（肿瘤学专业论文）大鼠Ⅱa型磷脂酶a2基因分子进化及其相关研究.pdf

大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基洲分予进化及其相关研究2 0 1 0 届硕t z t i ) f 究生学位论文 缩略词表 英文缩写英文全写中文全称 p l a 2 p h o s p h o l i p a s ea 2 c p l a 2c y t o s o l i cp l a 2 s p l a 2 s e c r e t o r yp l a 2 i m p c r r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e e be t h i d i u mb r o m i d e m r n a m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a r p m r o u n d p e rm i n u t e 瑚t r i sa c e t i ca c i de d 弘 磷脂酶a 2 胞浆型磷脂酶a 2 分泌型磷脂酶a 2 逆转录一聚合酶 链反应 焦碳酸二乙酯 溴化乙锭 信使r n a 互补d n a 每分钟离心转数 三羟甲基氨基甲烷 一乙酸缓冲液 e d t a e t h y l e n e d i a m i n et e t e a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d m e md u l b e c c om i n i m u me s s e n t i am e d i u m 改良的e a g l e p b s p h o s p h a t eb u f f e rs u l f a t e 磷酸盐缓冲液 s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s 单核苷酸多态性 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未 获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 = 芷 思0 学位论文作者签名：7 7 、i 前名么 签字日期：2 。f 哞6 月膨日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解广西医科大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权广西医科大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国优 秀博硕士学位论文全文数据库、中国学位论文全文数据库，并通过 网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 学位论文作者签名：朗长哳2导师签字：翠守王 签字日期：7 - , 卜年月j 字日签字日期：如加年6 月亏日 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基凶分子进化及j 相关研究 第一部分 大鼠i ia 型磷脂酶a 2 分子进化的研究 摘要 目的：研究大鼠i i a 型磷脂酶a ：( p l a 。) 分子进化的一些特点，了解 这一分子结构形成的可能原因，为合成和结构改造提供信息。 方法：收集所有已知的大鼠i i a 型p l a ：的c d n a 和基因资料，比较编码 区d n a 序列和氨基酸序列；分析其碱基取代以及取代发生的位置；取代是 同义取代和非同义取代、转换还是颠换；氨基酸取代的性质和位置等特点。 结果：1 大鼠i i a 型p l a ：基因发生碱基取代时，存在在密码子第1 i 位 多于第1 位和第1 i i 位，非同义取代多于同义取代，颠换多于转换现象；2 氨基酸取代多集中于i i a 型p l a 。蛋白分子的后半段( c 端) ；3 部分氨基 酸取代发生的氨基酸性质的改变，对其功能可能会产生影响，部分氨基酸 取代的性质无改变，可能对其功能影响不大。 结论：1 大鼠i i a 型p l a ：存在加速进化现象，可能是由于协同进化所 致；2 大鼠i i a 型p l a ：的分子的基本结构和功能可能n 端更为关键；3 部分取代氨基酸的性质改变可能会对其功能产生影响。 关键词i i a 型磷脂酶a ：，分子进化，加速进化 ，“西科学基金资助项目( 桂科回0 6 3 9 0 2 6 ) 广西医疗卫生重点科研课题( 重2 0 0 7 0 7 ) 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基冈分了进化及其相关研究 2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 s t u d yo fm o l e c u l a re v o l u t i o no f p h o s p h o l i p a s e a 2g r o u p i i ai nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t os t u d yt h e c h a r a c t e r i s t i c so fm o l e c u l a re v o l u t i o no fr a t s p h o s p h o l i p a s ea 2 ( p l a 2 ) g r o u pi i aa n dt ou n d e r s t a n dt h ec a u s eo fm o l e c u l a r s t r u c t u r et of o r m ，w h i c hc a n p r o v i d e i n f o r m a t i o nf o r s y n t h e s i s a n d r e c o n s t r u c t i o no fp l a 2m o l e c u l e m e t h o d s ：a l lk n o w nc d n a sa n dg e n e sd a t ao fr a t sp l a 2g r o u pi i a w e r ec o l l e c t e da n dt h e i rc d so fd n aa n ds e q u e n s e so fa m i n oa c i dw e r e c o m p a r e d ，t oa n a l y z eb a s es u b s t i t u t i o n so fs y n o n y m o u sa n dn o n s y n o n y m o u s ， t r a n s i t i o na n dt r a n s v e r s i o n ，a n dt h ec h a n g eo fs u b s t i t u t i o n so fa m i n oa c i d s p o s i t i o na n dt h e i rf e a t u r e ，e t c r e s u l t s ：1 t h en u m b e r so fn o n s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n so ft h ep l a 2 g r o u p i i a g e n e w e r e h i g h e r t h a n s y n o n y m o u s s u b s t i t u t i o n s ，a n dt h e t r a n s v e r s i o n sw e r eh i g h e rt h a nt h et r a n s i t i o n s ；t h es u b s t i t u t i o n so fn u c l e o t i d e w e r em o s t l yl o c a t e do nt h es e c o n dp o s i t o no fc o d o n ，t h eo t h e r sw e r el o c a t e d o nt h ef i r s ta n dt h et h i r dp o s i t o n ；2 t h er e p l a c e m e n to fn u c l e o t i d e sa n da m i n o a c i d s m o s t l yl o c a t e d o nt h ec t e r m i n a l p a r t o ft h e p r o t e i n ；3 s o m e s u b s t i t u t i o n so fa m i n oa c i dc h a n g e dt h e i rc h a r a c t e r c o n c l u s i o n s ：1 a c c l e r a t e de v o l u t i o no c c u r si nt h ep l a 2g r o u pi i ag e n eo f r a t i tm a yb ea s s o c i a t e dw i t hc o n c e r t e de v o l u t i o n ；2 t h eb a s i cs t r u c t u r ea n d 3 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基冈分予进化及其相关研究2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 f u n c t i o no fr a t sp l a 2g r o u pi i am a yb er e l a t e dt ot h en t e r m i n a lp a r t ；3 t h e c h a r a c t e rc h a n g eo fs o m ea m i n oa c i d sm a yi n f l u e n c ef u n c t i o na n ds t r u c t u r eo f p l a 2g r o u pi i am o l e c u l e k e yw o r d s p h o s p h o l i p a s ea 2g r o u pi i a ，m o l e c u l a re v o l u t i o n ， a c c l e r a t e de v o l u t i o n 4 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 - 上_ - 一 刖舌 生物进化一直以来是生物学研究领域中的一个重要课题。有学者认 为：生物进化论是生物学中最大的统一理论，生物学各学科无不贯穿进化 的思想。综合进化论的主要代表杜不赞斯基( d o b z h a n s k y ) 曾说过：“没有 进化论的指导，生物学就不成其为科学；而进化学界的权威迈尔( e r n s t m a y r ) 更指出：“进化是生物学中最重要的概念。如果不考虑进化的话， 对生物学中任何为什么的问题都无法得出确切的答案晗b 。 生物进化简单地说是指生物种群在一定时间内性状和遗传组成上的 变化b 1 。生物进化是以生物大分子为基础的，随着分子生物学的发展，进 化的研究深入到分子领域。通常所说的分子进化指在生物进化过程中，生 物分子结构和功能的变化以及这些变化与生物进化的关系m 1 。 我们课题组一直从事磷脂酶a ：( p h o s p h o l i p a s ea 2 ，p l a 2 ) 的研究。 p l a 。是一系列参与磷脂代谢的酶，能催化水解磷脂s n - 2 位脂键，产生自 由脂肪酸和溶血磷脂。它广泛的存在自然界中，是一个大的酶家族，有不 同的分类方法。可依据酶活性对钙的依耐性，p l a 。分为两大类：( 1 ) 钙依 耐性p l a 2 ，包括分泌型( s e c r e t o r yp l a 2 ，s p l a 2 ) 、胞浆型( c y t o s o l i cp l a 2 ， c p l a 2 ) ；( 2 ) 非钙离子依赖型( c a l c i u mi n d e p e n d e n tp l a 2 ，i p l a 2 ) 。但最 常用的方法是根据不同分子的结构和功能特点，分为1 2 种小类别： ( 1 ) s p l a ：i 、i i 、i i i 、v 、x 、型；( 2 ) c p l a ：包括型；( 3 ) i p l a ：包括、型。它们广泛参与生物体内多种生理和病理过程。 其生理功能包括细胞信号传递及产生2 0 多种类脂质介质、改造磷脂结构、 促进机体坏死组织消失、肺泡表面活性物质代谢等1 。 在哺乳动物中的p l a ：，研究最多的是血小板型p l a ：( p l a t e l e tp l a 2 ) ， 即i i a 型p l a 。( p l a 2g r o u pi i a ) ，它的分子量为1 3k d a 1 5 k d a ，由1 2 2 个氨基酸残基组成，有7 对二硫键，结构很稳定。它广泛存在于哺乳生物 s 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基凶分子进化及其相关研究 2 0 10 届硕上研究生学位论文 的多种组织中，如肺、胸腺、肝、肾脏、前列腺、肠和血液中。除具有 p l a 。的一般功能外，十多年前发现它还是生物体内重要的宿主防御细菌感 染的物质，是一种具有强杀菌活性的蛋白分子，这是其他p l a ：所没有的晦， 刮。我们已经知道，某些p l a ：有着共同的祖先基因，如i i a 型和i b 型p l a ： ( p l a 2g r o u pi b ) ，二者结构很相似，但是为何i i a 型p l a ：有着更多样的 功能? i i a 型p l a ：的结构是如何改变，从而具备了许多新的功z 日, 匕i - ? 它经历 了怎样的进化历程呢? 这是我们感兴趣的地方。 在本研究中我们所有收集已经公布的大鼠的i i a 型p l a ：的e d n a ，进 行比对，比较其中取代发生的位置、同义取代和非同义取代、氨基酸替换 发生的位置等，并研究它们变化的特点和规律。 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基w 分了进化及其相关研究 2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 材料与方法 1e d n a 资料的来源 所有的大鼠i i a 型p l a ：c d n a 均来自美国国家生物工程信息中心n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，n c b i ) 网站基因库 ( g e n b a n k ) ，共收集到7 个i i a 型p l a ：m r n a 和基因，见表卜1 。其中第2 、 6 、7 号基因的顺序完全一致的，我们只取第2 个基因和其它进行比较， 第4 、6 个基因由我们实验室分离扩增后测定顺序，提交到g e n b a n k 。第5 个基因来自于胰腺细胞体外培养传代后得到的p l a 。测序结果，它在 g e n b a n k 中可以查询的有2 7 9 个核苷酸。其它的基因整理后均有4 3 9 4 4 1 个核苷酸，其中有些序列为全基因序列，包括内含子，我们按说明予以剪 切后进行连接。 表卜1i i a 型p l a ：c d n a 来源及提交者 亟量壅塑! 叁垦! 堡查 l g i 1 5 5 3 6 9 7 3 5 血管平滑肌细胞r a v a u xl ，d e n o y e l l ec ，m o r m ec 2 9 i 2 0 4 3 1 8 未标明k o m a d am ，k u d oi ，i n o u ek 3 9 i 2 2 0 8 5 7 巨核细胞k o m a d am ，k u d oi ，m i z u s h i m ah 4 9 i ：1 4 0 1 0 6 2 8 全血liu t t ，l i a n gn s ，m e n gzq 5 9 i 1 7 5 4 7 3 4 胰腺细胞体外养c h e nm ，y a n gz ，n a j ia 6 9 i 4 9 8 2 3 2 9 0腹主动脉l i a n gn s ，s uq b ，l iy 卫生5 6 9 1 1壁壁鉴竺! 竺翌2 堑：兰呈1 2 垫兰：垡堡垒兰呈生! 坚： 2 比对 把第1 、2 、3 、4 、5 号序列按密码子排列方式，比对它们的编码序列， 见图1 - 1 。 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基凼分子进化及其相关研究2 0 l o 届硕上研究生学位论文 1a t ga a gg t cc t cc t gt t gc t ag c ag t t g t ga t ca t gg c ct t tg g ct c a 4 8 2 3 量 1a t tc a gg t cc a gg g ga g cc t tc t gg a gt t tg g gc a a a t ga t tc t gt t t 9 6 ：! ：； 4 1 2 3 4 a a ga c ag g a a a ga g ag c t g a tg t t a g ct a tg g ct t ct a c g g tt g cc a t l 4 4 1 t g tg g tg t gg g tg g ca g ag g at c cc c c a a gg a tg c ca c ag a tt g gt g c l 9 2 ： 3 4 5 1t g tg t ga c tc a tg a ct g tt g tt a c a a cc g tc t gg a ga a ac g tg g at g t 2 4 0 ：2 ：2 ：i 4 三； 1 2 3 4 5 g g ca c aa a gt t tg t ga c ct a ca a gt t ct c ct a cc g ag g gg g cc a aa t c 2 8 8 c g a ac t 8 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基凼分子进化及其相关研究2 0 1 0 届硕t = 研究生学位论文 1 2 3 4 5 t c ct g ct c ta c aa a cc a gg a ct c ct g cc g ga a ac a gc t gt g cc a gt g c 3 3 6 1g a ta a ag c tg c cg c tg a at g tt t tg c cc g ga a ca a ga a aa g ct a ca g t 3 8 4 4( ； 5g c g 1t t aa a gt a cc a gt t ct a cc c ca a ca a gt t tt g c a a ag g ga a ga c gc c c 4 3 2 2 3 4 5 1 2 3 4 a g tt g ct g a4 4 1 图卜1 按密码子方式排列后比对 注：1 、2 、3 、4 、5 为我们获得的基囚序列号，每行后面的数字为从起始密码子开始算起的顺序。黑 点表示顺序与1 号基因顺序一致的，不一致的标出碱基。 9 人鼠i i a 型磷脂酶a z 摹岗分了进化及其相关研究2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 氨基酸取代比对见图卜2 。 1mk vllllavv工mafgsiqvqgsllefgqmilfk 3 3 2 3 4 p 1tgkr advsygfygchcgvggrgspkdatdwccv 6 6 2 3 4 5v 1thdccynrlekr gcgtkfvtykfsyrggq 工scs 9 9 2 l 3 l 4 l r 5 0l 1tnqdscrkqlcqcdkaaaecfarnkksyslkyq 1 3 2 2 3 4 5 rr 1 fypnkfckgktpsc1 4 6 2 l 3 4 5 图卜2 氨基酸取代比对 注：星号表示和1 号氨基酸序列一致，不一致的标示出。o 表示终止密码子。每列后额数字表示从起 始氨基酸算起的顺序。同义取代未标注。 l o 人鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 3 碱基的同义和非同义取代及取代所在密码子位置 我们对5 个来自不同大鼠的i i a 型p l a ：基因的编码区进行两两比较， s 为同义取代( s y n o n y m o u s ) ，是未改变氨基酸的碱基取代，n 为非同义取 代( n o n s y n o n y m o u s ) ，是发生了氨基酸改变的碱基取代口1 。分析发生取代 所处密码子的位置( i 、i i 和i i i 位) 及取代后引起氨基酸改变的情况( 同 义取代和非同义取代) 。结果见表1 - 2 。 4 碱基取代的转换和颠换比较 我们对5 个基因进行两两比较，比较它们发生碱基取代时，转换和颠 换发生次数，见表卜3 。 5 氨基酸取代分析 分析氨基酸取代的发生的位置及如何替换，见图卜2 和表卜4 。 我们分析碱基突变发生的氨基酸位置，以氨基酸顺序为横坐标( 从n 末端到c 末端) 发生在每一氨基酸位置上的碱基取代数为纵坐标作图，见 图l 一3 。 以人的i i a 型p l a ：3 d 结构图为参照，氨基酸替换的位置见图卜4 。 大鼠i l a 型磷脂酶a 2 基冈分子进化及j 相关研究 钴里 ：口木 1 同义取代与非同义取代 大鼠i i a 型p l a ：间的碱基取代在密码子不同位置的发生数目以及同 义和非同义取代情况见表1 - 2 。从表中可以看到：碱基取代时，密码子第 1 i 位发生最多( 2 7 次) ，其次才是第1 i i 位( 1 6 次) 和第1 位( 8 次) ， 发生在第1 i 位的次数甚至多于第1 位和第1 i i 位的和；在表中还可以看到， 发生的非同义取代明显多于同义取代，二者之比为3 9 ：1 2 ；最后，从表 中可以看到第5 个基因发生的碱基取代明显多余其他组，尤其是非同义取 代明显多于其他组，其中5 号是从胰腺细胞培养克隆的p l a ：c d n a 。 2 转换和颠换 在碱基取代中，有两种基本形式，即转换和颠换。转换( t r a n s i t i o n ) 是嘌呤与嘌呤( a g ) 、嘧啶与嘧啶( c t ) 之间的相互替换。颠换 ( t r a n s v e r s i o n ) 是嘌呤与嘧啶之间( a c 、c g 、a t 和g t ) 的相互替 换。在我们的研究中，发生转换和颠换的情况见表1 - 3 。其中颠换发生2 8 次，转换发生2 3 次，颠换多于转换。 3 氨基酸替换分析 图卜3 中可以看到发生取代的氨基酸位置，在i i a 型p l a 。蛋白共1 4 6 个氨基酸中( 包括信号多肽2 4 个，成熟多肽1 2 2 个) ，在前7 6 个氨基酸 之前发生的取代只有3 次，而在后半部分之后发生了1 0 次。这些碱基取 代有一个很明显的特点，就是几乎绝大部分突变都发生在靠近p l a ：分子的 后半部分( c 端上) 。同样，发生氨基酸置换也以i i a 型p l a ：蛋白的后半 部分为主。 我们以人的i i a 型p l a ：蛋白3 d 结构为参照，观察大鼠i i a 型p l a ： l 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 氨基酸替换的位置如图卜4 。a 图中箭头处位置为活性中心氨基酸( 去除 信号肽后氨基酸第3 0 、4 8 、4 9 位随3 ) ，b 为从背面看到的氨基酸取代位置。 我们发现第5 个基因的5 2 号位置的取代氨基酸距离活性中心非常近，5 号基因为体外细胞培养的结果。 氨基酸取代的发生的位置及如何替换见图卜2 和表卜4 ，表中可以看 到在8 4 位中5 号p l a 。中出现终止密码子。其它位置具体如何替换见表卜4 。 表1 - 2 大鼠i i a 型p l a ：间的碱基取代情况 注：i 、i i 、1 分别为密码子第l 、2 、3 位，s 为同义取代，n 为非同义取代。s n 为二者的比值。 表1 - 3 大鼠i i a 型p l a ：分子发生碱基取代时，转换和颠换的情况 表1 - 3 a 转换次数比较 表卜3 b 颠换次数比较 表1 - 4 大鼠i i a 型p l a ：基因氨基酸替换的位置和氨基酸 注：括号内为发生氨基酸替换相应的序列号，和图卜2 一致。 查墼! 垫型堡望塑生至堕坌王望些苎兰型茎里型 垫! ! 堡堡兰竺墨兰兰些堡兰 母守孝毋毋寸pp p 图卜3 碱基取代和氨基酸位置的关系 注上图中，3 1 位氨基酸，有3 敬突变。5 2 位编码氨基酸的密码子中3 个碱基中，有两个位置发 生突变，各有4 次，其余类似。 活性中心 图卜4 氨基酸替换在3 d 结构中的位置 i 斋：! 箭头赴黄色表示话性中心位置的氨基酸其余黄色为氨基酸取代位置图4 为正面圈8 犬鼠i i a 型磷脂酶a ：基w 分子进化及其相关研究 讨论 1 大鼠i l a 型p l a ：有较快的进化速度 分子进化领域最重要的理论是中性进化理论( t h en e u t r a lt h e o r yo f m o l e c u l a re v o l u t i o n ) 。该理论认为生物在分子水平上的突变大部分是中性 的，没有达尔文进化论所说的“有利 和“有害”之分。这种突变对核酸 和蛋白质的功能，以及对生物个体的生存没有多大的影响和有利、有害之 分。“中性突变 是通过随机的“遗传漂变”的作用被加以固定在群体里， 自然选择在分子水平上的进化过程中不起作用。即当一个生物的d n a 分子 出现中性突变，那么它是通过群体中的随机交配加以固定，或者发展或者 消失，最后可实现种群的变化和新的物种的形成】。在中性进化时，常表现 为同义取代多于非同义取代、转换多于颠换、非编码序列进化速率快于编 码序列等现象。这些现象在分子进化中非常普遍。 该学说认为进化中的d n a 变化，大部分是符合中性进化的，只有一小 部分是适应性的，这部分是受自然选择作用的，称之为达尔文选择( d a r w i n p o s i t i v es e l e c t i o n ) ，又称为加速进化( a c c l e r a t e de v o l u t i o n ) 。评价是否发生 达尔文选择的重要指标是同义取代少于非同义取代，转换少于颠换，有的 还表现为编码序列核苷酸变化速率快于非编码序列或外显子快于内含子， 或者假基因取代快于基因取代的速率。总之，非编码序列、同义取代、假 基因承载的进化压力比较小，有较多的碱基取代，如果比这个速率快，就 考虑是外界环境对基因突变形成了选择压力，认为发生了加速进化n 叭。 分子进化中的碱基取代，一般的规律是转换多于颠换，二者之比为2 ： 1 3 ，从化学结构看，转换要比颠换容易。而在加速进化时会发生颠换多 于转换的现象。 编码氨基酸的3 个碱基中，同一种氨基酸第1 i i 位的碱基常会不同，例 如：c c t 、c c a 、c c g 和c c c 都是脯氨酸密码。虽然它们第1 i i 位上的碱基不同， ls 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基冈分了进化及其相关研究 但是都编码同一种氨基酸。这种情况也存在于其他一些氨基酸中。物种在 进化过程中由于承受保持蛋白质结构和功能的相对稳定的约束，碱基的取 代一般以第1 i i 位最多，因为第1 i i 位的碱基改变通常并不引起氨基酸的改变， 而第1 位碱基的改变常会引起氨基酸的改变，故发生的取代较少，第1 i 位 最少，因为每一次改变都会引起氨基酸的改变n 引。这也就造成了大多数基 因进化时，取代多发生于密码子第1 i i 位，而第1 i 位最少，从而造成同义取 代远多于非同义取代。 在我们的研究中( 见表卜2 和表卜3 中) ，可以看到i i h 型p l a ：的进 化中，有着很特别的方式：( 1 ) 非同义取代( 3 9 次) 明显多于同义取代 ( 1 2 次) ，s n n ) ，碱基取代在第1 i i 位多于 第1 、i i 位，转换多于颠换阻4 1 5 3 ，我们发现这个基因的进化特征与大多数 的基因进化不同，符合加速进化的模式。 i i a 型p l a ：的加速进化意味着i i a 型p l a ：发生碱基取代时多数发生了 氨基酸改变，也带来了蛋白质顺序的改变，加速的碱基取代和氨基酸改变， 使得p l a ：分子得以形成新的结构，而有了新的结构，p l a ：获得新的功能便 有了基础。 我们知道i b 型和i i a 型p l a ：均从共同的祖先基因进化而来，而且结 构也很相似，但两种类型的p l a 。功能却大相径庭，如i b 型p l a ：功能单一， 主要是消化食物中的磷脂；i i a 型p l a 。却功能多样，参与生物体内的多种 生理和病理过程以及具有杀菌功能。正是因为i i a 型p l a ：结构发生较多改 变，进化快，所以具有更多样的功能，包括具备了杀菌能力。 2 协同进化可能是大鼠l l a 型p l a ：加速进化的原因 为何i i a 型p l a ：基因进化不同于其它的基因呢? 我们必须联系它的 1 6 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 2 0 1 0 届硕一f ：研究生学位论文 功能才能解释这个现象，i i a 型p l a ：不仅仅作为水解磷脂释放炎症介质的 酶，它还是生物体内重要的抗菌物质。众所周知，动物体内的微生物，是 以相当快的速度进化来适应环境的变化，如细菌耐药的产生，就是细菌快 速进化以适应环境的现象n 引，作为防御微生物的物质，也必须不断进化以 应对体内微生物的变化。 哺乳动物体内还有一种重要的抗菌物质一防御素，目前对它研究也 比较多。它是一种抗微生物多肽家族，有多种作用，可以抗许多微生物， 如细菌、真菌、病毒等。d a v i dj 等在研究中运用最大似然比的方法，观 察到了a 一防御素存在加速进化现象，并认为是为了适应快速进化的微生 物带来的挑战n7 i 。而p a t i la 等在比较多种哺乳动物a 一防御素基因，得 出了其存在加速进化现象，是为了应对它们居住的生态小境的不同微生物 的挑战n 8 | 。 除上述之外，有报道蛇的蝮亚科和蝰亚科中的蛇毒p l a ：存在加速进 化现象。刘滔滔、k i n i c h in a k a s h i m a 、t o m o h i s ao g a w a 等在多篇文献中 报道：他们比较蛇毒p l a ：基因的外显子和内含子的核苷酸取代，发现很多 的p l a ：都有外显子比内含子有更多的核苷酸取代的现象，而一般的基因是 内含子比外显子发生更多的突变。而在比较外显子时，发现非同义取代比 同义取代相近或者稍多，上述证据说明该蛇毒p l a ：中存在加速进化现象n 玑 2 0 2 。h l i s l eg i b b s 等在进一步的研究中认为它的进化压力来自猎物的变 化，为了捕杀猎物，或者为了消化不同的捕获物，它必须进化来适应猎物 的变化瞳2 i 。 上述加速进化符合协同进化( c o n c e r t e de v o l u t i o n ) 现象。协同进化论 的主要观点是：一个物种在另一物种影响下产生进化，同时第二个物种在 第一物种的影响下也产生相应的进化，即两个物种在相互影响下产生的进 化心3 1 。协同进化可发生于个体水平、种群水平和生态系统水平，也可以发 生在细胞水平和分子水平。如前所述，i i a 型p l a ：和防御素都是体内重要 1 7 火鼠1 1 a 型磷脂酶a 2 摹凶分子进化及其相关研究 的防御物质，有抗微生物作用。细菌、病毒等微生物都以相当快的速度进 化，它们的进化构成了选择上的压力，物种为了维持生存，它的防御物质 也必须相应的加快进化，以应对微生物进化带来的挑战；同样，蛇毒p l a ： 为了回应猎物的变化，也必须不断进化，以适应这种环境的变化。 因此，我们认为大鼠i i a 型p l a ：、蛇毒p l a 。、防御素的加速进化是由 于分子水平上的协同进化造成的。依据这个设想，我们推测生物体内的防 御物质可能因协同进化，普遍存在加速进化现象。 协同进化的压力如何作用于分子，使分子加速进化，其中的分子机制 尚不清楚，值得继续探索。 3 体外细胞培养时l l a 型p l a ：发生了较多碱基取代，甚至出现了提前终止 的信号 第5 个基因来源于大鼠的胰腺细胞体外培养，从表1 - 2 中我们比较 发现它的突变比较多，共5 1 次碱基取代中，第5 组就发生3 6 次碱基取代。 这可能与它脱离了体内环境，在不同于体内的培养环境生长有关，造成了 分子有较多的变化。我们表卜4 中和图卜2 中可以看到第5 个序列中发现 它出现了无义突变，即出现终止密码子。这在活体中是极少发生的，因为 它将严重影响防御功能。这种有害突变的个体必然会被净化选择 ( p u r i f y i n gs e l e c t i o n ) 清除掉。在作3 d 图中还发现第5 个基因的5 2 号位 置( 相当于去信号肽后第3 2 位) 的取代氨基酸距离活性中心非常近，这 会影响p l a ：的功能，在活体内这种情况也不会发生。 我们清楚，在体外细胞培养中，它与生物体内环境有很大不同：i i a 型p l a ：不再作为炎症介质和防御物质发挥作用，细胞面临的周围微环境也 和体内有很大不同，如在生物体内有各种信号因子刺激细胞，在体外培养 时则很少；体内有各种防御感染的物质，体外细胞培养时也缺乏。那么， 体外细胞培养时i i a 型p l a ：如何进化，它的突变有何特点，至今文献报道 1 r 犬鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 很少，还需要进一步探索。 4 氨基酸取代性质及其位置分析 i i a 型p l a ：蛋白共有1 4 6 个氨基酸( 包括了信号肽) ，从图1 - 3 中可 以看到，1 4 6 个氨基酸中，氨基酸取代的位置多偏于后半段，前7 3 个氨 基酸只有3 次发生突变，后7 3 个共有1 0 次。我们考虑可能它的氨基酸 结构，特别是前半部分，对于保持p l a ：的基本功能或者结构非常重要，如 信号肽就在前半部分，非常保守，如果这部分有改变，将有可能使p l a ： 失去基本的结构，从而会失去功能，对i i a 型p l a ：的炎症介质作用和抗菌 功能产生影响，从而影响生物的生存；后半部分对保持它的基本结构或功 能不那么关键，所以变化较多。这符合一般的分子进化规律：进化的改变 是保守性质的，就是功能上次要分子的部分比那些主要分子的部分进化要 快些瞳4 i 。这些信息希望可以给蛋白质改造工程或者p l a ：的结构研究提供信 息。 在图1 - 4 中可以看到，氨基酸替换绝大多数不涉及p l a ：酶活性中心位 置( 除5 号基因5 2 位氨基酸取代除外) ，分布在活性中心周围。这意味 着氨基酸的改变不会影响p l a ：最基本的功能，即催化水解磷脂的功能。 在表i - 4 中看到其中3 1 、1 3 5 位为脯氨酸和亮氨酸，二者虽同属非 极性疏水性氨基酸，但是结构有不同：前者为脂肪族氨基酸，后者为亚氨 基酸；9 5 位谷氨酰胺为极性氨基酸，精氨酸为碱性氨基酸，二者性质不 同；1 1 5 位丙氨酸为非极性疏水性氨基酸，精氨酸为碱性氨基酸，性质也 有很大不同。这些氨基酸替换可能导致i i a 型p l a ：蛋白结构和功能变化。 其余几组：5 2 、8 5 、1 1 4 位氨基酸性质相似，突变后能否引起蛋白性质或 者功能的改变，还不得而知。 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基因分子进化及其相关研究 2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 结论 1 在i i a 型p l a ：基因的编码序列中，发现它的碱基取代多数发生在 密码子第1 i 位；非同义取代多于同义取代；颠换多于转换。提示大鼠i i a 型p l a ：基因存在加速的进化现象。 2 加速进化使i i a 型p l a ：分子有更多机会产生新的结构，从而具有 新的功能。协同进化可能是促使i i a 型p l a ：加速进化的原因。 3 体外细胞培养环境下出现突变较多的现象，可能与细胞培养时脱 离了活体的系统控制，故允许有较多的突变。 4 ：碱基取代和氨基酸取代多发生于i i a 型p l a 。蛋白分子的c 末端部 分，考虑n 末端对于i i a 型p l a ：基本结构和功能至关重要。 大鼠i i a 型磷脂酶a 2 基岗分了进化及j 相关研究 2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 参考文献 1 李难进化生物学基础北京高等教育出版社，2 0 0 5 ，1 2 李难进化生物学基础北京高等教育出版社，2 0 0 5 ，1 3 李难进化生物学基础北京高等教育出版社，2 0 0 5 ，2 4 沈银柱，王正询，李晓晨进化生物学北京高等教育出版社，2 0 0 2 ， 2 3 4 5 k u d oi , m u r a k a m im p h o s p h o l i p a s ea 2e n z y m e s j p r o s t a g l a n d i n so t h e r l i p i dm e d i a t ，2 0 0 2 ，6 8 - 6 93 5 8 6 w e i n r a u c hy ，a b a dc ，l i a n gn s ，e ta 1 m o b i l i z a t i o n o fp o t e n t p l a s m a b a c t e r i c i d a la c t i v i t yd u r i n gs y s t e m i cb a c t e r i a lc h a l l e n g e r o l eo fg r o u pi i a p h o s p h o l i p a s ea z j c l i ni n v e s t ，1 9 9 8 ，1 0 2 ( 3 ) ：6 3 3 8 7 李难进化生物学基础北京高等多教育出版社，2 0 0 5 ，1 6 2 8 s i n g hn ，j a b e e nt ，s h a r m as ，e ta 1 s p e c i f i cb i n d i n go f n o n - s t e r o i d a la n t i i n f l a m m a t o r yd r u g s ( n s a i d s ) t op h o s p h o l i p a s ea 2 s t r u c t u r eo ft h e c o m p l e x f o r m e db e t w e e np h o s p h o l i p a s ea 2a n dd i c l o f e n a ca t2 7ar e s o l u t i o n a c t a c r y s t a l l o g rdb i o lc r y s t a l l o g r , 2 0 0