（农药学专业论文）阿维菌素高产菌株的选育.pdf

华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 摘要 阿维菌素( a v e r m e c t i n s ) 是由阿维链霉菌( s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ) 发酵产生的是一 组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素，在医药、农业和畜牧业生产中有良好的应用， 并且具有广阔的市场前景。本文对工业生产阿维菌素的阿维链霉菌菌株进行了基因 工程改造研究。 o r f x , a v e r ，a f s r ，a f s q l q 2 是链霉菌中发现的四个正调控基因。本试验将上述4 个正调控基因通过接合转移法导入到阿维菌素工业生产菌株z 1 中，检测其对阿维菌 素产生的影响。试验结果表明d 瓣因有明显促进作用，阿维菌素产量提高了约3 0 ； a v e r 基因作用不十分明显；a f s r 和a f s q l q 2 基因使产素水平明显降低。 本试验进行了工业阿维链霉菌原生质体制备研究。试验结果显示阿维链霉菌原 生质体制备的最佳条件为：2 5 0 m i 三角瓶装有3 5 m l 含0 5 甘氨酸的y e m e 培养基， 孢子悬液接种，2 8 ，2 0 0 r m i n 培养4 0 h ；3 0 0 0 r m i n 收集菌丝体，用1 0 3 蔗糖溶 液清洗2 次；溶菌酶浓度为4 m g m l 的p 缓冲液悬浮菌丝体，3 0 c 下处理5 0 m i n 完成 原生质体制备。5 0 p e g l 0 0 0 做促融剂，原生质体融合率最高。利用o l m 菌株( a p r r ) 和z 1 菌株( s p c r ) 进行连续融合发现，经过连续5 轮融合，融合效率可达4 1 6 ， 并达到稳定。 以四株不同产量和来源的阿维链霉菌作为出发菌株，通过过五轮基因组重排处 理，比较发现，随着基因组重排的深入，重组群体中高效价菌株的比率例在逐步提 高。五轮基因组重排后得到了2 株高产菌株，菌株f 5 6 4 和f 5 1 7 0 ，其效价分别达 到3 3 2 2u g m l 和3 3 2 8u g 1 1 1 l 。 关键词：阿维链霉菌；阿维菌素；d 孵调控基因；a v e r 调控基因；a f s r 调控 基因，a f s q l ，a f s 妒调控基因；基因组重排技术 本课题由武汉天惠生物工程有限责任公司资助 阿维菌素高产菌株的选育 a b s t r a c t a v e r m e c t i n s ，as e r i e so f16 一m e m b e r e dm a c r o c y c l i cl a c t o n e sw i t hp o t e n ta n t h e l m i n t i c a n di n s e c t i c i d a la c t i v i t y , w e r ep r o d u c e dt h r o u g hf e r m e n t a t i o no fs t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s t h e ya r et h em o s te f f e c t i v ea g r i c u l t u r a lp e s t i c i d e sa n da n t i p a r a s i t i ca g e n t s ，a n du s e d w i d e l yi nm e d i c a l , v e t e r i n a r ya n da g r i c u l t u r a l f i e l d s t h i sp a p e rh a ds t u d i e dt h e o p t i m i z a t i o n 电nt h ei n d u s t r i a ls t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i ss t r a i nb yg e n e t i cm o d i f i c a t i o n o r f x , a v e r ，a y s r ，a f s q l ，a f s 0 2w e r ef o u rp o s k i v er e g u l a t o r yg e n e sd i s c o v e r e di nt h e g e n o m eo fs t r e p t o m y c e s t h ef o u rr e g u l a t o rg e n e sw e r ei n t r o d u c e di n t os t r e p t o m y c e s a v e r m i t i l i si n d u s t r i a ls t r a i nz1t h r o u g hc o n j u g a lt r a n s f e ra n da n a l y z e dt h ea v e r m e c t i n s y i e l do fr e c o m b i n a t i o ns t r a i n s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ea v e r m e c t i n sy i e l di ns t r a i nz 1 i n c r e a s e db y30 a f t e rt h er e g u l a t o r yg e n eo r f xt h ea v e rs h o w e dl i t t l ee f f e c t t h ea f s r a n da j 奎q l q 2g e n e sd e c r e a s e dt h ea v e r r n e c t i n sp r o d u c t i o ni ns t r a i nz 1 t h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n df u s i o no ft h ei n d u s t r i a ls t r e p t o m y c e sa v e v m i t i l i sw e r e s t u d i e di nt h i sp a p e r r e s u l t ss h o w e dt h a tc o n d i t i o n sf o rp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o nf o r s t r e p t o m y c e sa v e r m t i t l i sw e r ef o l l o w i n g t h e3 5m l y e m e m e d i a ( p l u s0 5 g l y c i n e ) i n 2 5 0 m lf l a s ki n o c u l a t e dw i t hs p o r es u s p e n s i o na n di n c u b a t e da t2 8 cf o r4 0 ho nar o t a r y s h a k e ra t2 0 0 r p m m y c e l i aw e r ep e l l e t t e dt h r o u g hc e n t r i f u g a t i o na t30 0 0 9a n dw a s h e d w i t h10 3 s u c r o s e m y c e l i aw e r er e s u s p e n d e dw i t hp b u f f e r ( c o n t a i n4 m g m ll y s o z y m e ) a n di n c u b a t e da t3 2 cf o r5 0 m i nt or e l e a s e p r o t o p l a s t 5 0 p e g l0 0 0w a ss u i t f o r p r o t o p l a s tf u s i o n t h es t r a i no l m ( w i t ha p r a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ，印力a n dz1 - s p c ( w i t h s p e e t r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ，s p c ) w e r eu s e df o rr e c u r s i v ef u s i o n a f t e rf i v er o u n d r e c u r s i v ef u s i o n , t h ef u s i o nr a t er e a c h e d41 6 a n dt h es y s t e mw e r es t a b l e f o u rs t r a i n so fs t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s , a si n i t i a ls t r a i n sw i t hd e f e r e n ty i e l da n d s o u r c e ，w e r eu s e df o rf i v er o u n dr e c u r s i v eg e n o m es h u f f l i n g t h er a t i o so fs t r a i n sw i t h h i g ha v e r m e c t i np r o d u c t i o ni n c r e a s ew i t ht h ef u r t h e rs h u f f l i n g t h r o u g ht h ef i v er o u n d r e c u r s i v eg e n o m es h u f f l i n g ，t w oh i g hy i e l ds t r a i n sf 5 6 4a n df 5 - 17 0 w e r es e l e c t e d t h e a v e r m e c t i nb l at i t r e sw e r e3 3 2 2u g m la n d3 3 2 8u g m lr e s p e c t i v e l y n 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ；a v e r m e c t i n s ；o r j x g e n e ；a v e rg e n e ；咖r g e n e ；a f s q l q 2g e n e ；g e n o m es h u f f l i n g i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：撇时间： 年月 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：张旋 、 导师签名：专幸厉夕专 签名日期：年 月日 签名日期：一矿年岁月二罗日 ? 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 1前言 1 1 阿维链霉菌简介 链霉菌是一种具有分枝状菌丝体结构的好氧革兰氏阳性土壤细菌，属于原核生 物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。其g + c 含量高达 7 0 8 0 ，是迄今为止自然界中已知g + c 含量最高的一类生物。1 9 7 5 年，日本 北里研究所( k i t a s a t oi n s i t u t e ) 从日本静冈县伊东市河奈( k a w a n a ) 地区一个土壤样品中 分离得到一株链霉菌。当时就发现该菌株的发酵液有很高的驱肠道寄生虫活性，即 使浓缩8 倍也没有发现毒性。美国默克公司( m e r c k ) 的进一步实验和分类鉴定结果证 明，它是链霉菌属的一个新种，定名为s t r e p t o m y c e sa v e r m i t l l i s ，原始菌株编号为 a - 4 6 8 0 。后来该驱虫活性物被鉴定为是一族结构相似的1 6 元环大环内脂类化合物， 含有8 个结构相似的组分，分别编号为a l a ，a 2 a ，a l b ，a 2 b ，b l a ，b 2 a ，b i b 和 b 2 b ( 图1 1 ) ，其中a l a ，a 2 a ，b l a ，b 2 a 是大量组分，占总含量的8 0 以上；a l b ， a l b ，b l b ，b 2 b 是四个少量组分，占总含量的2 0 以下。2 0 0 1 年研究人员完成了阿 维链霉菌m a 4 6 8 0 的全基因组序列分析( o m u r ae ta i ，2 0 0 i ；i k e d ae ta i ，2 0 0 3 ) ，序列 分析覆盖了全基因的9 9 ，获得大量完整、系统的遗传信息和研究数据。 阿维菌素类药物作用机制最初的解释为：丫氨基丁酸( g a b a ) 作为调节运动神经 系统活性的一种神经递质，当神经冲动到达神经末梢时，神经末梢的细胞膜释放出 g a b a ，作用于次级神经元细胞膜或效应器细胞膜，产生抑制效应，完成神经冲动的 传递过程。阿维菌素及其类似物进入靶标生物体后，表现为对g a b a 的激动作用，使 神经末梢大量释放g a b a ，并能促进g a b a 与次级神经元细胞膜或效应器细胞膜的结 合，产生长时间、高强度的抑制效应，使寄生虫麻痹死亡，达到杀虫效果( 朱蓓蕾 和李俊锁，2 0 0 0 ) 。但是后来研究发现，在较低浓度时，阿维菌素类药物( a v m ) 可引起与g a b a 系统无关的c r 通道开放，其活性主要是a v m 能发生立体选择性地反 应，调节谷氨酸控$ i j c r 通道，带负电荷的氯离子大量流入细胞内，使膜电位保持在 超极化状态，膜难以去极化。在线虫和节肢动物体内存在谷氨酸的神经递质，a v m 能发生立体选择性反应，调节特异性谷氨酸调控c i 通道和g a b a 敏感的c i 通道，细 胞不能兴奋，致使神经传导受阻，最终引起虫体麻痹死亡。c a m p b e l l 和s h o o p 等研究 阿维菌素高产菌株的选育 表明，由于在绦虫体内缺少受谷氨酸控制的c r 通道和抑制性神经递质g a b a ，所以 a v m 对绦虫无效。另外，至今尚未发现在哺乳动物体内存在受谷氨酸控制的c r 通道， 并且哺乳动物以g a b a 介导的神经位于中枢系统，a v m 不易通过血脑屏障进入中枢 神经系统，由此可推知，a v m 对哺乳动物应是比较安全的。 h t t v e r m t c t i na la a v e r m e c t i na i b a v e r m e c f i na 2 a a v e r m e c f i na 2 b a v e r m e c d nb l a a v e m 砌b j b a v c r m c c f i nb 2 a a v e r m e c d nb 2 b x y c h = , c h c h - c h c h 2 c h ( o h ) c h 2 c h ( o h ) c h = c h c h = c - i c h 2 - c h ( o ；- d c h 2 - c h ( o h ) 图1 1 阿维菌素化学结构式 f i g 1 1 s t r u c t u r eo fa v e r m e c t i n s 注：本图摘自中国农业大学王晓芳硕士论文 1 2 阿维菌素的生物合成 通过渗入同位素标记前体、鉴定生物合成阻断突变株代谢关键中间体、生物合 成阻断突变菌株或野生型菌株对中间体的转化试验，结合体外测定与阿维菌素生物 合成有关的酶实验，阿维菌素的生物合成途径已基本阐明( i k e d aa n do m u r a ，1 9 9 3 ； i k e d a e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，生物合成基因族( 图1 2 ) 已被克隆和测序，大部分基因的功能已经 确定( m a e n e i l e ta 1 ，1 9 9 3 ；i k e d ae ta 1 1 9 9 9 ) 。现在研究人员对阿维菌素的生物合成途 径及控制每一步反应的基因( 如图1 3 ) 已经有了大致了解。阿维菌素的生物合成可分 为3 个阶段： ( 1 ) 首先在阿维菌素聚酮合酶( a v e s ) 的作用下形成起始糖苷配基6 ，8 a - 闭联一6 ，8 a - 脱氧一5 一氧阿维菌素糖苷配基( 6 ，8 a s e c o - 6 ，8 a - d e o x y 一5 - o x o a v e r m e c t i na g l y c o n s ) ； ( 2 ) 起始糖苷配基经过一系列的修饰产生阿维菌素糖苷配基； ( 3 ) 阿维菌素糖苷配基由脱氧胸苷二磷酸( d t d p ) 齐墩果糖在c 一1 3 和c 一4 位进行 o 一糖基化形成阿维菌素。 2 心戡r：；|n：耋 c 0 e c r m m m m h h h h 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 o2 03 0 4 05 06 07 0 8 0 k b b 8 m h l l lliiiilili lillii i li - i ii ii i ii i i 一 c 令- i - _ _ 车j _ - - _ - - _ - 一毒0 椎 1 神e a 2 | “_ _ c = = 参_ a v e ra v c fa v e d i 啪 _ c = = a v c ca v e e 4 - c - - 日- - 脚 扫- 扣- 谨 栅砌l 砌埘哪r 图1 2 阿维菌素生物合成基因簇 f i g 1 2g e n ec l u s t e rf o ra v e r m e c t i nb i o s y n t h e s i s 曩a ，- c _ - _ - 0 - - 竹_ o _ - _ _ _ a 脚l t a f f i a e 枷y 4 - n 一r 2 lc = j 。r c = 令i 乍怅。吖凡斑 述呐凝 l 车= 一e j i 图1 3 阿维菌素生物合成流程图 f i g 1 3p r o p o s e db i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fa v e r m e c t i n 阿维菌素高产菌株的选育 1 。2 1 同位素标记前体的掺入 通过在阿维菌素合成过程中掺入同位素标记前体的研究表明( 见图1 4 ) ：阿维菌 素的聚酮骨架由七个乙酸盐，五个丙酸盐和一个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成。 阿维菌素a 组分中的2 - 甲基丁酸基( c 一2 5 - c 2 8 ) 和“b ”组分中的异丁酰基( c 一2 5 - c 一2 7 ) 分别由l 异亮氨酸和l 氨酸衍生而成。l 异亮氨酸和l 氨酸通过脱氨、转氨和脱羧 作用形成支链脂肪酸( o m u r a e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。齐墩果糖由葡萄糖分子直接转化而来( i k e d a e ta 1 ，1 9 8 8 ；s c h u l m a ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。s c h u l m a n 等的研究表明，齐墩果双糖是先甲基 化然后再连接到糖苷配基上最终形成阿维菌素的( s c h u l m a ne ta 1 ，1 9 8 7 ) 。阿维菌素中 与大环内酯c 5 和双糖中的c 3 ，和c 3 ”相连的三个甲氧基，均来源于甲硫氨酸上 的甲基( s c h u l m a ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 o c i 一一。嘲呐一帆 “意mc c h 翻a 删口h 嗣叩h p r e f 翻o 矗刚峨 t r t s t , 图1 4 阿维菌素起始单元的生物合成途径 f i g 1 4b i o s y n t h e t i cp a t h w a y so fs t a r t e ru n i t so fa v e r m e c t i n 注：本图摘自中国农业大学王晓芳硕士论文 1 2 2 阿维菌素聚酮体的生物合成 阿维菌素的起始糖苷配基是通过在起始单位( 2 甲基丁酸或异丁酸) 上按 p a - a - a a ppa - p a - p a ( p 代表丙酸盐，a 代表乙酸盐) 的顺序添加1 2 个延伸单位 缩合而成，整个过程由聚酮合酶催化完成。阿维菌素的生物合成基因簇全长8 2 k b ， 共有1 8 个开放阅读框架( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。基因簇内部的6 0 k b 片段含有4 个大的开 放阅读框架，因转录方向相反被分成两组：a v e a l a v e a 2 和a v e a 3 a v e a 4 ，它们分别 4 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 编码4 个多功能蛋白a v e s la v e s 2 和a v e s 3 ，a v e s 4 ，共同组成阿维菌素聚酮合酶。 该聚酮合酶由1 2 个模块组成，共有5 5 个活性位点。模块1 ，4 ，5 和1 0 中的酶域相同， 都由k s ，a t ，k r 和a c p 组成；模块3 和1 1 中只有k s ，a t ，a c p 模块2 ，6 ，7 ，8 ，9 和 1 2 中除k s ，a t ，k t la c p 外，还有d h 结构域，但模块7 中的d h 和模块1 0k r 是 没有活性的。模块2 中的d h 在脱水酶共有的活性位点h x x x g x x x x p 有一个错配的 氨基酸( p 突变为s ) ，似乎只有部分活性( 孙宇晖和邓子新，2 0 0 1 ；i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ； 2 0 0 1 ) 。在所有的模块中都没有e r 结构域，这与阿维菌素糖苷配基中没有完全饱和 的b 碳链是对应的。在a v e s l 的n 端有一个底物加载域( l o a d i n gm o d u l e ) ，包括 两个活性位点a t 和a c p ，在a v e s 4 的c 端有一个硫酯酶( t e ) 域。每个模块负责 一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及p 酮基的还原，最后所形成的聚酮在t e 的作用下从p k s 上释放出来成环内酯化。参与阿维菌素生物合成的有关基因及其推 测功能见表1 1 。 1 2 3 起始糖苷配基的修饰 起始糖苷配基合成后要经过一系列的修饰才能形成阿维菌素糖昔配基，包括呋 哺环的闭合，c 一5 位酮基的还原和甲基化。c 6 和c 一8 a 间呋喃环的闭合是在c 8 a 的 烯丙基甲基上引入氧原子后形成的( p a n gc ta 1 ，1 9 9 5 ) ，该过程由a v e e 编码的细胞色素 p 4 5 0 羟化酶催化完成( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。a v e e 和a v e c 基因位于a v e a l a r e a 2 和 a r e a 3 a v e a 4 基因之间。a v e c 基因突变株仅产阿维菌素2 组分( c 2 2 ，2 3 位为 c i - 1 2 c h o h ) ( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 a ) ，但a v e c 的氨基酸序列与p k s 或f a s 中的脱水酶 的氨基酸序列之间没有同源性，a v e c 的功能目前仍不清楚。 c 5 位的酮基还原成羟基是由a v e f 编码的c 5 酮基还原酶催化的，a v e f 突变产 生c 5 o 邛可维菌素( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 b ) 。紧邻a v e f 上游的a v e d 编码c 5 o 甲基转移 酶，该基因负责将s 腺苷甲硫氨酸的甲基转移到阿维菌素“b ”组分的c 5 位羟基上而 形成阿维菌素a ”组分( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。a v e f 与a v e d 的转录方向一致，可能属 干同一个转录单位( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 b ) 。 阿维菌素高产菌株的选育 褒t l阿堆蓝素生物含戚基因嫠中o r 如舯推潮功麓 墒因产物氮基峻效屡搭因豹功能斌功能预测 g c 肿p r o d u c t n u m b e ro f , a , a p r o p o s e dt l ，n c t i o uo fs e q u e n c es i n t h a f i t i e sd e t e c l e d 尚，e s l3 。9 5 3p i c s l o a d i n g d o m a i na t ( m s )腑 m o d u l el 璐御) x ra c p m o d u l e 2k s 属嗽)胛k ri 虻p a v e s 26 - 2 3 9p x s m o d u l e 3 x s 艇隧 ) a c p module幸ks期m)kr a c p m o d u l e sk sat(a)kra 口 m o d u l e 6k s鳓d hl 漾 i 四 a v e s 35 , 5 3 2p k s m o d u l e 7 k s鳓d h 。k r 口 m o d u k 8k s删d h双a c e m o d u i 。9站椰) d hl 漾a c p a v l 3 s 4 4 。8 8 1 p k s m o d u l e1 0k sat(a)kracp m o d u l e1 1k s a t c p ) a c p b t o o e l e1 2 k s a t c a ) d h k ra c pt e o r f i2 3 8 还原簿? ( 与阿维菌素合成无关) a v e b l4 1 2 糖基转移酶 a v e b l l 3 5 5 们：d p - 葡萄穗4 , 6 - 脱水酶 触棚i i2 9 9o 一胁碡譬塘- 1 磷酸臆苷转移酶 a v o b i v3 4 3 删p 4 酮辱脱氯山已糖4 还原酶 a v c b v2 2 5 d 1 d p 4 酮舌聪瓴己疆3 5 麓l 赶舅构酶 一a , e b v l4 6 9 d t d p - 4 酮舌聪钒o 己糖2 , 3 - 脱水酶 知曲h2 5 7 d t d p 6 脱氧山已糖3 - 凸甲蓦转移酶 v e b v i i i3 4 7 d t d p - 4 酮舌聪氧山已糖z , 3 - 还原簿 a v e c3 4 7 a v e d2 8 3 c 5 o 甲罄转移酶 a v e e4 5 6 细胞色素p 4 5 0 经化酶 知e f3 陀c 5 喇基还原醴 a v c r9 4 9 正调控蛋白 注t 斜体和袭示嬲只有韶分话性l 表示酶域无活性# h t ( m b ) 衰示负爨2 - 甲基丁酸戚跫丁酸翦体掺入的 醌基转移酶la t ( p ) 表示负责两酸前体掺入韵酰基转移酶；a t ( ) 袭幂煎责乙酸翦体掺入的殴基转移熏 注：本摘自中国农业大学王晓芳硕士论文 1 2 4 齐墩果糖的生物合成和连接 负责合成齐墩果糖和转移的基因( a v e b i - a v e b v ) 位于阿维菌素生物合成基因簇 6 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 的右侧( 图1 - 6 ) 。图1 - 5 是w o h l e r t 等人提出的齐墩果糖生物合成途径( w o h i e r te ta l ， 2 0 0 1 ) 。葡萄糖一l 一磷酸在a v e b i i i 和a v e b i l 的作用下首先形成t d p 一4 一酮一6 一脱氧葡萄糖 然后在d w b i v 一w b v i i i 的催化下合成d t d p l 一齐墩果糖，最后由a v e b l 编码的糖基 转移酶将d t d p 一齐墩果糖连接到阿维菌素糖昔配基的c 一1 3 和c - 4 + 位上形成阿维菌素 ( g 淑君1 9 9 7 ) 。 二：量三：= = ：薹三= ：王兰三= = ：= 二羔釜兰：三= 图5 阿维菌素p k s 结构域及其产物的推测 f i g 1 5 p r e d i c t e dd o m a i ns t r u c t u r ea n dp r o d u c t so f t h ea v e r m e c f f np k s 室产晦f 壹f 【警_ 丸i h 一一l ，一 篓，竺冷尹竺淹p 竖声l 图1 6l 齐墩果糖的生物合成途径 f i g 1 6p r o p o s e dp a t h w a y sf o r t h eb i o s y n t h e s i so f l o l e a n d r o s e 阿维菌素高产菌株的选育 1 3 阿维菌素的衍生物 a v e r m i t i l i s 产生的阿维菌素8 个组分中只有b 1 组分的杀虫活性最高，毒性最 小，被作为杀虫剂在农业和畜牧业中广泛使用。为了提高活性、扩大抗虫谱和降低 毒性，研究人员对阿维菌素进行了诱变、生物转化和化学修饰等一系列的改造。经 过多年努力，研究人员已经取得了可喜的进展，得到许多衍生物，如伊维菌素 ( i v e r m e c t i n ) 、多拉菌素( d o r a m e c t i n ) 、埃玛菌素( e m a m e c t i n ) 、埃伯利诺菌素 ( e p r i n o m e c t i n ) 、塞拉菌素( s e l a m e c t i n ) 和结构类似物米尔贝霉素( m i l b e m y c i n s ) 、尼玛 霉素( n e m a d e c t i n ) ( 2 e 道全1 9 9 4 ：李友顺1 9 9 9 ) 。 1 3 1 伊维菌素 1 9 8 1 年m e r k 公司开发了伊维菌素( i v m ) 。i v m 作为动物抗寄生虫药首先在法国上 市，之后i v m 迅速成为使用最广泛的抗寄生虫药，也是目前使用最为广泛的阿维菌 素类药物( 马承铸，2 0 0 0 ) 。到1 9 9 7 年，i v m 在9 0 多个国家注册的制剂己达2 3 种，适应 于多种动物在不同情况下使用。与阿维菌素相比，伊维菌素的杀虫活性基本不变， 但对哺乳动物的机体组织有更强的渗透性和安全性，持效期更长，特别适用于一般 口服驱虫剂难以到达的肌肉、器官和特殊组织中的寄生虫防治。伊维菌素在治疗盘 尾丝虫病等人体线虫感染时疗效明显。依维菌素由于双键加氢还原成饱和状态后， 具有较强的稳定性和抗氧化能力，因而药效更加可靠。同时，依维菌素的毒性只有 阿维菌素b l 的一半左右。2 0 0 3 年伊维菌素被注册用于人圆线虫病的治疗，在日本伊 维菌素将被批准作为控制老人疥疮突发症的药物。 m r o z i k 己确立了从阿维菌素b 2 a 通过化学方法产生c 2 2 c 2 3 脱氢b l a 最1 伊维菌素 b l a 的方法，因此阿维菌素b 2 a 单组分产生菌被认为是工业化产生伊维菌素b l a 的最有 效的方法。i k e d a 等利用体内体外两种突变方法得蛰 b 2 a 单一组分产生菌。体内突变法 是用n t g 处理上述构建的k 2 0 3 8 ，分离到单一组分的b 2 a 产生菌，但产量低。体外突 变法是由于阿维菌素的生物合成完整的基因簇己被克隆，参与c 2 2 2 3 脱氢的基因 ( a v e c ) 被确定为4 8 2 b p b a m h i 片段。在菌株k 2 0 3 8 染色体上含有a v e c 区左边克隆了一 个经p c r 反应错配的一段序列，再通过基因移位技术在染色体相应的区域产生了移 位或颠换突变，从而得到了只产生阿维菌素b 2 a 的菌株。 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 1 3 2 多拉菌素 ， 1 9 9 3 年美国辉瑞公司( p f i z e r ) 公司利用阿维链霉菌突变生物合成开发出多拉菌素 ( d o r a m e c t i n ，d o r ) 。多拉菌素是新大环内脂类抗生素阿维菌素的第三代衍生物，即 在c 2 5 位连接上环已基，即得到2 5 环己基5 一o 脱甲基2 5 脱( 1 甲基丙酸) 阿维菌素 b l ( 图1 7 ) 。它与伊维菌素的驱虫机制相同，多拉菌素与伊维菌素类产品比较，其抗 寄生虫范围更广泛、效果更好，而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目前世 界上效果最好、最有开发潜力的兽用抗寄生虫新药。国外报道多拉菌素对牛，马， 猪和骆驼的多种胃肠道线虫、体外节肢动物具有极佳的驱虫效果。 科学家们在研究多拉菌素的制各过程中发现，通过直接在阿维菌素产生菌的发 酵生产工艺中添加某些特定的羧酸或其衍生物的方法，就有可能获得与阿维菌素有 关的新化合物，现已探明，这些新化合物具有较高的杀寄生虫活性从这些化合物出 发，可以采用传统的化学结构改造反应更进一步地制备其衍生物。对c 4 ”位的改造研 究较多，其成功的衍生物也比较多。虽然有些阿维菌素类药物在防治寄生虫方面发 挥了巨大的作用，但是由于这些药物在奶中残留量高，因而禁止用于哺乳期动物。 鉴于此，1 9 9 4 1 9 9 6 年，m e r c k 公司从6 0 多种a v m 结构改造产物中，根据药物的临 床疗效、药代动力学特征和药物的奶血分配特性筛选出一种新的阿维菌素类药物埃 玛菌素，其通用名为甲胺基阿维菌素苯甲酸盐。有关阿维菌素类药物的研究越来越 受到人们的重视。尽管在对其衍生物的研究上取得了很大成功，但目前对其构效的 研究依然停留在定性的探讨上，还远未达到利用定量表达基团的活性参数来指导其 结构的改造。 9 阿维菌素高产菌株的选育 d o r a m e c t i n ? q 岣c p 图1 7 多拉菌素化学结构式 f i g 1 7 s t r u c t u r eo fd o r a m e c t i n 本图摘自中国农业大学王晓芳硕士论文 1 3 3 埃玛菌素和埃伯利诺菌素 通过对阿维菌素4 ”o h 的改造，分别开发了4 ”脱氧4 ”表甲氨酸阿维菌素 b 1 ( e m a m e c t i n ) 和4 ”一脱氧一4 ”一表一乙酰氨酸阿维菌素b 1 ( e p r i n o m e c t i n ) 。 e m a m e c t i n ( 图1 8 ) 的苯甲酸盐是已知的最有效的鳞翅目杀虫齐l j ( f i s h e r ，1 9 9 3 ) 。 e p r i n o m e c t i n ( 图1 8 ) 则是另一个具有高效、广谱杀虫活性的化合物，其特点是乳中残 留量较低( p a y n e ，e t a l ，1 9 9 7 ) ，可用于防治包括奶牛在内所有种类牛的寄生虫病。 瓯 h 筘、 r 2 s - s e c b u t y to f1 8 0 弘。刚 i 抽叠靠峙幽： r i = - - n h c h l 印血。哪c t i 联r l l 一 c ：o c 碣 图1 8 埃玛菌素和埃伯利诺菌素结构式 f i g 1 8 s t r u c t u r eo fe m a m e c t i n & e p r i n o m e c t i n 1 0 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 1 3 4 塞拉菌素 目前已商品化的s e l a m e c t i n ( 2 5 环己基2 5 脱( 1 甲基丙酸) 一5 - 脱氧一2 2 ，2 3 一双氢- 5 一 肟基阿维菌素b l 单糖衍生物) 是由d o r a m e c t i n 半合成改造得到的。由于它的高效和 安全性已经被允许用于宠物如猫、狗等的体内外寄生虫防治上。大牧羊犬对伊维菌 素有特异的毒性反应，而s e l a m e c t i n 对大牧羊犬则特别安全有效( b i s h o pe ta 1 ，2 0 0 0 ； b a n k se ta 1 ，2 0 0 0 ；p a c e ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。目前阿维菌素的衍生物中s e l a m e c t i n ( 图1 9 ) 的药效和安全性是最为理想的。 h o h 3 c s e t a me c t t n 7 0 ， h a g t i | 矾 n o h 图1 9 赛拉菌素化学结构式 f i g 1 9 s t r u c t u r eo fs e l a m e c t i n 注：本图摘自马承铸，魏春妹阿维菌素同系物和衍生物上海农业学报 1 3 5 米尔贝霉素和尼玛霉素 目前发现的阿维菌素结构类似物有m i l b e m y c i n s ( t a k i g u c h ie ta 1 ，1 9 8 0 ) 3 1 1 n e r n a d e c t i n ( r u d d e ra 1 ，1 9 8 7 ； c a r t e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。与阿维菌素的结构相比，它们在 c 1 3 位缺少双糖基团，并分别在c 4 a ，c 2 2 ，2 3 和c 2 5 位上有所不同( 结构见图 1 1 0 ) 。m i l b e m y c i n s 是由链霉菌属中的一些菌株产生的一系列在结构上非常类似 的化合物。最早报道的该家族中的化合物组分a l a l o 及p 1 - p 3 是从s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s 的发酵产物中分离得到的( t a k i g u c h ie ta 1 ，1 9 8 0 ) ，截止目前，已从多种 链霉菌的代谢产物中分离到同属m i l b e m y c i n s 的一些新化合物( h o o de ta 1 ，1 9 8 9 ； g e o f f e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。m i l b e m y c i n s 的发现时间要早于阿维菌素，但应用不女n g - i 维菌素 阿维菌素高产菌株的选育 广泛。对m i l b e m y c i n s 的研究主要集中在结构确定和进行结构修饰，以期发现更理想 的具有抗寄生虫活性的半合成抗生素。n e m a d e c t i n 是由s t r e p t o m y c e sc y a n e o g r 括e u s 产生的，其结构与阿维菌素极其相似，对它的研究比较少。根据它们化学结构的相 似性，推测它们的生物合成基因簇结构也具有相似性。 图1 1 0 米尔贝霉素和尼玛霉素化学结构式 f i g 1 1 0 s t r u c t u r eo fm i l b e m y c i n s n e m a d e c t i n 注：本图摘自马承铸，魏春妹阿维菌素同系物和衍生物上海农业学报 1 ，4 阿维菌素代谢调控的研究 链霉菌存在着原核生物中罕见的庞大而复杂的调控网络。在遗传水平，链霉菌 次级代谢调控有三个层次，分别是：途径特异性调控( p a t h w a y - s p e c i f i cr e g u l a t i o n ) 、多 效调控( p l e i o t r o p i cr e g u l a t i o n ) 和全局调控( g l o b a lr e g u l a t i o n ) 。研究次级代谢调控的分子 机制将对利用代谢工程手段得到理想的天然产物和提高其产量具有极大的促进作 用。如可以利用增加正调控基因的表达或抑制负调控基因表达等方法提高终产物的 产量，或通过改造细胞内现存的代谢途径，控制代谢物质流，产生传统途径中的中 间产物或经修饰的终产物。 1 4 1 途径特异性调控 次级代谢产物的生物合成基因常位于同一基因簇中，目前研究较多的是抗生素 生物合成基因簇。在基因簇中常包含一个或多个途径特异性调控基因，它们一般调 控一种抗生素或几种具有某些共同生物合成途径的抗生素的生物合成。这种调控依 赖于细胞生长周期。 1 2 华中农业大学2 0 0 8 硕士论文 阿维链霉菌基因组中存在很多途径特异性调控因子，! z l ：l a v e r ，a v e d ，a v e r l 和 a v e r 2 等。a v e r 位于a v e f 的下游，编码一个途径特异性正调控因子( i k