（内科学专业论文）sall4基因在恶性血液肿瘤中的表达研究.pdf

8 s j0 羔 中文摘要 il i l l l l l lulu li iii i s a l l 4 基因在恶性血液肿瘤中的表达研究1 8 0 18y 摘要 l i l l l 0 6 4 背景：近年来，在治疗血液系统的恶性肿瘤上虽取得很大的进展，但治疗 效果仍不尽人意，多数患者在完全缓解后还会出现复发，并最终死亡。常 规化疗只能杀灭增殖周期的细胞，目前单克隆抗体的靶向治疗研究较多， 然而很多单克隆抗体没有杀伤肿瘤细胞的能力，抗体对肿瘤相关抗原专 一性不强，如果仅针对增殖周期的肿瘤细胞表面标志，或许会取得暂时的 明显临床疗效，但因肿瘤干细胞的存在终会导致疾病复发。因此要根除恶 性血液肿瘤的前提仍然是弄清不同起源细胞的分子标志，直接针对恶性血 液肿瘤干细胞的靶向治疗，从源头上对恶性血液肿瘤进行治疗，可望成为 治愈恶性血液肿瘤的一个新策略。 、 s a l l 4 是一种新发现的含锌指结构的转录因子，是s a l l 基因家族 的成员之一，在胚胎干细胞增殖和胚胎发育中起重要的调控作用。越来越 多的研究表明s a l l 4 基因与细胞死亡、癌症、d n a 复制修复有关。正 由于s a l l 4 致瘤的潜能和维持干细胞的自我更新和多能性等特性，使人 们开始关注它与恶性血液肿瘤发生的关系，从而进一步了解s a l l 4 在血 液肿瘤发病机制中的作用。 目前常用的几种检测目的基因表达的方法有：形态学方法，荧光原位 杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) ，流式细胞仪等，均存在着 检出率较低的弊端，聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c 鼬技术 可以从1 0 5 1 0 6 正常细胞中检测出一个目的细胞，是公认的比较敏感的检 测方法，但传统p c r 技术只能做到定性或半定量检查，不能精确定量。 一种理想的检测方法应具备如下条件：特异性强，敏感度高，重复性好， 快速简便，定量分析。实时荧光定量聚合酶链反应技术( r e a l t i m e f l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r ，f q p c r ) 的出现为解决这一难题提供了新的 思路。 本课题采用f q p c r 方法检测不同恶性血液肿瘤骨髓细胞中s a l l 4 基因的表达，探索s a l l 4 基因是否为恶性血液肿瘤的标记之一。 中文摘要 目的：1 建立实时荧光定量p c r 检测s a l l 4 基因的方法。 2 检测不同类型恶性血液肿瘤患者体内s a l l 4 基因的表达情况。 方法：1 病例病例选自2 0 0 9 年1 月至2 0 0 9 年1 2 月海南省人民医 院住院患者及门诊体检者，共8 8 例( 恶性血液肿瘤患者7 7 例和1 1 例对 照者) ，其中男5 2 例，女3 6 例，年龄1 3 7 7 岁，平均年龄4 5 4 岁。实 验组所有病例经临床及实验室检查确诊，包括：4 6 例原发性白血病患者( 急 性非淋巴细胞白血病2 l 例，急性淋巴细胞白血病1 2 例，慢性粒细胞白血 病1 3 例) 、1 1 例骨髓增生异常综合征患者、1 2 例非霍奇金淋巴瘤患者( t 细胞非霍奇金淋巴瘤4 例，b 细胞非霍奇金淋巴瘤8 例) 、8 例多发性骨 髓瘤患者。1 1 例健康者骨髓标本为实验对照组。 2 实时荧光定量p c r 检测s a l l 4 基因的转录水平。 患者骨髓标本采集和骨髓中单个核细胞提取。 单个核细胞中核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) 提取。 逆转录反应合成互补脱氢核糖核( c o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，e d n a 。) 常规p c r 反应，p c r 产物构建质粒标准品。 实时荧光定量p c r 方法相对定量检测s a l l 4 基因转录水平。 3 统计学分析所有统计计算均用s a s 9 0 统计软件处理。p 0 0 5 认为差别具有统计学意义。 结果：1 s a l l 4 基因在急性非淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血 病、慢性粒细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征中有明显 的过表达，与正常对照组比较有统计学意义( p o 0 5 ) 。 2 正常对照组、急性非淋巴细胞白血病组、急性淋巴细胞白血病组、 慢性粒细胞白血病组、骨髓增生异常综合征组、非霍奇金淋巴瘤组、多发 性骨髓瘤组七组间s a l l 4 基因定量表达的差异有统计学意义( x 2 = 2 7 1 ， p 0 0 1 ) 。 3 多发性骨髓瘤患者和正常对照组的s a l l 4 基因表达水平无显著性 差异p o 0 5 ) 。 结论：1 f q p c r 方法具有敏感性高，特异性强，重复性和稳定性好 等优点，是进行目的基因检测的一种快速简便，定量准确的方法。我们已 成功构建了f q p c r 检测s a l l 4m r n a 表达水平的方法。 用。而s a l l 4 对恶性血液肿瘤预后判断是否有价值有待进一步研究。 3 s a l l 4 有可能成为治疗恶性血液肿瘤的一个潜在的分子靶点。 关键词：s a l l 4 ；基因表达；恶性血液肿瘤；实时荧光定量p c r 英文摘要 t h ee x p r e s s i o no fs a l l 4i nh e m a t o l o g i cm a l i g n a n tt u m o r a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：w eh a v em a d ear a p i dp r o g r e s s o nt h et r e a t m e n to f h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e si nr e c e n ty e a r s ，b u tt h ee f f e c ti sn o ts t i l l s a t i s f a c t o r y m o s to ft h ep a t i e n t sr e l a p s ea f t e rc o m p l e t er e m i s s i o na n dd i eo f t h ed i s e a s ef i n a l l y r o u t i n ec h e m o t h e r a p yc a l lo n l yk i l lt h em a l i g n a n tc e l l so f h e m a t o l o g i c a ls y s t e mi nt h ep r o l i f e r a t i v ep h a s eo f c e l lc y c l e n o wm o n o c l o n a l a n t i b o d yt h e r a p yi nh e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e si sp o p u l a r ，h o w e v e r , m a n ym o n o c l o n a la n t i b o d i e sh a v en oa b i l i t yt ok i l lt h et u m o rc e l l s ，a n t i b o d y i sn o ts i n g l e m i n d e dt ot u m o r - a s s o c i a t e da n t i g e n ，t h ea i mi so n l yd i r e c ta t s u r f a c em a r k e ro nt h em a t u r et u m o u rc e l l s ，p r o b a b l yt e m p o r a r ya n do b v i o u s c l i n i c a lt h e r a p e u t i ce f f e c tc a nb eg a i n e d ，b u tt h ed i s e a s ew i l lr e l a p s ei nt h ee n d d u et oc a n c e rs t e mc e l l s t h e r e f o r e ，t ot a r g e td i r e c t l ya tb l o o dt u m o rs t e mc e l l a f t e ra s c e r t a i n i n gm o l e c u l a rm a r k e r sp r o b a b l yb ean e wa p p r o a c ht or a d i c a l l y c u r eh e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e s s a l l 4i san e w l yi d e n t i f i e dz i n c f i n g e rt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ra n da m e m b e ro ft h es a l lg e n ef a m i l y ，w h i c hi se s s e n t i a lf o re m b r y o n i cs t e mc e l l p r o l i f e r a t i o na n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n t i n c r e a s i n gs t u d i e sr e v e a lt h a t s a l l 4 g e n ei n v o l v e di nc e l ld e a t h ，c a n c e r ，d n ar e p l i c a t i o n r e p a i r w eh a v e b e g u n t op a yc l o s ea t t e n t i o nt ot h er e l a t i o nb e t w e e ns a l l 4a n d h e m a t o l o g i c a l m a l i g n a n td i s e a s e ss i n c es a l l 4 w a s p r o v e dt oh a v et h ep r o p e r t yo fc a u s i n g t u m o ra n dk e e p i n gs t e mc e l ls e l f - r e n e w a la n dp l u r i p o t e n c y t ou n d e r s t a n dt h e r o l eo fs a l l 4i nt h e p a t h o g e n e s i so fh e m a t o p o i e t i cm a l i g n a n c i e s a r e n e e d e di nt h ef u t u r et oa d d r e s st h i sq u e s t i o n t h ed e t e c t i o ne f f i c i e n c yo nt h ee x p r e s s i o no f t a r g e tg e n ei sv e r yl o ws u c h a sc y t o m o r p h o l o g i ct e c h n i q u e ，f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) a n d f l o w c y t o m e t r ya th e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e s p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( p c r ) i sa b l et od e t e c tf r e q u e n c i e so ft a r g e tc e l l sa sl o wa s10 。6t o10 一， b u ti tc a n td e t e c tt h eq u a n t i t i e so ft a r g e tc e l l sa c c u r a t e l y an o v e la p p r o a c ht o 英文摘要 q u a n t i t a t i v ep c rs h o u l dh a v et h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：s p e c i f i c ，s e n s i t i v e ， r e p r o d u c i b l e ，r a p i da n ds i m p l eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，r e a l t i m ef l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( f q p c r ) t o s o l v et h i s p r o b l e m p r o v i d e san e ww a y 。 i nt h i ss t u d y ，w ed e t e c tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fs a l l 4 g e n ei nb o n e m a r r o wc e l l sf r o mp a t i e n t sw i t hv a r i o u sh e m a t o l o g i c a ls y s t e mm a l i g n a n t s u b t y p eu s i n gf q - p c ra n do b s e r v ew h e t h e rs a l l 4 i so n eo ft h em a r k e r si n h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e s o b j e c t i v e s ：1 t oe s t a b l i s ht h em e t h o do fd e t e c t i n go fs a l l 4m r n ab y r e a lt i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ( f q p c r ) 2 t os u r v e yt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fs a l l 4m r n ai nt h ep a t i e n t sw i t h d i f f e r e n th e m a t o l o g i cm a l i g n a n tt u m o r m e t h o d s ：1 f r o mj a n u a r y2 0 0 9t od e c e m b e r2 0 0 9 ，7 7p a t i e n t sw i t h h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n td i s e a s e sa n d11 n o r m a lc o n t r o l s ( 5 2m a l e sa n d3 6 f e m a l e s ，m e a na g e4 5 4y e a r s ，r a n g ef r o m13 - 7 7 y e a r s ) w e r ee n r o l l e di nt h e s t u d y a l lf u l f i l l e dt h ef a bc r i t e r i a f o rh e m a t o l o g i c a ls y s t e mm a l i g n a n t d i s e a s e s ，a n d21 a c u t en o n l y m p h o c y t i cl e u k e m i a ，12a c u t el y m p h o b l a s t i e l e u k e m i a ，13c h r o n i cm y e l o c y t i cl e u k e m i a ，1 1m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e ( m d s ) ，1 2n o n h o d g t d n sl y m p h o m a ，8m u l t i p l em y e l o m a ( m m ) 1 1 n o r m a lb o n em a r r o ws a m p l e sf r o mv o l u n t e e r sw e r es e l e c t e da sc o n t r o lc a s e s 2 d e t e c t i o no fs a l l 4e x p r e s s i o nb yr e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v e p c r c o l l e c t i o no fb o n em a r r o wo fp a t i e n t sa n de x t r a c t i o no ft h e m o n o n u c l e a rc e l l so fw h o l eb o n em a r r o w i s o l a t i o no ft o t a lr n a e d n aw a ss y n t h e s i z e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r p c r , c o n s t r u c t i o no fs a l l 4s t a n d a r dp l a s m i d d e t e c t i o no fs a l l 4u s i n gar e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o d 3 s t a t i s t i c a la n a l y s i sa l lc a l c u l a t i o n sw e r ep e r f o r m e d u s i n gs a s 9 0 p v a l u eo f o 0 5w a sc o n s i d e r e ds i g n i f i c a n t r e s u l t s ：1 s a l l 4g e n eo v e r e x p r e s s e di nt h ea c u t en o n l y m p h o c y t i c 英文摘要 l e u k e m i a ，a c u t el y m p h o b l a s t i el e u k e m i a ，c h r o n i cm y e l o c y t i c l e u k e m i a ， n o n h o d g k i n sl y m p h o m aa n dm y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e s t h ee x p r e s s i o n s o fs a l l 4 p r o t e i ni nf i v eg r o u p sa b o v ed e m o n s t r a t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n ta s c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p 2 t h ee x p r e s s i o n so fs a l l 4p r o t e i ni nn o r m a l ，a c u t en o n l y m p h o c y t i c l e u k e m i a , a c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a ，c h r o n i cm y e l o c y t i cl e u k e m i a , m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e s ， n o n h o d g k i n sl y m p h o m a ，m u l t i p l e m y e l o m ag r o u p s a b o v ed e m o n s t r a t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n t ( = 2 7 1 3 6 2 ， 尸 3 0 。 ( 3 ) 急性早幼粒细胞白血病( m 3 ) ：骨髓中以异常的颗粒增多的早幼 粒细胞增生为主， 3 0 ，其胞核大小不一，胞浆中有大小不等的颗粒。 ( 4 ) 急性粒单核细胞白血病( m 4 ) ：按粒细胞和单核细胞系形态不同， 分为下列四种亚型。 m 4 a ：骨髓中以原始粒细胞及早幼粒细胞为主，原始、幼稚、成熟的单 核细胞 2 0 。 m 4 b ：骨髓中以原始单核细胞及幼稚单核细胞为主，原始粒细胞、早幼 粒细胞 2 0 。 m 4 c ：骨髓中原始细胞既具有粒细胞系统的特点，也具有单核细胞系 统的特点，此类细胞比例 3 0 。 m 4 e o ：除具有上述各型的特点外，嗜酸粒细胞比例增多， 5 3 0 。 形态学上除胞浆中有典型m 的嗜酸颗粒外，可夹杂少许嗜碱颗粒。 ( 5 ) 急性单核细胞白血病( m s ) ： m 5 a ：骨髓中原始单核细胞 8 0 。 m 5 b ：骨髓中原始幼稚单核细胞 3 0 ，但原始单核细胞应 5 0 ，且伴有形态学异 常，表现为核染色质呈巨幼趋势，核分裂、双核或多核，核碎裂、巨形核 等，骨髓中原始粒细胞( 或原始、幼稚单核细胞) 3 0 ，若外周血中原始粒 细胞( 或原始、幼稚单核细胞) 5 ，则骨髓中原始粒细胞( 或原始、幼稚单 核细胞) 2 0 。 ( 7 ) 急性巨核细胞白血病( m 7 ) ：外周血中有原始巨核细胞( 小巨核 细胞) ，骨髓中原巨核细胞3 0 ，骨髓中细胞可减少或干抽。病理活检有 研究论文 巨核细胞等巨核细胞增生，且有网状纤维的增生。 急性淋巴细胞白血病：按照1 9 9 4 年在法国召开的欧洲白血病免疫学 分型协作组会议提出的四型2 1 类法。 2 2 2 慢性粒细胞白血病 ( 1 ) 诊断： 外周血白细胞常增高，大多超过3 0 x 1 0 9 l ，分类以成熟粒细胞为主， 可见各阶段幼稚粒细胞及少许原始粒细胞，嗜酸粒细胞及嗜碱粒细胞增 多。骨髓增生明显活跃或极度活跃，以粒细胞系统增生为主，中性晚幼粒 及杆状核细胞明显增多，也可伴有原粒、早幼粒细胞增多，嗜酸粒细胞及 嗜碱粒细胞比例增多。红系统减少，巨核细胞可正常，也可增多。外周血 中性粒细胞碱性磷酸酶阳性率及积分减低，细胞遗传学发现有b c 啪l 融合基因阳性。 ( 2 ) 临床分期： 按1 9 8 9 年全国白血病会议制订的分期标准分为慢性期、加速期、急 变期。 2 2 3 淋巴瘤 病理组织学确诊，可见正常淋巴组织结构消失，为肿瘤组织所取代， 根据有无r - s 细胞分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。 2 2 4 骨髓增生异常综合征 根据f a b 协作组的m d s 分型标准【1 7 1 。 2 2 5 多发性骨髓瘤 诊断标准：多发性骨髓瘤国内诊断标准【1 8 】 a 骨髓中浆细胞 1 5 ，并有异常浆细胞( 骨髓瘤细胞) 或组织学活检 证实为浆细胞瘤。 b 血清中出现大量单克隆免疫球蛋白( m 蛋白) ：i g g 3 5 9 l ； i g a 2 0 9 l ；i g d 2 0 9 l ；i g e 2 0 9 l ；i g m 1 5 9 l 或尿中单克隆免疫球 蛋白轻链) 1 0 9 2 4 小时。 c 无其他原因的溶骨病变或广泛的骨质疏松。 2 3 入选标准 2 3 1 实验组 实验组7 7 例患者均为2 0 0 9 年1 月至2 0 0 9 年1 2 月住院于 海南省人民医院经临床、实验室、病理确诊为恶性血液肿瘤患者，并且为 研究论文 初发及未治疗的患者。 对照组同期在海南省人民医院门诊健康体检者11 例。 2 3 2 年龄 1 2 岁，并 7 8 岁。 2 3 3 愿意合作者。 2 4 排除标准 上肢桡侧畸形，d u a n e 斜视，其他发育异常还包括肛管狭窄、色素发 布异常、房间隔缺损、听力障碍、肾脏发育不良、外耳畸形、颜面不对称。 3 实验材料和方法 3 1 实验材料 3 1 1 主要试剂 t r i z o l 美国i n v i t r o g e n 公司 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 美国s i g m a 公司 b i o t e k es u p e rr tk i t北京百泰克公司 2 x s y b rr e a l t i m ep c rp r e m i x t u r e北京百泰克公司 琼脂糖粉 美国s i g m a 公司 3 1 2 主要实验仪器 紫外分光光度计( u v 1 2 0 6 )日本s h l m o d z u 公司产品 a b 1 6 0 型电子分析天平美国d e n v e r 公司 高速冷冻离心机 美国s i g m a 公司产品 水平电泳电泳仪美国b i o r a d 公司 8 0 冰箱日本s a n y o 公司 - 2 0 冰箱日本s a n y o 公司 s y s t e m9 6 0 0 p c r 扩增仪美国g e n e a m p 公司 a b l 7 3 0 0 荧光定量p c r 扩增仪美国a b i 公司 o l y m p u s 数码相机 日本o l y m p u s 公司 3 1 3 主要溶液的配制 i d e p c 水的配制：玻璃容器1 8 0 c 烘烤3 d , 时，1 毫升( m i l l i l i t e r ，m 1 ) 的d e p c 加入1 0 0 0 m l 双蒸水中，混匀，室温放置1 2 d 时，用于浸泡一次性 塑料器皿。 无r n a 酶水的配制：磨口瓶于1 8 0 。c 拷3 d , 时，l m l 的d e p c 力i 入1 0 0 0 m l 双蒸水中，混匀，室温过夜，1 2 0 。c 高压灭菌2 0 分钟以去除残留的d e p c ， 研究论文 分装，4 c 保存。 无r n a 酶7 5 酒精的配制：磨口瓶1 8 0 拷3 d , 时，按1 ：4 比例分别加 入无r n a 酶水和无水乙醇，混匀，2 0 保存。 5 x t b e 缓冲液的配制：准备称取三( 羟甲基) 氨基甲烷 ( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ，t r i s ) 5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，加入0 5 mp h 8 0 乙二胺四乙酸钠( e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i dd i s o d i u ms a l t ，e d t a ) 1 0 m l ，三蒸水定容至1 0 0 0 0 m l ，磁力搅拌3 小时后放入棕色广口瓶中，避 光室温保存。电泳时稀释l o 倍制成0 5 t b e 缓冲液。 6 上样缓冲液：准确称取溴酚蓝0 2 5 9 ，二甲苯青f f0 2 5 9 ，加入甘油 3 0 m l ，三蒸水定容1 0 0 m l ，混匀后分装，4 c 保存。 2 琼脂糖凝胶的配制：准确称取0 6 9 琼脂糖加入3 0 m lo 5 t b e 电泳缓冲 液，微波炉中火2 分钟至沸腾2 次，溶化的琼脂物冷却至6 0 时加入 g e n e f i n d e r 核酸染料，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的凝胶 中，在室温下放置3 0 - - - , 4 5 分钟后进行电泳。 3 1 4 引物 所有引物均由北京百泰克公司合成。目的基因条带位置在5 8 8 碱基对 ( b p ) 左右。引物序列见t a b l e2 。引物均已在以往的研究中得到了很好 的确证，具有良好的特异性，无重复和自身互补序列，正义和反义引物设 计于不同的外显子，以排除来自基因组脱氧核糖核苷酸( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ，d n a ) 扩增产物的污染。 将合成的引物配制成l o o p m o l l 的贮存 液，用时稀释至1 0 p m o l l 的工作液。 3 2 实验方法 3 2 1 标本的采集和单个核细胞( m o n o n u c l e a rc e l l ，m n c ) 的提取 骨髓标本： 取骨髓穿刺抽取l m l 经肝素钠抗凝，p b s 液稀释3 m l ； 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液，取1 个无菌的1 5 毫升锥形 离心管，加入5 毫升淋巴细胞分离液； 小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的肝素抗凝 的骨髓标本在分离液上面，切记不要搅浑分离液； 小心放进台式离心机，室温下离一1 二, 2 0 分钟，速度为1 5 0 0 转数每分 钟( r m i n ) ； 研究论文 小心取出离心管，切记不要震动，可见到离心管分为四层：最上层 为血浆层( 为淡红色透明) ，第二层为骨髓单个核细胞层，呈薄薄的致密 白色环状层，第三层为细胞分离液层，最后一层为红色沉淀在管底的红细 胞层； 小心抽掉白色环状层以上三分之二的血浆液，切记不要搅动白色环 状层，用5 毫升无菌塑料吸管小心吸取白色环状层液体，移入到新的无菌 的1 5 毫升锥形离心管。加入p b s 缓冲溶液，用吸管吹打混匀，放进台式离 心机，室温下离心5 分钟，速度为1 5 0 0 r m i n ，洗涤细胞。必要时重复一次； 小心倒掉上清液，用手指轻弹离心管3 至5 下，使白色细胞颗粒群松 动，加入l m lt r i z o l ，转移至1 5 m l 灭菌离心管，8 0 0 c 保存备用或立即用于 以下实验。 3 2 2 总r n a 的提取 将上述加入l m lt r i z o l 的细胞充分振荡混匀，于1 5 3 0 。c 放置5 分钟。 加入2 0 0 山氯仿m lt r i z o l ，剧烈振荡，放置2 3 分钟，1 2 0 0 0 r r a i n ，4 c 离心 1 5 分钟； 将上层水相层转到一新的离心管( 注意不要吸到中间的蛋白层) ， 加入异丙醇5 0 0 肛v m lt r i z o l ，放置1 0 分钟，1 2 0 0 0 r m i n ，4 c 离心1 0 分钟， 去掉上清； 。 用l m l7 5 乙醇( d e p c 水配制) 晃荡洗涤一遍，随即于4 7 5 0 0 r r a i n 离心5 分钟后，去掉上清，空气晾干( 需注意不能完全干风，否 则将使鼢认很难溶于无酶水中) 。加入5 0 山的灭菌无酶水溶液溶解r n a 。 3 2 3 提取r n a 的检测 3 2 3 1 浓度及纯度测定 取5 山r n a 溶液加去离子水稀释1 0 0 倍，在核酸 蛋白测定直接读取r n a 浓度和纯度的数值，r n a 样本的o d 2 6 徊d 2 8 0 的比 值应在1 7 2 0 之间。根据分子克隆实验指南：1 0 d 值相当于4 0 i _ t g m l 的r n a 。计算出r n a 的含量微克微升( 耀r u 1 ) 。 3 2 3 2 完整性鉴定取5 9 l 提取的总r n a 用0 8 琼脂糖凝胶电泳，在紫 外灯下观察5 s 、1 8 s 、2 8 s 三条r n a 条带及云雾状m r n a ，确定r n a 的完整 性。用f l o u rc h e n 一8 9 0 0 凝胶扫描成像系统( a l f ai n n o t e c h 公司，u s a ) 进行拍照。其余r n a 放置一8 0 冰箱冻存备用。 3 2 3 3e d n a 合成 研究论文 按以下组分配制反转录反应体