（无机化学专业论文）中药秦皮荧光成分的光谱性质及分析方法研究.pdf

1一j一i j一 本人所提交的学位论文 师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：昝a i = i 隼 ld 年i 1 月阳f t 指导教师确认( 签名) 胡琴辖 为fd 年1 1 月l , vf t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者( 签名) ：岔阳年 沙f d 年if 月为同 指导袅舭：旧轻巍溉 叫d 年f 月矽同 一帆 厂魏 摘要 本文研究了中药秦皮活性成分秦皮苷、秦皮素的荧光性质，考察了环境因素对秦皮 甲素和秦皮乙素荧光光谱的影响。用柱色谱法分离得到了秦皮甲素和秦皮乙素，建立了 薄层荧光扫描法测定秦皮中秦皮甲素和秦皮苷含量的新方法，并用高效液相色谱法进行 了验证。 论文主要包括五部分： l 、首次报道了秦皮苷的荧光光谱并研究了实验条件对其荧光光谱的影响，以硫酸 奎宁为参比，测得p h9 4 2 时秦皮苷水溶液在最大激发波长3 8 7n m 处的荧光量子产率为 0 5 8 。 2 、首次报道了秦皮素的内源荧光和敏化荧光性质，考察了环境因素对其内源荧光 的影响。秦皮素自身荧光很弱，荧光量子产率为0 0 1 6 。加入硼砂之后荧光显著增强， 测得硼砂秦皮素络合物的荧光量子产率为0 0 7 7 。 3 、考察了环境因素对秦皮甲素和秦皮乙素荧光光谱的影响。发现硼砂和铝离子对 秦皮乙素有明显的荧光增敏作用。 4 、对中药秦皮中的荧光组分做了柱色谱分离，得到了两种荧光组分。经薄层色谱 对照和光谱性质研究，证明分离得到的两种组分分别为秦皮乙素和秦皮甲素。 5 、建立了薄层荧光扫描法测定秦皮中秦皮苷和秦皮甲素含量的新方法，并用高效 液相色谱紫外检测法进行了验证。 关键词：秦皮，秦皮苷，秦皮素，秦皮甲素，秦皮乙素，荧光分析，薄层荧光扫描， 高效液相色谱 a b s t r a c t f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i na n df r a x e t i n ，a c t i v ec o m p o n e n t so fc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e q i n p i ( c o r t e xf r a x i n i ) ，w e r es t u d i e di nt h i st h e s i s i n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n tc o n d i t i o n so n f l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fa e s c u l i na n da e s c u l e t i nw e r ei n v e s t i g a t e d an e wt h i n 1 a y e r f l u o r e s c e n c es c a n n i n gm e t h o dw a sp r o p o s e df o rd e t e r m i n a t i o no fa e s c u l i na n df r a x i ni n q i n p i , a n dt h ef e a s i b i l i t yo ft h en e wm e t h o dw a st e s t e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) f i v ep a r t sw e r ei n c l u d e di nt h i st h e s i s ： 1 f l u o r e s c e n c es p e c t r u mo ff r a x i nw a sr e p o r t e df o rt h ef i r s t t i m e ，a n di n f l u e n c e so f e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so nf l u o r e s c e n c es p e c t r aw e r ea l s os t u d i e d u s i n gq u i n i n eb i s u l f a t ea s ar e f e r e n c e ，f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d so ff r a x e t i na q u i o u ss o l u t i o nw i t hp h9 4 2w e l o m e a s u r e dt ob eo 5 8a te x c i t a t i o nw a v e l e n g t h3 8 7n m 2 t h ei n t r i n s i ca n ds e n s i t i z e df l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x e t i nw e r er e p o r t e df o rt h ef i r s t t i m e , a n di n f l u e n c e so fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r so ni t sf l u o r e s c e n c ew e r ei n v e s t i g a t e d t h e f l u o r e s c e n c eo ff r a x e t i nw a sv e r yw e a k , i t sf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d sw a s0 016 w ef o u n d t h a tf l u o r e s c e n c eo ff r a x e t i nc a r lb es e n s i t i z e db yb o r a x f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l do f f r a x e t i n - b o r a xc o m p l e xw a sm e a s u r e dt ob e0 0 7 7 3 i n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n tc o n d i t i o n so nf l u o r e s c e n c es p e c t r ao fa e s c u l i na n da e s e u l e t i n w e r ei n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tb o r a xa n da l u m i n i mi o nc a nm a r k e d l ys e n s i t i z et h e f l u o r e s c e n c eo f a e s c u l e t i n 4 u s i n gam e t h o do fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , f l u o r e s c e n tc o m p o n e n t so fq i n p iw e r e s e p a r a t e df r o mad r u gs a m p l e , a n dt w of l u o r e s c e n tc o m p o u n d sw e r eo b t a i n e d b yt h i n 1 a y e r c h r o m a t o g r a p h i cc o n t r a s tw i t hs t a n d a r sa n ds t u d yo fs p e c t r a lp r o p e r t i e s ，t h et w oc o m p o u n d s w e i ep r o v e dt ob ea e s c u l e t i na n da e s c u l i n , r e s p e c t i v e l y 5 b a s e do nt h ef l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e s o ff r a x i na n da e s c u l i n ，an e wt h i n 1 a y e r f l u o r e s c e n c es c a n n i n gm e t h o dw a sp r o p o s e df o rt h e i ra n a l y s i s ，a n di t sf e a s i b i l i t yw a st e s t e d b yah p l cm e t h o d k e yw o r d s ：q i n p i ( c o r t e xf r a x i n i ) ，f r a x i n ，f r a x e t i n ，a e s c u l i n ，a e s c u l e t i n ，f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s ，t h i n l a y e rf l u o r e s c e n c es c a n n i n g ，h p l c i v 目 摘要 a b s t r a c t 绪论 1 秦皮苷和秦皮素的荧光光谱研究 1 1 秦皮苷的荧光光谱研究5 1 2 秦皮素的荧光光谱研究1 4 1 3 硼砂对秦皮素的荧光增敏作用1 9 本章小结2 5 2 环境因素对秦皮甲素和秦皮乙素荧光光谱的影响2 6 2 1 金属离子对秦皮甲素和秦皮乙素荧光光谱的影响2 6 2 2 葡萄糖对秦皮乙素的荧光增敏作用2 8 2 3 硼砂对秦皮乙素的荧光增敏作用3 0 本章小结3 2 3 中药秦皮中荧光组分的柱色谱分离与光谱性质3 3 3 1 荧光组分的柱色谱分离3 3 3 2 荧光组分的光谱性质3 5 本章小结4 0 4 中药秦皮中荧光组分的分析测定4 1 4 1 秦皮中荧光组分的薄层荧光扫描法测定4 l 4 2 秦皮中荧光组分的液相色谱一紫外检测法测定4 7 本章小结5 l 参考文献。5 2 攻读学位期阳j 科研成果5 6 后记( 致谢) 5 7 v 绪论 中药是我国医药宝库的重要组成部分，是我国传统医学用于防病和治病的主要物质 基础。中药包括植物药、动物药和矿物药【i 】等，其中植物药占绝大部分。中药质量 控制方法的科学化和标准化是中药迈向国际市场的重要保证。本文采用现代荧光分析技 术对中药秦皮活性成分的光谱性质进行深入研究，并采用薄层荧光扫描法对秦皮活性成 分的含量进行测定，以期能够为中药秦皮的质量控制以及药理学研究提供新的荧光分析 测定方法。 l中药秦皮的研究现状 中药秦皮是木樨科植物尖叶白蜡树、苦枥白蜡树、白蜡树或者宿柱白蜡树的枝皮晾 干而得，成品枝皮呈卷筒状或槽状，质硬而脆，黄白色，气微，味苦。干皮为长条状块 片，外表面灰棕色，有龟裂状沟纹及红褐色圆形或者横长的皮孔。秦皮具有清热燥湿， 收涩、明目的功效，最常用于治疗热痢、泄泻、赤白带下、目赤肿痛、目生翳膜等症【2 1 。 人们通过大量的研究发现，秦皮具有抗炎，止痛和降低血尿酸的功效，尤其对于治疗痛 风效果极佳【3 1 。此外，秦皮还具有抗氧化作用阳l 。 化学成分苦枥白蜡树树皮中含七叶素、七叶苷；白蜡树树皮中含七叶素、秦皮素； 宿柱白蜡树树皮中含七叶素、七叶苷、秦皮苷三种香豆素：尖叶白蜡树树皮中含有七叶 素、七叶苷、秦皮苷等。另外，苦枥白蜡树树皮中还含有鞣质：宿柱白蜡树树皮中还含 有丁香苷以及一种香豆素的多糖苷，即宿柱白蜡苷；尖叶白蜡树树皮中还有莨菪亭和2 ， 6 二甲氧基对苯醌以及微量的n 苯基2 萘胺【。香豆素类化合物是秦皮药材中主要的 化学活性成分。刘丽梅、王瑞海等人通过提取分离，对秦皮的化学成分进行了详细研究 】。魏秀丽等人【1 2 1 采用硅胶柱层析、s e p h a d e x l h 2 2 0 凝胶柱层析对秦皮中的化学成分 进行了分离，通过理化性质以及波谱方法对其进行了研究。秦皮中秦皮甲素及秦皮苷为 香豆素苷类成分，秦皮乙素及秦皮素分别为此两种成分的水解产物( 即苷元) 1 1 3 - 1 4 1 。i k o s t o v a 等人通过实验，详细研究了不同种类的白蜡树品种中的化学成分，并且已经从 白蜡树品种中提取出来的成分有香豆素类，丌环异落叶松树脂酚，苯基乙醇，类黄酮和 木质素类【15 1 。 药理药效秦皮中的香豆素对治疗原发性高尿酸血症具有明显功效【1 6 】。秦皮中的 秦皮苷具有较为明显的抗炎作用，其水溶液通过吸收紫外光能够保护皮肤免受损伤。生 物学研究表明，当秦皮苷以1 0m gk g - 1 腹腔注射，对角叉菜胶、右旋糖苷、组胺、甲醛 性足肿胀的抑制作用要大于秦皮甲素，而秦皮甲素对早期、中期、晚期的炎症均有效【1 7 1 。 此外，秦皮苷等香豆素类化合物还具有抗菌作用【1 8 , 1 9 1 ，是眼用制剂的主要成分，能够有 效的治疗眼部疾病【2 0 - 2 2 1 。而秦皮中的秦皮素能够预防骨质疏松症，抑制成骨细胞炎性细 胞因子介导的细胞凋亡，通过碱性磷酸酶活性和骨钙素，诱导分化的人成骨样细胞株球 蛋白6 3 ，从而抑制抗肿瘤抗体诱导细胞凋亡，而且还阻碍了抗肿瘤抗体与肿瘤坏死因 子吨和几1 p 对细胞死亡的协同作用瞄2 4 1 。秦皮乙素对骨关节炎还具有修复作用【2 5 1 。此 外，秦皮素还是一个自然酚醛抗氧化剂，能够诱导细胞内谷胱甘肽显著升高，防止鱼藤 酮介导的毒性，抗氧化和抗凋亡性能使这种天然化合物具有潜在的保护对鱼藤酮诱导的 细胞毒化作用2 6 , 2 7 。同时秦皮素对神经也具有保护作用，对鱼藤酮诱导的细胞内神经母 细胞瘤具有抑制作用【2 引。 提取分离2 0 0 3 年刘丽梅等人用聚酰胺柱第一次从苦枥白蜡树中分离得到了秦皮 中的几种化学成分】。郭希圣等人应用高效液相层析的方法对秦皮进行了分离并有了较 好的分离效果，但对于含有宿柱白蜡甙的样品，该方法则不能使其与秦皮苷有很好的分 离1 2 9 1 。另外用s e p h a d e xl h 2 0 凝胶柱层析【1 2 1 、高速逆流色谱( h s c c c ) 3 0 , 3 1 】等方法也 能将秦皮中的化学成分分离出来。l e iz h o u , j i ek a n g 等人通过超声提取了秦皮中的成 分，并采用梯度洗脱的方法分离得到了秦皮中的七种化学成分【1 4 1 。陈冰，宁丽等人采用 毛细管电泳的方法对秦皮中的秦皮甲素和秦皮乙素进行了分离【3 2 1 。 含量测定对于中药秦皮中各化学成分的质量测定，研究的很多，如有报道采用紫 外分光光度法测定以及薄层扫描法测定【3 3 1 ，中国药典中测定秦皮甲素的含量则应用的是 高效液相色谱法，中国药典2 0 0 5 年版规定秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量不得低于 1 0 0 4 。以往的定量研究主要集中于秦皮甲素和秦皮乙素两个方面，而对于秦皮中秦皮 素和秦皮苷的研究相对较少。 为了对秦皮质量检测提出客观的指标，需要定量测定药品中有效成分的含量，已报 道的多为秦皮甲素和秦皮乙素的定量测定，而且多为高效液相色谱法测定【3 ”7 】。此外还 有二阶导数示差脉冲极谱法1 3 8 】，差示脉冲伏安法【3 9 1 ，偏最d - - 乘一近红外透射光谱法1 4 0 1 ， 反相高效液相色谱法【4 l 】等测定秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的方法。孙翔宇等采用三维荧 光分析结合交替三线性分解算法对秦皮中的秦皮甲素和秦皮乙素做了定量分析【4 2 1 。郭希 2 圣等用秦皮的乙醇提取液点在硅胶g 薄板上，用氯仿甲醇水( 3 0 ：1 0 ：3 ) 的下层清液2 5m l 加甲酸0 5m l 作为展开剂，成功地分离了五种香豆素甙和甙元并用岛津c s 9 1 0 型双波长 薄层扫描仪测定了其含量，相对于其他方法，此法更准确、灵敏、简便、重现性也好【4 3 1 。 陈琳，刘丽梅，王瑞海等人采用高效液相的方法对秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、 秦皮素、6 ，7 二甲氧基8 羟基香豆素五种成分进行了含量测定【3 刀。l e iz h o u 等人用高效 液相色谱二极管阵列技术电喷雾质谱联用技术( h l p c d a d e i s m s ) 对秦皮的七种 成分实现了同时定量分析，组分分离是在a g i l e n tz o r b a xs b c 1 8 型色谱柱( 2 5 0m i n x 4 6 衄i d ，5t u n ) 上进行的。在4 0 分钟内以乙腈和0 3 的醋酸溶液梯度洗脱。检测波长为2 5 4 n m ，工作曲线呈良好的线性关系( ，2 0 9 9 9 2 ) ，检出限和定量的范围分别是1 0 7 3 1 9n g l i l l 一，2 7 9 1 2 7 5n gi i l l 。日内和日间精密度的相对标准偏差小于5 ，准确度能达到 9 6 4 9 1 0 3 5 5 。分析的回收率在9 7 6 1 - 1 0 3 5 5 之间。该法可以作为秦皮质量评价的 简便，快捷又可靠的方法【1 4 l 。 真伪鉴别中药的真伪优劣直接关系到用药的安全和疗效。在中药真伪鉴别的主要 手段有外观形态的鉴别、理化性质的鉴别和光谱、色谱分析【4 4 4 5 1 等。目前，对于秦皮真 伪的鉴别，已见报道的主要是就秦皮与其易混品木棉皮，合欢皮，女贞皮等等的鉴别 4 6 4 s l ，以及秦皮与水曲柳，毛白蜡树，秦岭白蜡树等的区别【5 6 5 7 】。应用的鉴别方法主 要有高效液相色谱法，薄层色谱法【5 蚋，荧光反应等。 2 荧光分析法 荧光分析法是现代分析化学的一种重要分析方法【5 9 】。在对微量物质的各种分析方法 中，荧光分析法的灵敏度和选择性较好，其灵敏度要比分光光度法高2 3 个数量级。此 外，荧光分析法还具有线性范围宽，方法简单，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂 等优点。目前，荧光分析法在药物分析方面的应用同益广泛【删。本实验室在前人工作的 基础上对中药荧光成分的光谱性质和分析方法开展了系列研究。 物质产生荧光的能力主要决定于其分子结构，但是环境因素也可能对分子荧光产生 比较大的影响，因此了解和利用环境因素的影响，对于提高荧光分析方法的灵敏度和选 择性具有重要意义。 3 薄层色谱分析法 薄层色谱法是将固定相涂和于玻璃等载板上，形成均匀的薄层，将被分离物质点在 薄层的一端，置展开室中，展开剂( 流动相) 借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一 端，在此过程中不同物质可以得到分离【6 1 1 。薄层色谱分析与其他色谱分析相比，其显著 不同之一是得到的图谱是直观性很强的图像。常规薄层色谱由于同板同时可以检测多个 样品，分析时间短。凡化合物本身或经过色谱前或色谱后衍生化能生成对紫外光有吸收 并能发出更长波长的化合物适用于荧光测定法。荧光测定法的优点在于灵敏度高于吸收 测定法1 0 0 1 0 0 0 倍，最低可测至l o 5 0p g ；荧光测定法的专属性强，可避免一些杂质 的干扰，基线也较稳定；此外，定量分析的线性范围相当宽【6 2 1 。薄层色谱法在医药方面 的应用十分广泛。倪坤仪等【6 3 】统计了有关药物分析的论文的概况，薄层色谱的应用由 1 9 9 2 年的1 3 4 上升到2 1 4 ，已成为当今药物分析领域必不可少的色谱技术之一。在 中药材分析方面，主要用于中药材的品种鉴别【诈6 9 】以及中草药成分分析 7 0 - 7 5 1 及中成药及 合成药制剂的含量测定1 7 6 4 0 。 4 本文研究的内容和意义 中药的活性成分大多采用高效液相色谱法测定。为了扩大荧光分析法在中药分析中的应 用，本文在前人工作的基础上，进一步开展了中药三维荧光光谱及中药活性成分的光谱性质 和定量分析方法的研究。秦皮是一种常用的中药，目前对秦皮的研究多为秦皮甲素和秦皮乙 素，而对秦皮苷和秦皮素的研究很少，本文考察了秦皮中的秦皮苷和秦皮素的二维荧光光谱 以及三维荧光光谱，并测定了它们的荧光量子产率和电离常数，同时考察了环境因素对荧光 光谱性质的影响。建立了秦皮苷和秦皮甲素的含量测定的薄层色谱荧光扫描分析新方法， 并采用高效液相色谱紫外检测法进行了验证，结果较为理想。本研究对于中药秦皮的成分 分析和质量控制具有一定的学术意义和应用价值。 4 1秦皮苷和秦皮素的荧光光谱研究 秦皮苷和秦皮素( 分子结构见图1 1 ) 是中药秦皮的活性成分，秦皮素是秦皮苷的 苷元。已有的关于秦皮活性成分的报道多是关于秦皮甲素和秦皮乙素的研究，对秦皮苷 和秦皮素的报道相对较少，而且多是药理学方面的研究。对秦皮苷和秦皮素的分析测定 大多采用高效液相色谱法和薄层色谱法等方法，未见有荧光分析法的研究报道。 本文详细研究了秦皮苷和秦皮素水溶液的荧光光谱和吸收光谱，以硫酸奎宁做参比 测定了秦皮苷和秦皮素的荧光量子产率，采用荧光光度法测定了秦皮苷的电离常数；考 察了环境因素对秦皮素荧光光谱的影响，详细研究了硼砂对秦皮素的荧光增敏作用。 h 3即 ab 图1 1 秦皮苷( a ) 、秦皮素( b ) 的分子结构 f i 9 1 1m o l e c u l a rs t r u l a r o f f r a x i n ( a ) a n df r a x e t i n ( b ) 1 1 秦皮苷的荧光光谱研究 1 1 1 实验部分 1 1 1 1 仪器与试剂 u v - 2 5 0 1 p c 分光光度计( s h i m a d z u ) ：f 4 5 0 0 荧光分光光度计( h i t a c h i ) ：8 2 8 型p h i s e 测试仪( o r i o n ) 。 秦皮苷( 上海海灿生物科技有限公司，编号：5 2 4 - 3 0 - 1 ) - 准确称取秦皮苷0 0 0 1 4 3g 溶于甲醇，得1 4 3 嵋m l j 溶液，用时根据需要适当稀释。硫酸奎宁( 生化试剂) ：5 0 0 x 1 0 6 m o ll ；n a o h ：1 0 m o ll - 1 ；b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液( 简称三酸溶液) ：准确称取1 2 3 6 6 g 硼酸于小烧杯中，用水溶解，转移到1 0 0 0 m l 的容量瓶中，加入乙酸( 3 6 ) 3 1 8m l ， h 3 p 0 3 ( 8 5 ) 1 3 6m l ，以水定容摇匀；实验用水为二次去离子水。 1 1 1 2 实验方法 取一系列1 0m l 容量瓶，分别加入秦皮苷溶液以及p h 缓冲溶液，以水定容摇匀， 然后扫描各溶液的荧光光谱。 5 1 1 2 结果与分析 1 1 2 1 秦皮苷的三维荧光光谱 研究了秦皮苷水溶液 在酸性、近中性以及碱性 条件下的三维荧光光谱， 分别得到图1 2 、图1 3 和图1 4 。由图1 2 可见， 在酸性条件下，秦皮苷自 身具有弱荧光，图中出现 两个荧光峰，激发波长k 分别位于2 3 5n n l 和3 4 0 n n l ，发射波长k 相同， 均为4 7 0 n m 。 当改变溶液酸度时， 其峰形状和峰强度均有 较大改变。在图1 3 中， 在p h6 1 8 时，两个荧光 峰的激发波长k 分别为 2 3 0 和3 2 0n i n ，发射波长 k 均为4 4 0 n m 。与图1 2 相比，荧光峰蓝移。 在p h9 6 8 的时候， 秦皮苷荧光最强，两个荧 光峰的a 甑腺锄分别位于 2 5 0 4 4 0n m 和3 5 0 4 4 0 n m ，峰强度和峰位置都有 所改变，见图1 4 。 6 图1 2 秦皮苷在酸性溶液中的三维荧光光谱 h g 1 2t h r c e i m c n s i o n a lf l u o 代络c a 尬es l 豫a r ao ff r a x i ni na c i d i c s o l u t i o n | x i n - 0 7 1 5p gm l 一，p h1 7 3 ，s l i t ：5 0 5 0r i m , i n t e r v a l ：3 0 e m 图1 3 秦皮苷在近中性溶液中的三维荧光光谱 f i g 1 3t h r e e - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni nn e u t r a l s o l u t i o n c j 阳l x 缸= 0 7 1 5p gm l - 1 ，p h6 1 8 ，s l i t ：5 0 5 0n l l l ，i n t e r v a l ：3 0 图1 4 秦皮苷在弱碱性溶液中的三维荧光光谱 f i g 1 4t h r e e - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni nw e a ka l k a l i n e s o l u t i o n c f r a x i n = 0 7 1 5l j gm l ，p h9 6 8 ，s l i t = 5 0 5 0n m ，i n t e r v a l ：3 0 由上述三个图谱可以知道，秦皮苷的荧光光谱随着p h 值的改变有较大的改变，因 此，有必要详细研究秦皮苷荧光光谱的p h 效应与分子结构的关系。 1 1 2 2 秦皮苷在不同酸度下的荧光光谱 在一定的浓度条件下，测量了p h 值对其二维荧光光谱的影响，结果见图1 5 图1 1 0 。 图1 5 和1 6 分别为秦皮苷在弱酸性及中性条件下的荧光光谱。在弱酸性条件下( 图1 5 ) ， 荧光激发波长k = 3 4 0n m ，发射波长k = 4 7 0a m ，随着p h 值的增大，荧光逐渐增强； 到中性条件下( 图1 6 ) ，秦皮苷的发射光谱峰形和峰强度都没有发生改变，在p h = 6 2 1 时，激发光谱略有红移，但变化不大。 u n m 图1 5 秦皮苷在弱酸性溶液中的荧光光谱 f i g 1 5f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni nw e a k a c i d i cs o l u t i o n s c f m i 和715p gm l 一， 九以m ：3 4 2 4 7 2m n ，s l i t ：5 o 5 0n l l l u n m 图1 6 秦皮苷在中性条件下的荧光光谱 f i g 1 6f l u o r e s c e n c es p t r ao ff r a x i ni nn e u t r a l s o l u t i o n s c f r a x i n - o 715l a gm l ， 九x 正l 咖：3 4 2 4 7 2n l n ，s l i t ：5 0 5 0n l n 随着p h 值升高，在p h6 6 0 8 1 5 之间，秦皮苷激发光谱发生变化，k 由3 4 2n m 逐渐红移到了3 8 6n l l l ，荧光强度增大，见图1 7 。 言1 耋， 8 蓉 羹 正 a 空 d c 旦 e 8 c o 岔 2 o 三 也 2 0 02 5 0 湖3 , 5 04 0 04 , 5 05 0 0 渤鲫 a h m b 图1 7 秦皮茴在弱碱性性条件下的荧光光谱 f i g 1 7f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni nw e a ka l k a l i n es o l u t i o n s c f r a x i n = 0 7 1 5p gm i ，s l i t ：5 0 5 0n m a ：儿以m ：3 4 2 4 7 2h i l l ，b ：厶x l m ：3 8 6 4 7 2n m 7 空蚕量灭芒震i墨5nik 参一竹c置coocou协m=o丁一!| 在弱碱性条件下( p h8 5 7 - 1 0 4 1 之间) ，秦皮苷的荧光光谱保持不变，见图1 8 。 誊 c 旦 g o t ) c 8 巴 。 呈 u - 圣 丽 c 旦 曼 o ) c o o 巴 。 三 i t 2 2 3 0 03 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 06 7 j n m ab 图1 8 秦皮苷在弱碱性条件下的荧光光谱 f i g 1 8f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni nw e a ka l k a l i n es o l u t i o n s c 阳x 棚7 1 5i 上gm l 一，s l i t ：5 0 5 0n m a ：3 4 2 4 7 2n l n ，b ：k ：3 8 6 4 7 2n l n 随着p h 值升高，在p h1 0 8 3 1 1 9 9 之间，秦皮苷的激发光谱和发射光谱的峰形没 有变化，但峰强度逐渐降低，见图1 9 。 2 2 f 鼢3 3 5 04 4 , 5 05 0 05 6 0 0 7 j r a l 2 2 5 03 3 5 04 0 04 5 0 o5 咖 7 j n m ab 图1 9 秦皮苗在强碱性溶液中的荧光光谱 f i g 1 9f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni ns t r o n ga l k a l i n es o l u t i o n s c 阳x 矿o 7 1 5g gm l 一，s l i t ：5 0 5 0n l n a ：厶以m ：3 4 2 4 7 2n l n ，b ：k ：3 8 6 4 7 2h i l l 根据以上实验结果和秦皮苷的分子结构( 图1 ) ，我们推测，在溶液p h 改变的过程 中，秦皮苷分子中2 位羰基( 2 c = o ) 和7 一位羟基( 7 o h ) 可能发生了质子化或质子离 解作用，这种作用导致了秦皮苷荧光光谱随p h 的改变而改变。为了进一步验证这一推 测，我们分别在k 脱锄= 3 4 2 4 7 2n r f l 以及k = 3 8 6 4 7 2h i l l 条件下，研究了荧光强度 随p h 值的变化关系，得到图1 1 0 ： 8 珊 瑚 吾 鲫 i | o 扫isco芒一moc量6j正 x嚣ncm_coocm_omojk 24681 01 224681 01 2 p hp h ab 图1 1 0 溶液酸度对秦皮苷荧光强度的影响 f i 9 1 1 0i n f l u e n c e o f a c i d i t y o nf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f f r a x i n c f m x = o 7 1 5t t gm r l ，s l i t ：5 0 5 0n l n a ：l 姐哪：3 4 2 4 7 2n l n b ? k ：3 8 6 4 7 2n l n 由图1 1 0 并结合秦皮苷的分子结构，我们推测秦皮苷存在不同型体之间的质子转移 过程，如图1 1 l 所示g =” h g i u i o g l u g l u ii ii i o 图1 1 1 秦皮苷的质子电离与水解过程 s c h e m e1 11t h e p r o t o nd i s s o c i a t i o na n dh y d r o l y z a t i o np r o c e s so ff r a x i n 上述质子转移过程导致了秦皮苷荧光光谱的改变： 在强酸性条件下，秦皮苷2 位羰基结合质子，形成型体i ，该型体无荧光。 随着p h 的增大( p h 2 ) ，2 一位羰基结合的质子逐渐离解，形成型体i i ，该型体 有弱荧光，a 矾锄为3 4 2 4 7 2n l n 。 在p h 5 的近中性条件下，秦皮苷7 - o h 质子随着p h 的升高而离解，形成型体 i i l ，此时型体具有强荧光，a k 为3 8 6 4 7 2n m 。由图1 1 0b 可知，该型体在p h7 5 1 0 5 之间具有稳定的强荧光。 在强碱性条件下( p h 1 1 ) ，随着p h 升高，秦皮苷溶液荧光逐渐减弱直至荧光 消失，这是由于其分子结构中的内酯环发生水解，形成型体i v ，该型体无荧光。 由上述分析可知，利用荧光分析法测定秦皮苷，适宜的溶液酸度是p h7 5 1 0 5 ， 测量波长应为a 既从咖= 3 8 6 4 7 2n m 。 9 咖 渤 瑚 啪 啪 i ； o j 釜c卫coocm_om匕oriu 参协cm芑一8c8笛jo，正 仅 眇。人v o y字如 1 1 2 3 荧光法测定秦皮苷的7 羟基质子电离常数 秦皮苷7 羟基质子的电离， 导致荧光强度随溶液p h 的变化 而改变，利用这一性质，可以测 定7 羟基质子的电离常数，有 关原理可参见文献【8 3 1 。 秦皮苷荧光强度随p h 的变 化如图1 1 2 所示。根据图中的 数据计算秦皮苷的电离常数，结 果列下表1 1 。 456 7 891 01 1 ，n m 图1 1 2 酸度对秦皮苷荧光强度的影响 f i g 1 1 2i n f l u e n c eo f a c i d i t yo nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f f r a x i n c f 捌7 1 5p gm l l , 屯姒铀：3 8 6 4 7 2n m 表1 1 荧光法测定秦皮苷的7 习弪基质子解离常数p k , t a b l e1 1c a l c u l a t i o no f d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t7 - o hp k o f f r a x i n f s = 1 5 8 9 凡b = 4 6c f n 。捌7 1 5t t gm l s l i t ：5 0 5 0a m 由上表可见，秦皮苷的7 羟基质子电离常数p k a 值为6 8 2 。 1 1 2 4 秦皮苷在不同介质中的荧光光谱 秦皮苷在不同浓度甲醇溶液中的荧光光谱见图1 1 3 。从图中可以看出，随着甲醇体 积分数的增加，秦皮苷的荧光激发光谱和发射光谱基本不变，但荧光强度逐渐降低，当 甲醇体积分数为1 0 0 时，秦皮苷荧光激发波长红移至k = 3 9 2n n l ，荧光强度有所增加。 即秦皮苷荧光强度与甲醇体积分数成反比。 其他溶剂对秦皮苷荧光光谱也有一定的影响，如秦皮苷在不同介质中的荧光光谱见 图1 1 4 ，由图中可以看到，秦皮苷在甲醇溶液中的荧光最弱，在水中和乙醇中的荧光强 1 0 o 湖 吾； 瑚 啪 湖 | | o 釜co重8c8笛匠 度基本一致，但在乙醇介质中荧光激发波长发生明显红移，k = 3 9 8n l t l 。 釜 罂 旦 量 8 c 8 o 尘 。 呈 u 图1 1 3 秦皮苷在甲醇溶液中的荧光光谱 f i g 1 13f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni n m e t h a n o ls o l u t i o n s c 胁x 棚7 1 5 呜n l r l ， l 以锄：3 4 0 4 7 0n l n ，s l i t ：5 0 5 0n l n 图1 1 4 秦皮苷在不同介质中的荧光光谱 ( 1 ，l ) ：水；( 2 ，2 ) ：乙醇；( 3 , 3 ) ：甲醇 f i g 1 1 4f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i ni n d i f f e r e n tm e d i u m c f 锨矿吣7 1 5p gm r l ， a 魄j 。m ：3 4 0 4 7 0n m ，s l i t ：5 0 5 0m n 1 1 2 5 秦皮苷的荧光量子产率 以硫酸奎宁溶液在激发波长3 1 3n i n 的荧光量子产率0 5 5 为参比，以参比法【s 2 】测定 了秦皮苷的荧光量子产率。扫描一定浓度的秦皮苷溶液( p h = 9 4 2 ) 和硫酸奎宁溶液的 吸收光谱，如图1 1 5 所示。再扫描秦皮苷溶液与硫酸奎宁溶液在不同激发波长下的荧 光光谱，如图1 1 6 与图1 1 7 所示。然后分别读出其在一定波长下的吸收值以及相应激 发波长下的积分荧光强度，然后计算其荧光量子产率，数据列于表1 2 。 疗 d 图1 1 5 秦皮茴与硫酸垒j 的吸收光谱 f i g 1 15a b s o r p t i o ns p e c t r ao ff r a x i na n dq u i n i n eb i s u l f a t e c f r a x i n = 0 9 3 8g gm l ，p h = 9 4 2 ，c q u i n i 矿5 0 1 0 6m o ll ，0 0 5 0m o ll h 2 s 0 4m e d i u m 净一c小崔c一8c_om=03一k 笃7 3 7 0 3 0 3 4 0 3 3 0 互d 到3 0 心 卸拗如黝彻伽锄锄咖 7 y n m 图1 1 6 秦皮苷溶液的荧光光谱 f i g 1 16f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff r a x i n c f l 捌9 3 8t t gm l ，s l i t ：5 0 5 0n m , p i - l = 9 4 2 享 i 三 ； ； ! 1 3 1 3 卸卸锄卸4 0 d 卸锄锄仰 g r i n 图1 1 7 硫酸奎宁的荧光光谱 f i g i 17 f l u o r e s c e n c es p 妇o f q u i n i n e b i s u l f a t e cq i i i n i n eb 姗l 劬产5 o xl o - 6m o ll 1 ， 0 0 5 0m o ll 1 h 2 s 0 4 ，s l i t ：5 0 5 0n m 表1 2 秦皮苷的荧光量子产率( 2 5 ) t a b l e l 2f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l do f f r a x i n 激发波长 硫酸奎宁( q u i n i n eb i s u l f a t e )秦皮苷( f r a x i n ) ，、 ，积分荧彳 y 荧光量 。 f 一积分荧 彳 】，荧光量 n m 光强度吸光度子产率 列b 1 3 光强度吸光度季；i 3 0 08 1 2 3 0 80 0 2 50 5 7 1 0 3 3 1 3 1 2 2 1 7 7 30 0 3 8 8 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 3 3 7 0 3 8 0 l2 6 5 7 4 8 1 3 1 3 9 3 7 1 5 6 4 6 0 2 0 0 3 7 6 0 0 3 7 3 0 0 4 6 2 o 5 5l 0 5 9 1 0 7 0 6 21 1 2 0 5 91 0 8 8 2 3 6 2 9 l1 3 7 1 4 5 0 0 2 6 9 0 0 3 4 0 1 4 3 4 6 6 60 0 4 2 9 1 6 2 4 1