（生药学专业论文）海洋来源的肿瘤血管破环剂的筛选及药效评价.pdf

海洋来源的肿瘤血 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 3 本人声明 研究成果。据 他人已经 注! 垫遗直墓他益噩挂别童明的：奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：7 易砖 签字日期：v 产r 月讥日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社 用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名：浩滗 签字日期：年 月日= 么凡 e ” 哞 字 曲 签 ： 师 期 导 日字签 。- 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i _ _ _ _ _ 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 摘要 肿瘤血管在实体瘤的发生发展中具有重要的作用，为肿瘤细胞提供氧气，养 料并输送废物，同时提供转移的主要路线。靶向肿瘤血管系统作为肿瘤治疗的策 略已经取得了很好的临床结果。目前上市的药物主要是作用于肿瘤的新生血管， 而肿瘤血管具有的分级不规则、混乱等特点使得靶向既存的肿瘤血管成为可能。 小分子化合物可以快速、选择性的破坏既存的肿瘤血管网络从而引发肿瘤的坏 死，为肿瘤的治疗提供了新的策略。通过破坏既存肿瘤血管而致使肿瘤组织坏死 的药物称之为肿瘤血管破坏剂( v a s c u l a rd i s r u p t i n g a g e n t ，v d a ) 。目前世界上 已有多种v d a 候选药物处于研究和开发中，其中有数十种已经进入临床研究阶 段。 海洋生物资源是保留最完整，资源最丰富，最具新药开发潜力的领域，当前， 世界各国已将从海洋资源中挖掘具有挑战性的创新药物列为国家重点发展领域。 l a m e l l a r i n s 是从海洋中海绵、海鞘里分离得到的一大家族的生物碱，其结构特征 为一吡咯中心被多羟基或多甲氧基苯环取代。研究表明l a m e l l a r i n s 对多种肿瘤 细胞株有较强的细胞毒活性。因此，我们课题组选择结构简单且具有显著抗肿瘤 活性的l a m e l l a r i n d 为苗头化合物，经过大量结构修饰优化与构效关系研究，合 成了一系列与c a 4 p 结构相近的化合物。 我们在人脐静脉内皮细胞( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ，孙e c ) 上建立模型，用融合状态和非融合状态的细胞在体外模仿正常血管和肿瘤血管， 利用该模型进行化合物筛选。结果我们发现化合物m d s 11 及其磷酸盐m d s 11 p 具有较好的效果和阳性化合物c a 4 作用相当。进一步，我们利用分子水平上 的生物芯片( s p r ) 观察m d s 1 1 与微管蛋白之间的相互作用实验，徼管聚合实 验。结果表明：m d s 1 1 与微管蛋白有较高的亲和力，并且可以剂量依赖的抑制 无细胞体系的微管蛋白聚合。然后，在细胞水平上利用激光共聚焦观察实验、 w e s t e r n b l o t 观察细胞内微管蛋白的聚集实验、体外培养的内皮细胞管腔模型观察 评价，结果表明：m d s 1 l p 可以迅速破坏h u v e c 形成的管腔；内皮细胞形态 的改变在化合物的血管破坏作用中具有重要意义，激光共聚焦观察结果表m d s 1 1 可以破坏微管蛋白骨架，诱导h u v e c 形态发生变化，出现膜发泡和应力纤 维，这一点和体外抑制微管聚合实验一致；体内微管蛋白分离实验也表明m d s 一 11 p 可以剂量依赖的减少细胞内聚合状态的微管；最后，利用动物水平上裸小鼠 移植瘤m d a - m b 2 3 1 模型、h e 染色、c d 3 1 及p c n a 免疫组化等方法进行了一 系列的药理学评价。实验表明：2 4 小时给药后处死，h e 染色可以观察到肿瘤内 部的大面积坏死，而正常组织影响较小；c d 3 1 及p c n a 免疫组化证明m d s - li p 可以剂量依赖的引起肿瘤内部血管破坏和肿瘤的坏死，肿瘤内部增殖减慢，血管 减少。 最终，我们根据分子，细胞和动物实验的数据分析得出结论：m d s 1 1 可以 通过影响肿瘤内皮细胞的骨架系统选择性的破坏肿瘤血管，起到抗肿瘤作用。 m d s 1 1 是一个值得进一步研究开发的抗肿瘤化合物。 关键词：肿瘤；血管内皮：血管破坏剂；m d s - 1 1 s c r e e nin ga n dp h a r m a c o d y n a mice v aiu a tio no ft u m o rv a s 一 一 c uia rc lis r u p tin ga g e n tt r o mo c e a n t u m o rb l o o dv e s s e l sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to fs o l i dt u m o r 8 ，i t p r o v i d e so x y g e n ，n u t r i e n t sa n dt r a n s p o r t st h ew a s t e ，m e a n w h i l ep r o v i d i n gt h em a i n t r a n s f e rr o u t e t a r g e t i n gt u m o rv a s c u l a rs y s t e ma sat r e a t m e n ts t r a t e g yf o rc a n c e rh a s a c h i e v e di n s p i r i n gc l i n i c a lr e s u l t s c u r r e n t l ym o s to ft h ea v a i l a b l ed r u g so ft h i sk i n d a r et a r g e t i n gt u m o ra n g i o g e n e s i s a st h ee s t a b o l i s h e dt u m o h rb l o o dv e s s e l s 踟屯 c h a r a c t e r i z e do fi r r e g u l a r , c o n f u s i o na n ds oo n ，w h i c hm a k e si tp o s s i b l ef o rt a r g e t i n g t h ee s t a b l i s h e dt u m o rv a s c u l a r l o wm o l e c u l a rv a s c u l a r d i s r u p t i n ga g e n t s c a u s e m a r k e da n ds e l e c t i v e d i s r u p t i o no ft h ee s t a b l i s h e dt u m o u rb l o o dv e s s e ln e t w o r k ， r e s u l t i n gi nt u m o u rn e c r o s i s ，w h i c hp r o v i d ean e ws t r a t e g yf o rt h et r e a t m e n to f c a n c e r v a s c u l a rd i s r u p t i n ga g e n t ( v d a ) i sak i n do fd r u gw h i c hc a nc a u s em a r k e da n d s e l e c t i v ed i s r u p t i o no ft h ee s t a b l i s h e dt u m o u rb l o o dv e s s e ln e t w o r k c u r r e n t l yt h e r ei s av a r i e t yo fv d a d r u gc a n d i d a t e si nt h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t , m a n yo fw h i c h h a v ee n t e r e dc l i n i c a lr e s e a r c h m a r i n er e s o u r c e si st h em o s tc o m p l e t ea n da m p l er e s o u r c e s ，a n di t st h em o s t p r o m i s i n ga r e a so fn e wd r u gd e v e l o p m e n t n o w a d a y s ，d e v e l o p m e n to fi n n o v a t i v ea n d c h a l l e n g i n gn e wd r u g sf r o mm a r i n er e s o u r c e sh a sb e e nl i s t e da san a t i o n a lp r i o r i t yf o r m o s tc o u n t r i e s l a m e l l a r i n sa r ea l a r g ef a m i l yo fa l k a l o i d sw h i c ha r ei s o l a t e df r o ms e a s p o n g e s ，s e as q u i r t s ，t h es t r u c t u r ec h a r a c t e ri st h a tam u l t i h y d r o x yp y r r o l ec e n t e rw a s r e p l a c e db yo n eo rm o l em e t h o x yb e n z e n er i n g m a n ye x p e r i m e n t ss h o wt h a t l a m e l l a r i n sh a v es t r o n gc y t o t o x i ca c t i v i t y a g a i n s tav a r i e t yo ft u f f l o r c e l ll i n e s t h e r e f o r e ，w ec h o o s el a m e l l a r i n da st h el e a d i n gc o m p o u n df o ri t ss i m p l es t r u c t u r e a n ds i g n i f i c a n ta n t i - t u m o ra c t i v i t y w eu s et h i ss t r u c t u r ea st h eg u i d ea n dg e tas e r i e s o fc o m p o u n d ss i m i l a rt oc a 4w i t hal o to fs t r u c t u r em o d i f i c a t i o na n ds t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i po p t i m i z a t i o n w es c r e e n e das e r i e so fc o m p o u n d su s i n gam o d e le s t a b l i s h e do nh u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ( m j h v e c ) ，w i t hc o n f l u e n c es t a t ea n dn o n c o n f l u e n c es t a t ec e l l s i nv i t r ot om i m i ct h en o r m a lb l o o dv e s s e l sa n dt u m o rb l o o dv e s s e l s t h er e s u l t ss h o w t h a tm d s - 11h a sg o o de f f e c t sa sw e l la sc a 4 f i r s to fa l l ，i nm o l e c u l a rl e v e l ，w e 墩 s p r b i n d i n ga s s a y , m i c r o m b u l ep o l y m e r i z a t i o ne x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o wt h a t ： m d s - 11h a v eah i g h e ra f f m i t y 、i t l lm b u l i na n dc a ni n h i b i t et h ec e l l - f r e et u b u l i n p o l y m e r i z a t i o nd o s e - d e p e n d e n t l y t h e n , a tc e l l u l a rl e v e l ，l a s e rc o n f o c a le v a l u a t i o n 卫 s m i c r o m b u l ep r o t e i ns e p a r a t i o na s s a y , h u v e cl u m i n a ld a m a g ea s s a y , r e s u l t s s h o wt h a t ：m d s - 11c a nq m c h y d i s r u p tt h ef o r m e dh u v e c l u m i n a l e n d o t h e l i a lc e l l m o r p h o l o g yc h a n g ei sv e r yi m p o r t a n ti nt h ed e s t r u c t i v ee f f e c t so ft h e s ec o m p o u n d s l a s e rc o n f o c a lr e s u l ts h o w st h a tm d s 一11c o u l dd i s m p tt u b u l i nc y t o s k e l e t o nt oi n d u c e m o r p h o l o g i c a lc h a n g e s i nh u v e c ，、) i ，i t l l a p p e a r e dm e m b r a n ef o a m i n ga n ds t r e s s f i b e r s ，w h i c hi sc o n s i s t e n t 晰t l lt h ei nv i t r ot u b u l i np o l y m e r i z a t i o ne x p e r i m e n t p ，s t u b u l i ns e p a r a t i o ne x p e r i m e n ta l s os h o w sm d s 一1ipc a nr e d u c et h ep t y p et u b u l i ni na d o s e d e p e n d e n tm a n n 朗 w i t h i nc e l l f i n a l l y , w eu s em d a - m b - 2 3 1n u d e m i c e t r a n s p l a n t e dt u m o rm o d e l ，c a r r y i n go u tas e r i e so fp h a r m a c o l o g i c a le v a l u a t i o n sw i t h h es t a i n i n g ，c d 31a n dp c n ai m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g e x p e r i m e n tr e s u l t s s h o wt h a t ：2 4h o u r sa f t e ra d m i n i s t r a t i o nt h em i c ew e r ek i l l e d ，h es t a i n i n gs h o w sl a r g e a r e ao ft u m o rn e c r o s i sw i t h i nt u m o r , w h i l el i t t l ee f f e c to nn o r m a lt i s s u e s ；c d 31 ，a n d p c n ai m m u n o h i s t o c h e m i s t r yp r o v e dt h a tm d s - 1ipc a u s e dv a s c u l a rd a m a g ea n d t u m o rn e c r o s i sw i t h i nt u m o ri nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r t u m o rp r o l i f e r a t i o ns l o w d o w na n db l o o dv e s s e ln u m b e r sr e d u c e i nt h ee n d ，b a s e do nm o l e c u l a r , c e l l u l a ra n da n i m a le x p e r i m e n t a ld a t a , w c c o n c l u d e dt h a t ：m d s 11c a na f f e c tt h et u m o re n d o t h e l i a lc e l ls k e l e t o ns y s t e m ， s e l e c t i v e l yd e s t r u c tt u m o rb l o o dv e s s e l s i ti m p l i e st h a tm d s 1 1i sac a n d i d a t ef o r f u r t h e rd e v e l o p m e n to ft h ev a s c u l a rd i s r u p t i n ga g e n t k e yw o r d s - t u m o r ；v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l ；v a s c u l a rd i s r u p t i n ga g e n t s ；m d s - 1 1 1 j 咖百 第一章m t t 法血 前言4月茜 材料与方法：5 结果6 讨论9 第二章m d s 1 1 的体外血管破坏作用研究 前言1 0日舌1 u 材料与方法1 1 结果1 4 讨论2 3 第三章m d s 1 1 的体内血管破坏作用研究 前言2 7 材料与方法2 8 结果2 9 讨论3 2 总结3 3 参考文献3 4 综述3 6 致谢4 6 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 1 上- j 刖昌 癌症是严重危害人类健康的常见病和多发病，2 0 0 7 年4 月世界卫生组织国 际癌症研究机构预测，到2 0 3 0 年，全球癌症患者将达到7 5 0 0 万，其中新增患者 2 7 0 0 万人，死于癌症的人数将增加到1 7 0 0 万人。2 0 世纪7 0 年代以来，我国的 癌症发病率一直呈上升趋势，目前我国每年新增癌症患者近2 0 0 万人，年死亡率 为1 4 0 万到1 5 0 万，癌症已成为我国各类疾病死因的头号杀手，抗肿瘤研究已经 成为当今生命科学和医药研究中极富挑战且意义重大的领域。 目前，抗肿瘤药物主要为细胞毒类药物，这类抗癌药具有难以避免的选择性 差，毒副作用强，易产生耐药性等缺点。随着近年来生物基因工程技术，分子肿 瘤学，分子药理学的飞速发展，肿瘤细胞的信号转导，细胞周期的调控，细胞凋 亡的诱导等各种基本生化过程的逐步阐明。因此，近年来出现了一大批的分子靶 向类抗肿瘤药物。而随着1 9 7 1 年f o l k m a n 教授【l 】提出通过抑制肿瘤血管新生 来抗肿瘤的概念，关于肿瘤血管系统的研究也越来越多，相关药物开发已经逐渐 成为了研究热点。 肿瘤既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过血管源源不断地向 宿主移送转移细胞，并在机体其它部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。 目前靶向肿瘤血管系统的药物大致分为两种：通过抑制肿瘤的新生血管生成而有 效阻止肿瘤生长和转移的药物称为肿瘤新生血管生成抑制剂( t u m o ra n g i o g e n e s i s i n h i b t o r , t a i ) 。目前世界上处于研究和开发中的t a i 候选物超过3 0 0 种，其中 有数十种已经进入临床研究阶段；通过破坏肿瘤内部血管而导致肿瘤坏死的药物 称为血管破坏剂( v a s c u l a rd i s r u p t i n g a g e n t ，v d a ) 。目前世界上已有多种v d a 候选药物处于研究和开发中，其中有数十种已经进入临床研究阶段闭。 血管破坏剂的开发相对较晚，是近年来伴随着人们对于肿瘤血管系统的深入 了解和对肿瘤血管内皮细胞的研究而出现的一类抗肿瘤药物。血管破坏剂包括生 物制剂( b i o l o g i c a lv d a s ) 和小分子制剂( s m a l lm o l e c u l ev d a s ) 两类，v d a 可 以快速、广泛地破坏已形成的肿瘤血管，成为近年来出现的治疗肿瘤的新策略之 一【3 】 o 生物制剂利用靶向分子将效应分子运送到肿瘤血管引起血管内凝血或者内 皮细胞死亡。靶向分子通常是能够与肿瘤细胞中选择性高表达的标志分子结合的 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 多肽或抗体，也包括一些能识别肿瘤血管高表达生长因子受体，与正常组织相比， 肿瘤组织中有很多分子上调，包括新生血管生成因子、血管重构因子、由炎性介 质( i l 1 ) 介导的细胞黏附分子、与肿瘤血管内皮凝血素相关的分子等，这些都可 被选用作为靶向分子。效应分子包括凋亡诱导蛋白( 组织因子) 、细胞因子、细 胞毒剂等能够直接诱导血栓，杀死内皮细胞间接诱导血栓，重新引导宿主免疫系 统攻击肿瘤血管或者引起内皮细胞形态学改变而后杀死肿瘤。 小分子制剂主要分为微管靶向类化合物c o m b r e t a s t a i na _ 4 和黄酮类化合物 d m x a a ，相比而言c o m b r e t a s t a i na 4 的研究较多，显示出非常好的开发前景。 c o m b r e t a s t a i na _ 4 为顺式二苯乙烯类化合物，该类化合物结构简单，但是抗肿瘤 活性极强。c a 4 的水溶性前药c a 4 p 的作用机理研究已经证实，c a 4 不仅可以 直接杀死肿瘤细胞，更重要的是通过抑制实体瘤血管内皮细胞微管蛋白聚合，改 变细胞骨架结构，引起肿瘤血管内皮细胞的变形，导致血栓的形成，阻断氧气和 营养的供应和细胞代谢废物的排出，进而引起实体瘤内部肿瘤细胞的大面积坏 死。但是近年来的研究发现，c a 4 p 的单独用药并不能达到最好的效果。早期的 实验发现肿瘤组织的边缘往往能“逃避 这类药物的杀伤1 4 1 ，这可能和边缘的肿 瘤血管与周围的组织联系相对紧密有关，所以这类化合物和放疗以及传统的化疗 药物联用显得尤为重要。 c a 4 p 目前由美国o x i g e n e 公司开发，c a 4 p 已经完成了五个i 期临床实验， 在欧洲、美国、亚洲、中东地区，一项针对未分化甲状腺癌的1 8 0 个受试个体的 i i i 期临床也已经开展。在美国，c a 4 p 和卡铂、紫杉醇及贝伐单抗联用针对非小 细胞肺癌的i l 期临床也已经开展。另外，c a 4 p 针对铂类耐药的卵巢癌的i i 期临 床也取得了非常好的效果，在受试的4 4 个个体中有2 5 表现出良性反应。c a 4 p 表现出对多种实体肿瘤的显著疗效1 5 】。 我国在肿瘤血管破坏剂开发方面还处于起步阶段。因此，开发具有我国自主 知识产权的，效果更加好的血管破坏剂显得尤为重要。 在国家“8 6 3 计划一的支持下我们与药物化学合成二室合作开发海洋来源的 血管破坏剂。海洋来源的化合物具有结构新颖，类型丰富等特点。l a m e l l a r i n s 是从海洋中海绵、海鞘里分离得到的一大家族的生物碱，其结构特征为一吡咯中 心被多羟基或多甲氧基苯环取代。l a m e l l a r i n s 对多种肿瘤细胞株有较强的细胞毒 2 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 活性【们。因此，我们以l a m e l l a r i n d 为苗头化合物，经过大量结构修饰优化与构 效关系研究，合成了一系列与c a 4 p 结构相近的化合物。 本课题利用在人脐静脉内皮细胞( 翔j v e c ) 细胞上建立模型，以融合状态 和非融合状态的细胞在体外模仿正常血管和肿瘤血管来筛选化合物，发现了活性 较好的候选化合物m d s 1 1 。之后经过分子水平上生物芯片( s p r ) 观察m d s 1 1 与微管蛋白之间的相互作用实验，微管聚合实验；细胞水平上激光共聚焦观察实 验、w e s t e m b l o t 观察细胞内微管蛋白的聚集实验、体外培养的内皮细胞管腔模型 观察评价；动物水平上裸小鼠移植瘤m d a - m b 2 3 1 模型、h e 染色、c d 31 及 p c n a 免疫组化等进行了一系列的药理学评价。 本课题筛选得到的化合物m d s 11 及其磷酸盐m d s 1l p 在分子、细胞和动 物水平上都显示出和c a 4 相当，甚至比c a 4 还好的药效。这对于我们国家开发 抗肿瘤药物，开发新型的血管破坏剂，对于人类战胜肿瘤都具有非常重要的科研 和社会意义。 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 第一章 m t t 法血管破坏剂药物筛选模型的建立及化合物筛选 刖 舌 肿瘤血管在实体瘤的发生发展中具有重要的作用，为肿瘤细胞提供氧气，养 料并输送废物，同时提供转移的主要路线。新生血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 是指 在原有的血管床上再生成新的血管，它有别于血管发生过程，是一个由多种细胞 因子和多种细胞成分参与的、动态的、协调的复杂过程，其起始的中心环节是血 管内皮细胞或基质细胞的迁移、分裂、分化，以及随后的管腔化，这一过程受到 血管生成因子和抑制因子的精密调控。肿瘤内部新生血管的生成为肿瘤生长提供 必需的氧气和养料，是肿瘤不断生长的前提。 然而，肿瘤血管和正常血管存在着很大的区别，肿瘤内皮增殖快，细胞形状 不规则，相互之间联系松散，血管平滑肌以及周细胞连接不紧密，形成的管腔具 有很大的渗透性。肿瘤的血管网络非常的杂乱，分支复杂，没有明显的分级，管 腔直径不规则，分支点之间的距离通常很远，使得肿瘤组织对压力很敏感。这些 特点导致了肿瘤内部较高的血流阻力和缺氧的微环境。另外，肿瘤内皮的基因表 达也存在很大的不同【刀。 血管破坏剂就是基于肿瘤血管的以上特点开发的一类化合物。我们根据肿瘤 血管不完整的特点，在体外利用非融合( n o n c o n f l u e n c e ) 状态的h u v e c s 来模 拟肿瘤血管，用融合状态( c o n f l u e n c e ) 的h u v e c s 模拟正常血管。d a r k 阳等报 道，c a 4 对于融合状态h u v e c 几乎没有毒性作用，而对快速增殖的非融合状态 的h u v e c 具有较强的细胞毒。另外，c a 4 p 在体内的半衰期很短，约o 5 h 左右 嘲。我们通过短时间的化合物作用来模拟c a 4 类化合物在体内较快的半衰期， 利用m t t 法检测化合物对细胞的损伤。利用该模型，我们筛选了一系列的化合 物，并得到了具有较好活性的化合物m d s 1l 及其磷酸盐m d s l l p 。 4 1 材料和方法 海洋 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 状态，加入m d s 1 l 、c a 4 ，2 h 后用p b s 洗两遍，换成正常培养基继续培养4 天( 直到对照组长到融合状态) 。m t t 法检测，同1 4 。 1 6m d s 1 1 p 不同时间点对非融合h u e v c 生长抑制敏感性 消化h u v e c 细胞，以4 0 0 0 ：孔种于9 6 孔板，正常条件( 3 7 c ，5 c 0 2 ) 孵育2 4 h 。将c a 4 p 及m d s 1l p 加至9 6 孔板，终浓度分别为lo 5 m ，l 驴m ，1 0 7 m ， 1 0 s m ，1 旷m 分别孵育1 h ，3 h ，1 2 h ，2 4 h ，4 8 h 。吸出含有化合物的培养基， p b s 洗三次后加入2 0 0pl 新鲜培养基。自加药起共孵育4 天后，m t t 法检测， 同1 4 。 1 7m d s 1 1 的常规细胞毒评价 消化i k j v e c ，以8 0 0 0 个孔种到9 6 孔板，2 4 h 后加入c a 4 和m d s - 1 1 ， 作用4 8 h 后，m t t 法检测，同1 4 。 2 结果 2 1 化合物筛选结果 通过上述模型，我们对1 2 个定向合成的c a 4 类血管破坏剂进行了评价，表 1 结果显示，m d s 1 1 具有和c a 4 相近的作用效果，化合物7 、1 0 、1 1 、1 2 几乎 没有抑制作用数据未列出。c a 4 和m d s 1 1 的抑制率基本相同，在1 0 洲有4 0 左右抑制作用，而且m d s 1 1 的磷酸钠盐8 号和锂盐9 也有较高的抑制率。这表 明m d s 1 1 具有继续进行深入研究的潜力。我们后续的研究就以m d s 1 1 为对象。 5 0 4 0 琶3 0 得 磊2 0 嚣 l o 0 药物抑制率( 1 0 u l i ) _ 。_ 3456 89 化合物 图l ：不同化合物对非融合h u v e c 的增殖抑制作用 6 e g s 00 0 0 0 0 10 0 0 0 10 0 0 10 0 10 1 浓度( 1 tm ) 1 0 表l ：c a 4 和m d s - i i 对非融合h u v e c 的增殖抑制作用比较 2 3m d s 1 i p 不同时间点对非融合h u e v c 生长抑制作用 从表2 中可以看出，m d s 1 i p 与c a 4 p 作用不同时间，对内皮细胞的作用的 敏感性相当。m d s 1 i pl p m 浓度，3 h 就显示出5 3 的抑制作用，4 8 h 的抑制作 用达到7 2 。 时间c a 4 p ( m )d s 1 1 p ( m ) 1 0 41 0 - e1 0 - 71 0 41 0 - 91 0 51 旷1 0 - 71 0 01 0 - 9 l h5 4 o 4 7 4 2 1 51 3 65 2 95 9 5 21 0 93 6 23 1 9 2 5 0 l 抑3 h6 3 44 1 49 1 4- 4 4 04 0 76 5 9 65 3 4 52 8 67 6 9- 9 8 0 制 68 率 1 2 h6 5 26 0 11 7 63 6 40 8 46 5 7 85 1 5 l1 4 44 5 l0 7 l 5646 2 4 h 6 5 16 4 3 5 4 8 1 4 95 5 36 9 0 46 4 1 95 3 81 3 49 0 l 58o606 4 8 h7 2 47 4 17 3 o5 3 94 8 87 0 2 l7 2 4 97 3 75 7 o4 3 6 729343 表2zm d s 1 1 p 与c a 4 p 不同时间对非融合h u e v c 生长抑制的敏感性 7 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 2 4m d s 1 l 常规细胞毒评价 目前的抗肿瘤药物大多是针对肿瘤细胞的细胞毒类药物。为了进一步评 价m d s 1 1 的作用效果，观察其是否在长时问作用具有细胞毒作用。我们将 时间点设为4 8 h ，进行常规细胞毒评价。结果如表3 所示，m d s - 1 1 和c a 4 两者具有几乎相同的长时间细胞毒作用，o m t u x 4 就显示出抑制作用，1 0 i t m 达到最大。 l - 6 1 4 1 2 l 智0 8 o 0 6 0 4 0 2 0 d m s 00 0 0 10 0 1 0 1l 浓度( i im ) 1 0 表3 ：c a 4 和m d s - i i 对h u v e c 的长时间增殖抑制作用 8 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 讨论 肿瘤血管系统的发展与肿瘤内部的微环境直接相关，肿瘤组织内部缺氧，并 且肿瘤细胞及肿瘤内皮细胞会分泌一系列的生长因子来调控肿瘤血管的形成。在 体外人们很难完全模拟肿瘤内部的微环境。因此，肿瘤血管破坏剂的筛选一直没 有很好的模型。人脐静脉内皮细胞( 阳e c ) 是目前研究中采用最多的一种内 皮细胞，由于其较为容易原代培养，在体外也可以诱导形成管腔，在血管系统的 研究中得到了大多数学者的认同【1 0 】。肿瘤内皮细胞和正常内皮细胞区别中非常 重要的一点就是其连接松散，增殖速度快。 我们就利用这一区别，在体外利用非融合( n o n c o n f l u e n c e ) 状态的h u v e c s 来模拟肿瘤血管，用融合状态( c o n f l u e n c e ) 的h u v e c s 模拟正常血管。在9 6 孔板的体系中，以h u v e c2 0 0 0 个孔，2 4 h 后为非融合状态进行化合物筛选。 m t t ( 四唑盐) 比色法的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源 性m t t 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( f o r m a z a n ) 并沉积在细胞中，而死 细胞无此功能。这一方法已经成为评价化合物细胞毒作用的经典方法【1 1 1 。 c a 4 p 在体内具有较短的血浆半衰期( 0 5 h 左右) ，并且c a 4 与微管蛋白的 结合是可逆的，这也成为c a 4 类化合物选择性破坏肿瘤血管的原因之一。为了 在体外模仿c a 4 p 在体内较短的半衰期，我们将化合物作用时间定为2 h 。之后 用p b s 洗掉反应体系中的药物，正常条件继续培养4 天观察化合物对h u v e c 内皮细胞短时间的损伤作用。 通过以上的模型，我们得到了候选化合物m d s 1 1 。在短时间2 h 内m d s - 1 1 和阳性化合物c a 4 具有相同的细胞毒作用，抑制率为4 5 左右，而且m d s 1 1 磷酸盐即8 号和9 号化合物在短时间2 h 也显示出相近的细胞毒。这说明m d s - 1 1 的磷酸盐同样可以很快代谢为原药而发挥作用，m d s 1 1 的作用模式很可能与 c a 4 相同，即可逆的结合与微管蛋白，从而影响内皮骨架系统，导致血管网络 的破坏。m d s 1 1 同样表现出较好的剂量依赖性，在l p m 作用2 h 就具有2 5 左 右的抑制率。不同时间点对m d s 1 1 p 细胞毒的评价表明，m d s 一1 1 p 可以随时间 和剂量影响h u v e c 细胞的增殖，效果与c a 4 p 相当。对m d s 1 1 在4 8 h 长时间 内细胞毒评价表明，m d s 1 1 具有和c a 4 相同的细胞毒作用。 因此，对m d s 1l p 进一步的细胞水平药效评价显得非常必要。 9 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 第二章 加s 1 1 的体外血管破坏作用研究 刖吾 c o m b r e t a s t a i na _ 4 类肿瘤血管破坏剂主要是通过与细胞的微管骨架系统的 相互作用而破坏肿瘤血管内皮，从而导致肿瘤的坏死。上一章的筛选中，我们得 到了候选化合物m d s 11 。初步的细胞毒表明m d s 11 具有和c a 4 相似的短时间 内损伤内皮的作用效果。c a 4 的细胞内的作用靶点为微管蛋白，c a 4 可以影响 微管蛋白的动态平衡，抑制微管的聚合，从而导致细胞骨架的损伤，破坏肿瘤血 管。为了进一步的寻找m d s 1 1 已经磷酸盐m d s 1 1 p 在细胞水平的靶点，证明 其对细胞骨架的影响和对微管动态的影响。我们将设计了以下实验来证明 m d s 1 1 和m d s 1 1 p 的微管靶向作用和血管破坏效果。 m d s 1 i p 与微管蛋白的相互作用研究：在这部分的研究中，我们通过表面 等离子共振技术来分析m d s 1 1 和提取的微管蛋白之间的相互作用。 m d s 1 i p 对微管蛋白无细胞体系聚合的影响：在这部分的实验中，我们利 用微管蛋白可以在体外聚合的特性来评价m d s 1 l 对无细胞体系微管蛋白聚合 的影响。 m d s 1 1 对细胞骨架系统的影响：在这部分的实验中，我们研究化合物 m d s 1l 对细胞微丝、微管骨架系统的影响。 m d s 1 i p 对细胞内不同形式微管蛋白比例的影响：在这部分的实验中，我 们利用高速离心的方法将细胞内聚合和游离型的t u b u l i n 分离，利用w e a t e r n 分析其比例。评价化合物m d s 1 1 对细胞内微管的影响。 m d s 1i p 对既成m a t r i g e l 管腔的影响：在这部分的实验中，我们利用改进 的h u v e c 和h m e c 管腔破坏实验评价m d s 1i p 的体外管腔破坏作用。 ， 1 0 海洋来源的肿瘤血管破坏剂的筛选及药效评价 1 材料和方法 1 1 化合物和试剂 m d s 1 1 以及其磷酸钠盐m d s 1 l p 和化合物c a 4 p 由中国海洋大学药物化 学合成二室提供。化合物用二甲亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 配成1 0 2 m o l l 储存液，分装后存放于2 0 c ，使用时用生理盐水或培液稀释，各给药组d m s o 浓度低于0 1 ( v v ) 。 1 6 4 0 、m c d b l 3 1 干粉培养基为g i b c o 公司( 美国) 产品：胎牛血清为杭州 四季青生物工程材料有限公司产品；t r y p s i n 、c o l c h i e i n e ( 秋水仙碱，c o l ) 、a c t i n 抗体、t u b u l i n 抗体、m t r i g e l 、均购自s i g m a 公司( 美国) ；g t p 、e g t a 等购自北 京鼎国生物技术公司，其它试剂为国产分析纯。 1 2 实验仪器 细胞培养瓶、多孔培养板购自c o a s t a r 公司( 美国) ；c 0 2 细胞培养箱为 h e m e u s 公司( 德国) 产品；倒置相差显微镜为奥林巴斯公司( 日本) 产品；酶 标仪为r a i n b o w 公司( 奥地利) 产品。冷冻高速离心机：5 8 1 0 r ，德国e p p e n d