（植物病理学专业论文）土壤微生态调控对草莓连作障碍防治效果研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰垦盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：富垂面 签字日期： 彻j 年石月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盛些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇堡垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： _十、 觊迦 签字日期：仞j 年6 月7 日签字日期：铂“年6 月 7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编：0 7 1 0 0 0 摘要 | | m i tll ll u ii iiu i y 18 9 7 3 8 5 连作导致土传根部病害日趋严重、草莓生长发育不良，被称为草莓连作障碍( 再 植病害或重茬病) 。连作后土壤微生态环境恶化是草莓连作障碍发生的根本原因，连 作使草莓根际微生态环境向有利于病原物群体数量增加、根系抗病性降低的方向转 变，根系化感物质的产生是导致这种转变的核心问题。在对草莓连作障碍发生机理、 连作土壤微生态系统中诸因子互作关系等研究基础上，本试验通过繁育菌根化的抗 ( 耐) 病种苗，以v a m 真菌菌种g z o m u sm o s s e a e 为最优，提高草莓根系活力，进而 达到健根抗病的目的；并将草莓根系自毒物质的高效降解菌b 3 5 1 2 与药用植物材料有 效结合，既可抑制土壤中病原菌的侵染，又可降解土壤中草莓根系分泌的自毒物质， 从而达到祛毒抑菌的目的。近而形成基于土壤微生态调控的设施草莓连作障碍综合防 治技术，研究成果不仅可为草莓连作障碍的有效控制提供技术支撑，还可丰富作物连 作障碍防治理论，为控制其他作物连作障碍提供借鉴。 土壤中病原微生物侵害和草莓根系自毒物质的分泌是草莓连作障碍的2 大主要 原因，为有效解决单一使用解酚菌或药用植物材料防治草莓连作障碍过程靶标单一的 问题，本试验以解酚菌b 3 5 1 2 与6 种对草莓枯萎病有抑制作用的药用植物( 姜黄、 青皮、山柰、枳实、z l 、z 2 ) 为试材，将二者有效结合制成复合微生态调控剂，最后 确定以姜黄为基质，玉米秸秆粉、麦麸为碳源、氮源时，解酚菌b 3 5 1 2 的生长速率 最快且对草莓枯萎病病原菌的抑菌率最高；同时筛选出以姜黄为基质利于b 3 5 1 2 定 植、增殖的固体发酵培养基配方及条件，配方为麦麸：玉米秸秆粉：姜黄按2 0 ：1 0 ：6 的比例混合，b 3 5 1 2 以2 0 的接种量、最适温度3 2 、初始含水量5 0 、初始p h7 0 培养9 6h 时，b 3 5 1 2 的繁殖能力最强且活菌数最高。结合室内实验，筛选得到以解 酚菌b 3 5 1 2 与姜黄发酵制成的复合微生态调控剂以2 的比例接种到草莓连作土壤 中，覆膜熏蒸7 天，于接开膜晾晒6 天后，植株的各项生长指标均高于其它处理，从 而使祛毒抑菌的效果达到最优。根据1 6 s r d n a 序列分析，初步鉴定b 3 5 1 2 为烟酸芽 孢杆菌( b a c i l l u sn i a c i n o 。 v a m 菌根真菌g m o s s e a e 对草莓生长有明显的促进作用，本试验通过室内试验 筛选出繁育v a m 菌根化苗的最佳接种量和接种时间，其结果为当v a m 菌剂以8 接种 量接种时，且菌根化时间为2 5 d 时，草莓的各项生长指标达到最高且菌根化程度达到 最高，从而使健根抗病的效果达到最优。 0 9 年9 月到1 1 年4 月的田间微区试验表明复合微生态调控剂可有效抑制土壤中 病原菌的增殖，同时可有效降解草莓根系分泌的自毒物质对羟基苯甲酸，结合由 g o m u s 厨o s s e h e 菌剂菌根化的草莓苗，最终提高草莓植株对连作障碍的抗性，使草 莓根系的保护酶活性明显升高，降低发病率，提高产量，保证品质。 关键词：草莓连作障碍固体发酵复合微生态调控剂v a m 菌根化苗 t h ee f f e c to fm i c r o e c o l o g i c a lr e g u l a t i o no fs t r a w b e r r yc o n t i n u o u s c r o p p i n go b s t a c l e s a u t h o r ：h uj i n 1 i a d v i s o r ：p r o f e s s o rz h e l lw e n c h a o m a j o r ：p l a n tp a t h o l o g y a b s t r a c t t h ep h e n o m e n o nt h a tc a u s e sp o o rg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fs t r a w b e r r ya n d i n c r e a s i n g l ys e v e r es o i l - b o m er o o td i s e a s ei sk n o w na ss t r a w b e r r yc o n t i n u o u sc r o p p i n g o b s t a c l e s ( r e p l a n td i s e a s e o rc r o p p i n gd i s e a s e ) 。t h ef u n d a m e n t a lc a u s e sw h i c hm a d e s t r a w b e r r yr o o tm i c r o e c o l o g i c a lc h a n g et o w a r d sf a v o r a b l ef o rm u l t i p l i c a t i o no fp a t h o g e n s a n dw e a k e n i n gr o o tr e s i s t a n c ea f t e rc o n t i n u o u sc r o p p i n g t h ec o r em e c h a n i s mi st h a tr o o t a l l e l o c h e m i c a l sl e a dt ot h ec h a n g e o nt h eb a s i so ft h em e c h a n i s mo nc o n t i n u o u sc r o p p i n g o f s t r a w b e r r y a n dt h ei n t e r a c t i o n s a m o n g t h ev a r i o u sf a c t o r si nt h es o i l m i c r o - e c o s y s t e m , m y c o r r h i z a ls t r a w b e r r ye u l t i v a ri n o c u l a t e dg i o m u sm o s s e a ew a sb r e dt 0 r e s i s td i s e a s e ，w h i c hc a ni m p r o v es t r a w b e r r yr o o t v i t a l i t y ；s i m u l t a n e o u s l y t h ep l a n t i n o c u l a t e db 3 5 1 2w i t ha h i g h e f f i c i e n c yd e g r a d a t i o nt op ac o m b i n e dw i mm e d i c i n a lh e r b s w e r et e s t e dt oa g a i n s tp a t h g e n so fs t r a w b e r r yr e p l a n t i n gd i s e a s ei nap o te x p e r i m e n ta n d f i e l dt r i a l s a tl a s tt h er e s u l tw i l lf o r mt h ei n t e g r a t e dc o n t r o lt e c h n o l o g yo fs t r a w b e r r y c o n t i n u o u sc r o p p i n go b s t a c l e ，w h i c hc a l lp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sa n dt e c h n i c a ls u p p o r t f o rl u t h e rs t u d y i n gt or e d u c ec o n t i n u o u sc r o p p i n go b s t a c l e t w ol a r g em a i no b s t a c l ef a c t e r so fs t r a w b e r r yc o n t i n u o u sc r o p p i n ga r ep a t h o g e ni nt h e s o i la n dt o x i cs u b s t a n c eo fs t r a w b e r r yr o o t i no r d e rt os o l v et h ep r o b l e mo fu s i n gs i n g l e a c i dd e g r a d a t i o nb a c t e r i ao rm e d i c i n a lh e r b st oc o n t r o ls t r a w b e r r yr e p l a n td i s e a s e ，t h i s s t u d yu s e da c i dd e g r a d a t i o nb a c t e r i ab 3 5 12a n ds i xk i n d so fm e d i c i n a lh e r b s ( t u r m e r i c 、 p e e l 、k a e m p f e r o l 、c i t r u sa u r a n t i u m 、z l 、z 2 ) w h i c hh a di n h i b i t e ds t r a w b e r r yw i l ts t r o n g l y a st e s tm a t e r i a l s t h et e s tp r o p o s e dt oc o m b i n et h et w of a c t o r sa sc o m p l e xm i c r o e c o l o g i c a l r e g u l a t i o na g e n t s f i n a l l yw ei d e n t i f i e dt h a tb 3 5 1 2h a dt h ef a s t e s tg r o w t hr a t ea n dt h e h i g h e s ti n h i b i t i o nr a t et os t r a w b e r r yw i l tp a t h o g e nw h e nt u r m e r i cw a sc o n s i d e r e da s s u b s t r a t e ，c o ms t r a wf l o u ra n d w h e a tb r a na sc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e a tt h es s a l l et i m e w es e l e c t e dt h es o l i df e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n sw h i c h w e r eb e n e f i t e df o rs t r a i n b 3 51 2c o l o n i z a t i o na n dp r o l i f e r a t i o n t h el a s tf o r m u l aw a sw h e a tb r a n ：c o ms t r a w p o w d e r ： t u r m e r i ca tt h er a t i oo f2 0 ：10 ：6 a n dw h e no p t i m a li n o c u l u mc o n c e n t r a t i o no fa c i d d e g r a d a t i o nf u n g ib 3 5 1 2w a s2 0 ，o p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 2 c ，i n i t i a lm o i s t u r ec o n t e n t w a s5 0 ，i n i t i a lp hw a s7 0 ，i n c u b a t i o nt i m ew a s9 6 h ，b 3 5 1 2h a dt h eh i g h e s tr e p r o d u c t i v e c a p a c i t ya n dt h eh i g h e s tn u m b e ro fv i a b l ec e l l s w i t hp o te x p e r i m e n t , w es e l e c t e dw h e n c o m p l e xm i c r o e c o l o g i c a lr e g u l a t i o na g e n t si n o c u l a t e ds t r a w b e r r yc o n t i n u o u sc r o p p i n gs o i l a tt h er a d i oo f2 ，c o v e r e d7d a y sw i t hf i l ma n dd r i e d6d a y sa f t e ro p e n e dt h ef i l ma s ，p l a n t g r o w t hi n d e xi sh i g h e rt h a no t h e rt r e a t m e n t s b 3512w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sn i a c i n i a c c o r d i n gt ot h es e q u e n c ea n a l y s i so f16 s r d n a o ft h es t r a i n v 久mf u n g ig m o s s e a ec a np r o m o t es t r a w b e r r yg r o w t hs i g n i f i c a n t l y t h r o u g hp o tt e s t w es e l e c t e do p t i m a li n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o na n di n o c u l a t i o nt i m e t h er e s u l ts h o w e dt h a t w h e nt h ei n o c u l a t i o nw a s8 a n di n o c u l a t i o nt i m ew a s2 5d a y s s t r a w b e r r yh a dt h e h i g h e s tg r o w t hi n d e xa n dt h eh i g h e s td e g r e eo fm y c o r r h i z a l t h ef i e l dt e s tf r o ms e p t e m b e r2 0 0 9t o a p f i l 2 0 11s h o w e dt h a t c o m p l e x m i c r o e c o l o g i c a lr e g u l a t i o na g e n t sc a ni n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fp a t h o g e n si ns o i l ，a n dc a l l e f f e c t i v e l yd e g r a d et h e t o x i cs u b s t a n c e so fh y d r o x y b e n z o i ca c i d t h a tr e l e a s e db y s t r a w b e r r yr o o t t h ee x p e r i m e n ta l s oi n d i c a t e dt h a tt h ep l a n ti n o c u l a t e dg l o m u sm o s s e a e w i t ho t h e rf a c t e r sw h i c hw em e t i o n o d t h a tc a ni m p r o v et h er e s i s t a n c et ot h ec o n t i n u o u s c r o p p i n g , i n c r e a s et h ep r o t e c t i o ne n z y m e sa c t i v i t yo fs t r a w b e r r yr o o t ，r e d u c et h ei n c i d e n c e o fd i s e a s ea n di n c r e a s ep r o d u c t i o na n dq u a l i t y k e yw o r d s ：s t r a w b e r r y ；c o n t i n u o u sc r o p p i n g ；s o l i df e r m e n t a t i o n ；v a mm y c o r r h i z a l s e e d l i n g s ；c o m p l e xm i c r o e c o l o g i c a lr e g u l a t i o na g e n t s ； 目录 l 弓j 言1 1 1 连作障碍的危害。1 1 2 连作障碍发生的原因1 1 2 1 土传真菌性病害和线虫增多2 1 2 2 根系土壤中发生的化感自毒作用2 1 2 3 土壤理化性状的劣变2 1 3 草莓连作障碍的防治2 1 4 研究意义4 2 材料与方法6 2 1 供试材料。6 2 1 1 供试六种药用植物材料或组合6 2 1 2 供试有益菌6 2 1 3 供试草莓品种6 2 1 4 土壤样品6 2 1 5 主要试剂6 2 2 试验方法6 2 2 1 复合微生态调控剂的筛选6 2 2 2 复合微生态调控剂施用条件的筛选7 2 2 3 解酚菌b 3 51 2 分子鉴定8 2 2 4v a m 菌剂施量及菌根化草莓苗移栽时间的确定1 0 2 2 5 土壤微生态调控对草莓连作障碍防治的微区试验1 1 2 2 6 统计分析方法1 3 3 结果与分析1 4 3 1 复合微生态调控剂的筛选1 4 3 1 1 复合微生态调控剂主体材料的筛选1 4 3 1 2 土壤微生态调控剂工艺优化1 5 3 1 3 复合微生态调控剂最佳施用条件1 8 3 1 4 基于1 6 sr d n a 的分子生物学鉴定2 0 3 2v a m 菌剂施量及菌根化草莓苗移栽时间的确定。2 0 3 2 1 菌根化草莓苗最佳移栽时间。2 0 3 2 2v a m 菌剂最佳施用量2 1 3 3 土壤微生态调控对草莓连作障碍的影响2 2 3 3 1 对草莓连作土壤中主要病原菌的影响2 2 3 3 2 对草莓生长和生理状况的影响2 2 3 3 2 对草莓生长和生理状况的影响2 3 3 3 3 对草莓连作土壤中酚酸含量的影响2 8 z l 讨论3 ( ) 4 1 复合微生态调控剂的筛选3 0 4 2 解酚菌b 3 5 1 2 的分子鉴定3 1 4 3v a m 菌剂接种草莓条件的确定31 4 4 土壤微生态调控对草莓连作障碍产生的影响3 2 5 结论3 3 5 1 复合微生态调控剂的筛选3 3 5 2 解酚菌b 3 5 1 2 的分子签定3 3 5 3 菌剂接种草莓条件的筛选3 3 5 4 土壤微生态调控对草莓连作障碍产生的影响3 3 参考文献3 4 附录3 9 在读期间发表的论文4 9 作者简介5 0 j $ 【谢5 1 土壤微生态调控对草莓连作障碍防治效果研究 1 引言 草莓( f r a g a r i a ) 是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，其果实甜美多汁、营养丰 富，富含蛋白质及多种维生素，尤其是维生素c 含量很高，故有“水果牛奶”和“水 果皇后”的美誉n 一1 ，深受全世界消费者的喜爱。草莓在世界小浆果生产中是栽培最 为普遍的，其产量高居世界首位。据中国园艺学会草莓分会统计，2 0 0 7 年中国草莓 总面积约8 6 万h m 2 ，总产量约1 5 0 万t ，栽培面积和总产量均居世界第1 位口3 。 1 1 连作障碍的危害 随着我国经济社会的快速发展及人民生活水平的稳步提高，人们对粮食、水果、 蔬菜等农产品的需求量大幅增加，可目前我国可利用土地面积却日益减少，所以土地 利用率的提高和土地的高度集约化经营已成为当今农业发展的一种必然趋势。随之而 来的是现代农业的高复种指数和单一的作物种类，随着重复栽培年限增加，出现了一 个严重且亟待解决的农业生产瓶颈问题作物连作障碍( 再植病害或重茬病) h 。 连作障碍是长期以来困扰农业生产的复杂问题，尽管土壤病原微生物、化感作用 ( a l l e l o p a t h y ) 、土壤营养元素亏缺等都可以导致连作障碍的发生畸6 1 ，但土壤微生 态失衡是连作障碍发生的根本，这一点为研究者所公认，围绕根系化感物质对土壤微 生态环境影响的研究也日益成为揭示连作障碍机理的热点盯一1 。 连作障碍中的化感作用是一个涉及化学、植物学、生态学、农学等多领域的交叉 学科阳1 。并且化感作用在植物中广泛存在，如：玉米n 们、黄瓜1 、棉花n 2 1 3 1 等。对连作 障碍中化感作用的研究以根系分泌物和残茬腐解物的自毒作用较多。y u 和m a t s u i 研究 发现黄瓜根系分泌物通过抑制黄瓜根系对营养元素的吸收影响自身生长发育u 嘲。黄 瓜连作障碍中的化感作用己被证实是影响植物生长的1 个不利因子，通过对其化感物 质特征及作用机理等方而的研究采取措施可减轻连作障碍叼。阎飞、韩丽梅等认为大 豆残株腐解产生的有毒物质、根系分泌物中的异黄酮类物质以及土壤微生物产生的一 些代谢物质都会对植株生长产生抑制或毒害作用。 草莓连作障碍主要表现为草莓生长发育不良、根部病害日趋严重、产量和品质急 剧下降n h 。草莓在同一田块上连作2 年一般减产1 0 - 1 5 ，连作3 年减产2 0 一2 5 ， 连作4 年以上减产4 0 以上，严重者甚至绝收乜删。草莓连作障碍是现今制约草莓生 产的主要因素。 1 2 连作障碍发生的原因 1 9 3 9 年k l v u s 总结归纳了作物连作障碍的五大因子学说。以后的研究也普遍认 为产生连作障碍的原因可归纳为以下五个方面：即土传真菌病害加重、线虫增多、化 感作用、作物对土壤营养元素片面吸收和土壤理化性状的变劣。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 1 土传真菌性病害和线虫增多 随保护地作物种植年限的增加，土壤有害病原菌的种类和数量都明显增加。而线 虫、病原真菌等有害微生物大量繁殖还使土壤微生物区系组成发生很大变化，土壤无 机养分和微生物的自然平衡遭到破坏。 1 2 2 根系土壤中发生的化感自毒作用 化感作用是指由植物或微生物释放到环境中的化学物质而对其它植物或微生物 的生长发育所产生的有利或不利的作用【2 5 。2 7 】。自毒现象( a u t o t o x i c i t y ) ，又称自毒作用， 是化感作用的重要形式之一，它是指植物根分泌和残茬降解所释放出的次生代谢物， 对自身或种内其它植物产生危害的一种现象【2 8 - 3 0 l 。根系分泌物和腐解物中的酚酸是被 广泛认可的重要自毒物质，y o u n g 等利用循环收集装置收集石刁柏根系分泌物，鉴 定出3 ，4 对羟基苯甲酸等酚酸类自毒物质，后来从石刁柏根残体中也鉴定出上述物 厨3 l 】。h a m m g 和s t e p h e n s 认为芦笋自毒物质和枯萎病菌的协同作用导致芦笋连作障 碍的严重发生。 连作草莓的根部发生严重病害与其根系分泌物及腐解物与根系产生的化感作用 密切相关，研究表明，酚酸类化合物是植物根系分泌物中主要的毒性物质【3 2 1 ，它们对 草莓植株的生长是有害的，会造成草莓根部土壤微生态环境的恶化，从而对草莓的生 长产生抑制作用。 1 2 3 土壤理化性状的劣变 蔬菜大棚土壤随种植年份的延长，盐分积累增加。在保护地蔬菜种植中由于施肥 过多、温度高、土表不加覆盖条件下，土壤中可溶性盐分随地下水的上升、水逸盐留， 又无雨水冲洗，土表盐分不断累积，从而导致的土壤盐渍化、酸化、土壤板结、地力 下降、线虫及土传病害加重是引起再植病害的主要原因b 引。 1 3 草莓连作障碍的防治 缓解连作障碍的方法主要有三大类：农业防治、化学防治和生物防治。农业防治 主要是针对植物的生长环境，通过改进栽培措施、加施微肥等方法来为作物生长发育 营造更加良好的条件。化学防治是通过农药或消毒剂的施用来防治病虫害，生物防治 的防效较长，不会造成环境污染，安全性较高，且不易产生抗性 3 4 - 3 6 。所以，生物防 治现在已逐渐成为作物连作障碍防治研究的热点。植物病害的生物防治是指通过除人 以外的一种或多种生物来降低病原菌数量或减弱病原的致病活力，从而减少病原菌所 致病害的发生【3 7 ，3 引。 目前用v a m 真菌作为生物防治的一种有效手段来防治多种作物的土传病害越来 越受到人们的关注【3 卅。丛枝菌根真菌对植物具有广泛的侵染性，世界上约9 0 以上 2 土壤微生态调控对草莓连作障碍防治效果研究 的维管植物都可与丛枝菌根真菌形成“菌根”( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a ，简称a m ) t 4 0 1 。 许多植物上v a m 菌根都被证明能促进植物对矿质元素的吸收和利用，改善植物营养 状况，增强植物的抗逆性，提高植物的产量和质量，增加植物经济产量和效益【4 1 4 2 】。 v a m 真菌对植物病害主要是通过降低病原菌的活性从而达到减轻植物病害的效果 1 4 3 舯j 。由于v a m 真菌侵染的是植物的根系，大量试验给明，v a m 菌根能不同程度地 减轻多种作物的土传真菌性病害的危害【4 5 加】。研究发现接种v a m 真菌后陆地棉根系 表面和根围的镰刀菌( f u s a r i u m ) 、丝核菌( r h i z o c t o n i a ) 、轮枝菌( v e r t i c i l l i u m ) 等几种 病原物的发生频率明显降低，证明了v a m 菌根在植物体内对病原物具有侵染竞争和 拮抗作用1 4 。菌剂g l o m u sm o s s e a e 接种韭菜后其叶片面积、株高、鲜重、干重分别 增加1 1 6 、5 5 8 、1 1 9 5 、1 2 8 7 1 4 引。此外，菌根茵对番茄、青椒的增产方面也 有过报导【4 9 】。 郝永娟等1 5 0 在研究a m 真菌对黄瓜生长和枯萎病的影响时发现，a m 菌根能减少 植株根系及根围土中的枯萎病菌的数量，抑制镰刀菌的侵染，降低黄瓜枯萎病的发病 率，在感病品种上的效果尤为明显。朱红惠等【5 l 】利用平板与d g g e 相结合的技术证实， 接种地表球囊霉的番茄根际细菌数量和d n a 总量都高于对照，而对应的青枯细菌的 数量却显著低于对照。a m 菌根通过改变植物根际微生物环境和区系，增加有益微生 物种群数量促进植物生长。g h o r b a n l i 等【5 2 】发现在盐胁迫下，菌根植物体内s o d 酶和 p o d 酶活性比非菌根植物显著提高，因而认为s o d 酶和p o d 酶活性的增加也许是提高 植物耐盐能力的机理之一。 拮抗微生物由于具有不易使病原菌产生耐药性，对人畜安全无毒，不污染环境， 无残留，能保持生态平衡，生产工艺较简单以及不少拮抗微生物同时具有对作物的促 生作用等特点而引起越来越多的关注和重视，在植物病害的生物防治中发挥着重要的 作用。拮抗微生物种类繁多，拮抗型种群数量最多的是放线菌。木霉( t r u c h o d e n n as p p ) 以及细菌中的假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 和芽孢杆菌( b a c i l l u s ) ，对多种土传病原菌具有 拮抗作用。由于芽孢杆菌生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆能力的芽孢，在 产品开发中较非芽抱杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。目前用于植 物病害生物防治的芽孢杆菌主要有b s u b t i l i s 、b b r e v i s ，b c e r e u s ，b p u m i l l u s 和 b p o l y m y x a 。这些具有生防作用的芽孢杆菌对p y t h i u m u l t i m u m 、r h i z o c t o m i as o l a n i ， p h y t o p h t h o r ac i n n a m o m i 等多种病原物及它们引起的病害具有抑制作用或防病效果 p ”。黄亚丽等实验证明木霉t 4 2 发酵液能明显控制草莓土传病害的发生。此外，头 状茎点霉( e h o m ag l o m e r a t a ) ，主要用于防治白粉菌【5 8 】等，存在于自然界中还有许多有 益真菌有待我们发现。利用拮抗微生物对病原菌的抗生作用、营养和空间竞争、重寄 生作用以及微生物诱导植物产生系统抗性等作用，来防治植物病害是植物病害生物防 治的一个最重要的组成部分【5 9 邡】。 自2 0 世纪7 0 年代以来，国外很多学者对植物提取物的抑菌作用进行了积极探 索【6 1 侧，近几年，国内学者也逐渐开始了这方面的研究。佘世望，范青生等1 9 9 7 报 道了6 0 多味中草药对1 9 种常见食品腐败的抑制效果【6 7 1 。郑永权等对苦参提取物的杀 虫和抑菌活性进行了研究，结果表明，苦参提取物在相同浓度下，对供试的7 种真菌 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 和3 种细菌等动植物病原菌，均有明显的抑制作用【6 引。 自2 0 世纪6 0 年代以来，土壤改良剂研究屡见报道。良好的土壤改良剂不仅能增 加土壤养分含量、改善土壤理化性状、促进植物生长发育、提高产量和品质，对土传 病害也有较好的控制作用。在大量研究报道中，多以植物材料( 绿肥植物、植物秸秆 和残体等) 作为土壤改良剂的主体。本实验通过多种防控措施减轻草莓土传病害的发 生，马宝红【6 9 】等实验证明了两种w 真菌g l o m u sm o s s e a 和g l o m u sy e r s i f o r m e 对草 莓黄萎病均有明显的防效。此外，两种v a m 真菌对草莓生长有明显的促进作用，接种 g m o s s e a e 和g v e r s i f o r m e 处理的单株株高、茎粗、根长和地上部鲜重等各项指标均明 显高于对照。张瑜等【7 0 】证实康地3 号生物制剂( 由本实验室和秦皇岛领先科技发展有 限公司联合研发的生物制剂) 的各个不同用量处理都能不同程度地促进草莓植株的生 长发育，并且减少了草莓根部病害的发生。同时，董轶博【_ 7 1 】等从1 5 3 种药用植物材料 中筛选出四种复配药用植物材料t 1 2 、t 1 4 、t 1 5 和f 1 0 ，并最终证实复配药用植物 材料t 1 5 和t 1 2 处理均表现出较好的促进根系生长和抑制病原菌的作用。齐永志【7 2 】 等从土壤中分离纯化得到高效降解生防菌株b 3 5 1 2 ，并通过盆栽试验证实接种降解菌 b 3 5 1 2 可明显提高组培苗根系活力和降低根系细胞膜渗透性，提高组培苗的根长、单 株叶面积，植株高度和植株干重等各项指标，有效缓解了对羟基苯甲酸对草毒生长的 抑制作用。 本实验室己经筛选出对草莓重茬病菌有较强抑菌作用的植物中草药，并已经经 过了大田验证。本研究从生物防治和生态农业方面着手，研究草莓连作障碍的防治办 法。筛选出一种强拮抗作用的生防菌与具有抑菌活性的植物中草药结合方式，以植物 中草药作为固体基质发酵，研制成为微生物菌肥，同时与v a m 菌根化草莓苗相结合， 共同调控土壤微环境，促进植株生长，提高草莓产量，达到有效控制草莓重茬病的目 的。 1 4 研究意义 诸多学者对草莓连作障碍进行了研究，证实连作后土壤微生态环境恶化是草莓 连作障碍发生的根本原因，草莓根系分泌物和残茬腐解物中的酚酸类物质具有自毒作 用，抑制根系生长、降低根系抗病性，而某些特定氨基酸和糖分又为土传病菌的繁殖 提供了丰富营养，最终导致植株生长发育不良，枯萎病、黄萎病、立枯病等土传病害 加重，其中尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h l f s p f r a g a r i a e ) 引起的草莓枯萎病 在中国北方草莓产区最为严重。 尽管土壤中的病原物是草莓连作障碍发生的直接原因，但根系化感物质绝非简单 的辅助因素。连作使草莓根际微生态环境向有利于病原物群体数量增加、根系抗病性 降低的方向转变，根系化感物质的产生应是导致这种转变的核心问题。国内其他研究 者也有此共识【7 3 。7 7 】。在对草莓连作障碍发生机理、连作土壤微生态系统中诸因子互作 关系等研究基础上，本实验通过繁育菌根化的抗( 耐) 病种苗，以v a m 真菌菌种 g l o m u sm o s s e a e 为最优，提高草莓根系活力，从而达到健根抗病的目的；并将草莓根 4 土壤微生态调控对草莓连作障碍防治效果研究 系自毒物质的高效降解菌b 3 5 1 2 与药用植物源土壤添加剂t 1 5 有效结合，可抑制土 壤中病原菌的侵染，达到祛毒抑菌的目的。从而形成基于土壤微生态调控的设施草莓 连作障碍综合防治技术，研究成果不仅可为草莓连作障碍的有效控制提供技术支撑， 还可丰富作物连作障碍防治理论，为控制其他作物连作障碍提供借鉴。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 材料与方法 2 1 供试材料 2 1 1 供试六种药用植物材料或组合 青皮、枳实、山柰、姜黄、z 1 ( 青皮+ 山柰+ 枳实) 、z 2 ( 姜黄+ 山柰+ 枳实) 购自 保定市南市区医药公司。 2 1 2 供试有益菌 b 3 5 1 2 烟酸芽孢杆菌，对草莓根系分泌的自毒物质对羟基苯甲酸具有降解作用， 由河北农业大学植病生态学研究室筛选得到；v a m 菌根真菌，购自北京市农科院。 2 1 3 供试草莓品种 丰香( t o y o n o k a ) 。 2 1 4 土壤样品 土壤样品于草莓定植9 月起每月1 5 日取样，采用五点取样法采集草莓土壤，用 直径为4 c m 的土钻钻取草莓5 1 0 c m 的根围土。 2 1 5 主要试剂 对羟基苯甲酸( p a ) 和苯甲酸( b a ) ，s c r c 国药集团化学试剂有限公司生产的分析 纯；甲醇、乙睛，天津协和公司色谱纯；乙酸钠，广州化学试剂分析纯。 2 2 试验方法 2 2 1 复合微生态调控剂的筛选 2 2 1 1b 3 5 1 2 菌落生长的测定 将6 种复合微生态调控剂主体材料或组合与蒸馏水按质量( 干重) ：体积= 1 ：1 混合，1 2 1 高压灭菌l h 。用接种针取一环b 3 5 1 2 菌株接种于盛有1 0 0 m l 无菌液体 l b 培养基( o i m p 灭菌2 0 m i n ) 的2 5 0 m l 摇瓶中，3 0 。c ，2 0 0 r p m ，摇床上振荡培养2 4 h 。 以5 * , ( v w ) 接种量接入发酵培养基内，置生化培养箱中3 0 c 培养9 6 h 后，取1 9 基质 6 土壤微生态调控对草莓连作障碍防治效果研究 加入到9 9 9 无菌水中，1 2 0 r p m ，2 8 下摇床振荡3 0 m i n ，静置1 0 m i n ，通过血球计数 法测不同处理活菌数，绘制菌落增长曲线图并计算增殖率。 2 2 1 2 复合微生态调控剂主体材料的筛选 将发酵液在8 0 0 0 r p m ，2 5 下离心10 m i n ，取上清液，无菌条件下，依次用o 4 5 i im 和o 2 2 “m 孔径的无菌滤膜过滤除去上清液中的细菌，得无菌滤液备用对病原 菌菌丝生长的抑制作用，通过菌丝生长速率法【7 8 , 7 9 测定。取l m l 无菌滤液与9 m l 冷 却至4 5 的p d a 培养基迅速混匀，待冷却凝固后，在每个培养基中心接入1 个病原菌 菌饼，长有菌丝的一面朝下，用无菌水作对照，重复3 次2 8 培养3 d 5 d ，十字交叉法测 量菌落扩展直径，计算抑制率。 计算公式为：抑制率( ) = ( 对照菌落生长直径处理菌落生长直径) 对照菌落生长 直径x 1 0 0 。 2 2 1 3b 3 5 1 2 与药用植物材料固体发酵条件优化 固体发酵培养基配方的优化本试验采用3 因素3 水平正交设计( 见表1 ) 优化培 养基比例，筛选适宜培养基配方。同样以5 ( v w ) 接种量接种到固体发酵培养基内， 充分搅拌均匀，各三角瓶中厚度一致，约l c m ；置生化培养箱中3 0 c 培养4 8 h ：期间 翻料叩瓶两次，取样测定活菌数( c f u g ) 。 表l 培养基成分水平设置 t a b l e1s e tt h el e v e lo f m e d i u mc o m p o s i t i o n 固体发酵培养条件的优化分别检测出不同的接种量( 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 ) ， 初始含水量( 5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0 ) ，培养时间( 2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 h ) ， 培养温度( 2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 c ) ，起始p h 值( 5 、6 、7 、8 、9 ) ，对菌株b 3 5 1 2 生长量的影响。