（植物学专业论文）中国莲超氧化物歧化酶基因msd1的分离与序列分析.pdf

奎妻 主圄垂整氢生堑些垡堕垫圈些婴! 曲坌重生庄型坌堑士出盘生墅芏焦迨查! ! ! ! 中国莲超氧化物歧化酶基因m s d l 的分离与序列分析 专业：植物学 硕二亡生：李文 指导教师：黄上志副教授 摘要 中国莲( n e l u m b on “c i f e r ag a e r t n ) 作为地球幸存的冰期以前的古老植物 之一，它与水杉被称为“中国的两种绝妙植物”。莲种子是经科学鉴定的最长寿 和最耐高温的植物种子。莲种子的抗氧化系统，特别是高度热稳定性的超氧化物 歧化酶，在延长种子寿命和提高种子耐热能力方面发挥重要的作用。 本研究利用s m a r tc d n a 合成技术，首次成功分离中国莲超氧化物歧化 酶的c d n a 。该c d n a 包括7 0 2 b p 的开放读码框，5 端有3 5 个碱基的非编码序 列，3 端有个2 4 8 b p 的非编码序列和2 1 b p 的p o l y ( a ) 尾巴。根据莲超氧化物歧 化酶c d n a 序列设计特异性引物扩增基因组d n a ，该基因约2 5 k b 的基因组d n a 序列已测定。该基因组d n a 片段包含5 个外显子和4 个内含子，其中第一个内 含子和第四个内含子长度分别为7 7 2 b p 和9 2 4 b p ，而第二个内含子和第三个内含 子只有1 0 4 b p 和1 4 2 b p ，内含子中a t 含量非常高( 6 5 ) 。 该基因编码2 3 3 个氨基酸的多肽，使用生物学软件计算得到其分子质量为 2 5 9 2 8 4 5 d a ，等电点为6 5 9 。该多肽和樟树( c i n n a m o m u mc a m p h o r a ( l ) ) f e - - s o d 的同源性非常高，但是，它们与其他植物m n - - s o d 之间的同源性比它 们与其他植物f e - - s o d 之间的同源性更高。预测陔多肽n 末端有2 5 个氨基酸 长的转运肽，其亚细胞定位在线粒体。结果表明，莲超氧化物歧化酶基因编码锰 超氧化物歧化酶，该基因命名为m s d l 。 关键词：中国莲超氧化物歧化酶c d n a 术端快速扩增 聚合酶链式 反应局部相似性基本查询 二具 奎圭 主国董塑氢垡盐些韭堕塞囤丛塑! 盟金壶墨丘! 一 坌堑主出盘生塑生堡垒圭! ! ! ! i s o l a t i o na n d s e q u e n c ea n a l y s i so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s eg e n e m s d lo fn e l u m b o h u c i f e r ag a e r t n m a j o r ：b o t a n y n a m e ：l iw e n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f h u a n gs h a n g z h i a b s t r a c t s a c r e d l o t u s ( n e l u m b o “c i f e r ag a e r t n ) ，a s o n eo ft h eo l d e s t p l a n t s s u r v i v a lf r o mi c ea g e ，w a sr e g a r d e da s “t w ow o n d e r f u lp l a n t s ”i nc h i n a ，t o g e t h e r w i t hm e t a s e q u o i a g l y p t o s t r o b o i d e s l o t u ss e e d sw e r er e c o g n i z e ds c i e n t i f i c a l l ya s t h es e e d sw h i c hh a dt h el o n g e s tl i f e s p a na n dt h eh i g h e s th e a tr e s i s t a n c e ，t h e a n t i o x i d a n t s y s t e m ，e s p e c i a l l yt h e h e a t r e s i s t a n t s u p e r o x i d ed i s m n t a s e ，p l a y e d i m p o r t a n tr o l e si nt h el o n g i v e t ya n d t h et h e r m o t o l e r a n c eo fl o t u ss e e d s ae d n ae n c o d i n gs a c r e dl o t u s s u p e r o x i d e d i s m u t a s ew a s s u c c e s s f u l l y i s o l a t e du s i n gs m a r te d n a s y n t h e s i st e c h n o l o g yf o rt h ef i r s tt i m e t h ee d n a c o n t a i n e da l l o p e nr e a d i n gf r a m eo f7 0 2n u l e o t i d e s f l a n k e d5 b y 3 5b a s e so f n o n e o d i n gs e q u e n c ea n d3 b y2 4 8b a s e so fn o n c o d i n gs e q u e n c ea n da2 1 - b a s e p o l y ( a ) t a i l a c c o d i n g t ot h ee d n a s e q u e n c e ，g e n es p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e d t oa m p l i f yt h eg e n o m i cd n ao ft h eg e n e af r a g m e n to f2 5 k bw a ss e q u e n c e d t h e g e n o m i cd n a f r a g m e n ti n c l u d e df i v ee x o n sa n df o u ri n t r o n s t h ef i r s ti n t r o na n d t h es e c o n do n ew e r e7 7 2b a s e sa n d9 2 4b a s e sr e s p e c t i v e l y ，w h i l et h es e c o n do n e a n dt h et h i r do n ew e r e o n l y 1 0 4b a s e sa n d 1 4 2b a s e s r e s p e c t i v e l y t h e a t p e r c e n t a g eo f t h ei n t r o n sw a sv e r yh i g h ( 6 5 ) ， t h el o t u sg e n ee n c o d e dap e p t i d eo f2 3 3a m i n oa c i d s t h ec a l c u l a t i o n so f b i o s o f i w a r e ss h o w e dt h a ti t sm o l e c u l a r w e i g h t w a s2 5 9 2 8 4 5 d aa n di t s i s o e l e c t r i cp o i n tw a s6 5 9 t h ep e p t i d ea n dc a m p h o rt r e e ( c i n n a m o m u mc a m p h o r a i l 至j 王卫旦。垂整氢垃蝗些坠羹旦坐! ! 的盆基墨壁! - ! 坌堑主出盘堂塑茎焦迨圭 ! 唑! ( l ) ) f e s o ds h a r e da n e x c e p t i o n a l l yh i g hh o m o l o g yb u tt h ed e g r e eo f h o m o l o g yb e t w e e nt h e ma n dt h eo t h e rp l a n tm n - s o dw a sh i g h e rt h a nt h a t b e t w e e nt h e ma n do t h e rp l a n tf e - s o d i tw a sp r e d i c t e dt h a tt h e r ew a sat r a n s i t p e p t i d eo f2 5a m i n oa c i d sa tt h ene n da n dt h ep e p t i d es h o w e dm i t o c h o n d r i a l s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e l o t u s g e n e e n c o d e da m n s o da n di tw a sn a m e dm s d 7 k e y w o r d s ：s a c r e dl o t u s ( n e l u m b on u c i f e m g a e r t n ) ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，r a p i d a m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，b a s i cl o c a la l i g n m e n t s e a r c ht 0 0 1 生圭 主固堇整氢坐堑些也堕塾固些! 丛监金宴生丘到盒堑主虹盘茔墅兰焦迨圭! q 她 a b a b l a s t b p c u c 1 a b d t t d m s o d n t p d s c d n a e b f e z n k b k d a m n n b t p c r p a r r a c e r a p d s o d s sc d n a p p b t r i s u v 缩略语表 a b s c i s i ca c i d b a s i cl o c a l a l i g n m e n ts e a r c h t o o l b a s e p a i r c o p p e r h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d i t h i o t h r e i t o l d i m e t h y l s u l f o x i d e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d o u b l e s t r a n d c o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d e t h i d i u mb r o m i d e i r o n z i n c k i l o b a s e p a i r s k i i o d a l t o n m a n g a n e s e n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n p h o t o s y n t h e t i c a l l ya c t i v er a d i a t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a s u p e r o x i d e d i s m u t a s e s i n g l e s t r a n dc o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d p a r t sp e rb i l l i o n t r i s ( h y d r o x y m e t b y l ) 一a m i n o m e t h a a n e a l t r a v i o l e t 1 v 脱落酸 局部相似性基本查询工具 碱基对 铜 十六烷基三甲基溴化铵 二硫苏糖醇 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 双链互补d n a 溴化乙锭 铁 锌 千碱基对 千道尔顿 锰 氮蓝四哗 聚合酶链式反应 光合有效辐射 c d n a 术端快速扩增 随机扩增多态性d n a 超氧化物歧化酶 单链互补d n a 十亿分之一 三( 羟甲基) 氨基甲烷 紫外光 李文 中国莲超氧化物歧化酶基因m s d i 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文 2 0 0 4 i 前言 生物体中的超氧化物阴离子是氧代谢过程产生的中间产物，它既是阴离子又是自 由基，具有极高的氧化势能，很容易夺取它邻近的核酸、氨基酸、蛋白质、类脂等的 电子，使这些物质变性和丧失功能，它还能衍生为毒性更强的羟自由基伤害机体。超 氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；e c ，1 1 5 1 1 ；简称s o d ) 是细胞抵御活性氧攻击 的第一道防线，它催化超氧物阴离子自由基歧化为基态的分子氧和过氧化氢。自从 m c c o r d 和f r i d o v i c h 1 发现s o d 以来，越来越来多的研究表明，生物体的衰老、病 变、辐射伤害等与氧自由基的形成有关，s o d 是已知唯一能消除超氧物阴离子的细胞 保护酶，它在真核细胞防御逆境胁迫过程中发挥重要的作用，而植物由于其自身的特 点比其他真核生物更容易遭受氧胁迫的危害。因此，植物超氧化物歧化酶及其基因的 研究受到广泛的关注，成为当今植物发育与分子生物学的研究热点之一。 1 1 植物超氧化物歧化酶及其基因的研究进展 1 1 1 超氧化物歧化酶 1 1 1 1 超氧化物歧化酶的分类与分布 植物超氧化物歧化酶是广泛分布于所有植物体内的一类金属酶。根据其辅助因子 即金属离子可分为三类：c u z n s o d ，m n s o d ，f e - s o d 。一般说来，c u z n - s o d 分 布在细胞质和叶绿体中，m n s o d 分布在线粒体基质中，而f e - s o d 分布在叶绿体 中【2 。上述3 类酶对氰化物和过氧化氢的敏感性不同，c u z n - s o d 对过氧化氢和氰 化物都敏感，而m n s o d 则对两者均不敏感，f e s o d 只对过氧化氢敏感【3 。这些特 性已作为鉴别不同类型s o d 的标准。不过，k a m i n a k a 等【4 在水稻( o r y z a s a t i v a l ) 中发现一种特殊的f e s o d ，其活性不被过氧化氢抑制。 c u z n s o d 是最重要的一种同工酶，几乎在所有的植物中均存在，m n - s o d 分 布在绝大多数植物中，但f e s o d 只在少数植物中检测到。s u s a n 等 5 】对维管植物中 李文中固莲起氟化物歧化酶基因, q s d l 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文2 0 0 4 f e s o d 的分布状况进行了研究，发现银杏科( g i n k g o a c e a e ) ，睡莲科( n y m p h a c e a e ) 和 十字花科( c r u c i f e r a e ) 植物中存在这种s o d 。黄上志等 6 通过s o d 活性电泳检测到 中国莲胚及其子叶中有m n s o d 和f e s o d ，而没有检测到c u z n s o d 。不过， u s h i m a r u 等 7 】通过活性电泳和w e s t e r nb l o t 在去离子水中萌发得到的莲( n e l u m b o n u c i r e r 6 g a e r t n ) 幼苗中检测到c u z n - s o d 和f e s o d ，而没有检测到m n s o d 。这 可能是因为湖泊底部的含氧量相当低，铜主要以不溶的硫化铜存在，水生植物不像陆 生植物一样能够稳定的吸收利用铜( 7 。睡莲科植物王莲中没有c u z n s o d ，却有 m n s o d 和f e s o d s 。吴国荣等对部分植物药超氧化歧化酶活性进行分析，研究结 果表明枸杞、宁夏枸杞、沙参和合子草具有f e s o d 9 1 】。有趣的是，c h e n 等【9 】从 樟树种子里分离了f e ，s o d 及其基因。该基因连接到载体p m f t 7 - 5 中后在大肠杆菌 菌株b l 2 1 表达，发现表达的蛋白与f e 2 + 或m n “结合均有相同的酶活力。进一步研究 表明，从蛋白质一级结构来看，该f e 。s o d 与植物的m n s o d 相似性更高，但是它结 合的金属离子以及它的紫外吸收光谱和可见光光谱与f e s o d 更为相似，可见该 f e s o d 是一种“兼性s o d ”( c o m b i a l i s t i cs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) ，该类酶在植物中 尚属首次发现。 植物m n s o d 与线粒体密切相关，它由核基因编码，在细胞质中合成蛋白质前体， 蛋白质前体在线粒体前导肽作用f 运输到线粒体内发挥功能【1 0 。c u z n - s o d 主要位 于植物细胞质和叶绿体 1 1 ，叶绿体c u z n s o d 在细胞内运输的情况与m n s o d 类似， 是在叶绿体前导肽的引导下进行。o g a w a 等【1 2 采用免疫组织化学和免疫电子显微镜 技术首次发现菠菜叶肉细胞的细胞核存在c u z n s o d 。f e s o d 一般存在叶绿体中， 但是豇豆根瘤中有- 4 中f e s o d 定位在细胞质中 1 3 。此外，乙醛酸循环体和过氧化 物酶体中也存在s o d 1 4 。 1 1 1 2s o d 的结构特点 从已经纯化的c u z n s o d 看，除了从人肺提纯的酶分子质量为1 3 5 k d a ，并具有4 个亚基外【1 5 】，其他物种的c u z n s o d 酶分子质量为3 1 - 3 3 k d a ，由两个亚基组成。 菠菜叶【1 6 】和绿豆【1 7 】中的c u z n s o d 的分子质量分别为3 2 2 k d a 和3 1 5k d a 。每个 s o d 亚基或其单体酶都古有一个铜原予和一个锌原子。植物c u z n - s o d 的二聚体由 两个相同的亚基组成，其亚基分子质量为1 5 1 7k d a 。m n - s o d 分子量与c u z n - s o d 李文中国莲超氧化物歧化酶基因m s d l 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文 20 0 4 不同，如四聚体的大鼠肝m n s o d 分子质量为8 9 k d a 1 8 ，而二聚体的红藻m n s o d 分子质量为4 0 k d a 9 2 。从亚基分子质量来看，m n s o d 多肽链大于c u z n s o d 。在 真核生物中，除红藻中提纯的m n s o d 为二聚体外，其他均为四聚体。f e s o d 的分 子质量和m n s o d 相似，其亚基分子质量大于c u z n s o d 。包括所有已经纯化的植 物f e s o d 在内，绝大多数f e s o d 为二聚体，如从织线藻提取的f e s o d 分子包含 两个亚基 2 0 。从萍蓬草( n u p h a rl u t e u ml ) 叶片中分离的f e s o d 分子质量为4 6 k d a ， 由两个同样大小的亚基组成，该蛋白的抗体与油菜( b r a s s i c ac a m p e s t r i s ) 的f e s o d 以及藻类的提取物没有抗原一抗体之间的交叉反应【8 。 不同来源的c u z n s o d 一级结构均显示明显的进化保守性和高度序列一致性。 此外，氨基酸序列同源性还表现在以下三个方面。第一、在金属辅基c u 与z n 相连接 的氨基酸残基和参与肽链内部二硫键形成部位附近氨基酸残基都相同：第二、在c 末 端有一个序列一致性很高的区域，其中精氨酸残基是此类同工酶活性的关键部位之 一；第三、甘氨酸含量相当高，约占总数的六分之一，而且均匀地分布在整个序列中， 甘氨酸的存在与蛋白质肽键折叠有关 2 1 。不同来源的同种s o d 同工酶之间具有很高 的相似性，每一种s o d 同工酶的氨基酸序列具有特定的保守序列，用软件c l u s t a l v 对不同来源的m n s o d 和f e s o d 的氨基酸序列进行分析后，发现不同来源的 m n s o d ，序列的一致性都超过7 0 ，不同来源的f e s o d 的序列一致性约为6 0 2 2 】。 m n - s o d 和f e s o d 的氨基酸序列以及结构；# 常相似【2 3 】，m n s o d 和f e s o d 的氨 基酸序列的相似性约为5 0 ，可能他们的起源是相同的，当然植物中的f e s o d 并不 是简单的将m n s o d 的金属辅助因子替换后得到的 2 4 。两类同工酶的氨基酸序列长 度不同，平均长度为2 3 0 个氨基酸。其中f e s o d 中连续5 个氨基酸在m n s o d 中没 有，这是两者在一级结构的主要区别。另外，矮牵牛属( 尸e t u n i a ) 的f e - - s o d 的氨基 酸序列中有一个长为1 5 个氨基酸的插入片段 2 2 1 。非细菌来源的f e s o d 具有以下共 同特征：第1 2 4 1 2 8 位残基依次为a l a - a l a a l a t h r g i n ；第1 8 7 1 9 4 位氨基酸残基依 次为g i n a s n - a r g - a r g - p r o a s p t y r i l e ；c 末端有一段a l a - a l a x a a - a l a 的特征序列 【2 4 。植物c u z n s o d 的c 末端氨基酸序列比n 末端的氨基酸序列更为保守，其 m n s o d 也是如此 2 2 1 。 植物体内。定位在细胞器中的s o d 的前体一般在n 末端有一段转运肽，指导s o d 进入相应的细胞器中，而定位在细胞质中的s o d 则没有 2 5 】。桃( p r u n u sp e r s i c al 李文 中国莲超氧化物歧化酶基因m s d l 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文 2 0 0 4 b a t s c h ) m n - s o d 多肽链在n 末端的2 4 个氨基酸大部分由疏水氨基酸组成，其中有5 个带正电荷的氨基酸残基，没有酸性氨基酸残基，这些都是将蛋白定向输送到线粒体 的转运肽的特点 2 6 t 。小麦中不同的m n - s o d 都有非常保守的转运肽，其c u z n s o d 的情况也是如此 2 7 1 。 从高级结构来看，c u z n s o d 的多肽经折叠、盘曲的二缴结构表现在c 【一螺旋占 的比例撮小，反平行的b 一折叠占的比例最高，其他为无定形卷曲环。在二级结构的 基础上，c u z n s o d 多肽链进步盘曲成特定格式的三级结构，两条多肽链通过次级 键缔合成为四级结构。m n s o d 的二级结构不同于c u z n s o d ，它的0 【一螺旋为4 5 - - 6 1 ，b 一折叠仅为2 7 - - 3 4 ，f e - - s o d 二级结构类似m n s o d 2 8 1 。m n s o d 和f e s o d 的整个结构比较紧凑，在空间结构上与c u z n s o d 有明显的不同。后者 由于c 【一螺旋所占比例很小，反平行的b 一折叠所占比例很高，其结构比较松散 2 h 。 1 1 2 超氧化物歧化酶基因 1 1 2 1s o d 基因的克隆 植物s o d 基因克隆策略主要采用功能克隆和表型克隆，如c a m p 等 2 4 利用缺 乏s o d 的大肠杆菌突变体建立了一种分离真核细胞s o d 基因的表型选择系统。自从 第一个植物s o d 基因从玉米中克隆以后 3 0 1 ，植物s o d 基因的克隆在国外进展迅速。 科研工作者主要从一些经济作物中得到基因的e d n a 序列或表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g s ，e s t ) 。f e s o d 基因也从水稻( o r y z as a t i v a l ) 、鼠耳芥似r a b i d o p s & t h a l i a n a ) 、大豆( g t y c i n em a x ) 、白花丹叶烟草( n i c o t i a n ap l u m b a g i n i f o l i a ) 和樟树 ( c i n n a m o m u m c a m p h o r a ) 等高等植物中得到克隆 4 ；9 ；2 4 ；3 l 】。 1 1 2 2s o d 基因的表达与调控 i i 2 2 is o d 基因表达的组织特异性 植物基因一般是根据自身生理活动的需要按一定的时间和空间顺序进行表达，植 物s o d 基因也是如此。水稻f e s o d 基因在幼苗的茎、黄化幼苗以及胚性愈伤组织 中优势表达，而在叶片和根中表达水平很低【4 】。r n a 印迹杂交表明玉米m n s o d 多 基因家族中每个成员的表达具有时空特异性，其中s o d 3 2 、s o d 33 和s o d 3 4 基因在玉 米中表达具有组织特异性；s o d 3 ，转录产物在所有的组织中存在，但是它在种子吸胀 李文中国莲超氧化物歧化酶基因m s d i 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文2 0 0 4 4 天后盾片中含量最高。在植株生长发育过程中m n s o d 转录产物积累模式与线粒体 活力有关 3 2 1 。 b a g n o l i 等 2 6 对桃树m n - s o d i 基因在不同组织以及不同发育时期的表达情况进 行研究。该基因在完全展开的桃叶中表达水平比营养繁殖时期的顶端枝条中要高，在 叶片中的表达水平比茎中要高，而在未抽蕾的芽中和正在发育的果实( 直径为3 c m ) 中该基因的表达水平是一致的。编码m n - s o d 的m r n a 在次生枝条的顶端比在初生 枝条的顶端要丰富，在两类枝条上的小叶片和完全展开的叶片中含量没有太大的差 别，不过，初生枝条上中等大小的叶片和大叶片完全展开后该基因的表达量最高。 1 1 2 2 2 基因表达的诱导 环境，特别是逆境，对植物s o d 基因的表达有不同程度的影响。k l i e b e n s t e i n 等 3 3 研究了不同胁迫因子对七种拟南芥s o d 基因( 包括编码c u z n s o d 的基因c s d l 、 c s d 2 和c s d 3 ，编码m n s o d 的m s d l ，编码f e s o d 的f s d 、f s d 2 和f s d 3 ) 表达 的影响进行了系统的研究。其中只有f s d l m r n a 的表达出现昼夜的周期性变化，它 在中午的时候表达量最大。植株在6 0 至1 2 5 u m o lm _ 2s 叫p a r 光照条件下培养时， c s d l 和c s d 2 m r n a 的表达量随光照强度的增大稳定地增加，光照强度继续增大时 其表达水平不再提高：植株在光强为6 0u m o lm - zs 叫p a r 的光照下培养时 f s d l m r n a 的积累最多：而c s d 3 m r n a 当植株在5 0 0u m o lm - 2s 1p a r 的光照下培 养时表达量最大；，2 和m s d i 的表达不受测试光照强度的影响。用1 7 5 0u m o lm 一 2s _ 1 p a r 的强光照射两周龄的拟南芥植株4 小时，c s d 3 m r n a 水平在处理两个小时 后迅速提高；c s d 2 表达的m r n a 缓慢地增加；f s d 2 表达的m r n a 只在处理1 2 小 时后急剧增加；f s d l 只受光周期的影响，不受强光刺激的影响：c s d l 和m s d l 的 表达水平基本保持不变。用3 3 0 p p b 的臭氧熏蒸8 小时后放置在不含臭氧的环境中让 其恢复，c s d l m r n a 的表达受到臭氧的刺激后增加，甚至在恢复初期继续增加，直 至开始熏蒸后2 4 小时才开始下降；而c s d 3 对臭氧熏蒸的发应较慢，在开始熏蒸后 2 4 小时表达水平增加：f s d l m r n a 水平在熏蒸4 小时后下降，熏蒸后4 8 7 2 小时后 回复到熏蒸前的水平，c s d 2 的表达情况与之类似；f s d 2 和m s d l 的表达不受臭氧的 影响。将两周龄的拟南芥植株放在强烈的紫外线u v - b 下照射3 天，c s d l m r n a 表 达量在紫外线处理一天后开始上升，2 天后达到最大；f s d 2 m r n a 表达量在2 4 小时 孛丈 中国莲超氧化物歧化酶基因 l s l l l 的分离与序列分析中山戈学硕士学位论文 2 0 0 4 内增加，此后又略有下降：c s d 2 、f s d i 和m s d l m r n a 的表达水平与未处理的对照 一致。 a b a 和高渗同时作用能诱导玉米m n s o d 基因勋卯的表达；a b a 单独作用能 诱导玉米野生型和玉米a b a 合成缺陷突变体( v p s ) 勋邪基因的表达；而高渗只能 诱导野生型玉米黝棚基因的表达，不能诱导玉米a b a 合成缺陷突变体( v p 5 ) s o d 3 基因的表达，这说明a b a 介导高渗对s o d 3 基因的表达调控 3 4 1 。玉米中结构上非常 相似的两个c u z n 。s o d 基因s o d 4 和s o d 4 a 在胚胎发育以及种子萌发过程中对a b a 产生不同的反应。尽管& 谢和s o d 4 a 的转录产物均在胚胎发育后期积累，但是a b a 和高渗处理只诱导前者的表达，a b a 能提高玉米a b a 合成缺陷突变体( v p l ) 中的 勋以转录水平，a b a 处理4 小时后，发育胚、成熟胚以及嫩叶中勋出的转录产物增 加，而s o d 4 a 的转录产物只在嫩叶中增加，但是，单独高渗处理不能改变两者的表达 水平，可能a b a 和高渗胁迫通过两条不同的途径调节勋幽和s o d 4 a 的转录 3 5 1 。 w u 等【2 7 】研究了干旱胁迫和冷害条件下小麦m n s o d 基因和c u z n - s o d 基因 的表达情况。在干早胁迫过程中，m n s o d m r n a 的表达量逐渐上升，处理6 天后达 到最大；重新给水后，春小麦中表达水平下降，而冬小麦维持不变。干旱胁迫并不诱 导小麦c u z n s o d 基因的表达，但是重新给水后c u z n s o d m r n a 的表达量增加3 - 4 倍。将三叶期的小麦在2 。c 的低温下培养后，m n s o d 和c u z n s o d 基因的转录水平 都上升。由于光合作用过程中产生超氧化物自由基，可能s o d 基因的表达与光合作 用的速率有一定的关系。但是t s a n g 等【3 6 】发现冷害条件下白花丹叶烟草m n s o d 和 c u z n s o d 基因表达不受影响，但是当植株重新放置在最适温度下培养时，其表达水 平提高5 一l o 倍。光诱导水稻f e s o d 基因表达，黄化幼苗恢复光照6 0 分钟后， f e s o d m r n a 的表达水平明显j ：升，4 小时后达到最大，2 4 小时后下降，与光照下 培养的幼苗的表达水平接近【4 。同样，光照诱导玉米幼苗勋以的表达 3 7 】。d i d i e r 等【2 9 】将白花丹叶烟草c u z n s o dc y l 基因的启动子与p 一葡糖醛酸酶报告基因融合，得 到转基因的原生质体，发现用还原性的谷胱甘肽( 1 0 u m 0 1 ) 、l - 半胱氨酸( 1 0 0 u m 0 1 ) 、 二硫苏糖醇( 1 0 u m 0 1 ) 和n 乙酰l 半胱氨酸均能使原生质体中p 一葡糖醛酸酶的活性 明显提高，而甲硫氨酸和丝氨酸却没有这个作用，尽管它们与l 半胱氨酸的结构非常 相似，只是没有巯基。可见，只有抗氧化的巯基试剂爿能诱导c u z n - s o d 聊基因表 达。 6 李文中国莲超氧化物歧化酶基因m s d l 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文 20 0 4 u s h i m a r u 等 3 8 通过w e s t e r nb l o t 检测了暗处培养的水稻幼苗中s o d 蛋白的含 量，发现氧气诱导p l s o d ( 定位在质体) 和c y t s o d ( 定位在细胞质) 的表达，而抑 制m t s o d ( 定位在线粒体) 的表达。他们还研究了光和氧气对莲不同s o d 表达的影 响，发现光诱导p l c u z n s o d 和p l f e s o d 的表达，光和氧气浓度过高都能抑制 c y t c u z n - s o da 和b 的表达 3 9 。 1 1 2 3s o d 基因功能研究 到目前为止，不同类型的s o d 基因已经被转化到多种植物中，实验结果表明 s o d 在转基因植株中的过量表达能不同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力。 m n s o d 基因的过量表达在一定程度上提高了转基因植物对氧胁迫的耐受性。b o w l e r 等 4 0 将叶绿体特异的前导序列取代m n s o d 基因的线粒体前导序列，然后将此 m n s o d 融合基因转到烟草中，结果表明m n s o d 在叶绿体前导肽作用下进入叶绿 体内并行使其功能，这种转基因烟草能够抵抗除草剂引起的氧胁迫。 m c k e r s i e 等【1 9 将烟草的m n s o dc d n a 转入苜蓿使其在线粒体中过量表达， 得到的转基因植株总s o d 酶活性为对照植株的2 倍，提高了冷害耐受性和下一年的 产量。m c k e r s i e 等【4 1 】对获得的转基因苜蓿进行田间试验，进一步证明了先前的实验 结果。m n s o d 在烟草和玉米叶绿体中的过量表达增强了转基因烟草和玉米对质膜和 光系统i i 的保护作用和对除草剂引起的氧胁迫的耐受1 陛 4 0 ；4 2 ；4 3 】，f e - s o d 在烟草 和玉米叶绿体中的过量表达，也产生类似效果，但它们对冷害和盐胁迫的耐受性并没 有提高 4 4 ；4 5 。玉米m n s o d 基因( s o d 3 j ) 在缺乏m n s o d 的酵母突变体中表达 使转化的酵母细胞重新获得抗氧胁迫的能力 4 6 。转基因烟草的叶绿体中过量表达 c u z n s o d 能提高它在中等胁迫下的光合作用速率以及在严重的氧伤害后恢复光合 作用的能力【4 7 】。将豌豆c u z n s o d 基因嵌入烟草基因组中，豌豆叶绿体c u z n s o d 基因转入烟草得到的转基因植株s o d 活性提高了3 倍，抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 活性同时提高了3 4 倍，转基因烟草在低温或强光照射的条件下能维持较高水平的 光合作用，对除草剂引起的氧胁迫的耐受性增强 4 7 ；4 8 】。目前普遍认为，虽然s o d 基因的过量表达在一定程度上提高了转基因植物对氧胁迫的耐受性，但这种抗逆性的 提高很有限。 李文中国莲超氧化物歧化酶基因m s d l 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文2 0 0 4 i i 3 问题与展望 植物抗氧化系统的调节机制非常复杂，尽管科学家就环境与抗氧化基因表达的关 系开展了大量的研究，但是对于环境信号如何转变为细胞内信号并最终引起相关基因 的表达水平发生改变等问题人们知之甚少。令人欣慰的是，科学研究工作者对个别植 物，特别是玉米的s o d 基因进行了系统而深入的研究，因此，玉米的s o d 基因系统 可能为研究防御系统重要基因的调控机制以及激素介导的代谢变化与氧胁迫的关系 提供很好的材料 3 s 1 。 此外，人们也在研究s o d 基因的功能并获得抗逆能力较强的转s o d 基因植物。 通过对转基因植物的研究发现，s o d 的过量表达能减轻氧胁迫对细胞的伤害，维持细 胞正常的新陈代谢活动。然而，人们通过进一步的研究发现，s o d 基因表达的增强与 植物抗逆能力的提高并不一定存在正相关。p i t c h e r 等 4 9 将编码矮牵牛叶绿体 c u z n s o d 的基因转入烟草中，该转基因植物过量表达叶绿体s o d ，但是它并没有减 轻奥氧对植株的毒害。这可能是因为细胞中过氧化氢的浓度过高使c u z n - s o d 失活， 而且，过氧化氢本身对细胞有毒害作用，尤其是它能与过氧化物反应产生攻击能力很 强的羟基自由基。越来越多的研究表明，细胞中s o d 的过量表达并不定能降低氧 自由基水平，只有当s o d 和清除过氧化氢的酶( 如过氧化氢酶c a t , 抗坏血酸过氧化 物酶a p x ) 以适当的比例存在细胞中共同作用才能有效减轻氧胁迫对细胞的伤害。 g u p t a 等 4 7 】的研究支持这一观点，他们发现，豌豆编码叶绿体c u z n - s o d 的基因在 烟草中表达的同时，植物体内清除过氧化氢的酶抗坏血酸过氧化酶的表达水平也提 高。更明确支持这一观点的证据来源于果蝇，o r r 等【5 0 】j 哿s o d 基因和c a t 基因转入 果蝇基因组内，获得了过量表达s o d 和c a t 的转基因果蝇，结果显示，在新陈代谢 水平与对照果蝇相同的情况下，转基因果蝇与对照果蝇相比较，平均寿命延长三分之 一。不难设想，抗氧化系统也在延长植物的寿命和提高植物的抗逆能力中发挥重要的 作用，如能利用转基因技术获得种子寿命长、抗逆能力强的新品种，将为解决高温等 恶劣环境中植被覆盖率低等问题提供契机。 1 2 本研究的目的及意义 莲是一种古老的植物，是被子植物中起源最早的物种之一。中国是中国莲 ( ，删6 d 以u c i f e , ag a e r t n ) 的起源地，电是莲的世界分布中心和世界栽培中心【5 l 】。 李文 中国莲超氧化物歧化酶基因m s d i 的分离与序列分析中山大学硕士学位论文 2 0 0 4 莲在我国不但分布广泛，栽培历史悠久，而且资源丰富，品种繁多。它是一种用途甚 广的水生经济植物，它不仅可供食用、药用，莲花还是我国传统十大名花之一，具有 很高的观赏价值。古往今来，我国人民对莲有着特别的感情，儒家文化中莲常喻君 子、女子，发源于印度的佛教更把莲花视为圣洁之物，故莲是一种文化植物，具有重 要的文化价值 5 2 1 。 莲属( n e l u m b oa d a n s ) 是最早的被子植物之一，在被子植物系统演化中占据着 相当独特的地位，研究莲属的系统位置对探讨原始被子植物系统演化及单子叶植物起 源都有重大意义。被子植物的起源问题一直是一个假说众多、悬而未决的“令人讨厌 之谜”，关于现生被子植物的原始类群及其祖先的探讨，从时间上可以划分为三个阶 段：第一阶段是“假花说”( p s e u d a n t h i a lt h e o r y ) 与“真花说”( e u a n t h i a l a n t h o s t r o b i l u s t h e o r y ) 之间的争论；第二阶段是“木本木兰说”( m a g n o l i a l e a nh y p o t h e s i s ) 与“古草本 说”( p a l e o h e r bh y p o t h e s i s ) 之间的争论：在第三阶段，分子系统学提供新的证据使 得众说纷纭的局面到2 0 世纪末有了突破 s 3 。4 个独立的研究小组几乎同时发表了他 们最新的分子系统学研究结果 5 4 ；5 5 ，一个被简称“a n i t a ”的类群组合被认为位于 被子植物系统树的基部，代表了现生被子植物的最原始类群。这些分子系统学家认为， 互叶梅科( a m b o r e l l a c e a e , a ”) 最先从被子植物中分支出来，紧随其后的是睡莲目 ( n y m p h a e a l e s ，n ”) ，然后是被简称为“i t a ”的类群组合，包括八角科( i l l i c i