定与分析。 1 4 2 2 植物生物逆境相关蛋白质组鉴定与分析 植物在病虫危害时局部坏死或诱导产生一些抗病抗虫蛋白。m e h t aa 和r o s a t o yb 【5 l 】用2 d e 电泳分析黄单胞茵属x a n t h o m o n a sa x o n o p o d i s 与宿主植物甜桔互 作蛋白谱的变化。结果发现1 2 个蛋白点发生上调或下调的变化。n 末端测序分析结 果发现r u b i s c o 大亚基和1 个硫结合蛋白在柑桔叶片提取液中特异上调表达。r e p m 等【5 2 1 研究发现感染维管束萎蔫真菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 的番茄木质部液的蛋白 含量发生明显变化，出现5 条受菌诱导的蛋白带。用m a l d i t o fm s 技术分析这些 蛋白质，发现1 个p r 5 家族新成员，主要在互作早期积累。其他致病蛋白如p r 1 和 p 1 ，3 葡聚糖酶仅出现在相容性互作，并伴随病害形成。由卵菌病原( a p h a n o m y c e se u t e i c h e s ) 弓 起的豆科植物根腐病是豆科作物生产中一个主要的减产因子。c o i d i t zf 等【5 3 】用比较蛋白质组学方法鉴定模式豆科植物受卵菌病原诱导调节的蛋白。在差异 表达的蛋白中，有2 个推测细胞壁蛋白和2 个小热激蛋白。此外，发现1 个查耳酮o 甲基转移酶同工型在受感染的根中表达增加。大多数受诱导的蛋白属于p r l 0 类家 族。 1 4 2 3 植物遗传多样性蛋白质组学 主要以蛋白质组学标记为纽带联系基因多样性和表型多样性，有助于了解植物 种内和种间进化趋势，以及用于品种鉴定。d a v i d 等及p i c a r d 等于1 9 9 7 年分别利用 2 d p ag e 分析了亲缘关系很近的硬粒小麦( t r i t i c u ma e s t i v u mli n n ) 不同株系的 遗传多样性，发现品系间的多态性很低，并且7 个蛋白可以用于基因型的鉴定【】。 z i v ym 等【5 4 j 5 】利用2 d e 分离的蛋白标记质量和数量差异区分了3 个不同的小麦 品种。用2 d e 分离的蛋白标记鉴定品种( 或亚种) 在其他物种如水稻【媳5 7 1 、甘蔗【5 8 】、 辣椒【5 9 ，删上均有报道。 1 4 2 4 植物突变体蛋白质组学 突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一，应用蛋白质组学方法研究因基 l o 拟南芥声j d 突变体与野生型差异表达蛋白质的初步研究 因突变引起的蛋白质表达变化可以揭示植物一些生理生态过程的机制，为突变体背 后的生化过程提供信息。通过比较在相同条件下栽培的突变体及野生型植物的蛋白 质表达谱，鉴定出差异蛋白点，为研究表型突变背后的生化过程提供有价值的信息。 d a m e r v a l 和l eg u i l l o n x ( 1 9 9 8 ) 将野生型与o2 基因突变体的蛋白质2 d e p a g e 图 谱进行比较，鉴定出属于各种代谢途径的一些酶，说明0 2 基因是玉米代谢中联系 多种代谢途径的调节基因【1 2 】。而叶绿素突变体有利于研究高等植物光合作用、叶绿 体遗传与发育等。k o m a t s u 掣6 1 】对水稻绿色和白化幼苗的蛋白质通过2 d e 分离，n 端及内部氨基酸测序，发现参与光合作用的蛋白质只在绿苗中出现，在白化苗中以 前体存在不能参与光合作用；抗坏血酸过氧化物酶只出现于白化苗中，起到细胞保 护的作用。 1 4 2 5 植物发育蛋白质组学 主要研究植物各个组织器官及细胞器内蛋白质的表达基因。对于植物细胞器， 研究比较多的是叶绿体和线粒体。r a h a r j o 等于2 0 0 4 年对大麻( c a n n a b z zs a t i v alf n n a e u 曲的叶、花、槲果组织特异性蛋白的研究表明，大麻醇在这些组织中表达显 著不同，主要在槲果中分布【13 1 。h e a z l e w o o d 等2 0 0 3 年对水稻线粒体蛋白进行分离， 鉴定了其中1 4 9 个蛋白点，并确定了8 5 个蛋白的功能，包括线粒体的许多主要的 功能蛋白【1 4 1 。近年来，对植物蛋白质组学的研究不仅仅是拟南芥【a r a b i d o p s i s 历疗 a n a ( li n n ) h e y n h o l d 】和水稻( o r y z as a t i v ali n n ) 这2 种模式植物为主了，除了 前面介绍已研究的一些植物外，还展开了对其它作物的研究，如蒺藜状苜蓿( m e d i c a g ot r u n c a t u l ag a e r t n e r ) 、烟草( n i c o t i a n at a b a c u mli n n ) 、罂粟( p a p a v e s rs o m n i f e r u m n n ) 、篦麻( ri c i n u sc o m m u n i sli n n ) 、大豆( g 咖i n em a xli n n ) 、 大麦( h o r d e u mv u l g a t e 三i n n ) 、菠菜( s p i n a c i ao l e r a c e a 三n n ) 、葡萄( vi t i s v i ni fe r a 工i n