（内科学专业论文）氧化型低密度脂蛋白对心肌纤维化影响的实验研究.pdf

j i l l i i i f p ii i i i ii i ip i j ii lliii y 17 6 19 0 4 e f f e c to fo x i d i z e dl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n o n m y o c a r d i a lf i b r o s i s ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i t y f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro fm e d i c i n e b ys u j i n g - l i s u p e r v i s e dbysupervlsed p r o f e s s o rg o n gh a i b i n m e d i c a lc o l l a g eo f s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a p r i l 2 0 1 0 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：锄 日 期：3 - , o o 一口如乡 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：荔趟出秒 导 同期：芦扣叫 中文摘要 氧化型低密度脂蛋白对心肌纤维化 影响的实验研究 东南大学医学院 中文摘要 目的探讨氧化型低密度脂蛋白( o x l d l ) 对离体大鼠心肌细胞分泌转化生长因子 1 3 1 ( t g f p 1 ) 和碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 的影响；在体对大鼠血浆中i 型前 胶原羧基端肽( p i c p ) 、t g f b 1 、b f g f 浓度，以及心肌组织中胶原容积分数( c v f ) 的影响，以探讨心肌纤维化( m f ) 的发生机制及o x l d l 在m f 中的作用。 方法研究对象为正常雄性s d 大鼠。 离体实验：分离大鼠心肌细胞后培养，随机分为i f 常组、l d l 组、o n l d l 组；正 常组为空白组，后两组分别于细胞培养液中加入l d l 、o x l d l 与心肌细胞共孵育，分 别于第0 、6 、1 2 、2 4 及4 8 h 收集细胞培养上清液，用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 检测 细胞培养上清液中t g f b 1 和b f g f 的浓度。 在体实验：将大鼠随机分为正常组、l d l 组、o x l d l 组；正常组为空白组，后两 组大鼠以尾静脉注射方式分别给予l d l 、o x l d l ，分别于第l 、7 、1 4 、2 l 及2 8 天采 血、取心肌组织。抗凝离心得到血浆，用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 检测血浆中p 1 c p 、 t g f b 1 及b f g f 浓度；心肌组织做石蜡切片，行m a s s o n 染色，计算胶原容积分数。 结果离体实验：o x l d l 组细胞培养上清液中t g f p l 和b f g f 浓度显著高于正常 组和l d l 组( 尸 o 0 5 ) 。 结论o x l d l 能够刺激离体大鼠心肌细胞分泌t g f d 1 和b f g f ，增加大鼠血浆中 p i c p 浓度，增加心肌胶原容积分数，但对血浆中t g f p 1 及b f g f 浓度无明显影响， o x l d l 可能通过作用于心肌细胞促进了心肌纤维化的进展。 关键词心肌纤维化，低密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白，转化生长因子d l ，碱 性成纤维细胞生长因子，i 型前胶原羧基端肽，胶原容积分数。 英文摘要 e f f e c to fo x i d i z e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n o nm y o c a r d i a lf i b r o s i s m e d i c a lc o l l e g eo f s o u t h e a s tu n i v e r s i t y , n a n j i n g ，210 0 0 9 a b s t r a c t o b i e c t i v et os t u d yt h ee f f e c to fo x i d i z e dl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n ( o x - l d l ) o nr a t m y o c a r d i a lc e l l si n t h es e c r e t i o no ft r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o ri bi ( t g f 一1 31 ) a n db a s i c f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( b f g f ) ，a n dt h ee f f e c to fo x l d lo np l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fp i c p 、 t g f 一1 31 、b f g f 、c o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o ni nr a t t oe x p l o r et h em e c h c n i s mo fm y o c a r d i a l f i b r o s i s ，a n dt h er o l ei nw h i c ho x l d lp l a y s m e t h o d st h es u b j e c t sw e r en o r m a lm a l es dr a t s t h e s em y o c a r d i a lc e l l sw e r ed i v i d e d i n t on o r m a lg r o u p ，l d lg r o u p ，o x l d lg r o u pr a n d o m l y , i n c u b a t e dw i t hn o t h i n g ，l d la n d o x l d li nv i t r or e s p e c t i v e l y ，c o l l e c t ec e l lc u l t u r es u p e m a t a n ta t0 、6 、12 、2 4 、4 8 hr e s p e c t i v e l y t h ec o n c e n t r a t i o n so ft g f 1 31a n db f g fw e r em e a s u r e db ye n z y m e - - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y t h e s er a t sw e r ed i v i d e di n t on o r m a lg r o u p 、l d lg r o u p 、o x l d lg r o u pr a n d o m l y t h e l d l 、o x l d lw e r ei n j e c t e di n t ot h er a t sv i a t h et a i lv e i n 。t h e s er a t sw e r ek i l l e da t1 ，7 ，1 4 ， 2l 、2 8d a y sr e s p e c t i v e l y c a r d i a cm u s c l et i s s u ea n dp l a s m aw e r eo b t a i n e d t h ec o n c e n t r a t i o n s o fp i c p 、t g f - 1 31a n db f g fw e r em e a s u r e db ye n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , t h e c o n t e n to fm y o c a r d i a lc o l l a g e nw a sm e a s u r e db yc o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o n r e s u l t sc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lg r o u pa n dt h el d lg r o u p ，o x - l d li n c r e a s e st h e e x p r e s s i o n so ft g f 一1 3 1a n db f g fi nv i t r o ( 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lg r o u pa n dt h el d lg r o u p ，o x - l d li n c r e a s e st h ep l a s m a c o n c e n t r a t i o n so fp i c pa n dt h ec o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o ni nv i v o ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lg r o u p ， l d lh a sn oe f f c to nt h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fp i c p 、t g f 一1 31 、b f g fa n dt h ec o l l a g e n v o l u m ef r a c t i o n ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o no x l d ls t i m u l a t e st h es e c r e t i o no ft g f 1 31a n db f g ff r o mr a t sm y o c a r d i a l c e l l si nv i t r o ，i n c r e a s e st h ee x p r e s s i o no fp i c pa n dt h ec o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o ni nv i v o ，b u t 英文摘要 h a sn oe f f e c to nt h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o n so ft g f b1a n db f o f , o x - l d lm a yc o n t r i b u t et o t h ep r o g r e s so f m y o c a r d i a lf i b r o s i sb ya c t i n go nt h em y o c a r d i a lc e l l s k e yw o r d sm y o c a r d i a lf i b r o s i s ，l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，o x i d i z e dl o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n ，t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rp 1 ，b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，t y p ei c t e r m i n a l p e p t i d eo fp r o c o l l a g e n ，c o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o n 目录 目录 中文摘要i 英文摘要1 i 目录。 主要缩略词表v 绪论1 文献综述3 材料和方法15 1 材料15 2 方法17 结果一2 6 结论3 8 论文不足之处3 9 参考文献4 0 作者简介4 7 致谢4 8 i v 缩略词 主要缩略词表 缩略语英文全称中文全称 a c - l d l a c e t y l a t e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n乙酰化低密度脂蛋白 a f g fa c i df i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 酸性成纤维细胞生长因子 a m i a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n急性心肌梗死 a n g l ia n g i o t e n s i ni i血管紧张素i i a p o ba p o l i p o p r o t e i nb载脂蛋白b a sa t h e r o s c l e r o s i s 动脉粥样硬化 b c d fb - c e l ld i f f e r e n t i a t i o nf a c t o rb 细胞分化因子 b f g fb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 碱性成纤维细胞生长因子 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 c t g fc o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r 结缔组织生长因子 c t l c y t o t o x i cl y m p h o c y t e细胞毒性t 淋巴细胞 c v f c o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o n胶原容积分数 d g d i a c y l g l y c e r o l甘油二酯 e c me x t r a c e l l u l a rm a t r i x 细胞外基质 e d c f e n d o t h e l i a lc e l l d e r i v e dc o n t r a c t i n g内皮细胞衍生收缩因子 f a c t o r e d r f e n d o t h e l i u md e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r内皮细胞衍生舒张因子 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e g f e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r表皮生长因子 e l i s a e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附法 e t - 1e n d o t h e l i n 一1 内皮素1 f bf i b r o b l a s t 成纤维细胞 f nf i b r o n e c t i n 纤连蛋白 g m c s f g r a n u l o c y t e m a c r o p h a g e 粒一巨噬细胞集落刺激因子 c o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r h c a e c sh u m a nc o r o n a r ya r t e r ye n d o t h e l i a lc e l l s人冠状动脉内皮细胞 h e p e s n 一2 - h y d r o x y e t h y l - p i p e r a z i n e - n - 2 - e t h a n e s u ln 一2 - 羟乙基哌嗪n - 2 - 乙磺酸 f o n i ca c i d v 缩略词 l c a m - li n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e - 1 i f n 一丫i n t e r f e r o n - ) , i gi m m u n o g l o b u l i n l li n t e r l e u k i n l d l l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n l o x - 1l e c t i n - l i k eo x i d i z e dl o w d e n s i t y l i p o p r o t e i nr e c e p t o r m a p k m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m c p 1 m o n o c y t ec h e m o t a c t i cf a c t o r - 1 m c s f m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r m d a m a l o n d i a l d e h y d e m f m y o c a r d i a lf i b r o s i s m h c m a j o rh i s t o c o m p a b i l i t yc o m p l e x m lm i l l i l i t e r m m m i l l i m o l a r m m p sm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e n f r b n u c l e a rf a c t o r - k a p p ab n l d ln a t i v el o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n n k n a t u r a lk i l l e r n o n i t r i co x i d e n o s n i t r i c o x i d es y n t h a s e n t an i 俩l o t r i a c e t i ca c i d o d o p t i c a ld e n s i t y o x - l d l o x i d i z e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n p b m c p e r i p h e r a lb l o o dm o n o u c l e a rc e l l s p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p d g f p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r p g p r o s t a g l a n d i n p i c p t y p eic - t e r m i n a lp e p t i d eo fp r o c o l l a g e n p i i i n p t y p ei i in t e r m i n a lp e p t i d eo f v l 细胞间粘附分子1 卜干扰素 免疫球蛋白 白细胞介素 低密度脂蛋白 凝集素样氧化型低密度脂蛋 白受体一1 促分裂原活化蛋白激酶 单核细胞趋化因子1 巨噬细胞集落刺激因子 丙二醛 心肌纤维化 主要组织相容性( 抗原) 复合物 毫升 毫摩尔 基质金属蛋白酶 核因子一r d 3 天然低密度脂蛋白 自然杀伤细胞 一氧化氮 一氧化氮合酶 氨基三乙酸 吸光度 氧化型低密度脂蛋白 外周血单核细胞 磷酸盐缓冲液 血小板衍生生长因子 前列腺素 i 型前胶原羧基端肽 i l i 型前胶原氨基端肽 缩略词 p r o c o l l a g e n p k c p r o t e i nk i n a s ec 蛋白激酶c p u f a s p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s 不饱和脂肪酸 r a a s r e n i n a n g i o t e n s i n a l d o s t e r o n es y s t e m 肾素- 血管紧张素一醛固酮系统 s m as m o o t hm u s c l ea c t i n平滑肌肌动蛋白 s r a s c a v e n g e rr e c e p t o r 清道夫受体 t b at h i o b a r b i t u r i ca c i d硫代巴比妥酸 t f t i s s u ef a c t o r组织因子 t i m p st i s s u ei n h i b i t o ro f m e t a l l o p r o t e i n a s e s基质金属蛋白酶抑制剂 t g f p lt r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r1 3 1转化生长因子p l t g f p rt r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rpr e c e p t o r转化生长因子1 3 受体 t n ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子 t xt h r o m b o x a n e血栓素 v c a m 一1v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e 1血管细胞粘附分子一1 w h ow o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n世界卫生组织 v i i 绪论 绪论 心血管系鲥1 】由心脏、血管和调节血液循环的神经体液组织构成，其功能是为全身 组织器官运输血液，通过血液将氧、营养物质、激素和酶等供给组织并将组织代谢废物 运走，以保证人体进行正常新陈代谢。心血管疾病包括上述组织器官的疾病，在内科疾 病中属常见病，且较严重。根据世界卫生组织( w h o ) 报告，心血管疾病的死亡人数 自2 0 世纪5 0 年代起已超过了肿瘤、结核、腹泻和肺炎所引起的死亡总和，成为人类“第 一杀手”。其中，以高血压和冠状动脉粥样硬化性心脏病( 冠心病) 最为常见，随着寿 命的延长，上述疾病都会导致心力衰竭，它们都严重危害人类健康。 心肌纤维化( m y o c a r d i a lf i b r o s i s ，m f ) 是指心肌细胞外基质( e c m ) 中胶原纤维过 量积聚、胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变，它是胶原合成代谢和降解代谢失衡的 结果。这种病理变化在高血压、冠心病、心肌病、心包疾病等多种心血管疾病中广泛存 在，现认为其与心律失常、心功能障碍甚至心源性猝死密切相关，引起了人们的广泛关 注。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，长期的压力超负荷、炎症反应、氧化应激等是 其主要原因，细胞凋亡、细胞信号调节等均与其相关，涉及到神经内分泌系统、免疫系 统等。上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁自分泌系统的调控紊乱，导致炎症因子如 t g f p 1 和b f g f 等分泌增加，这些炎症因子在心肌纤维化的发展过程中发挥了重要的 作用。有研究表明t g f b l 能够促进胶原、纤连蛋白( f n ) 和层粘连蛋白等e c m 的合 成，抑制胶原的降解【2 】；促进基质金属蛋白酶抑制剂一1 ( t i m p s 1 ) 的高表达，而抑制基 质金属蛋白酶一1 ( m m p s 1 ) 的活性，从而导致i 、i i i 型胶原比例增耐”】；而b f g f 则 对成纤维细胞( f b ) 有很强的促细胞分裂增殖活性【5 1 ，通过成纤维细胞促进胶原的合成， 上述二者作用于机体，共同促进了心肌纤维化的进展。c u c i n aa 等【6 】研究发现氧化型低 密度脂蛋白能刺激平滑肌细胞分泌b f g f 。氧化型低密度脂蛋白在体内由低密度脂蛋白 经氧自由基氧化而来，它对心血管系统有着广泛影响：在泡沫细胞形成过程中起关键作 用【7 】；诱导单核细胞向内皮细胞的粘附和向内皮下的趋化【8 】；促进巨噬细胞增殖退化； 促进血小板粘附、聚集、血栓形成【9 】；加剧心脏和血管的炎症反应诱导巨噬细胞和平滑 肌细胞产生血小板衍生生长因子( p d g f ) i o 】；促进平滑肌细胞移行、损伤内皮细胞等。 上述研究中研究的是o x l d l 作用于内皮细胞、平滑肌细胞等细胞，o x l d l 能否刺激 心肌细胞分泌b f g f 及t g f b 1 ，目前仍无相关报道。本实验以f 常雄性s d 大鼠为研究 对象，以o x l d l 为实验组，f 常组、l d l 组为对照组，将l d l 、o x l d l 离体与大鼠 心肌细胞共孵育，e l i s a 法检测，t 5 肌细胞培养上清液中t g f b 1 和b f g f 浓度；将l d l 、 东南大学硕。i ：学位论文 o x - l d l 以尾静脉注射方式注入大鼠体内，检测血浆中p i c p 、t g f 1 3 1 和b f g f 的浓度及 心肌组织中胶原容积分数，以探讨o x l d l 在心肌纤维化中的作用及可能的作用机制， 筛选心肌纤维化的危险因素，为预防和治疗心肌纤维化提供理论依据。 2 文献综述 文献综述 心肌纤维化是指胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著高于正常值。其主要的特征 为成纤维细胞数目增多和心肌细胞外问质胶原过度沉积。这种病理变化在高血压、冠心 病、心律失常、心肌病、心包疾病、心力衰竭等多种心血管疾病中普遍存在。心肌纤维 化是一种连续变化的过程，根据有无心肌细胞缺失、坏死和瘢痕形成可分为反应性纤维 化和修复性纤维化，前者根据病变特点又分为间质纤维化和血管周围纤维化，引起心脏 结构重塑，并由此引起舒张、收缩功能不全，最终导致心力衰竭；后者主要表现为心肌 细胞坏死和瘢痕形成，并可有心脏功能的异常。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，长 期的压力超负荷、缺血缺氧、炎症反应、氧化应激等是其主要原因，涉及到神经内分泌 系统、免疫系统等。上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁自分泌系统的调控紊乱，炎 症因子如t g f b 1 和b f g f 分泌增加，二者发挥着重要作用，促进了心肌纤维化的进展。 c u c i n aa 掣6 】研究发现氧化型低密度脂蛋白能刺激平滑肌细胞分泌b f g f 。氧化型低密 度脂蛋白在体内由低密度脂蛋白经氧自由基氧化而来，它对心血管系统有着广泛影响： 在泡沫细胞形成过程中起关键作用【7 l ；诱导单核细胞向内皮细胞的粘附和向内皮下的趋 化【8 】；促进巨噬细胞增殖退化；促进血小板粘附、聚集、血栓形成【9 】；加剧心脏和血管 的炎症反应诱导巨噬细胞和平滑肌细胞产生血小板衍生生长因子( p d g f ) d o ；o x l d l 还通过促进内皮细胞分泌t g f b 1 【1 、诱导细胞问粘附分子1 ( i c a m 1 ) 【1 2 】及单核细胞 趋化因子1 ( m c p 1 ) 的表达【8 1 、诱导平滑肌细胞分泌b f g f 和p d g f 、加剧炎症反应、 促进内皮素一1 ( e t - 1 ) 1 3 】的表达、抑制一氧化氮( n o ) 合成等途径导致血管壁和心肌 间质中胶原合成增加。上述研究中研究的是o x l d l 作用于内皮细胞、平滑肌细胞等细 胞，o x l d l 能否刺激心肌细胞分泌b f g f 及t g f p l ，目前仍无相关报道。随着人口老 龄化的进展，心血管疾病发病率的增高，心肌纤维化愈发引起了人们的重视，对其发生 机制的研究显得更加重要。 一氧化型低密度脂蛋白 氧化型低密度脂蛋白( o x l d l ) 由天然的低密度脂蛋白( l d l ) 经氧化修饰形成， 天然的l d l 核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) ， 约占l d l 总脂肪酸含量的3 5 - 7 0 ，所以容易发，上自身氧化。l d l 中的p u f a s 在自 由基或其他氧化剂作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的过氧化脂质，引起连锁的 自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和载脂蛋白b ( a p o b ) 发生结合，产生新的抗原决定簇，形成氧化l d l 。 奎堕叁堂堡生兰垡笙塞 1 9 7 9 年b r o w n 和g o l d s t e i n h 】发现了乙酰化的l d l ( a c e t y l l d l ) 会经由特异的受 体路径很快地被巨噬细胞吸收，而形成泡沫细胞( f o a mc e l l ) 。他们把这种新发现的受体 暂时命名为乙酰化l d l 受体( a c e t y l l d lr e c e p t o r ) 。1 9 8 1 年h e n r i k s 朗【1 5 】又发现l d l 与培养过的内皮细胞一起培养时，会导致l d l 的另外一种化学修饰( m o d i f i c a t i o no f l d l ) ，这种修饰与乙酰化修饰的l d l 比较，能够更加迅速和大量地被巨噬细胞摄取。随 后几个试验还发现，除内皮细胞外，当l d l 与平滑肌细胞或巨噬细胞等出现于动脉粥 样硬化斑( a s ) 中的细胞一起培养时也会对l d l 产生相同的修饰结果；l d l 与金属离 子如c u 2 + ，f e 2 + 一起培养时也有相同的结果。1 9 8 4 年h c i n e c k c t l 6 1 在细胞培养液中添加氧 化剂使l d l 氧化修饰，其结果证实了l d l 这种化学修饰就是氧化修饰。内皮细胞、平 滑肌细胞或巨噬细胞可以释放氧自由基，使得一起培养的l d l 产生了氧化修饰。随后 又陆续发现，除了o x l d l 外还存在着另外几种l d l 的化学修饰形式，如糖化修饰l d l ( g i y - l d l ) 、糖氧化修饰l d l ( g l y o x l d l ) 、免疫复合物修饰l d l ( l d l c i c ) 等。 但与其它化学修饰的l d l 比较，o x l d l 被s r 摄取的速度最快、数量最多、而且细胞 毒作用最强。 o x l d l 的特点：o x l d l 内维生素e 含量下降，游离氨基减少，琼脂糖电泳速率增 快。氧化时l d l 中所含的大量卵磷脂转变为溶血卵磷脂。氧化修饰程度低时，a p o b 以 分解为主。修饰程度高时，降解的a p o b 又可重新聚合成大分子。o x l d l 还具有一系 列生物学毒性作用。氧化修饰后的l d l 不能经l d l 受体代谢，而由清道夫受体识别、 结合、内吞饮入细胞并丧失j 下常的胆固醇代谢途径，能够引起细胞内脂质沉积，泡沫样 变。 o x l d l 由清道夫受体【1 7 1 识别并进一步代谢。清道夫受体可能是多种受体的总称， 据报道，除乙酰化l d l 的受体外，f c r 受体和c d 3 6 受体也能介导o x l d l 的摄取和降解。 巨噬细胞和内皮细胞对不同氧化程度的l d l 的结合和降解量是不同的。总的来说，随 着氧化修饰程度的升高，巨噬细胞和内皮细胞对l d l 的结合和降解随之升高。研究臣 噬细胞和内皮细胞对这几种不同氧化程度的l d l 的结合和降解，发现当l d l 修饰程度 很低( r f = 1 3 3 ) 时，o x - l d l 被巨噬细胞结合和降解的量接近、甚至低于天然l d l ，而 当修饰程度高时，被巨噬细胞和内皮细胞结合和降解的量随之升高，而且明显高于正常 l d l 。另有报道，j 下常细胞摄取o x l d l 时，l d l 受体与清道夫受体起协同作用。因为 氧化程度不同，o x l d l 的a p o b 上可能残留多少不等的l d l 受体识别位点，用单抗封 闭这些位点时，细胞对o x l d l 结合量和降解量下降。 o x l d l 在体内能起到以下作用：( 1 ) o x l d l 在泡沫细胞形成过程中起核心作用7 1 。 4 又献综述 泡沫细胞的形成是整个动脉粥样硬化进程中最重要的病理学标志，o x l d l 通过巨噬细 胞表面的s r a 而非l d l r 被无限制地摄取，导致巨噬细胞内大量的胆固醇脂质颗粒蓄 积；同时由于o x l d l 本身的细胞毒作用( 主要是l d l 氧化过程中诸多的中问代谢产物 如过氧化脂质、m d a 等所致) ，进一步诱导巨噬细胞凋亡为泡沫细胞，所以o x 。l d l 是 泡沫细胞形成的关键环节。m a f i l e e 、l o u g h e c d 等f j8 】认为o x l d l 能抵抗组蛋白酶，从而 抵抗溶酶体对o x l d l 的降解。脂质在泡沫细胞中沉积的结果使得动脉壁从最初的脂肪 纹发展到更复杂的纤维斑块和粥样斑块。这些斑块最外层富含巨噬细胞来源的泡沫细 胞，易于发生斑块破裂，导致血栓形成。( 2 ) 促进巨噬细胞增殖退化1 1 9 1 。巨噬细胞吞噬 o x l d l 后，由于o x l d l 的细胞毒作用，可以刺激巨噬细胞分泌产生一种特定的巨噬 细胞集落刺激因子( m c s f ) 。m c s f 负责介导巨噬细胞的激活、分泌、增殖、聚集、 退化，并进一步凋亡为泡沫细胞，同时m c s f 还能诱导巨噬细胞表面s r a 的表达，使 o x l d l 摄取增多。( 3 ) 促进血小板粘附、聚集。o x l d l 可以刺激血栓形成组织因子( t f ) 、 血小板衍生生长因子( p d g f ) 、促凝血因子一1 ( p a l 1 ) 的表达，促进血小板粘附、聚集， 形成血栓【9 1 。此外，o x l d l 还可以增强花生四烯酸代谢及血栓素b 2 ( t x b 2 ) 的产生【2 0 】， 减少膜脂流动性。o x l d l 抑制前列腺素1 2 合成酶，使前列腺素1 2 ( p g l 2 ) 合成减少【2 1 1 ， 激活血小板环氧化酶，使血栓素a 2 ( t x a 2 ) 产生增加【2 2 j ，破坏了p g l 2 t x a 2 平衡，促进 血小板聚集，引起血管痉挛和血栓形成。( 4 ) 促进血管收缩。内皮素1 ( e t - 1 ) 、血管 紧张素i i ( a n g i i ) 都是很强作用的缩血管多肽，o x l d l 可以促进血管内皮细胞和平滑 肌细胞分泌释放e t - i t l 3 】和a n g i i 2 3 1 ，而且o x l d l 中的溶血卵磷脂还诱导合成内皮细胞 衍生收缩因子( e d c f ) ，诱使血管收缩。此外o x l d l 还通过抑制内皮细胞衍生舒张因 子( e d r f ) 2 4 】、抑制一氧化氮合酶( n o s ) 减少对内皮具有保护作用的一氧化氮( n o ) 的合成，从而损伤动脉壁j 下常的舒张功能。( 5 ) 产生抗o x l d l 的自身抗体。在兔和人 的血清中都发现了抗o x l d l 的自身抗体，且抗体的滴度和心血管动脉粥样硬化进程密 切相关，表明免疫机制在动脉粥样硬化发病机理中起了作用【2 5 1 。 二转化生长因子p 1 ( t g f p 1 ) 、碱性成纤维细胞因子( b f g f ) 、i 型前 胶原羧基端肽( p i c p ) 1 转化生长因子- p l ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r p 1 ，t g f - p 1 ) t g f p 1 属于一组调i 了细胞生长和分化的t g f p 超家族。这一家族除t g f p 外，还 有活化素( a c t i v i n s ) 、抑制素( i n h i b i n s ) 、缪勒氏管抑制物质( m u l l e r i a ni n h i b i t o rs u b s t a n c e ) 和骨形成蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ) 。t g f b 的命名是根据这种细胞因子能使 东雨入学坝j 二学位论文 正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表皮生长因子( e g f ) 同时存在的条件下，改 变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度依赖的抑制 作用。t g f p 与早先报道的从非洲绿猴肾上皮细胞所分泌的生长抑制因子是同一物质。 t g f 8 1 的分子结构和基因：1 9 8 5 年t g f p 1 的基因克隆成功，并在大肠杆菌内得 到表达。t g f b 1 是由两个结构相同或相近的、分子量为1 2 5 k d a 亚单位借二硫键连接 的双体。人t g f 8 1e d n a 序列研究表明，单体的t g f 一8 11 1 2 个氨基酸残基是由含4 0 0 氨基酸残基的前体分子( p e r - p r o - t g f - p ) 从羧基端裂解而来。p r e - p r o t g f b ln 端含有 一个信号肽，在分泌前被裂解掉，成为非活性状态的多肽链前体( p r o t g f d 1 ) ，通过 改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除n 端部分氨基酸残基，所剩余的羧基端部分形成 有活性的t g f 一8 1 。 人t g f d l 的基因定位于染色体1 9 q 3 ，含有7 个外显子，所编码的前体分子c 端有 9 个保守的c y s ，人和小鼠t g f b l 的同源性高达9 9 ，表明在不同种属中t g f p l 都具 有重要的生物学功能。其人t g f b l 基因调控区进行了研究，发现该基因5 端序列包含 5 个明显的调控区：一个类增强子活性区，二个负调控区和二个启动子区。机体多种细 胞均可分泌非活性状态的t g f p l 。在体外，非活性状态的t g f p 1 通过酸处理可被活化。 在体内，酸性环境可存在于骨折附近和j 下在愈合的伤口。蛋白酶的裂解作用可使t g f 一1 3 1 复合体变为活化t g f p 1 。一般在细胞分化活跃的组织常含有较高水平的t g f p l ，如成 骨细胞、。肾脏、骨髓和胎肝的造血细胞。t g f b 1 在人血小板和哺乳动物骨中含量最高； 活化后t 细胞或b 细胞产生t g f 6 l 水平比静止细胞明显为高。几乎所有肿瘤细胞内均 可检测到t g f p 1m r n a 。神经胶质细胞瘤在体内可分泌较高水平的t g f p 1 。 t g f p 1 的生物学作用：起初对t g f p 1 的生物学功能研究主要在炎症、组织修复 和胚胎发育等方面，近年来发现t g f b l 对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调 节作用。一般来说，t g f p 1 对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层 来源的细胞起抑制作用。( 1 ) 抑制免疫活性细胞的增殖：抑制i l 3 、g m c s f 、m c s f 所诱导小鼠造血前体细胞和l t b m c 的集落形成f 2 6 】，并降低巨核细胞对i l 3 和c s f 的 反应性。抑制丝裂原、同种异体抗原刺激的t 细胞增殖或i l 2 依赖的t 细胞生长【2 7 1 。 ( 2 ) 抑制细胞因子产生：如抑制p b m c 中i f n 吖和t n f a 的产生 2 s 】。( 3 ) 其它调节 作用：促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长。t g f b 1 促进人成纤维细胞 i l 6 的产生，其机理可能足通过对i l 6 基凶转求的调节【2 9 1 。促进细胞外基质( e c m ) 如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制e c m 的降解，对细胞的形态发生、增殖和分化 过程起着重要作用，有利于胚