（分析化学专业论文）氨基酸金属离子体系的测定.pdf

摘要 摘要 金属元素及其配合物稳定常数测定的主要方法有电化学分析法、配位滴定 法、光谱分析法及色谱分析法等。氨基酸与许多金属离子能够配合并释放出氢 离子，从而引起电位的变化，找到合适的体系之后可用计算滴定分析的方法对 金属离子、氨基酸及其稳定常数进行测定。本文以氢离子选择性电极为工作电 极，以氨基酸和金属离子的配位反应为研究体系，做了以下工作：( 1 ) 对恒电 位滴定法测定的体系进行选择。经过对谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸和组氨酸与铜 离子及锌离子所组成的不同体系的试验，最终确定了组氨酸一铜离子作为研究体 系，并探讨了恒电位滴定法适用的氨基酸类型。( 2 ) 用恒电位滴定法测定了铜 离子和组氨酸的含量。其中，铜离子的测定误差基本控制在1 以内；组氨酸的 测定误差一般不超过2 。 ( 3 ) 用p h 电位法测定了甘氨酸铜离子配合物的稳 定常数。用氢氧化钠滴定甘氨酸铜离子混合溶液，利用标准碱与生成函数的关 系求得稳定常数。实验结果与文献值吻合较好。并探讨了反应温度对稳定常数 的影响。( 4 ) 还用紫外可见分光光度法测定了组氨酸铜离子配合物的稳定常数。 关键词：氨基酸，铜离子，稳定常数，恒电位滴定，p h 滴定 a b s t r a c t a b s t r a c t t h em a i nm e t h o d so fd e t e r m i n i n gt h em e t a le l e m e n t sa n dt h es t a b l ec o n s t a n t so f t h e i rc o m p l e x e sa r ee l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i s ，l i g a n dt i t r a t i o n ，s p e c t r a la n a l y s i s ， c h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i sa n d s oo n t h ea m i n oa c i d sc a nc o p ew i t hl o t so fm e t a li o n s ， r e l e a s eh y d r o g e ni o n sa n dc h a n g et h ep o t e n t i a l t of i n dt h es u i t a l es y s t e mc a nu s e m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r a t i o na n a l y s i st od e t e r m i n ea m i n oa c i d s ，m e t a li o n sa n d t h e i rs t a b l ec o n s t a n t s i nt h i sp a p e r , i ts t u d i e st h ec o o r d i n a t i o nr e a c t i o no ft h ea m i n o a c i d sw i t ht h em e t a li o n sb yu s i n gt h eh y d r o g e ni o n s - s e l e c t i v ee l e c t r o d e a st h e w o r k i n ge l e c t r o d e t h ej o bi n c l u d e s ：( 1 ) t h ed e t e r m i n a t i o ns y s t e mb ym u l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o nt i t r a t i o nc a nb es e l e c t e d t ot e s tt h ec o m p l e x e so f 酉u t a m i ca c i dw i t hz i n c i o n s ，a l a n i n ea c i dw i t hz i n ci o n s ，g l y c i n ea c i dw i t hz i n ci o n s ，h i s t i d i n ea c i dw i t hz i n c i o n s ，g l u t a m i ca c i dw i t hc o p p e ri o n s ，a l a n i n ea c i dw i t hc o p p e ri o n s ，g l y c i n ea c i dw i t h c o p p e ri o n s ，h i s t i d i n ea c i dw i t hc o p p e ri o n s ，f i n a l l yh i s t i d i n e - c o p p e ri o n si si d e n t i f i e d a st h er e s e a r c hs y s t e m s o ，w h i c ht y p e so ft h ea m i n oa c i d sc a na p p l yt h em u l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o nt i t r a t i o ni se x p l o r e d ( 2 ) r n l ec o n t e n to fc o p p e ri o n sa n dh i s t i d i n ea c i di s d e t e r m i n e d t h em e a s u r e m e n te r r o ro fc o p p e ri o n si sa tl e s st h a n1p e r c e n ta n dt h e d e t e r m i n a t i o ne r r o ro fh i s t i d i n ea c i di sa tl e s st h a n2p e r c e n t ( 3 ) t h es t a b l ec o n s t a n t s o ft h ec o m p l e xf o rg l y c i n e c o p p e ri o n sa r ed e t e r m i n e db yp ht i t r a t i o n t 1 l c e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ei ng o o da g r e e m e n t w i t hl i t e r a t u r ev a l u e s a l s o ，t h er e a c t i o n t e m p e r a t u r eo nt h ei m p a c to fs t a b l ec o n s t a n t si se x p l o r e d ( 4 ) t h ec o m p l e xs t a b l e c o n s t a n t sf o rh i s t i d i n e c o p p e ri o n sa r ed e t e r m i n e db yu v - v i ss p e c t r o p h o t o m e t r i c k e yw o r d s ：a m i n oa c i d ，c u ( i i ) ，s t a b l ec o n s t a n t ，m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r a t i o n ， p ht i t r a t i o n 1 1 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 立 j 。 导师签名： 年弓月，牛e t 年月日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：毙、 7 彳”刖烟 第1 章引言 第1 章引言 1 1金属元素的测定方法 目前，国内外测定金属元素的方法有很多，主要有光谱分析法、色谱分析 法、电化学分析法及配位滴定法。 1 1 1 光谱分析法 光谱分析法包括：原子发射法，原子吸收法，紫外吸收及荧光光谱法。其 中石墨炉原子吸收分光光度法灵敏度较高，普适性较强，可被用于土壤或食品 中多种金属元素( 常见的有f e 、c u 、z n 、c d 及p b 等) 的测定，并能在环境监测 中对所有主要金属阳离子( 女t l n a + 、k + 、m 9 2 + 、c a 2 + 、c u 2 + 、n i + 、c l ；+ 及a 矿等) 进行测定【l 】。但这种方法相对标准偏差较大，在消化过程中容易造成金属元素的 损失从而导致测量结果偏低；紫外吸收光谱法要求待测物在紫外区有吸收，否 则需要寻找合适的显色刹2 l ；荧光分析检测限非常低，可达1 0 d o m o l l 能够检测 痕量金属【3 j ，在矿业和医药方面都有所应用，但易受其他共存离子的干扰。 1 1 2 电化学分析法 电化学分析法具有灵敏、准确、快速的特点，方法多样，检测的含量范围 宽，能对组分、形态、价态进行分析【4 】，特别适用于连续、自动和在线分析，这 决定了其在元素分析中的重要地位【5 1 。用于元素分析的电化学方法有极谱法、伏 安法、离子选择性电极法及库仑分析法。 1 1 3 配位滴定法 利用金属离子与其他物质的配合性进行测定，最常见的是用e d t a 作为滴定 剂。该方法操作简便，无需大型仪器，但是有较大的局限性，如某些金属离子 对指示剂的屏蔽作用。并且用该法进行实际样品分析时，由于常有多种元素共 存，而e d t a 又能与许多金属离子形成稳定的配合物，这样势必会造成对被测定离 1 第1 章引言 子的干扰。这方面也有人做了工作，如通过控制酸度和加人掩蔽剂滴定铅、镉、 钙三种离子【6 1 ，不少中外学者也突破了传统的滴定方法1 7 捌，扩大了其使用范围， 增强了该法的实用性。 1 1 4 其他分析法 随着仪器分析的发展，离子色谱法、电感耦合等离子体质谱法( i c p m s ) 及电感耦合等离子体发射光谱法( i c p a e s ) 等在金属元素测定领域也得到广泛 应用。i c p m s 法同时测定多种金属元素也得到了较多应用，如测定水中c r 、m n 、 f c 、c u 、z n 、n i 、m o 、c o 、c d 等元素1 9 j ，它具备准确、快速、线形范围宽等特 点，主要针对微量或痕量金属元素的测定。国内有学者利用离子色谱非梯度洗 脱法同时测定7 种稀土元素，取得了很好的效果l l 川；i c p a e s 法具有多元素同时 测定i l ，低检测限，高灵敏度，操作简单，分析速度快，基体干扰少的优点， 非常适于进行大气颗粒物中痕量金属元素同时测定1 1 2 1 。也有学者利用i c p a e s 法分析污泥中铅、镉、铬含量1 1 3 】和饮用水中的金属离子含量。此# - i c p a e s 法也 可被应用于金属元素测定1 1 4 1 。针对某些特定目的，一些新的方法也有所发展， 如，采用坯境扫地史壬垦邀垡和x 射线电子探针的方法，测定了水稻籽粒不同部 位重金属的含量【l 5 。 1 2 氨基酸的性质及测定方法 1 2 1 氨基酸的概述 氨基酸是最基本的生命物质。作为游离态的氨基酸是构建生物机体的众多 生物活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基础材料，是制造精卵细胞的 主体物质，是合成神经介质的不可缺少的前提物质；当氨基酸合成蛋白质以后， 被用以对抗细菌和病毒的侵染，传送氧气，制造酶和激素以维持和调节新陈代 谢。 氨基酸是分子中具有氨基和羧基的一类含有复合官能团的化合物，具有共 同的基本结构。迄今为止，自然界中已经被发现的氨基酸有1 8 0 多种，而其中参 与蛋白质合成的氨基酸有2 0 种，称为基本氨基酸。2 0 种基本氨基酸中，除脯氨 2 第1 章引言 酸外其余均为o t 一氨基酸，即羧酸分子中的q 一碳原子上的一个氢原子被氨基取 代而成的化合物。本文所涉及的氨基酸，除特别说明外均为a 一氨基酸。 1 2 2 氨基酸的分类 c o o 一 +i h 8 n _ 彳_ h r 图1 1c t 一氨基酸的结构式 表1 1 各类氨基酸在2 5 c 时的p h 值和p i ( 等电点) 近似值【1 6 1 极性状况带电状况氨基酸缩写符号p 屉删p p 届p i 组氨酸 h i s1 8 29 1 76 o7 5 9 带正电荷赖氨酸 l y s 2 1 88 9 51 0 5 39 7 4 精氨酸 a r g 2 1 79 0 41 2 4 8l o 。7 6 天冬氨酸 a s p 1 8 89 6 73 6 52 7 7 极 带负电荷 谷氨酸 g l u2 1 99 6 74 2 53 2 2 性 丝氨酸 s e r2 2 19 1 5 5 6 8 氨 基 苏氨酸 t h r2 6 31 0 4 36 5 3 酸 天冬酰氨 a s n2 0 28 8 05 4 1 不带电荷 谷氨酰氨 g l n2 1 7 9 1 35 6 5 酪氨酸 t y r 2 2 09 1 l1 0 0 75 6 6 半胱氨酸 c y s 1 9 6 1 0 2 88 1 85 0 7 ( 3 0 ) 甘氨酸 g l y 2 3 49 6 0 5 9 7 非 丙氨酸 a l a2 3 4 9 6 96 o 极 缬氨酸 v r a l2 3 29 6 25 9 6 性 异亮氨酸 i l e2 3 69 6 86 0 2 氨 基 苯丙氨酸 p h e1 8 39 1 3 5 4 8 酸 蛋氨酸 m e t2 2 89 2 l 5 7 4 脯氨酸p r o1 9 9 1 0 6 06 3 0 3 第1 章引言 根据分类原则不同，氨基酸有多种分类方式。2 0 种基本氨基酸可根据其侧 链上的不同r 基团极性的不同分为非极性氨基酸和极性氨基酸。其中，极性氨 基酸又可以分为不带电荷的极性氨基酸、带正电荷的极性氨基酸以及带负电荷 的极性氨基酸，具体见表1 1 。 按化学结构式分为脂肪族氨基酸，芳香族氨基酸以及杂坏氨基酸。其中脂 肪组氨基酸又可按其分子中含有的氨基或羧基的数目分成：一氨基一羧基酸， 一氨基二羧基酸和二氨基一羧基酸。 正是由于氨基酸所含这些基团的数目不同而左右了氨基酸的酸碱性。常见 氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸含有两个酸性的羧基，常称为酸性氨基酸；精氨酸 和赖氨酸都含有两个碱性的氨基和一个酸性的羧基，组氨酸的含氮杂环具有微 碱性，三者统称为碱性氨基酸；其他氨基酸通常都称作中性氨基酸。 此外氨基酸还可以从营养学角度上分为必需氨基酸和非必需氨基酸。 1 2 3 氨基酸与金属离子的配合 大多数过渡金属离子都有良好的配位性能，其中不少金属离子能与氨基酸 形成稳定配合物。近年来，氨基酸微量元素金属离子配合物的研究一直为人们 所重视，并且发展迅速。如有人利用p h 电位法研究了甘氨酸及其二、三肽与锌、 铜元素的配位作用，并测定相应的配位稳定常数【1 7 】；锌( i i ) 氨基酸配合物分子 内配体间疏水作用，应用p h 电位滴定法研究了锌氨基酸配合物在水和2 0 、4 0 及6 0 - - 氧六环水溶液种的稳定性【1 8 】等等。 金属离子与氨基酸配体形成配合物的过程也就是与氢离子竞争的过程，溶 液中的总反应为 m + n i l 。a a = m ( a a ) 。+ ( n x m ) h 从而反应过程中p h 值不断变化，其变化规律与配合物的各级稳定常数有关。不 少学者在此基础上展开了研究工作，! t i s a n d r i n e 用p h 滴定法对铝一氨基酸配合物 进行了定量研究，并评估了其与铝在人体中的代谢和毒性的联系。此外人们还 对氨基酸金属离子配合物的性质展开研究【1 9 - 2 0 1 。唐浩等【2 1 l 用滴定量热法分别测 定了铜离子与六种氨基酸配合物在2 9 8 1 5 k 下配位反应的热效应。计算了一级配 合反应产物和二级配合反应产物的稳定常数及配位反应热焓，并由此推出反应 的吉布斯自由能变化和熵变。讨论了铜离子和氨基酸的结构对配合物稳定性的 4 第1 章弓i 言 影响。王瑞瑶等i 翻总结讨论了稀土金属离子和氨基酸所形成的配合物的化学键 特点，结构类型及一般规律。刘岩松1 2 3 j 研究了锌铜色氨酸配合物的伏安特性。 1 2 4 氨基酸的测定方法 氨基酸分析作为生命科学研究中最重要的技术之一，始于上世纪三、四十 年代，当时使用的方法包括色谱、离子交换树脂等。而在2 0 世纪8 0 年代之后， 随着毛细管电泳与电化学方法测定相结合之后，电导检测、安培检测和电化学 发光分析等检测技术成为了氨基酸分析的另一种发展趋势。 目前主要的氨基酸分析方法大致可以分为四大类，化学分析法，光谱分析 法，电化学分析法和色谱分析法。 与此同时，一些尖端技术也逐渐开始被应用于氨基酸的分析分离。如等温 滴定反应热测定，核磁共振滴定分析等方法。 纵然目前氨基酸分析可供选择的方法很多，如何通过简单、廉价而又具有 较高准确性的仪器或实验方法对氨基酸的测定分析，始终是氨基酸分析技术中 一个不可忽视的发展方向。而电位滴定方法可以胜任氨基酸分析中的一些简单 的测定，能够取得良好的效果。 1 3 配合物稳定常数的测定方法 配合物稳定常数是研究受体和配体的结合作用的重要参数。稳定常数的测 定方法大多是以配合物形成时所引起的物理化学性质的改变为依据，为了得到 稳定常数，首先要选择适当的测定方法，在各种测定稳定常数的方法中，除了 经典的电位法、分光光度法外，还出现了很多新方法如h p l c 法、毛细管电泳 法、离子色谱法、流动注射离子交换法及火焰原子分光光度法( 见表1 2 ) 。 本文选用p h 电位法和分光光度法测氨基酸和铜离子配合物的稳定常数。 1 3 1电化学法 当配合物形成时，金属离子和配体浓度发生的变化会使电化学性质发生改 变，根据测定这种变化的方法，一般可分为电位法和极谱法。 电位法就是选择适当的指示电极和参比电极组成电池，测定其电动势，再 5 第1 章引言 利用适当的函数关系求出配合物的稳定常数。该法简单可靠，但是应用该法时 所选用的电极必须为可逆惰性电极，而且要处理好液接电位产生的实验数据误 差。 当弱酸或弱碱配体在形成配合物时，溶液的p h 值往往会发生变化，从p h 值的变化可以算出配体的平衡浓度及生成函数，从而进行稳定常数的计算。p h 电位法一般需要配体理解常数，需要在测定配合物稳定常数的同样条件下测定 离解常数，其数据处理与计算稳定常数基本相同。p h 电位法是一种极有效的方 法，不仅用于单核混合配合物的研究，也用于多核配合物的研究。 以金属离子配合物为例，金属离子与配体形成配合物的过程也就是与氢离 子竞争的过程，溶液中的总反应为 m + n h 。l = m l + ox m ) h 因此反应过程中p h 值不断变化，其变化规律与配合物的各级稳定常数有关。在 这个反应体系中，已经和金属离子配合的配位剂的浓度与金属离子的总浓度之 比，称作生成函数或平均配位数，记作h - 。生成函数的数学表达式为 二：c l - l i c m c l 和c m 是配位剂和金属离子的总浓度；【l 】是没有与金属离子形成配合物的配位 剂的浓度。 根据溶液中的平衡关系，可以得到生成函数万和配合物的逐级条件累积稳定 常数屏( i = l n ) 及溶液中配位剂平衡浓度【l 】之间的关系。 一 瞩 l f n = 童! h 1 + 3 i l 】i i = 1 因此从p h 值的变化可以算出配体的平衡浓度及生成函数，从而进行稳定常 数的计算。 电位法应用最为广泛。张有娟，陈静等【2 4 l 等用p h 电位滴定法研究了两种体 系中甘氨酸和铜配合物稳定常数的测定。此外电化学方法在测定稳定常数方面 也有了一些新发展。s c a r a n o 等采用配位竞争阳极溶出伏安法测定海水中c u 配 合物的稳定常数。刘海坤等采用微分脉冲伏安法，以悬汞电极为工作电极测定 铅( i i ) 精氨酸配合物的稳定常数。这些方法可替代传统的电位滴定法和经典极 6 第1 章引言 谱法等方法，可大大地降低被测配合物中金属离子浓度，有利于低浓度下研究 配合物。但必须准确控制配位数，才能得到准确的结果【2 5 1 。 1 3 2 分光光度法 分光光度法是根据配合物形成时溶液吸光度发生变化，配合物、配体及金 属离子的吸收光谱不同，从而求出配合物的稳定常数。分光光度法的应用广泛， 其优点是迅速可靠，可测的溶液范围较广，适合于低浓度的溶液( 浓度可选1 酽 1 0 m o l l ) ，但是数据处理比较困难，未知数的数目比电位法多。 分光光度法测定稳定常数又分为等摩尔连续变化法和对应溶液法。等摩尔 连续变化法是在一定体积溶液内，配体和金属离子的总摩尔浓度( c m + c l ) 不 变而改变两者的比例，由 a ： ! 丝生! ( c m 。一【m 乙】) 【c k 一m l 】) 计算稳定常数。该法简单、迅速，但不适用配合物的稳定性太大、太小或配体 数目太高的情况。等摩尔连续变化法也可以用来测定配合物的组成，通过吸光 度与金属离子的物质量分数作连续变化曲线，可以求出配体和金属离子的组成 配比，并可以计算配合物的稳定常数。卢泽楷等【硼采用等摩尔连续变化法测得3 种氨基酸与铜离子配合的组成配比，并计算了配合物的稳定常数。 对应溶液法适用溶液中存在多种配合物的复杂体系，其理论基础是生成函 数 二：删：型 1 + 屈 l r 其中一系列n 、【i d 相同，f f c l 、c m 不同的溶液称作对应溶液。找出这样的一列 溶液，由c l 、c m ，求出疗、【l 】，从而求出逐级稳定常数。但通过吸光度寻找对 应溶液比较困难。步骤繁琐、工作量大、数据处理困难和结果准确性差等限制 了它的应用。林秀丽等【2 7 】在铜氨基酸配合物的稳定常数测定中，引进平均摩尔 吸光系数简化了对应溶液的寻找，并获得了较满意的效果。 随着现代仪器分析技术的发展，色谱法，毛细管电泳法应用越来越广，亲 7 第1 章引言 和毛细管电泳法( a c e ) 应用于配合物稳定常数的测定，越来越显示出广阔的 前景。它们的测定原理、特点及应用见下表。 表1 2 配合物稳定常数的主要分析方法总纠捌 类 分析 测定原理或测定对象特点应用 别 方法 选择适当的指示电极和参比电简单、数据可靠 罗勤慧以丙二酸根乙 电 极组成电池，测定j e 电动势， 所用电极必须为可逆惰 二胺合铜为例，测定其 然后计算指示电极的电位，再 性电极。 稳定常数。 位 利用f r o n a u e s 函数测定配合物 r o s s o t t i 2 8 1 对液接电位 法 的稳定常数。 产生的实验数据误差做 了很好的处理。 p h 当弱酸弱碱型配体在形成配合极有效的方法，不仅用于张毕麟对n i 2 + 和多种氨 电 物时，溶液的p h 值发生变化， 单核混合配合物的研究基酸的混合型配合物的 化 电 从p h 值的变化算i i l 配体的平衡 也用于多核配合物的研稳定常数的测定作丫详 学 位浓度及生成函数。究。细研究。 分 法 析 法 根据加入配位剂前后金属离子方法多样。c r o w 以c d 2 + 为指示离 半波电位的改变来计算稳定常 不管金属离子是否在电 子，吡唑为配体测定了 数，利用金属离子可逆还原的 n i 2 吡唑配合物的稳定 极 极上可逆还原均可适用。 极谱波，当一定浓度的配体加 常数。 谱 入到金属离子的溶液后形成配 合离子，其峰电位随着配体浓 法 度的增加而负移。另外还可利 用极限扩散电流随配位浓度改 变的关系米计算稳定常数。 根据配合物形成时溶液中光密 应用仅次于电位法及p h 等摩尔连续变化法： 度发生变化，凶而配合物的吸电位法，优点是迅速町靠， 曾伟等通过对不稳定配 分收光谱与配位及金属离子的吸溶液选择的范围比较广，合物离解度的测定，利 光 收光i 譬有所不同，从而求出配适合于低浓度的溶液( 浓用线性回归法校正配合 合物的稳定常数。 度可1 0 - 4 。1 0 5 m o l l ) 。 物的摩尔吸光系数及离 光 解度，。求算配合物的稳 数据处理时，未知数的数 度 日比电位法多，对复杂体 定常数。 法 系的研究存在一定困难，对廊溶液法：林秀丽 j e 准确性也比i 乜位法差。等1 2 7 】祚钢氨皋酸配合 物的稳定常数。 8 第1 章引言 续表1 类 分析 测定原理或测定对象特点应用 别 方法 高 有柱前衍生，柱后衍生两大类。简便、迅速，准确度高，u e k a m a 等将h p l c 法应 目前多用柱前衍生反相高效液适用于多阶逐级稳定常用于配合物稳定常数的 效 相色谱法，用柱上衍生反相色数的测定测定取得了较好的效 色液 谱法测得保留时间以计算稳定 果。 谱相 常数。 h o r v a t h 等提f f 用反相 法 色 h p l c 方法测定某些金 属离子与各种核甙酸、 谱 冠醚、弧硝基r 盐形成 法 配合物的稳定常数。 离子或荷电粒子以电场为驱动 所需样品少( p g 级) ；对受 a c e 用于研究受体配体 力，在毛细管中按其迁移率或体的纯度要求不高，可以相互作用，测定其稳定 表观迁移率不同进行高效、快同时研究多种配体对一常数。 速分离的一种新技术。种受体的结合行为：在溶 w h i t e s i d e s 等与h o n d a 毛 亲和毛液中进行，可以保持受体 等报道了通过测定受体 细管电与配体作用所需的生理 细 在含有不同浓度配体的 泳 条件，更接近体内的结合 缓冲溶液中迁移时间的 管 ( a c e ) 行为；不需对受体或配体 变化来计算稳定常数的 电 进行标记，简化- ，操作步 方法。这种方法称为“迁 骤；有多种模式可供选 泳 移牢移动法”( 或“峰漂 择，适合各种亲和体系； 移法”) 法测定速度快，准确性好 ( c 空亲和 相互作用的组分加入缓冲液准确，有效 b u s c h 等提出了空亲和 e )中，在电泳谱上产生两个负峰，毛细管电泳法( v a c e ) 毛细管 电泳法 负峰的迁移时间反映丫混合物 ( v a c 中组分结合部分与游离部分的 分数。这种漂移与稳定常数相 e ) 关，从而计算出稳定常数。 9 第1 章引言 1 4 滴定计算分析法 上世纪五十年代初瑞典化学家g r a n 提出了计算滴定分析法，其后这种方法 逐渐受到重视，其理论亦不断完善。尤其是在上世纪八十年代之后，随着计算 机技术的飞速发展，实验中繁琐的数据处理得以大为简化【2 9 出】，这更使得滴定 计算分析在理论上和应用上得到了更大的发展。 计算滴定分析法一般思路是先建立一个包括滴定剂体积、被测物浓度、稳 定常数及其他常数在内的数学模型，也即滴定方程，为了方便计算，必要的时 候可作适当的简化，然后根据滴定过程中记录的滴定数据( 如e ，y 或p h ，y ) ， 通过适当的数学计算，确定被测物质的浓度。 按滴定形式、计算模型、测定原理及滴定剂的性质等可将计算滴定分析法 分为了控制体积滴定法和控制电位滴定法两大类。 控制体积滴定法，即首先确定标准溶液( 滴定剂) 加入的体积，当滴加到一 定体积时记录电位，从而得到若干组数据( e ，y ) ，通过数学模型计算出待测 溶液的浓度。根据采用数据( e ，y ) 组数的不同，控制体积滴定法又可分为线 性滴定、单点滴定和双点滴定。 控制电位滴定法，也被称作恒电位滴定或校正滴定法1 3 5 j ，多元校正是一种数 学方法，l i n d b e r g 和k o w a l s h i 于1 9 8 8 年首次将其引入滴定分析中，并由此产生 了多元校正滴定分析法。这种方法的基本原理是：滴定曲线上的每一电位点处 滴定剂消耗的量与待测物的浓度存在如下关系 = 七盯c ，+ k f 。 ，= 1 其中，f 和f 分别对应不同的工作电位和混合溶液中的不同组分； e 为达到工作电位时消耗的滴定剂体积； c ；为混合溶液中f 组分的物质的量浓度； k ，为比例系数，k ，。为非零截距。 该方法的优势在于，这个线性计算模型不涉及反应中的具体步骤，无须对 电极进行严格校正，也无须预知待测物质的反应常数。因而该方法具有一定的 理论和实际应用价值。 1 0 第1 章引言 根据控制电位滴定法的数学模型可知，只需使用待测物质的校准溶液，在 工作电位下进行测定，便可求出数学模型中各常数k 的准确值( 由于该校准溶液 的浓度是已知的，且在每一个工作电位e 之下，所加入的滴定剂体积v i g 是可以 读取的，因而通过这些数据可以求出每个工作电位下数学模型中各常数七) 。在 获得常数k 值之后，可以在相同电位下对待测溶液进行滴定，将实验测得的滴定 剂体积眦入计算模型，经过数据处理，便可获知待测物质的浓度。 根据实验过程中所选取的电位点数的不同，控制电位滴定法又可分为单电 位滴定和多电位滴定。 单电位滴定：即在实验中只选用一个电位，根据这一电位下消耗的滴定剂 的体积，求得待测溶液的浓度。这种方法只适合单组分的测定，其不足之处和 控制体积中的单点滴定法相似。 多电位滴定：根据实际需要选取若干个电位，每滴到一个电位就可得到一 个相应的滴定剂体积，将这些体积代入计算模型中，用适当的数学方法( 如最 小二乘法) 就能求出待测溶液的含量。这种方法既适合单组分含量的测定也适 合多组分的钡6 定，用计算机处理数据也不显复杂，测定结果准确度高，因此各 种有关这方法应用的报道也不少。 1 5 本文所作的工作 用电位滴定的方法测定金属离子的方法有很多，如配位滴定法，氧化还原 滴定法等等，但是始终面临着电极选择的问题，一般金属基电极测定固定的金 属离子，金属电极的选择有一定的难度，并不是每种金属都有与之对应的电极， 而且即使有对应的电极，大部分的金属电极测定的稳定性和重现性都不是很理 想，干扰离子的存在对测定的准确度有影响。离子选择性电极是比较理想的电 极，电极膜对特定的离子具有选择性响应，这样相对而言准确度较高，但同样 面临某些金属离子没有对应的离子选择性电极的问题。氨基酸与许多金属离子 能够配合并释放出氢离子： m + n h 。l = m l + o 肌) h 反应过程 p h 值不断变化，从而引起电位的不断变化。选用氢离子选择性电极， 在一定的电位下可测得金属离子。这样在找到了合适的体系之后可以用滴定分 析的方法对许多金属离子进行测定，而且只需用到一支氢离子选择性电极，从 1 1 第1 章引言 而提高了分析的效率和准确性。 本文以氢离子选择性电极为指示电极，以氨基酸一金属离子的配合反应为研 究体系，做了以下工作： ( 1 ) 氨基酸金属离子体系的选择。分别对组氨酸、甘氨酸、丙氨酸以及谷 氨酸与铜离子及锌离子所组成的不同体系进行了试验，并最后确定了组氨酸一铜 离子和甘氨酸铜离子为研究体系。 ( 2 ) 以氨基酸为滴定剂，用恒电位滴定法测定铜的含量；以铜离子溶液为 滴定剂，用恒电位滴定法测定氨基酸的含量，并对实验误差进行讨论和分析。 ( 3 ) 以一定浓度的氢氧化钠溶液为滴定剂，滴定氨基酸和金属离子混合溶 液，利用p h 电位法，从溶液p h 值的变化求出配体的平衡浓度及生成函数，从 而用生成函数法对氨基酸铜离子配合物的稳定常数进行了测定。 ( 4 ) 用对应溶液紫外分光光度法测定了组氨酸铜离子配合物的逐级稳定常 数。 1 2 第2 章恒电位滴定法对铜离了及氨基酸的测定 第2 章恒电位滴定法对铜离子及组氨酸的测定 2 1原理部分 2 1 1p h 电极法测定金属离子或氨基酸的原理 氨基酸与许多金属离子能够配合并释放出氢离子： m + n h 。l = m k + ox m ) h 反应过程中p h 值不断变化，从而引起电位的不断变化。以氢离子选择性电极作 指示电极，可以用恒电位滴定法测定金属离子或氨基酸的含量。 2 1 2 计算模型和原理 多组分体系的恒电位滴定分析法数学模型的表达式为 k = 七日c j + 屯。 ( 2 1 ) j = l 其中，f 和j 分别对应不同的工作电位和混合溶液中的不同组分，小为组分个数。 对单组分体系而言，恒电位滴定法的表达式可以简化为 k = 也c + 色。 ( 2 2 ) 其中，y 为达到工作电位i 时消耗的滴定剂体积；c 为待测组分的物质的量浓度； k i 和七，n 为工作电位f 下的常数。 恒电位滴定法的实验步骤可分为两个阶段：第一阶段，在若干个工作电位最 下对已知浓度的一系列校准溶液进行测定，求出计算模型( 式2 2 ) 中常数七：和 t 。第二阶段，对未知浓度的待测溶液进行测定。将待测溶液滴定到该电位， 测定用去的滴定剂的体积v ；将y 代入计算模型可求出待测物质的含量。 2 2实验部分 1 3 第2 章恒电位滴定法对铜离子及氨基陵的测定 2 2 1实验仪器及试剂 1 实验仪器 7 9 8 m p t 全自动滴定仪( 瑞士万通) ；氢离子选择性复合电极( 瑞士万通) ； 铜离子选择性复合电极( 瑞士万通) ： ( d r a g o n m e d0 - 5 0 0 m 1 ) ；电子天平； 常用玻璃仪器。 2 实验试剂 银氯化银电极( 瑞士万通) ；移液枪 分析天平；医药天平；计算机；实验室 甘氨酸( 生化试剂) ；组氨酸( 生化试剂) ；e d t a ( a r ) ；邻苯二甲酸 氢钾( a r ) ；五水硫酸铜( a r ) ；硝酸钾( a r ) ；醋酸钠( a r ) ；盐酸( a r ) ： 乙酸( a r ) ；纯铜( 9 9 9 9 ) ；浓氨水( a r ) ；甲基橙( a r ) 。 2 2 2 溶液的配制 1 组氨酸母液的配制 用分析天平准确称量于1 0 5 。c 的电烘箱中干燥2 小时的氨基酸3 8 7 8 4 9 和 3 8 7 8 8 9 两份，移至1 0 0 m l 的烧杯中，加入蒸馏水，使其完全溶解。然后将溶液 转移至2 5 0 m l 和5 0 0 m l 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液全部转移 至容量瓶中，最后加入蒸馏水稀释至刻度线，摇匀配制得两份组氨酸母液浓度 为0 1 0 0 0 m o l l 和0 0 5 0 0 0 m o l l 。 2 甘氨酸母液的配制 用电子天平精确称量于1 0 5 c 的电烘箱中干燥2 小时的氨基酸1 8 7 6 8 9 和 1 8 7 6 9 9 ，移至1 0 0 m l 的烧杯中，加入蒸馏水，使其完全溶解。然后将溶液转移 至2 5 0 m l 和5 0 0 m l 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液全部转移至容 量瓶中，最后加入蒸馏水稀释至刻度线，摇匀配制得两份甘氨酸母液浓度为 0 10 0 0 m o l l 和0 0 5 0 0 0 m o l l 。 3 e d t a 溶液的配制与标定 称取e d t a 约4 9 ，转移至4 0 0 m l 的烧杯中，加入2 0 0 m l 蒸馏水，使其完 1 4 第2 章恒电位滴定法对铜离子及氨基酸的测定 全溶解，然后将溶液转移至试剂瓶中，再加8 0 0 m l 水，摇匀待标定。 用电子天平准确称取0 1 5 8 9 9 纯铜，置于1 0 0 m l 的烧杯中，加入1 0m l 盐 酸，滴加约2 - 3 m l 过氧化氢，加热使其溶解完全，再加热分解赶尽过氧化氢， 再煮沸1 2 分钟。冷却后转移到2 5 0 m l 的容量瓶中，配得0 0 1 0 0 0 m o l l 的铜溶 液。测得p h 为2 - 3 ，用1 ：1 浓氨水调节p h 至4 - 5 ，再加缓冲溶液醋酸醋酸 钠，选择铜电极的自动电位滴定仪，用配制好的e d t a 溶液滴定。标定得e d t a 浓度为o 0 1 0 2 9 m o l l 。 4 硫酸铜溶液的配制与标定 称量2 5 9 左右的五水硫酸铜，移至1 0 0 m l 的烧杯中，加入蒸馏水，使其完 全溶解。然后将溶液转移至1 l 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液全 部转移至容量瓶中，最后加入蒸馏水稀释至刻度线，摇匀。 在已配好的硫酸铜溶液中加醋酸醋酸钠缓冲溶液，选择铜电极的自动电位 滴定仪，用配制好的e d t a 溶液滴定。标定得浓度为0 0 0 9 9 6 7 m o l l 。 5 硝酸钾溶液的配制 用托盘天平称取1 0 1 9 硝酸钾固体，移至2 5 0 m l 烧杯中，加入蒸馏水，使其 完全溶解，将溶液转移至1 l 的容量瓶中，洗涤烧杯数次，每次转移至容量瓶中， 定容后摇匀，配制得浓度为l m o l l 的硝酸钾溶液，作为离子强度调节剂。 6 盐酸溶液的配制 用量筒量取2 m l 浓度为3 7 的盐酸，转移至1 l 的容量瓶中，并用蒸馏水 稀释至1 l 。配得0 o 1 0 0 0 m o l l 盐酸，可用于调节氨基酸混合溶液的酸度。 7 组氨酸校j 下溶液和试液的配制 用移液枪吸取组氨酸母液于5 0 m l 容量瓶中，配制浓度为1 0 0 xl o - 3 m o l l 、 2 0 0x1 0 一m o l l 、3 0 0 1 0 0 m o l l 、4 0 0 1 0 。3 m o l l 和5 0 0 1 0 。3 m o l l 的校正溶 液，以及浓度为1 5 0 1 0 一m o l l 、2 5 0 1 0 - 3 m o l l 、3 5 0 1 0 - 3 m o l l 、4 5 0 1 0 。3 m o l l 和5 5 0 1 0 弓m o l l 的待测溶液。具体配制方法见表2 1 。 1 5 第2 章恒电位滴定法对铜离子及氨基酸的测定 表2 1 组氨酸溶液的配制 组氨酸溶液的浓度氨基酸母液的体积 k n 0 3 溶液 ( m o l l )( m l )( m l ) 1 0 0 x1 0 1 1 0 0 5 0 0 校正溶液 2 0 0 x1 0 3 3 0 0 1 0 。3 4 0 0 1 0 3 2 0 0 3 o o 4 0 0 5 o o 5 0 0 5 0 0 5 0 0 1 0 q5 0 0 5 0 0 1 5 0 1 0 。31 5 0 5 0 0 待测溶液 2 5 0 x 1 0 。3 3 5 0 x 1 0 3 4 5 0 x 1 0 3 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 0 0 5 0 0 5 0 0 5 5 0 x1 0 门5 5 0 5 0 0 8 硫酸铜校正溶液和试液的配制 用移液枪吸取硫酸铜母液于5 0 m l 容量瓶中，配制浓度为1 0 0xl o 3 m o l l 、 1 2 0xl o - 3 m o l l 、1 4 0xl o 3 m o l l 、1 6 0x 1 0 3 m o l l 和1 8 0 l o - 3 m o l l 的校正溶 液，以及浓度为1 1 0 l o - 3 m o l l 、1 3 0 l o - 3 m o l l 、1 5 0 1 0 - 3 m o l 几、1 7 0 l o - 3 m o l l 和1 9 0 1 0 3 m o l l 的待测溶液。具体配制方法见表2 2 。 表2 2 硫酸铜溶液的配制 硫酸铜溶液的浓度硫酸铜母液的体积 k n 0 3 溶液 ( m o l l )(ml)(ml) 1 0 0 1 0 5 0 05 0 0 校正溶液 1 2 0 1 0 3 1 4 0 1 0 。3 1 6 0 1 0 。3 6 0 0 7 0 0 8 0 0 5 0 0 5 o o 5 0 0 1 8 0 x1 0 9 0 05 0 0 1 1 0 1 0 q 5 5 05 0 0 待测溶液 1 3 0 x 1 0 3 1 5 0 x1o - 3 1 7 0 1 0 3 6 5 0 7 5 0 8 5 0 5 0 0 5 0 0 5 0 0 1 9 0 1 0 9 5 05 0 0 2 2 3 实验步骤 1 铜离子的测定 第2 章恒电位滴定法对铜离子及氨基酸的测定 将全自动滴定仪设置在等体积测定( m e t ) 模式下，用浓度为0 0 5 0 0 0 m o l l 组氨酸溶液滴定浓度分别为1 0 0 1 0 3 m o l l ，1 5 0 x1 0 - 3 - m o l l ，2 0 0 x1 0 3 m o l l 的硫酸铜溶液。根据滴定曲线确定适合恒电位滴定法的工作电位范围，从而选 定恒电位滴定的9 个电位点( 见2 3 2 中的图2 1 7 ) 。 将全自动滴定仪设置在恒电位测定( d e t ) 模式下，用浓度为0 0 5 0 0 0 m o l l 组氨酸溶液滴定表2 2 中已知浓度的硫酸铜溶液( 校正溶液) 。在之前所确定的 9 个电位点下，读取滴定剂的消耗体积，求出计算模型( 式2 2 ) 中常数t