（外科学专业论文）沉默twist基因对hct116细胞株体外增殖及侵袭性影响的研究.pdf

目录 1 ：； 因对h c t l1 6 细胞株体外增殖及侵袭性影响的研 前言6f j 【j 舌 材料与方法7 结果1 6 附图1 8 附表2 3 讨论2 4 结论2 6 参考文献2 7 综述t w i s t 基因低表达与大肠癌的发生、发展及转移的研究2 9 致谢4 1 个人简历4 2 袭性影响的研究 常见的消化道恶性 的发病是一个多因 瘤的发生和发展是 正常的细胞在受到包括生物、物理、化学等各种外界因素作用后发生一系 列分子水平变化，最终导致表型变化，成为肿瘤。肿瘤的发生，也是细胞 增殖与细胞凋亡平衡失调的结果。结直肠癌的发生发展与细胞凋亡有密切 的关系。在对细胞凋亡机制的研究中，人们发现，碱性螺旋一环一螺旋蛋白 ( b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i xb h l h ) 家族中高度保守的t w i s t 基因不仅具有癌 基因的特性，而且能通过多种途径抑制细胞凋亡过程，促进上皮一间质转 化( e m t ) 的发生及血管的形成，同时也导致肿瘤的发生、发展。研究表 明，t w i s t 过高表达于各种实体瘤中( 包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤 以及骨肉瘤) ，能够促进人乳腺癌和黑色素瘤细胞系的凋亡。也有研究证 实，t w i s t 在人类乳腺癌m c f 7 细胞株、结肠癌h c t l1 6 细胞株、肾癌 7 8 6 0 细胞株、胃癌m n k 细胞株、肝癌h e p g 2 细胞株、正常肝细胞l 0 2 等6 种细胞系中，在结肠癌h c t l1 6 细胞系中的表达最高，而在正常肝脏 细胞l 0 2 中的表达最低。而我们之前的研究也表明在h c t l1 6 ，s w 4 8 0 ， s w 6 2 0 三种结肠癌细胞系中，t w i s t 基因在h c t l1 6 细胞系中表达最高。 我们在前期研究中发现上调t w i s t 基因的表达，会增强人结肠癌s w 4 8 0 细胞株体外增殖及侵袭转移能力。本研究通过下调t w i s t 基因的表达，观 察对人结肠癌h c t l1 6 细胞株体外增殖及侵袭性的影响，进一步确定 t w i s t 基因与结直肠癌发生，发展的关系。 方法：本研究将t w i s ts i r n a 干扰质粒和空载质粒瞬时转染入t w i s t 高表达结肠癌细胞系h c t l1 6 中，分别做为干扰组和对照组，通过g 4 18 筛选，经过r t - p c r 和w e s t e r n b l o t 方法鉴定，观察t w i s ts i r n a 是否成 功沉默结肠癌h c t l1 6 细胞株中t w i s t 基因的表达，再通过m t t 法测定 并绘制干扰组和对照组细胞的生长曲线，然后通过细胞划痕实验和 t r a n s w e l l 侵袭实验，观察t w i s t 基因对细胞迁移和侵袭能力的影响。 中文摘要 结果： 1 r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 结果显示：干扰组细胞t w i s t 基因的表达水平 显著低于对照组，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 2 通过m t t 法绘制细胞生长曲线，结果显示，从第4 天开始，干扰组细 胞生长速度明显低于对照组，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 3 通过细胞划痕实验显示，划痕2 4 小时后对照组细胞迁移了( 2 5 2 4 1 6 5 ) ，而干扰组细胞迁移了( 1 5 0 6 2 5 6 ) ，差异有统计学意义。 4 8 小时后，对照组细胞迁移了( 4 5 3 7 6 7 9 ) ，而干扰组迁移了( 2 5 7 7 4 0 6 ) ，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 4 体外侵袭实验结果显示，对照组细胞发生侵袭的个数为( 1 2 3 2 0 ) ， 干扰组细胞侵袭个数为( 6 8 1 8 ) ，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 结论： 1 采用本实验方法可以成功沉默人结肠癌h c t l1 6 细胞株中t w i s t 基因 的表达。 2 沉默t w i s t 基因表达后，h c t l1 6 细胞体外增殖率明显下降，说明t w i s t 基因能够影响h c t l1 6 细胞的体外增殖能力。 3 沉默t w i s t 基因表达后，h c t l1 6 细胞体外迁移能力明显下降，说明 t w i s t 基因能够影响h c t l1 6 细胞的迁移能力。 4 沉默t w i s t 基因表达后，h c t l1 6 细胞体外侵袭能力明显下降，说明 t w i s t 基因能够影响h c t l1 6 0 细胞的体外侵袭能力。 关键词：t w i s t 基因；结肠癌细胞株；s i i 斟a ；r t - p c r ；w e s t e r n b l o t 英文摘要 r e s e a r c ha b o u te f f e c t i o n so fd o w n r e g u l a t i o nt w i s tg e n e e x p r e s s i o no n v i t op r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no fc e l lh c t i 16 a b s t r a c t o b j e c t ：c o l o r e c t a lc a n c e ri st h ec o m m o nd i g e s t a lm a l i g n a n t t u m o ri no u r c o u n t r y , t h em o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yr a t e a l lp r e s e n to b v i o u su p - t r e n d t h e c o l o r e c t a lc a n c e ro c c u r a n c ei sa nm u t i f a c t o ra n dm u t i - s t e pp r o g r e s s ，f o r m s t h ed i f f e r e n tp a t h o l o g ys t a g ei nt h ec o r r e s p o n d i n gp h e n o t y p e a f t e rb e i n g s u b je c t e dt ov a r i o u so u t s i d ef a c t o rc h a n g e d i n c l u d el i v i n gc r e a t u r e ，p h y s i c s ， a n dc h e m i s t r y a n ds oo n ，as e r i e so fm o l e c u l eh o r i z o n t a lw a so c c u r r e di n n o r m a lc e l l sw h i c hf i n a l l yc a u s et a b l et y p e sc h a n g i n ga n db e c o m et u m o r t h e o c c u r r e n c eo ft h et u m o ri sa l s ot h er e s u l to fo u tb a l a n c eb e t w e e nt h ee e l l p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s c o l o r e c t a l c a n c e r so c c u r a n c eh a dac l o s e r e l a t i o nw i t hc e l la p o p t o s i s i ti sr e p o r t e dt h a tt w i s tr e g u l a t e se x p r e s s i o no f l o t so fg e n e si nt r a n s c r i p t i o n a ll e v e l ，i t so r i g i n a l f u n c t i o nw a sf o u n dt o r e g u l a t et h ed e v e l o p m e n to fe m b r y ob ye m t i ti sr e c e n t l yc o n f i r m e dt h a t t w i s tw a se n g a g e di ne p i t h e l i a lm e s e n c h y - - m a lt r a n s i t i o n ( e m t ) i ns o m e e p i t h e l i u m o r i g i n a lt u m o r sa n dp r o m o t e i t si n v a s i o na n dm e t a s t a s i s m e a n w h i l e ， t w i s tc a ni n d u c eas e to fm e s o c h y m a lm a r k e r si nt h ep r o g r e s so ft u m o r s s e p a r a t e l y i tw a ss h o w nt h a tt w i s tw a so v e r - e x p r e s s e di nv a r i o u sk i n d so f s o l i dt u m o r s ， l i k eb r e a s t c a n c e r s ，p r o s t a t e c a n c e r s ， m e l a n o m aa n d o s t e o s a r c o m a ；i t c a np r o m o t e a p o p t o s i s o fh u m a nb r e a s tc a n c e r sa n d m e l a n o m a t h ee x p r e s s i o no ft w i s tw a sa l s oc o n f i r m e di nh u m a nb r e a s t c a n c e rm c f 7c e l ll i n e ，c o l o nc a n c e rh c t 1 16e e l ll i n e ，k i d n e yc a n c e r7 8 6 0 c e l ll i n e ，g a s t r i cc a n c e r 腻c e l ll i n e ，h e p a t i cc a n c e rh e p g 2c e l ll i n ea n d n o r m a lh e p a t i cl 0 2c e l ll i n e ，i t se x p r e s s i o nw a sh i g h e s ti nc o l o nc a n c e r h c t l16c e l ll i n e ，w h i l et h el o w e s ti nn o r m a lh e p a t i cl 0 2c e l ll i n e i no u r f o r m e rr e s e a r c h ，i nt h et h r e ec o l o nc a n c e rc e l ll i n e s ，t h ee x p r e s s i o nw a sh i g h e s t i nc o l o nc a n c e rh c t 1 16 i no u rf o m e rr e s e a r c hw ef i n dt h a ti fw eu pr e g u l a t e t h ee x p r e s s i o no ft w i s tg e n et h ep r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no f s w 4 8 0c e l l 3 英文摘要 l i n e sw e r ep r o m o t e d m e t h o d s ：i nt h i se x p e r i m e n t ，w eu s e ds i r n at od o w nr e g u l a t et h et w i s t g e n ee x p r e s s i o na n dg 4 18s i e v et h ec e l l s w eu s e di m p c ra n dw e s t e r nb l o t t oe x a m i n et h er e s u l t w eu s em t tm e t h o dt od r a wt h ec e l lg r o w t hc u r v e ， w o u n dh e a l i n ga s s a ym e t h o dt oo b s e r v et h ec e l l m i g r a n t i o n ，t r a n s w e l l i n v a s i o nm e t h o dt oo b s e r v ec e l li n v a s i v e n e s si nv i m r e s u l t s ： lr t - p c ra n dw e s t e r nb l o tr e s u l t s ：t w i s tm r n aa n dp r o t e i ni sl o w e ri nt h e i n v a s i v e dc e l l st h a ni nc o n t r o lg r o u pc e l l s 2m t tm e t h o dr e s u l ts h o w ：c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h eg r o w t hr a t eo f s t a b l y t r a n s f e c t e c g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nc o n t r o l g r o u p ( 尸 0 0 5 ) 3w o u n dh e a l i n ga s s a yr e s u l t s ：t h et r a n s f e c t e da n d g r o u pc e l l sm i g r a t e d s l o w l y a n dc l o s e dt h ew o u n db y ( 1 5 0 6 士2 5 6 ) a r e r 2 4 ha n d ( 2 5 7 7 士4 0 6 ) a f t e r4 8 h i nc o n t r a s t ，c o n t r o lg r o u pc e l l so n l yc l o s e dt h e w o u n db y ( 2 5 2 4 + 1 6 5 ) a n d ( 4 5 3 7 士6 7 9 ) i nt h es a m et i m ei n t e r v a l t h e w o u n dc l o s e dr a t ei nt r a n s f e c t e dg r o u pc e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ni n c o n t r o lg r o u p s ( p 0 0 5 ) 4t h en u m b e ro fi n v a s i v ec e l l s i nt r a n s f e c t e dg r o u p sw e r e ( 6 8 士18 ) a n d w e r e ( 12 3 士2 0 ) i nc o n t r o lg r o u p t h e i n v a s i v ec e l l sn u m b e ri nt r a n s f e c t e d g r o u p sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ni nc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) c o n c u i s i o n s ： 1i nt h i sr e s e a r c ht w i s tg e n ew a si n t e r f e r e n c e ds u c c e s s f u l l yi nt h eh c t116 c e l l sa n dc a nb es t a b l ye x p e r s s e d 2a f t e rd o w n r e g u l a t e dt h et w i s tg e n ei tc a nb ed o w nt h ev i t op r o l i f e r a t i o n o ft h eh c t 116c e l l i ti ss h o wt h a tt w i s tg e n ec a ne f f e c tt h ev i t o p r o l i f e r a t i o no f t h eh c t ll6c e l l s 3a f t e rd o w n r e g u l a t e dt h et w i s tg e n ei tc a nb ed o w nt h ev i t om i g r a t i o no f t h eh c t116c e l l i ti ss h o wt h a tt w i s tg e n ec a ni m p r o v et h em i g r a t i o no f t h eh c t l1 6c e l l s 4a f t e rd o w n r e g u l a t e dt h et w i s tg e n ei tc a nb ei m p r o v et h ev i t oi n v a s i o no f 4 一一一- _ 5 研究论文 沉默t w is t 基因对h c t l16 细胞株体外增殖及侵袭性影响的研究 - * 苎 嗣罱 结直肠癌( c o l o r e c t a lc a n c e r ，c r c ) 是我国常见的消化道恶性肿瘤， 且发病率及死亡率均呈明显上升趋势。结直肠癌的发病是一个多因素多步 骤的过程，形成不同病理阶段的相应表型。肿瘤的发生和发展是正常的细 胞在受到包括生物、物理、化学等各种外界因素作用后发生一系列分子水 平变化，最终导致表型变化，成为肿瘤。肿瘤的发生，也是细胞增殖与细 胞凋亡平衡失调的结果。结直肠癌的发生发展与细胞凋亡有密切的关系。 在对细胞凋亡机制的研究中，人们发现，碱性螺旋环螺旋蛋白( b a s i c h e l i x 1 0 0 p h e l i xb h l h ) 家族中高度保守的t w i s t 基因不仅具有癌基因的 特性，而且能通过多种途径抑制细胞凋亡，促进上皮间质转化( e m t ) 的 发生及血管的形成，同时也导致肿瘤的发生、发展【i 2 1 。 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是指外源性的双链r n a ( d s r n a ) 特异性降解细胞内同源m r n a ，使基因表达沉默的现象。r n a i 是生物体 在进化过程中抵御病毒入侵，抑制偶转座子移动或重复序列的积累引起的 基因组不稳定的保护机制，另外还是基因表达调控的一个重要途径。而小 干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ，s i r n a ) 是指在r n a i 过程中产生的长约 2 1 2 5 核苷酸的小双链r n a 分子，是r n a i 作用机制的重要的中间效应 分子。s i r n a 的特点：特异性高而且没有副作用；效率高且持续时 间长；成功率高，目前已能做到设计的s i r n a 一半具有7 5 以上的抑 制效率；应用范围广泛，并且在诊断治疗中有巨大的应用潜力。研究证 实，t w i s t 过高表达于各种实体瘤中( 包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤以 及骨肉瘤) ，能够促进人乳腺癌和黑色素瘤细胞系的凋亡。也有研究证实 【3 】，t w i s t 在人类乳腺m c f 7 细胞株、结肠癌h c t l1 6 细胞株、肾癌7 8 6 0 细胞株、胃癌m n k 细胞株、肝癌h e p g 2 细胞株、正常肝细胞l 0 2 等6 种细胞系中，在结肠癌h c t l1 6 细胞系中的表达最高，而在正常肝脏细胞 l 0 2 中的表达最低。而我们之前的研究也表明在h c t l1 6 ，s w 4 8 0 ，s w 6 2 0 三种结肠癌细胞系中，t w i s t 基因在h c t l1 6 细胞系中表达最高。t w i s t 与肿瘤细胞侵袭关系密切相关，我们在前期研究已经发现上调t w i s t 基因 研究论文 的表达，会增强s w 4 8 0 体外增殖及侵袭转移能力。本研究通过下调t w i s t 基因的表达，观察对人结肠癌h c t l1 6 细胞株体外增殖及侵袭性的影响， 进一步确定t w i s t 基因与结直肠癌发生，发展的关系。 材料与方法 l 材料 1 1 细胞株 人结肠癌细胞h c t l1 6 细胞株购买自上海中国科学院细胞库。 1 2 主要实验仪器 超净工作台豪尔医疗器械公司 恒温水浴箱哈尔滨东联公司 c 0 2 恒温细胞培养箱美国s h e l d o n 公司 8 0 低温冰箱日本三洋公司 相差显微镜日本o l y m n p u s 公司 光学显微镜日本o l y m n p u s 公司 紫外分光光度计日本h i t a c h i 公司 p c r 仪美国a b i 公司 凝胶成像系统美国i m a g e 公司 移液器北京中杉生物技术有限公司 双稳电泳仪北京六一仪器厂 1 3 主要试剂 乙醇北京化学试剂厂 m c c o y s 5 a 培养液武汉博士德公司 胎牛血清杭州四季青公司 0 2 5 胰酶 i n v i t r o g e n 公司 l i p o f e c t a m i n e w m 2 0 0 0 i n v it r o g e n 公司 1 x p b s 细胞培养液s o l a r bi o 公司 氯仿北京化学试剂厂 异丙醇北京化学试剂厂 溴酚蓝北京化学试剂厂 研究论文 焦炭酸乙二酯( d e p c )a m r e s o 公司 琼脂糖pro m e g a 公司 溴化乙锭 s i g ma 公司 d a b 显色剂 s i g ma 公司 p v d f 膜华美公司 蛋白提取试剂盒美国ac t i v e m o t i f 公司 g a p d h 引物上海生工 t w i s t 引物上海生工 p g e n e s i l 2 1 质粒武汉晶赛生物技术有限公司 p g e n e s i l 1 1 质粒武汉晶赛生物技术有限公司 h r p 抗山羊i g g ( 二抗)北京中衫生物技术有限公司 兔抗人t w i s t 多克隆抗体( a b e a m ，美国) m a r k e r 华美生物工程公司 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究 1 4 主要试剂的配制 1 4 11 x p b s 缓冲液的配制： 电子天平称取n a c l 8 0 9 ，k c l 0 2 9 ，n a 2 h p 0 4 1 4 4 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 4 9 ，溶于 8 0 0 m l 蒸馏水中，盐酸调节p h 至7 4 ，最后加蒸馏水至1 0 0 0 m l 定容，高温 消毒，4 c 保存。 1 4 21 x t b e 溶液的配制： 电子天平称取1 0 8 9t r i s 、5 5 9 硼酸、o 5 m l e d t a4 m 1 ) 3 1 1 入1 0 0 0 m l 双蒸水中，混匀，室温放置。 1 4 31 5 琼脂糖的配制： 电子天平称取琼脂糖1 5 9 ，移液器量取5 9 le b j 至l0 0 m l 1x t b e 中， 充分溶解，室温放置备用。 1 4 42 x s d s 凝胶加样缓冲液的配制： t r i s h c i p h 6 8 ( 1 0 0m m ) ；s d s ( 4 ) ；溴酚兰( o 2 ) ；甘 油( 2 0 ) ，共9 5 t l ；p 一巯基乙醇( 2 0 0r a m ) 5 山使用前加入。 1 4 51 0 x 扩增缓冲液的配制： 电子天平称取1 8 6 9 k c l ，7 9 9 t r i s c 1 ，7 2 9m g c l 2 ，o 1 明胶，加双蒸 水至5 0 0 m l ，调节p h 至8 3 。 研究论文 1 4 6 ( p h8 8 ) 1 5 m o l l t r i s h c i 缓冲液的配制： 电子天平称取t r i s1 8 2 9 ，加双蒸水至1 0 0 m l ， 1 4 7 ( p h 6 8 ) t r i s h c l 缓冲液的配制： 电子天平称取t r i s 6 0 6 9 ，加双蒸水至1 0 0 m l ， 1 4 83 0 丙烯酰胺溶液的配制： 1 nh c l 调节p h 至8 8 。 1 nh c l 调至p h 6 8 。 电子天平称取2 9 9 丙烯酰胺，l g 亚甲基双丙烯酰胺，加双蒸水至1 0 0 m l 。 ( p h 8 3 ) 1 0 x s d s p a g e 电泳液的配制： 电子天平称取9 4 9 甘氨酸，1 5 1 9t r i s ，移液器量取5 0 m 1 1 0 s d s ，加 双蒸水至5 0 0 m l 。 1 4 95 x 转印缓冲液的配制： 电子天平称取9 4 9 甘氨酸，1 5 1 9t r i s ，加双蒸水1 0 0 0 m l 转印时取2 0 0m 1 5 x 转印缓冲液，加去离子水6 0 0 m l s n 甲醇2 0 0 m l 混匀，即 配成总体积为1 0 0 0 m l 的1 转印缓冲液。 1 4 1 01 x t b s 缓冲液的配制： 电子天平称取9 9t r i s ，2 4 9n a c l ，0 6 9k c l ，加入3 0 0 0 m l 双蒸水，最 后调节p h 值至7 4 ，室温保存。 1 4 111 0 x 丽春红染液的配制： 电子天平称取2 9 丽春红s ，3 0 9 - - 氯乙酸，3 0 9 磺基水杨酸，加双蒸水 至1 0 0 m l 。 1 4 1 2 封闭液的配制： 电子天平称取1 9 脱脂奶粉，移液器量取2 0 m lt b s ，加入4 0 t l t w e e n 2 0 混匀。 1 4 1 3g 4 1 8 溶液的配制： 电子天平称取l gg 4 18 粉末溶于l m l 的h e p e s 液中，加入双蒸水至 1 0 m l 过滤消毒，4 冰箱保存。 2 实验方法 2 1 细胞培养 从液氮中取出入结肠癌h c t l1 6 细胞株进行快速复温，接种于含1 0 小牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养液中，置3 7 c 、含5 c 0 2 的饱和湿度培养 箱中培养，细胞呈单层贴壁生长后每2 d 更换培养液1 次。 2 1 1 细胞计数 一li 研究论文 取对数生长期的细胞，弃去培养液，然后用0 2 5 胰酶消化，待细胞 间逐渐变圆时，弃去胰酶，l x p b s 缓冲液洗涤，加入新鲜的培养液反复吹 打，制成单细胞悬液，细胞充分混匀后，用细胞计数板在显微镜下计数。 计算公式：细胞数( 个细胞m 1 ) = ( 4 大格细胞数4 ) x 1 0 4 稀释倍数。 2 2t w i s t s i r n a 质粒转染 携带t w i s t s i r n a 的载体及相应的阴性对照质粒分别为： p g e n e s i l 2 1 ( 不含有荧光蛋白基因f i g 1 ) 和p g e n e s i l 1 1 ( 含有荧光蛋白基 因) ，后者用来检验转染效率( f i g2 ) 。r n a 干扰序列： 干扰组：5 g c t g a g c a a g a t t c a g a c c c t 3 对照组：5 - g c g a c c g a c g a t g g ，丌a t t c g 3 2 2 1s i r n a 转染效率的观测 准备行转染前1 天，选择生长良好的且将近8 0 9 0 汇合的h c t l1 6 细胞，经胰酶消化，接种于2 4 孔细胞培养板上，在不含抗生素的1 0 胎牛 血清的m c c o y s 5 a 培养液中培养过夜。 转染时，分别取干扰组和对照组2 o 嵋质粒加至5 0 i ，t l 无血清无双抗的 m c c o y s 5 糖养液中进行稀释，此为a 液。同时再取4 i _ d l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 加入至5 0 1 x l 无血清无双抗的m c c o y s 5 糖养液中进行稀释，此为b 液。a 液b 液均室温静置5 m i n ，取各个a 液与b 液混匀，形成转染复合物，室温放 置2 0 m i n ，充分反应。将转染复合物加入到2 4 孔板的细胞培养孔中，轻轻摇 动培养板混匀。将培养板置3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养。6 h 后换液，加入 含有双抗及胎牛血清的m c c o y s 5 a 培养液继续培养。 4 8 h 后，倒置荧光显微镜观察转染情况：每孔随机取5 个视野，可见光 下计数视野内细胞总数，紫外光下计数转染细胞数，取平均值，俺下面公 式计算转染效率： 转染效率= 被转染细胞数细胞总数1 0 0 。 2 3g 4 1 8 筛选 人结肠癌细胞h c t l1 6 接种子含1 0 胎牛血清的m c c o yt s 5 a 培养基 中，置于3 7 c 、含5 c 0 2 的饱和湿度培养箱中持续培养，0 2 5 胰酶消 化传代，待细胞贴壁生长至基本铺满瓶底时收集细胞，将细胞稀释至1 0 0 0 个m l ，2 4 孔板每孑l j j n 入1 0 0 u l 细胞悬液，每孔中已预先加入5 0 0 山含g 4 18 的完全培养基。( 将每孔中的g 4 1 8 浓度稀释至o m g l ，1 0 0m g m ，2 0 0 研究论文 m g l ，3 0 0m g l ，4 0 0m g l ，5 0 0m e t e ，6 0 0m g l ，7 0 0m g l ，8 0 0m g m ，9 0 0 m e f l ，1 0 0 0m g l ，11 0 0 m g l 等12 个级别) ，各级别均设3 副孔；3 7 。c ， 5 c 0 2 培养1 0 1 4 天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，筛选时比该浓 度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 2 4r t - p c r 检测h c t l l 6 细胞中t w i s t m r n a 的表达 细胞大量扩增后，应用r t - p c r 检测转染后h c t l16 细胞中 t w i s t m r n a 的表达。 2 4 1h c t l l 6 细胞总r n a 的提取 ( 1 ) 将弃去培养瓶的培养液，用1x p b s 缓冲液洗涤细胞2 次，加入l m l t r i z o l 1 0 c m 2 培养瓶，反复吹打，充分裂解细胞，室温放置5 m i n 。 ( 2 ) 用移液器将细胞匀浆液移入1 5 m l e p 管中，加入约总体积1 5 的氯 仿，盖好e p 管，充分振荡，冰浴中静置1 5 分钟。 ( 3 ) 4 ( 13 0 0 0 r p m m i n ) 离一1 二, 2 0 m i n ，取上层液体至另一e p 管中， 让后加入等体积异丙醇，充分混匀冰浴中放置，沉淀1 h 。 ( 4 ) 再次4 c ( 1 3 0 0 0 r p m m i n ) 离一1 二, 2 0 m i n ，弃去上清，加入等体积异 丙醇，充分混匀后冰浴中放置，至少沉淀1h 。 ( 5 ) 再次2 0 分钟( 4 、1 3 0 0 0r p m m i n ) 离心，弃上清，用7 5 乙醇 洗涤一次，冰浴放置，去除残留乙醇，加入适量0 i d e p c 溶解，既得到 提取的细胞总r n a 。 整个操作过程均在冰浴中进行，以防止r n a 裂解。 2 4 2 细胞总r n a 的鉴定 将提取的细胞总r n a 与2 x s d s 凝胶加样缓冲液按1 ：5 混合，在1 5 琼 脂糖凝胶中电泳。待上样缓冲液中的溴酚蓝迁出一定距离后，停止电泳。 取出凝胶，放至紫外透射仪下，进行观察，r n a 的电泳带2 8 s 、1 8 s 应清晰 无降解，且2 8 s 的亮度和宽度是1 8 s 的两倍，即表明r n a 的完整性良好。 2 4 3r n a 的定量 在紫外分光光度仪上检测2 6 0 n m 和2 8 0 n m 两个波长的吸光度( o d 2 6 0 和o d 2 8 0 ) ，o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值应在1 7 1 8 以上说明r n a 完整无降解。 r n a ( k t g m 1 ) 计算公式：o d 2 6 0 x 4 0 x 稀释倍数。 2 4 4 逆转录合成t w i s t c d n a 第一链 反应体系( 2 0 p 。1 ) 研究论文 1 0 x 扩增缓冲液 2 0 i - t l d n t p 混合液( 10 m m o l l ) 2 0 9 l a m v ( 反转录酶)2 0 u o l i g d t1 0 9 l 模板r n a ( 1 t g 9 1 )1 0 t x l m g c l 21 0 9 l 加去离子水补至2 0 9 l 2 4 5p c r 扩增 反应体系( 2 5 1 上1 ) 10 x b u f f e r 2 5 1 x l d n t p 混合液 o 5 9 l c d n a 2 0 1 x l 上游引物 0 5 p l 下游引物 o 5 9 l t a q d n a 聚合酶0 3 9 l 去离子水1 8 7 山 反应条件：9 5 。c 预变性，5 m i n 。循环参数：9 5 3 0 s ，6 2 4 0 s ，7 2 4 0 s ， 扩增3 0 个循环后，7 2 延伸1 0 m i n 。 t w i s t 引物序列： 上游引物：5 g c c a g g t a c a t c g a c t t c c t c t a c 3 下游引物：5 c c t c c a t c c t c c a g a c c g a g a a 一3 g a d p h 内参对照引物序列： 上游引物：5 g a a g g t c g g a g t c a a c g g a r r - 3 下游引物：5 c g c t c c t g g a a g a t g g t g a r - 3 2 4 6p c r 产物鉴定 取8 9 l p c r 扩增产物与2 9 l 溴酚蓝上样缓冲液混合，加入1 5 琼脂糖 凝胶加样孔中，恒压1 0 0 v ，电泳缓冲液1x t b e ，电泳3 0 r a i n 。通过凝胶 扫描仪进行d n a 电泳条带密度值分析，并且拍照记录实验结果。 2 5w e s t e r n b l o t 检测h c t l1 6 细胞中t w i s t 蛋白的表达 2 5 1 细胞总蛋白的提取 取贴壁生长的两组h c t l1 6 细胞，1 x p b s 漂洗2 次，分别加入总蛋白裂 1 2 研究论文 解液裂解蛋白，静置5m i n ，以细胞刮子收集细胞，( 1 3 0 0 0 r m i n ) 4 离心 1 5 m i n ，取上清，分装，置8 0 冰箱保存备用。 2 5 2 总蛋白浓度测定 采用考马斯亮兰法检测细胞蛋白浓度。将待测蛋白样品浓度调节至 0 7 8 5g l 取待测蛋白样品2 0 p , l ，加入稀释的c b b 显色齐l j l m l ，混匀，室温放 置l o m i n 显色。显色后，6 0 m i n 钟内测定于5 9 5 n m 处的各管吸光度值。蛋白 含量( g l ) = 测定管吸光度标准管吸光度x 0 7 8 5 9 l 。 2 5 3s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ( 1 ) 将洗净烘干的电泳仪各部件包括外壳，橡胶边框，玻璃片准备就位； ( 2 ) 制备分离胶： h 2 0 ( 双蒸水) 5 0m l 3 0 丙烯酰胺贮存液 6 0 m l p h 8 6t r i s c 1 3 7 m l 1 0 s d s 1 5 0 t x l 1 0 a p s 1 5 0 1 , t l t e m e d 8 9 l 将上述液体轻轻混匀摇动，然后将凝胶溶液平稳连续地注入步骤( 1 ) 准备好的两个玻璃板中，再在页面上小心注入一层蒸馏水，以隔绝空气， 静置直至凝胶的形成。 ( 3 ) 制备浓缩胶 3 0 丙烯酰胺贮存液0 6 7 m l p h 6 8t r i s c i 缓冲液 o 5m l 10 s d s 4 0 t l 1 0 a p s 4 0 “l t e m e d 4 山 i - 1 2 0 ( 双蒸水) 2 7 m l 将上述成分均匀混合。 ( 4 ) 待分离胶完全聚合( 胶层与上面水层之间有明显的界限) ，吸净上层 液体，连续平稳地在分离胶上面注入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，然后小心 插入梳子，注意不要在顶端留下气泡； ( 5 ) 待浓缩胶完全聚合后，取下梳子、夹子等将此凝胶板放置于电泳槽中； 一 研究论文 ( 6 ) 在电泳上、下槽即两侧电极槽中注入电泳缓冲液，注意缓冲液与凝胶 上下两端之间不要有气泡； ( 7 ) 将待测蛋白样品与样品处理缓冲液以1 ：1 的比例混合，煮沸5 m i n ，冷却 至室温： ( 8 ) 在凝胶玻璃板上做记号，将样品分别加在凝胶样品槽中； ( 9 ) 调节电泳电压至8 0 v ，当指示染料溴酚蓝进入分离胶后将电压上调至 1 2 0 v ，当染料迁移至凝胶下端附近，约距下端l c m 左右，关闭电源，停止 电泳； ( 1 0 ) 将凝胶玻璃板从电泳槽上取下，切去浓缩胶，在分离胶左上切去一 小角作为记号，将凝胶浸入染色液中，染色1 h ，弃去染色液； ( 1 1 ) 加入脱色液，脱色2 h ，期间更换2 3 次脱色液； ( 1 2 ) 凝胶浸泡在脱色也中过夜，直至背景透明清楚； ( 1 3 ) 观察电泳结果。 2 5 4w e s t e r n b l o t 操作步骤 s d s p a g e 同上： ( 1 ) 剪出凝胶同样大小的膜，将滤纸及转移膜浸入转移缓冲液中；平衡 3 0 m i n ： ( 2 ) 将电泳完毕的凝胶做上记号( 一般在胶的底部切去一角) ，放入转移 缓冲液平衡3 0 分钟； ( 3 ) 在转移缓冲液中按照自下之上的顺序，将滤纸、p v d f 转移膜、凝胶、 滤纸重叠，各层之间避免留有气泡； ( 4 ) 组装电转移槽，凝胶在阴极，p v d f 膜在阳极； ( 5 ) 通电转移，恒压6 0 v ，电转移4 h ： ( 6 ) 转移结束，取出p v d f 膜，丽春红染色，观察蛋白转移情况； ( 7 ) 用蒸馏水冲洗p v d f 膜直至丽春红色消失，封闭液在室温下封闭非特 异性抗原2 h ； ( 8 ) 加入1 ：5 0 0 稀释的兔抗人t w i s t 多克隆抗体，1 3 - a c t i n ，4 。c 过夜； ( 9 ) 洗去未结合的抗体：用t w e e n 2 0 漂洗液振荡漂洗1 0 m i n 3 ； ( 1 0 ) 加入辣根过氧化物酶标记的二抗( 1 ：2 0 0 0 稀释) ，3 7 * c 摇床作用1 h ； ( 11 ) 洗去未结合的二抗，t w e e n 2 0 漂洗液振荡漂洗1 0 m i n x 3 ； ( 1 2 ) d a b 显色； 研究论文 ( 1 3 ) 膜置于滤纸上干燥，分析结果。 将条带结果进行光密度值分析，目的蛋白与p a c t i n l