（生药学专业论文）国产石杉科药用植物的分子生物学研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名 论文使用授权声明 日期 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 导师签名：i 叠 日期： 摘要 摘要 石杉科( h u p e r z i a c c a e ) 植物是一类多年生小型草本植物，土生、附生或生于苔 藓丛中，直立或下垂生长，喜阴凉潮湿环境。近年来随着对石杉科植物的开发和 利用，使得石杉科植物资源逐渐减少。因此，对石杉科植物资源有效的合理保护 与科学的开发利用工作己迫在眉睫。本课题针对这一状况，为了解决石杉科药用 植物的资源匮乏问题，保证石杉科药用植物资源的可持续开发和利用，进行设计 和研究。本论文首先对我国的石杉科植物的生态状况、资源情况、分类情况以及 石杉碱甲在石杉科植物中的分布、研究状况、药理作用等作了详细的分析和描述， 并着重进行如下研究。 1 对石杉科植物的分子生物学研究 利用基因组学对石杉科药用植物进行研究。通过对不同种石杉科植物的总 d n a 的提取，选择叶绿体基因而c l ，r p l l 6 ，m a t k 及p s b a t r n h 间区进行p c r 扩增并测序，通过序列比对并构建系统进化树进行分析，结果阐明了石杉科植物 系统位置和分类关系。系统进化树中石杉科与石葱属p h y l l o g l o s u m 位于系统树的 姊妹枝，共同组成的进化枝与石松科l y c o p o d i a c e a e 植物平行排列，这一结果与 形态学上的分类方法是一致的，支持了将石杉科独立于石松科植物的分类观点。 对石杉科的属下分类，系统进化拓扑树表明，该科植物中明显的包含了两个进化 枝，即石杉属植物进化枝和马尾杉属植物进化枝，这一结果提示了石杉科植物中 两个属的划分的正确性，确立了石杉科植物的系统分类关系，即石杉属h u p e r z i a 与马尾杉属p h l e g m a r i u r u s 的分类方法。这一方法与形态学的分类方法相辅相成， 这一结果是对于捷克植物学家h o l u b 对该属分类的不确定性的有力的答复。并对 属下的分类做了进一步的研究，系统树上石杉属中石杉组和小杉兰组的植物明显 地被分为两个聚群，这一结果同张丽兵、孔宪需的分类学观点相一致。由于马尾 杉属的供试材料不足，其属内系统演化结果尚不明朗，有待于进一步的研究。本 研究还确立了长柄石杉应为蛇足石杉的一个变种，这一观点得到了系统树的支 持。伏贴石杉虽然与小杉兰在形态学上很难区分，在系统树上该两种植物分别聚 于不同的演化枝，并有很高的b o o t s t r a p 支持率，这一结果可以明显的把小杉兰 和伏贴石杉区分开，伏贴石杉应该为一个独立的种。 摘要 通过对不同基因序列比对并通过遗传距离及碱基差异的分析，表明了石杉科 植物之间存在一定的差别，特别是属间有较大的差别，为属问鉴定提供了重要的 鉴定依据。一些形态上相似难以鉴定的种，如蛇足石杉与长柄石杉；东北石杉、 伏贴石杉和小杉兰之间可以通过碱基差异及遗传距离的不同进行准确的鉴定，为 石杉科植物在分子鉴定提供了简便、可靠的鉴定方法。 2 进行了两种石杉科植物蛋白质表达谱的研究 利用蛋白质组学技术对石杉科药用植物进行了研究。为探讨石杉科植物中主 要有效活性成分石杉碱甲生物合成的途径奠定了基础。分析比较了石杉碱甲含量 差别较大的东北石杉和伏贴石杉中的蛋白质的2 - d e 表达谱，优化了从石杉科植 物中提取纯化蛋白质的方法。从东北石杉的蛋白质表达谱中分离出蛋白质斑点 1 3 3 8 个，从伏贴石杉中分出蛋白质斑点1 2 6 9 个。2 7 3 个差异蛋白质斑点多集中 在分子量在1 5 7 5 k d a 和p h 4 - 7 之间。通过对1 3 7 个成功获取的蛋白质斑点的鉴 定，有6 0 个蛋白质斑点鉴定成功。其中在有贡献的1 6 个蛋白质斑点中，斑点 h a 2 2 号蛋白质存在于石杉碱甲含量高的伏贴石杉中，而不含石杉碱甲的东北石 杉中无此斑点，该蛋白质在动物体内为一种丝裂原调节蛋白m r p 3 ，而在植物体 内该蛋白质的作用机理尚不清楚，由于该蛋白质是存在于两种石杉碱甲含量明显 不同，但生长环境和形态相似的两个种中的明显差别蛋白质，它的存在有可能与 石杉碱甲的生源途径有一定的相关性，因而改变了不同的石杉科植物中的石杉碱 甲的含量的高低。另外的1 5 个蛋白质在两个种都存在着差异，表明，这些有差 异的蛋白质都有可能参与了石杉碱甲的生物合成途径。以上结果还需要进一步的 试验验证。本实验为寻找参与石杉碱甲合成的功能基因或蛋白质提供了重要的参 考资料。该研究将为对石杉科药用植物次生代谢产物的生物合成途径以及与基因 和蛋白质的关系的研究奠定了坚实的基础。 本实验研究在国内外尚未见文献报道，属国际首创。该研究为中药植物资源 的合理开发和保护提供了一个全新的研究思路。 2 a b s t r a c t r e s e a r c ho nm o l e c u l a r b i o l o g yo fh u p e r z i a c e a e m e d i c i n a lp l a n t s a b s t r a c t h u p e m i a c e a ei sa l la n c i e n tg r o u po fp l a n t st h a th a saw o r l d w i d ed i s t r i b u t i o n a m a j o r i t yo fh u p e r z i a c e a ep l a n t so c c u re i t h e ra se p i p h y t e si nl o w - t om i d - a l t i t u d e m o n t a n er a i nf o r e s t so fs o u t ha m e r i c a , a f r i c a , a n ds o u t h - e a s ta s i a , o ra sg r o u n d d w e l l e r si no p e n sh a b i t a t so ft h eu p p e rm o n t a n en e o t r o p i c a lr a i nf o r e s t sa n d h i g h - a l t i t u d ea l p i n ev e g e t a t i o no f t h em o u n t a i n so f t h e s er e g i o n s t h i sg r o u po f p l a n t s i s f i e q u e n f l yu s e di nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e sf o rt h et r e a l a n e n to fa l z h e i m e r s d i s e a s e ( a d ) ，m y a s t h e n i ag r a v i s ( m g ) ，f e v e r , a n dp n e u m o n i a h u p c r z i n ea ( h u p - a ) i s o n eo ft h ep r i m a r yi n g r e d i e n t st h a ta r ee x t r a c t e df r o ms p e c i e so ft h eh u p e r z i a c e a e f a m i l y , a n di te x h i b i t sm a n yp h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c ha si m p r o v e dm e m o r yi n t h ee l d e r l y , i n h i b i t i o no fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ea c t i v i t y , a n da n t i d e p r e s s i v ea c t i v i t y h u 舭h a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e df o ri t sp o t e n t i a li nt r e a t i n ga d i ti sa b u n d a n ti n h u p c r z i a c e a es p e c i e sa n dh a sb e e nd e m o n s t r a t e dt ob eap o w e r f u ls e l e c t i v ei n h i b i t o r o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i th a sa t t r a c t e dw i d e s p r e a da t t e n t i o nb e c a u s eo fi t su n i q u e p h a r m a c o l o g i c a lp r o f i l ea n dl o wt o x i c i t y r e c e n t l y , t h er e s o u r c eo fh u p e r z i a c e a e p l a n t sh a sb e c o m ed e p l e t e dr c s l l l t i n gi na ne x t r e m es h o r t a g eo f t h e s ep l a n t s s c i e n t i f i c a n do t h e rs u i t a b l e a p p r o a c h e sa r en e c e s s a r yt op r e v e n tf u r h e rd e p l e t i o no f h u p e r z i a e e a ep l a n t s s e v e r a la l t e r n a t i v e sh a v eb e e n 伍e dt oo v e r c o m et h es h o r t a g eo f t h i sr e s o u r e , e p l a n tt i s s u ec u l t u r ea n d e u t m g ep r o p a g a t i o nh a v eb e e nu s e dt os o l v et h e p r o b l e mo f t h es h o r t a g eo f t h eh u p e r z i a c e a e “：s o u r c e a c c o r d i n ga n a l y s i sb a s eo nc h l o r o p l a s tg e n er 6 乩，r p l l 6 ，m a t ka n dp s b a t r n h s e q u e n c e sd a t ao fh u p e r z i a c e a ep l a n t s t h er e s u l t sw e r ee o n s i s t e mw i t hp r e v i o u s v i e wo fam a j o re a r l yd i c h o t o m yi nl y e o p o d i a c e a eb e t w e e nh u p e r z i a - p h y l l o g i o s s u m a n da l y e o p o d i u m - l y e o p o d i e l l ac l a d e h u p e r z i as p e c i e sa n dp h y l e g m a r i u m ss p e c i e s 帆c l a s s e di n t od i f f e r e n tc l a d e w h i c hs h o w e dt h a tt h e r e 、 饿t w og r o u p si n 3 a b s t m e t h u p e r z i a c e a ef a m i l yi nc h i n a t h er e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t hc l u n gr c sv i e w p o i n t a b o u tt h es e c t i o nw i t h i ng e n e r a , t h et o p o l o g i e so fp h y l o g e n e f i ch i 艳ss h o w e dt h a t h u p c r z i ai n c l u d e ds e c t h u p e r z i ac l a d ea n ds e t h u p e r z i o i d e sc l a d et w om a j o rg r o u p s w i t hh i g hb o o t s t r a ps u p p o r t t h er e s u l t sa g r e e dw i t hz h a n gl ba n dk o n gx x s v i e w p o i n ta b o u ts e c t i o nt a x o n o m y t h em o l e c u l a rg e n e t i ca p p r o a c h ( r b c l ，r p l l 6 ，m a r ka n d 芦m - t r n hi n t e r g e n i c s p a c e r s ) p r o v i d e dam e t h o df o rt h ei d e n t i f i c a t i o na n db o t a n i c a lc l a s s i f i c a t i o no f m e d i c i n a lp l 趾t sw i t h i nag e n u s i nt h i ss t u d y , w ed e v e l o p e dan o v e lr e l i a b l e m o l e c u l a rg e n e t i cm e t h o df o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fh u p e r z i a c e a ep l a n t s w eu s e d m o l e c u l a rg e n e t i cm e t h o d st od i s c r i m i n a t et h e s es p e c i e s w e p e r f o r m e d e x t r a c t i o n p r o t e i n a n d c o m p a r a t i v e t w o - d i m e n s i o n a l p o l y a e r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i sm a pi no r d e rt of i n dt h ed i f f e r e n tp r o t e i ns p o t s t h er e s u l t ss h o w e da b o u t1 3 3 8s p o t si nh u p e r z i am i y o s h i a n aa n d1 2 6 9s p o t si n h u p e r z i aa p p r e s s a2 - d em a p t h i sp r o t e i ns p o t sf a s t e n e do nb e t w e e nm w 1 5 7 5a n d # - i 4 7 a b o u t6 0p r o t e i ns p o t sw e t ei d e n t i f i e d t h e s er e s u l t s c a ns e r v ea st h e a d v a n t a g e db a s i co f t h es t u d yo f h u p aa n do t h e rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sb i o s y n t h e s i s ， a n dc o l l a t ef 砸h e ri n f o r m a t i o no nm e t h o d sf o rs o l v i n gt h es h o r t a g eo f t h e s ep l a n t s k c y w a r d s ：h u p e r z i a c c a e ；o e n o m e ；p r o t e o m e ；c h l o r o p l a s tg e n e ；r b c l ；r p l l 6 ； m a t k ；p s b a - t r n h ；p h y l o g e n y ；i d e n t i f i c a t i o n ；t w o - d i m e n s i o n a le l c c t r o p h o r e s i s ；m a s s s p e c t r o m e t r y 4 前言 前言 石杉科植物是具有我国特色的重要天然药物资源，在2 0 世纪8 0 年代初，我 国科学家首先从中国民间草药“千层塔”( 即蛇足石杉) 中分离得到石杉碱甲 ( h u p e r z i n e 九h u p - a ) 并经药理实验发现它有强效、高选择性的抗乙酰胆碱酯酶 活性及提高学习和改善老年人记忆功能的作用。引起了世界各国科学家的广泛注 意，成为药学界最受人瞩目的研究热点之一。由于h u p - a 是一种低毒、高效、可 逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 抑制剂，已被国际上列为第二代的a c h e 抑制剂之一。 石杉科植物属于原始蕨类植物，生长速度缓慢，生长周期很长。从孢子萌发 到长成植株通常需8 1 0 年时间。由于它扎根浅表，易被连根拔起，此后就永无 再生的可能。近年来国际市场上h u p - a 有效成分的原料价格日益攀升，而有效成 份( h u p - a ) 含量高的品种又非常少。鉴于该有效成分的化学合成工艺复杂，成 本昂贵，至今尚不能用于实际工业生产。目前市场供应的石杉碱甲均依靠从天然 的石杉科药用植物中提取。巨大的市场需求造成原料药材的大量消耗，高额的商 业利益驱使人们对这些石杉科药用植物进行着毁灭性的滥采乱挖。这样做的结果 已经造成我国这些重要的天然药材资源急剧减少。造成该科药用植物资源枯竭， 甚至达到了部分品种频临灭绝的地步。因此对石杉科药用植物资源的合理开发和 保护，已刻不容缓。 石杉科植物在全世界虽然分布广泛、种类繁多，但在不同地域生长的不同种 群中有效成份含量差异显著。甚至在同一地区，相同地理生态环境条件下生长的 不同种群中有效成分含量也可以有几十倍的差异。例如在福建省长汀县生长的闽 浙马尾杉中h u p - a 的含量只有0 0 0 6 ，而在福建省连城县生长的柳杉叶马尾杉 中含量则高达0 1 9 6 ；同样生长在东北长白山地区的东北石杉中的含量几乎为 零，而伏贴石杉则含量为o 1 0 8 。石杉碱甲在不同的种中的含量不同为寻找石 杉碱甲植物资源，解决石杉科药用植物资源的紧缺状况提供了一个很好的研究条 件和研究思路。 充分发掘利用具有我国特色的天然药物和保护好这些宝贵的重要资源是一 前言 对矛盾，也是一个亟待解决的重大课题。只有妥善地处理好这两者的关系，才能 使我国的中药现代化走可持续发展的道路。通过人工栽培和组织培养是一种常用 的解决办法，但是这种办法对蛇足石杉等这样生长周期特别长，又很难进行组织 培养的物种来说并非易事。天然药材中的有效成分大多数属于次生代谢产物，而 其含量的高低通常是由多基因控制的。通过基因组学和蛋白质组学方法研究清楚 天然药材中与有效成分高含量相关的基因，并利用现代基因工程技术从生长缓慢 且难于培养的高产物种中鉴定、分离出重要的相关基因，这将为今后进一步把这 些基因转化入生长相对较快且易于培养的同属植物中，以获得有效成分高含量的 转基因药材品种创造条件。本研究不但对于研究石杉科药用植物中有效成分的合 成与调控机理具有重要的科学意义，而且对于从根本上解决利用石杉科药用植物 并保护这一珍贵资源这对矛盾有重要的应用前景，同时也符合我国中药现代化可 持续发展的战略需求。该研究方法可以适用于其它的频临灭绝的中药植物资源的 合理开发和保护。 6 第一章石杉科植物研究进展 第一章石杉科植物研究进展 1 石杉科植物概况 石杉科( h a p e r z i a c e a e ) 植物是一类土生或附生的多年生小型蕨类，多生长 于较低的灌木丛，苔藓层等阴凉潮湿的环境中。该类植物在古生代时较为繁盛， 是迄今为止最古老的高等植物类群之一。随着生态环境的变化，其中大多数植物 已经灭绝，现仅存少数种类，分布也较为稀疏。在世界上石杉科植物大约有3 0 0 4 0 0 种，主要以附生植物分布在南美洲、非洲以及亚洲东南部的热带雨林地区， 或者是以土生植物分布于新热带的雨林地区以及海拔较高的高山植被区 ( w i k s t r 6 mn 等，2 0 0 1 ) 。我国现存的石杉科植物有2 个属近5 0 种( 秦仁昌， 1 9 8 1 ，1 9 8 2 ) 。为大家所熟知的是在i 临床上以“千层塔”入药的蛇足石杉。( 图1 1 ) 图1 1 蛇足石杉及石杉碱甲分子结构式 2 石杉科植物的分类概况 关于石杉科植物的分类，一直以来都存在着争议。在最早的分类系统中石杉 科植物隶属于石松亚门石松纲石松目中的一个混合石松科和多谱系的石松属中， 统称为石松类植物，均被使用广义的l y c o p o d i u m 概念( l i n n e a u sc ，1 9 7 5 ) 。后 来的研究发现石松科和石杉科植物之间在形态上存在很大的差别，石杉科植物的 孢子叶与营养叶同型，与石松科植物的孢子叶与营养叶异型存在明显的差异，德 国植物学家h e r t e r 提出将其分成石松属和石杉属( u r o s t a c h y s ) ( h e r t e rc l ，1 9 2 2 ) 。 这一观点被德国植物学家n e s s e l 所采用，在他的石松科专著中明确了这一观点。 7 第一章石杉科植物研究进展 后来，德国植物学家r o t h m a l e r 根据原叶体的不同，首次将石松类植物分为石杉 科和石松科( r o t h m a l e rw ，1 9 4 4 ) ，当时的石杉科中只有一个属，即石杉属。捷 克植物学家h o l u b 在1 9 6 4 年对r o t h m a l e r 的观点进行了修正，其中的石松科包 含了7 个属，包括石杉科的马尾杉属p h l e g m a r i u r u sh o l u b ( h o l u bj ，1 9 6 4 ) 。自 从石杉属公布后，世界各国的植物学家对这一观点的反映不一，有的支持，也有 的反对，甚至到后来h o l u b 本人也不再使用马尾杉属p h l e g m a r i u r u sh o l u b 这一 名称。因此，在世界上对马尾杉属的划分还需进一步的讨论，在许多研究报道中 仍旧是上述几种分类观点并存。在我国对于石杉科植物的分类是植物学家秦仁昌 先生在1 9 8 1 年创立的。他接受了将石杉科分为石杉属和马尾杉属的分类方法， 并在此基础上建立了中国的石松类植物的分类系统，他引用了w r o t h m a l e r 的观 点，将中国的石松目分为两个科，即石杉科h a p e r z i a c e a e ( = u r o s t a c h y a c e a e ) 和石 松科l y e o p o d i a e e a e ( 狭义) ，并将石杉科植物分为石杉属和马尾杉属两个属，改 变了我国过去长期以来科属不分、把上百种石松类植物统称石松的混乱状态，这 一系统在我国一直沿用至今( 秦仁昌，1 9 8 1 ) 。 在石杉科植物属下的分类上，张丽兵、孔宪需( 张丽兵，孔宪需，1 9 9 8 ，1 9 9 9 ， 2 0 0 0 ，2 0 0 0 ) 提出了自己的观点，他们将我国的石杉科植物分为2 个属5 个组， 并对5 个组的概念进行了修订( 见表1 1 ，表1 2 ) 。这一观点被中国学术界广泛 接受，但是，对于个别的种的划分，存在着不同的意见。由于我国地大物博，地 理环境和气候条件相当复杂，在石杉科植物中，我国有很多特有的种，而这些种 大都分布局限，储量较少，一般不涉及跨气候区的现象，所以外形上的变异很小。 个别广布的种，如小杉兰h u p e r z i a s e l a g o ( l ) b e m h e ) 【s e h r a n k e t m a r t 和蛇足石 杉h u p e r z i a s e r r a t a ( t h u n b e x m u r r a y ) t r e y ，由于生长的地区和环境不同，表现 在形态上的变异，造成了分类学上的分歧点。 对于长柄石杉的分类，很多学者有着不同的观点，秦仁昌将其定名为( 秦仁 昌，1 9 8 1 ) hs e r r a t a ( t h u n b “m u r r a y ) t r e y f 1 0 n g i p e t i o l a t a ( s p r i n g ) c h i n g 。张 丽兵，孔宪需( 张丽兵等，2 0 0 0 ) 认为世界广布的种就要用大一些的分类概念， 所以赞同将其作为蛇足石杉的变种和变型予以归并。而杨纯瑜( 杨纯瑜，1 9 8 9 ) 提出了自己不同的观点，认为长柄石杉在外形上与蛇足石杉明显不同，同时石 杉碱甲的含量明显高出蛇足石杉，可将其列为一个种，即长柄石杉尼 l o n g i p e t i o l a t a 。伏贴石杉与小杉兰在形态上相似，对于伏贴石杉且a p p r e s s a ( d e s v ) l f i v ee ti 6 v e 的归属，张丽兵，孔宪需( 张丽兵，孔宪需，1 9 9 8 ) 先将 其单独列为一个种，后来又主张并入小杉兰hs e l a g o ( l ) b e m h 懿s c h r a n ke t m a r t ( z h a n gxc h ，等2 0 0 4 ) 第一章石杉科植物研究进展 表1 1 国产石杉科石杉属植物名录( 根据张丽兵，孔宪需的分类方法) 组名种名拉丁名 中华石杉 hc h i n e n j i sr c m i s t ) c h i n g 东北石杉 hm i y o s h i a n a ( m a k l n o c h i n g 南川石杉 hn a n c h u a n e m i s ( c h i n ge th s k t m g ) c h i n gc th s k u n g 曲尾石杉 hb u c a h w a n g e m i sc h i n g 两藏杠杉 i - lt i b e t i c a ( c h i n g ) c h i n g 小杉兰组 伏贴石杉 ha p p r e s s a ( d e s v , ) l o v ec td l o v e s e c t h u p e r z l a 红茎杉 儿r u b i c a u l i ssk w uc i x c h c n g 相马石杉h $ o m a i ( h a y a t a ) c h i n g 雷波石杉 h | n i d o e n s sc h i n g 峨剧石杉 hp 脚坤，坫捃( c h i n ge th s k u n g ) c h i n gc lh s k u n g 金发石杉 4 q u a s i p o l y t r i c h o i d e s ( h a y n a ) c h i n g 小杉兰 h s e l a g o 【l ) b e r n h c xs c h r a n ke tm a r l 墨脱石杉1 4 m e d o g e n s i sc h i n ge tyxl i n g 蛇足石杉 hs e r r a t a ( t h u n b “m u r r a y ) t r e y 皱边石杉 hc r i s p a t e ( c h i n g “hs k u n g ) c h i n g 四川石杉 b ls u t c h u e n i a n a ( h e r t e r ) c h i n g 凉山石杉 hl i a n g s h a n i c a ( h sk u n g ) c h i n ge ths k u n g 康定石杉 lk a n g d i n g e n s i j ( c h i n gc xh s k u n g ) c h i n g 蛇足石杉组 苍山石杉 b ld e l a v a y i ( c h r i s ti g xr t e r t e r ) c h i n g s e c t s e r m t a e ( r o t h m ) 华两石杉 hd i x i t i a n apm o n d a le tr kg h o s h h o l u b昆明石杉 hk u n m i n g e n g i sc h i n g 雷山石杉 h e s h a n e n s sx yw a n g 赤水石杉 h c h i s h u i e n s i sx 、w a n gc t p s w a n g 锡金岳杉 lh e r t e r a n a ( k u m m1 u s e nc t ts e n 亮叶石杉 hl u c i d u l a ( m i c h x ) t r e y 拉觉石杉 t t 1 a j o u e n a i sc h i n g 王峻利用孢子的形态特征( 图1 2 ，图1 3 ) 对石杉科植物进行了分类学研 究( 石杉科药用植物分类学与生药学的研究，2 0 0 5 年复旦大学博士学位论文) ， 并列出了2 1 种石杉科植物的孢子检索表。根据这一分类方法，可以将石杉科的 石杉属植物和马尾杉属植物区分开。 图1 2 石杉属植物孢子远极面观图1 - 3 马尾杉属植物孢子远极面观 9 第一章石杉科植物研究进展 表i - 2 国产石杉科马尾杉属植物名录( 根据张丽兵，孔宪需的分类方法) 组名 种名拉丁名 马尾杉 p h p h l e g m a r i a ( l ) h o l u b 马尾组 柔软马尾杉 p hs a l v i m w d e $ ( h o r r o r ) c h i n g s e c t p d e g m o r i u r u 8 广东马尾杉 p i tg u a n g d o n g e n s i sc h i n g 美丽马尾杉p h p u l c h e r r i m v a ( w a l l “h o o k e tg m ) l l o v ec td l o v e 台湾马尾杉 p i tt a i w a n e w i s ( k u o ) l b z h a n g 杉形马尾杉 p hc u n n i n g h a m i o i d e s ( h a y a t a ) c h i n g 有柄马尾杉 p hp e t i o l a t u s ( cbc l a r k e ) h s k u n ge tl b z h a n g 华南马尾杉 p ha u s t r o s i n i c u s ( c h i n g ) lb z h a n g 喜马拉雅马尾杉 p i th a m i l t o n i i ( s p r e n g e l ) l l o v ee ld l 6 v e 拟石杉组 上思马尾杉 p i ts h a n g s i e n m sc yy a n g s e c t h u p e r z i o i d e s 椭圆马尾杉 p h h e nr i ( b a k e r ) c h i n g h s k u n g c t l b 福氏马尾杉 p h f o r d i i ( b a k e r ) c h i n g 闽浙马尾杉 p hm i n c h e g e m i s ( c h i n g ) l bz h a n g 柳杉叶尾杉p h c r y p t o m e r i a n u a ( m a x i m ) c h i n g “l b z h a n gdh s k u n g 卵叶马尾杉 p i to v a t i f o l i u $ i c h i n g ) w m c h u “lb z h a n ge th sk u n g 聂拉木马尾杉p h n y l a m e n s i s ( c h i n ge ts ，k w u ) h s k u n ge tl b z h a n g 粗糙马尾杉p h s q u a r r o s u sf f o r s t ) l l o v ec td l o v e 龙骨组s e c t 鳞叶马尾杉 p i ts i e b o l d i i ( m i q ) c h m g c a r i n a t u r u s ( h m - r ) 云南马尾杉 p i ty u n n a n e n s i sc h i n g h s k u n ge t l b z h a n g 金丝条马尾杉p i t f a r g e s i i ( h e r t e r ) c i t i n g 网络马尾杉 p hc a n c e l l a t u a ( s p r i n g ) c h i n g 龙骨马尾杉 p i tc a r i r w t l v j ( o e s v ) c h i n g 关于长柄石杉的归属问题王峻认为：蛇足石杉和长柄石杉在孢子类型上均是 原始的三裂缝四分孢子，是二者唯一的共同点。远极面观，外壁的穴状纹饰上前 者大、稀、浅，后者小、密、深；近极面观，前者辐射间区极度内陷，后者只是 轻度内陷；赤道面观，前者极轴长于至少等于赤道轴，后者极轴只是赤道轴的 1 2 到3 4 。如此大的差异，加上二者在地理分布区域上的间隔，建议将长柄石杉 恢复为种的地位。 小杉兰月：s e l a g o ( l ) b e r n h 懿s c h t a n k e tm a r t ，又名石杉，为石杉科的模式 标本，鉴别标志是二叉分枝、叶无锯齿。东北石杉，伏贴石杉，中华石杉都是先 后从小杉兰之中独立出来的，最早独立的是中华石杉，这时的东北石杉被置于中 华石杉之下，如东北草本植物志，后东北石杉独立成为种。伏贴石杉长期以 来做为小杉兰的变种存在，曾一度独立成为种，后又归并于小杉兰。关于东北石 杉，伏贴石杉，中华石杉与小杉兰的分类等级划分王峻认为： ( 一)小杉兰是一个分布非常广的种，近缘种比较容易混淆。不仅上述的 1 0 第一章石杉科植物研究进展 东北石杉，伏贴石杉不易区分，就连亮叶石杉也可能被误认为小杉兰。孢子形态 上的不同，可将他们进行区分。 ( 二) 东北石杉与另外三个种的区分在于“叶片基部是否为叶片最宽部 分”。孢子形态上的不同，证明了该种独立的可靠性。 ( 三)伏贴石杉是一个独立的种，特产于高山地带。许多小杉兰的标本实 际上就是生于高海拔地区的伏贴石杉。伏贴石杉孢子形态也有显著特征。 中华石杉和伏贴石杉分布的海拔高度是一致的，孢子形态没有差别，应该归 并。王峻认为形态上的差别，是由环境造成的：伏贴石杉的叶片抱茎，是因为在 它的生长环境中，它是最高的植物( 虽然只有3 l o c m ) ，在高山多风的气候下， 伏贴石杉必然叶片抱茎甚至呈网状纺织以保护叶腋下的孢子；中华石杉叶片外 张，是因为生于林下，风力小得多，势必外张调整叶镶嵌从而吸收更多的阳光。 事实上由于环境的变化，叶片从外张到抱茎这一变化是连续的，在长白山区的伏 贴石杉中极为明显：越橘丛中的伏贴石杉植物高度低于密生的越橘，故叶片外张； 杜鹃丛中的伏贴石杉高度高于密生的杜鹃从2 0 5 0 ；而生于多风多雨、阳光充 足的山顶岩石上的伏贴石杉，得不到环境的任何保护，叶片紧紧抱茎且呈网状交 叉为叶腋下的孢子纺织一道严密的防风网。 + 针对以上分类学上的争议点，我们将利用基因组学对石杉科植物进行研究， 以其找到其分类学上的可靠证据。 3 石杉科植物的生物学特性及资源状况 石杉科植物为小型的拟蕨类植物，植株矮小，土生或附生，生长状态多直立 或下垂，根着生于主茎基部，生于土中或腐殖质中，主茎短，枝呈有规律的二歧 分叉等长分支。叶螺旋状排列，小型，无叶舌，无侧脉，仅有一条中肋。孢子囊 有小柄，扁肾形，顶缝开裂，着生于茎、枝等长的叶腋，或仅聚生于枝顶部叶腋 处，有时呈很长的、多回二叉分支的下垂的线形孢子叶穗。孢子叶与营养叶同型 或稍异型，并含有叶绿体，质厚，呈龙骨状。孢子具有孔穴状的纹饰。原叶体圆 柱状长圆形或线形，长达几厘米，单一或分支，有菌根，与真菌共生，菌丝生于 原叶体的外部细胞层内。精子器与颈卵器生于原叶体背面，并与节状菌丝混生( 浙 江植物志( 第一卷) ，1 9 9 3 ) 。关于石杉科植物的生物学研究，只有蛇足石杉有 详细的报道，鲁润龙等( 鲁润龙等，1 9 9 9 ) 较详细的描述了蛇足石杉包括外部形 态、内部构造、孢子囊和孢子形态、菌根、生活史、生长特征、地理分布、生态 学和群落学等生物学特性。表明蛇足石杉是一种多年生，生长缓慢的小草本，年 净生物量的增长速率有限，长成一颗高1 2 c m 的成苗，在自然条件下大约需要6 7 年的时间。而对其它石杉科植物的报道较少。 第一章石杉科植物研究进展 我国的石杉科植物以广泛分布的种一一蛇足石杉的资源最多，其他种的植物 资源较少。吴荭等( 吴荭等，2 0 0 5 ) 通过对我国蛇足石杉主要分布区3 5 个野外 样点和总样方量7 1 ，3 0 0 m 2 的调查，并结合国内1 2 个标本馆4 7 0 多号蛇足石杉馆 藏标本及现有文献调查显示：蛇足石杉主要分布在亚热带常绿阔叶林区域，尤其 是中国东南部的中亚热带一一南亚热带区域内。蛇足石杉在中亚热带南部亚区和 南亚热带有团块状分布现象，但仍以散生状分布为主。在纬度偏北的区域如亚热 带北部区域已被证明其资源分布量很少，由此推测在中国东北区不会有很可观的 资源富集地。台湾省、海南省中部山脉可能会有一定的资源储量。结果表明，我 国的蛇足石杉的天然生物量虽然比流行的预计量( 3 0 0 4 0 0 吨) 大了很多，这 与其分布覆盖面宽而星散的特征相吻合。但是，可供开采的天然植物资源很小， 主要是由于其分布星散，资源更新周期长，多数分布在风景区和自然保护区，因 此，直接采收天然资源是不太可行的利用途径。而要从根本上解决石杉科植物资 源短缺的问题，有必要寻找科学合理的开发利用方式。如：细胞与组织培养，扦 插繁殖和栽培，或者转基因克隆等其它的高科技技术。 4 石杉科植物的繁殖特性 石杉科植物的繁殖方式通常有以下三种形式：孢子繁殖、分株繁殖、芽胞繁 殖，在春季枝的顶端长出芽胞，落地后长出新苗。不同的石杉科植物的芽胞繁殖 的速度不同，植株的生长速度也不一样，相对而言，马尾杉属植物的植株较大， 且生长速度比石杉属植物相对较快。在自然条件下，石杉科植物的分株繁殖，生 长成新的个体也很缓慢。盛束军等( 盛束军等，2 0 0 0 ) 认为在野生条件下蛇足石 杉通过生殖芽繁殖的现象较少；而孢子萌发周期较长，萌发后属地下生配子体， 需要6 1 5 年时间才能成熟，因此极大限制了其野生资源的再生，远远不能满足 市场的需要。 组织培养技术应用于石杉科植物的繁殖逐渐被人们重视，由于石杉科植物是 与真菌共生的植物，要完全去除其体内的真菌是相当困难的( 鲁润龙等，1 9 9 9 ) 。 沈晓霞等( 沈晓霞等，2 0 0 0 ) 采用多次灭菌的试验方法，推测出蛇足石杉植株中 有内源真菌共生，并且可标记其内源真菌的共生部位对石杉科植物的组织培养 首先要解决的是真菌问题，因此，组织培养技术应用在石杉科植物的繁殖中还有 很长的路要走。 扦插繁殖技术不失为一个繁殖石杉科植物的好的方法，与组织培养相比，扦 插技术不需要考虑内生真菌的问题。盛束军( 盛束军等，2 0 0 0 ) 通过实验发现， 使用吲哚丁酸处理过的材料，发根率及平均生根量明显高于，使用奈乙酸、生根 粉和吲哚乙酸+ 奈乙酸等药物处理过的材料，且萌发枝条的生根率、平均生根量 1 2 第一章石杉科植物研究进展 和平均根长等指标明显高于不萌发枝条，且死亡率较低，使用土质上腐殖土与河 沙的温和土壤作为扦插基质要比腐殖土或河沙单独作为基质效果好。相对应而 言，扦插繁殖比组织培养繁殖更有利于现实规模化生产。 5 石杉科植物中活性成分的