（海洋生物学专业论文）鲤鱼类胰岛素生长因子结合蛋白igfbp1、2和3基因的克隆及其表达调控机制研究.pdf

陈文波中山大学博士学位论文2 0 0 9 年6 月 论文题目：鲤鱼类胰岛素生长因子结合蛋i 兰t ( i g f b p ) 1 、2 和3 基因的克隆及其表达调控机制研究 专业：海洋生物学 博士生：陈文波 导师：林浩然院士 指导老师：李文笙教授 摘要 哺乳动物循环系统中的类胰岛素生长因子( i g f s ) 几乎全部都高亲和力地与其结合蛋白 ( i g f b p s ) 家族成员结合。许多研究报道，i g f b p s 不仅有依赖i g f s 的行为，如转运i g f s ， 调节i g f s 的生物利用率及活性，还具有与其细胞表面受体结合或进入细胞核内的不依赖于 i g f s 的独立作用。本研究首先利用同源克隆和r a c e 方法，从健康的鲤鱼肝脏中克隆得到 鲤鱼i g f b p 1 、2 和3 全长e d n a 序列并进行分析；运用n o r t h e r nb l o t 对i g f b p 1 、2 和3 基因在鲤鱼肝脏中的转录本情况进行了研究；同时通过半定量r t - p c r 技术分析鲤鱼 i g f b p 1 、2 和一3 在成体鲤鱼各组织中m r n a 的表达情况；采用r e a l t i m ep c r 技术检测了 它们在胚胎、幼体不同发育阶段以及性腺不同发育阶段中的表达情况；利用鲤鱼肝细胞原代 培养系统，研究了g h 和i n s u l i n 对鲤鱼i g f b p 1 和2 基因表达的影响及其调控机制；最后 克隆得到鲤鱼i g f b p 1 、2 和3 基冈的上游启动子序列，并分析了其潜在的转录因子结合 位点。主要研究结果如下： 1 本研究克隆的鲤鱼i g f b p - le d n a 全长1 6 5 5 b p ，含有一个长7 8 9 b p 的开放阅读框， 编码一段由2 6 2 个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼i g f b p 2e d n a 全长1 8 7 9 b p ，开放阅读框 为8 2 5 b p ，编码一段由2 7 4 个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼i g f b p 一3e d n a 全长1 6 8 0 b p ，长 约8 8 2 b p 的开放阅读框编码一段由2 9 3 个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼i g f b p 1 、2 和3 与其它脊椎动物i g f b p s 结构类似，都包括富含、t - 胱氨酸、相对保守的氨基端( n 端) 、羧基 端( c 端) 和不含半胱氨酸、高度变化的中间区域。通过n o r t h e r n 杂交实验，在鲤鱼肝脏中分 别只检测到一种i g f b p 1 和i g f b p 3 的转录本，而i g f b p 2 却发现了两种形式的转录本。 与其它脊椎动物i g f b p s 氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现，鲤鱼i g f b p 1 、2 和3 与近源鱼种有较高的同源性，进化关系较近，与哺乳动物进化关系较远。 l 陈文波中山大学博士学位论文2 0 0 9 年6 月 2 除了i g f b p 1 在垂体表达较弱外，i g f b p 1 、2 和3m r n a 在脑各分区中表达量都 较高。i g f b p 1m r n a 在肝脏、胸腺、血液、视网膜和肌肉中表达量都较高，肾脏、心脏、 皮肤、鳃丝、脾脏、中肠和精巢表达量次之，在后肠、前肠、卵巢和头肾等其它组织中表达 量很低：i g f b p 2m r n a 尽管在肝脏中表达量最高，但在肝脏、垂体、卵巢和精巢中的表 达量也较高，在白肌、胸腺和头肾中表达量次之，而在视网膜、心脏和其它组织中只能检测 到很微弱的表达条带。i g f b p 3m r n a 在视网膜、红肌、肝脏、心脏、后肠、脾脏和精巢 中表达量相对较高，白肌、肾脏、胸腺和卵巢中表达量相对较低，头肾、血液、皮肤、鳃丝、 中肠和前肠中表达量更低。在受精卵和胚胎分裂期都没有检测到i g f b p 1 、2 和3m r n a 表达，直到囊胚期才能检测到其m r n a ，并随着胚胎发育阶段的进行它们的表达量升高， 且在某些阶段表达量急剧增加。结果表明，i g f b p 1 、- 2 和一3 可能参与了鱼类的早期发育。 i g f b p 1 和2m r n a 的表达量在卵巢发育期较低，在成熟期急剧增加，随之在退化期 恢复到极低的水平。i g f b p 3m r n a 在卵巢发育期的表达显著高于成熟期和退化期。在精 巢中，i g f b p 1m r n a 在发育期和成熟期的表达要显著高于退化期；i g f b p 2 的表达以成熟 期为最高；i g f b p 3m r n a 在三个时期的表达量没有显著性变化。这些结果表明，i g f b p 1 、 2 和3 基因可能参与了鲤鱼性腺的发育。 3 低浓度的g h ( 1 n m ) 就可以使肝细胞中i g f b p 1m r n a 表达量显著下降，并且随着 g h 浓度的增加，抑制程度没有显著性变化。与i g f b p 1 不同，g h 抑制i g f b p 2m r n a 的 表达呈现剂量依存效应。1 0 n mg h 能使i g f b p 1m r n a 的表达量先下降，1 2 小时达到最低， 随后表达量逐渐增加直至恢复原有水平。不同的是，i g f b p 2m r n a 的表达水平旱现时间 梯度效席。进一步对下游信号通路研究表明，m a p k 和p 1 3 k 信号转导途径可能都参与了 g h 对二者在鲤鱼肝细胞中的表达调控。 o 1 “mi n s u l i n 能显著性增加i g f b p l 和一2m r n a 的表达量，但在i p m 和5 v m 的高浓 度下，表达量与对照组相比差异不显著。不同浓度的8 - c p t - c a m p 、f o r s k o l i n 和i b m x 都能 刺激鲤鱼肝细胞中i g f b p 1m r n a 表达，且早剂量依存方式。腺苷酸环化酶抑制剂 m d l l 2 3 3 0 a 和p k a 的选择性抑制荆h 8 9 都能够阻断i n s u l i n 对i g f b p 1m r n a 的刺激表 达。这表明，至少p k a 信号途径参与了i n s u l i n 刺激肝细胞中i g f b p 1 的基冈表达调控之中。 4 克隆得剑了鲤鱼i g f b p l 、一2 和一3 基冈的启动子序列，长度分别是1 4 1 2 b p 、1 2 8 6 b p 和11 8 7 b p 。在鲤鱼i g f b p 一1 和i g f b p 一3 启动子中，距离潜在转录起始位点2 6 b p 和2 2 b p 处 各存在一个t a t a 框，t a t a 框上游只在i g f b p 1 启动子中发现c a a t 框，而在i g f b p 3 中则没有，取而代之则是一个s p i 结合位点。在i g f b p 2 启动子中，不存在t a t a 框和c 虹 u 陈文波中山人学博i ：学位论上2 0 0 9 年6 月 框，只发现一个s p i 结合位点和富含g c 的基簇。另外，三者都存在c r e b 、h n f 、p i t - i 、 o c t 1 、r x r 、g r 、e r 、p r 和s r y 等转录因子结合位点。同时只在i g f b p 1 的启动子上发 现了厌氧诱导因子结合位点。结果表明，它们的启动子都存在基础和激素应答表达，但三者 的表达调控机制又不完全相同。 关键词：鲤鱼，类胰岛素生长因子结合蛋白，e d n a 克隆，表达模式，信号通路 i i i 陈义波中山大学博j ：学位论文2 0 0 9 年6 月 t i t l e ：i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o rb i n d i n gp r o t e i n ( i g f b p ) - i 、 - 2a n d 3i nc o m m o n c a r p ( c y p r i n u sc a r p i o ) ：c l o n i n g a n dm e c h a n i s mo fe x p r e s s i o nr e g u l a t i o n m a j o r ：m a r i n eb i o l o g y n a m e ：c h e n 砌- b o s u p e r v i s o r ：p r o f l i nh a o - r a n ( a c a d e m i c i a n ) c o s u p e r v i s o r ：p r o f l iw e n - s h e n g a b s t r a c t i nm a m m a l i a ns e l u n l ，m o s tc i r c u l a t i n gi g f sa r eb o u n dt oi g f - b i n d i n gp r o t e i n s ( i g f b p s ) 诵ms p e c i f i ch i g ha f f i n i t y m a n ys t u d i e ss u p p o r tt h a ti g f b p sh a v en o to n l yi g f d e p e n d e n t a c t i o n s ( a sc a r r i e r so fi g f so ra sm o d u l a t o r so fi g f sa v a i l a b i l i t ya n da c t i v i t y ) ，b u ta l s o i g f - i n d e p e n d e n tm a n n e r sf o rc e l lg r o w t ho rd i f f e r e n t i a t i o nv i at h e i rp u t a t i v er e c e p t o r so nc e l l m e m b r a n eo rd i r e c tn u c l e a ra c t i o n sb y 船a n s p o r t i n gi n t ot h en u c l e u s i nt h i sp a p e r , w eh a v ef i r s t l y c l o n e da n ds e q u e n c e dt h ef u l ll e n g t hc d n a so fi g f b p - 1 ，- 2a n d 3i nh e a l t h yc o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i o ) b yh o m o l o g yc l o n i n ga p p r o a c hc o m b i n e d 谢t l lr a c em e t h o d t h ei g f b p 一1 ， - 2a n d - 3t r a n s c r i p t si nl i v e rw e r ea n a l y z e du s i n gn o r t h e r nb l o t ，a n dt h e nt h ee x p r e s s i o np a t t e r n s i nv a r i o u st i s s u e so fa d u l tc o m m o nc a r pw e r ec h a r a c t e r i z e du s i n gs e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r s u b s e q u e n t l y , t h ea b u n d a n c e so fi g f b p 1 ，- 2a n d - 3m r n a i nt h ed i f f e r e n ts t a g e so fe m b r y o n i c ， l a r v a ld e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e so fc o m m o nc a r pg o n a dw e r ec o n f i r m e d u s i n gr e a l - t i m ep c r t h eg e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fg ha n di n s u l i no n i g f b p - 1 ，一2a n d - 3m r n a l e v e l sw e r ei n v e s t i g a t e di np r i m a r yc u l t u r e dc o m m o n c a r ph e p a t o c y t e s f u r t h e r m o r e ，t h ep r o m o t e rs e q u e n c e so fi g f b p - 1 ，一2a n d - 3g e n e sw e r ec l o n e d ，a n dt h ep u t a t i v e t r a n s c r i p t i o nb i n d i n gs i t e sw e r ea n a l y z e d t h em a i nt o p i c so f t h i sp a p e ra r ea sf o l l o w e d ： 1 t h ec o m m o nc a r pi g f b p ic d n as e q u e n tw a s16 5 5 b pi n l e n g t hw i t l la7 8 9 b po p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) w h i c he n c o d e dap r o p e p t i d eo f2 6 2a m i n oa c i dr e s i d u e s ；i g f b p 一2e d n a s e q u e n c ew a s18 7 9 b pi nl e n g t h ，c o n t a i n i n ga l lo r fw i t h8 2 5 b pw h i c he n c o d e dap r o p e p t i d eo f 2 6 2a m i n oa c i dr e s i d u e s ；i g f b p - 3c d n as e q u e n c ew a s16 8 0 b pl o n g ，a n dh a da no r fo f8 8 2 b p e n c o d i n gap r o p e p t i d eo f2 9 3a m i n oa c i dr e s i d u e s t h eo v e r a l ls t r u c t u r eo fc o m m o nc a r p i v 陈文波中山大学博士学位论文2 0 0 9 年6 月 i g f b p - 1 ，- 2a n d 一3w a sc o n s e r v e dw i t hh i g h l yd e g r e et ot h e i rm a m m a l i a nc o u n t e r p a r t s t h e ya l l h a dc o n s e r v e dc y s t e i n e - r i c hn a n dc - t e r m i n a ld o m a i na n dac e n t r a ld o m a i nw i t hh i g hv a r i e t y i n l i v e rw ed e t e c t e do n et r a n s c r i p to fi g f b p - 1a n di g f b p 一3g e n e s ，a n dt w oi g f b p 2t r a n s c r i p t s u s i n gn o r t h e mb l o t t h eh o m o l o g yc o m p a r i s o na n dt h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a t c o m m o nc a r pi g f b p 1 ，- 2a n d - 3s h o w e dh i l g ha m i n oa c i di d e n t i t ya n dw e r em o r ec l o s e l y r e l a t e dt of i s hi g f b p s ，e s p e c i a l l yz e b r a f i s h ，b u tl e s sr e l a t e dt ot h em a m m a l i a ns p e c i e s 2 e x c e p tl o w e rl e v e lo fi g f b p - 1e x p r e s s i o ni np i t u i t a r y , i g f b p - 1 ，一2a n d - 3m r n a h a d h i g he x p r e s s i o nl e v e l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fb r a i n i g f b p 一1m r n aw a se x p r e s s e di nl i v e r , t h y m u sg l a n d ，b l o o d ，r e t i n aa n dw h i t em u s c l ew i t hh i g h e rl e v e l s ，w h i l et h er e l a t i v e l yl o w e rl e v e l s w e r ef o u n di nk i d n e y , h e a r t ，s k i n ，g i l l ，s p l e e n ，m i d d l ei n t e s t i n ea n dt e s t i s i no t h e rt i s s u e ss u c h 勰 p o s t e r i o ri n t e s t i n e ，a n t e r i o ri n t e s t i n e ，o v a r ya n dh e a dk i d n e y , t h ei g f b p - 1m r n ae x p r e s s i o n l e v e l sw e r ev e r yl o w i g f b p - 2m r n aw a sm o s ta b u n d a n ti nl i v e r ，a l t h o u g hr e l a t i v e l yh i g hl e v e l s w e r eo b s e r v e di np i t u i t a r y , o v a r ya n dt e s t i s i n t e r m e d i a t el e v e l sw e r eo b s e r v e di nw h i t em u s c l e ， t h y m u sg l a n da n dh e a dk i d n e y , w h i l ei nr e t i n a ，h e a r ta n do t h e rt i s s u e si g f b p - 2m r n al e v e l s w e r ev e r yl o w h i g hl e v e l so fi g f b p 一3m r n aw e r ef o u n di nr e t i n a ，r e dm u s c l e ，l i v e r , h e a r t ， p o s t e r i o ri n t e s t i n e ，s p l e e na n dt e s t i s r e l a t i v e l yl o w e rl e v e l sw e r ef o u n di nw h i t em u s c l e ，k i d n e y , t h y m u sg l a n da n do v a r y , w h i l ei nh e a dk i d n e y , b l o o d ，s k i n ，g i l l ，m i d d l ei n t e s t i n ea n da n t e r i o r i n t e s t i n et h ei g f b p 3m r n al e v e l sw e r em u c h1 0 w e r n oi g f b p 一1 ，2a n d 一3m r n a sw e r ed e t e c t e di nt h eu n f e r t i l i z e de g g sa n de i g h t c e l ls t a g e t h e i rm r n a sw e r ef i r s t l yo b s e r v e di nt h eb l a s t u l as t a g ea n dt h el e v e l sb e c a m et oi n c r e a s ei nt h e f o l l o w i n gs t a g e s ，e s p e c i a l l ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ns o m es p e c i f i cs t a g e s t h e s er e s u l t si n d i c a t e d t h a ti g f b p 1 ，2a n d 3m a yb ei n v o l v e di nt h ee a r l yg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ff i s h a tr e c r u d e s c i n gs t a g et h ee x p r e s s i o nl e v e l so f i g f b p 一1a n d 一2m r n aw e r ee x t r e m e l yl o w ， b u tt h e ys h a r p l yi n c r e a s e da tm a t u r e ds t a g e ，a n df i n a l l yb r o u g h tb a c kt ot h ev e r yl o wl e v e la t r e g r e s s e ds t a g e s i g n i f i c a n t l yh i g h e re x p r e s s i o no fi g f b p 一3m r n aw a sf o u n da tr e c r u d e s c i n g s t a g e i nt e s t i s ，t h ea b u n d a n c e so fi g f b p - 1m r n aa tr e c r u d e s c i n ga n dm a t u r e ds t a g e sw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fa tr e g r e s s e ds t a g e ，w h i l et h ei g f b p 一2m r n a l e v e lw a sh i 【g h e s ta t m a t u r e ds t a g e h o w e v e r , i g f b p - 3m r n aa b u n d a n c ed i dn o te x h i b i tas i g n i f i c a n tc h a n g e t h r o u g h o u tt h er e p r o d u c t i v ec y c l ei nt e s t i s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et h r e eg e n e sm a y b e i n v o l v e di nt h ed e v e l o p m e n to fc o m m o nc a r pg o n a d v 陈文波中山大学博上学位论文2 0 0 9 年6 月 3 a tl n mc o n c e n t r a t i o n ，g hr e d u c e di g f b p - 1m r n al e v e l ss i g n i f i c a n t l yi nt h ep r i m a r y c u l t u r e dc o m m o nc a r ph e p a t o e y t e s ，a n dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n si n c r e a s i n g ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c t d i dn o ts i g n i f i c a n t l yc h a n g e u n l i k ei g f b p 1 ，g hr e d u c e di g f b p 2m r n al e v e l si na d o s e - d e p e n d e n tm a n n e r i nt h et i m e - c o u r s ee x p e r i m e n t 10 a mg hf i r s t l yr e d u c e di g f b p 1 m r n al e v e l ，as i g n i f i c a n tr e d u c t i o nw a sf o u n da n du pt ot h em a x i m u mi n h i b i t o r ye f f e c ta t12h a l t h o u g ht h ea b u n d a n c eo fi g f b p - 1m r n aa t2 4hw a si n c r e a s e ds l i g h t l yc o m p a r e dt ot h a to f b e f o r e ，i tw a ss t i l ls i g n i f i c a n tr e l a t i v e l yt ot h a to fc o n t r 0 1 h o w e v e r , t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fg ho n i g f b p - 2m r n a e x p r e s s i o nw a st i m e d e p e n d e n t f u r t h e r m o r e ，m a p ks i g n a l i n gp a t h w a ya n dp 1 3 k i n a s e - s i g n a l i n gp a t h w a ym a y b ei n v o l v e di nt h eg h - i n h i b i t e di g f b p 1a n d 2m r n ae x p r e s s i o n i nc o m m o nc a r ph e p a t o c y t e s o 1l x mi n s u l i nc o u l di n c r e a s eh e p a t o c y t ei g f b p 1a n d - 2m r n al e v e l ss i g n i f i c a n t l y , b u tn o s i g n i f i c a n te f f e c tw a sf o u n dc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u po nt h et r e a t m e n to f1 州a n d5 v m i n s u l i n v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so f8 - c p t - c a m p , f o r s k o l i na n di b m xc o u l ds t i m u l a t eh e p a t o c y t e i g f b p - - 1m r n al e v e li nd o s e d e p e n d e n tm a n n e r t h ea d e n y l a t ec y c l a s ei n h i b i t o rm d l l 2 3 3 0 a a n dp k ai n h i b i t o rh - 8 9c o u l db l o c kt h es t i m u l a t o r ye f f e c to fi n s u l i no ni g f b p 1m r n a e x p r e s s i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp k ac o n t r i b u t e sp o s i t i v e l yt ot h er e g u l a t i o no fi g f b p - 1 m r n al e v e l sa n dt h a ti n s u l i ns t i m u l a t e di g f b p - 1m r n al e v e l s t h r o u g ht h ep k as i g n a l i n g 4 t h ep r o m o t e rs e q u e n c e so fc o m m o nc a r pi g f b p 一1 ，- 2a n d 一3w e r ec l o n e d ，a n dt h el e n g t h w a s1 412 b p ，12 8 6 b pa n d118 7 b p ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sac o n s e n s u st a t a b o x2 6 b pa n d2 2 b p 5 t ot h es t a r ts i t eo ft r a n s c r i p t i o ni ni g f b p 1a n d - 3p r o m o t e r s ，w h i l ei nt h eu p s t r e a mo n l y i g f b p 一3p r o m o t e rh a dc a a tb o x i ni g f b p 一3 ，t h e r ew a sas p1b i n d i n gs i t ei n s t e a do fc a a t b o x n e i t h e rt a t ab o xn o rc a a tb o xw a sf o u n di nt h ep r o m o t e ro fi g f b p 一2 ，o n l yas pi b i n d i n gs i t ea n dr i c h g cm o t i ef u r t h e r m o r e ，s o m eo t h e rt r a n s c r i p t i o nb i n d i n gs i t e sw e r e o b s e r v e di nt h et h r e ep r o m o t e r s ，s u c ha sc r e b ，h n f ，p i t - 1 ，o c t - 1 ，r x r ，g r ，e r , p r ，s r ya n d s oo n ，w h i l et h eh i f ( h y p o x i a i n d u c i b l e - f a c t o r , h i f ) w a so n l yf o u n di ni g f b p 一1 t h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h e r eh a db a s i ca n dh o r m o n e - i n d u c i b l ee x p r e s s i o np a t t e r n so fi g f b p 一1 ，- 2a n d 3 g e n e s h o w e v e r , t h er e g u l a t i o nm e c h a n i s m sw e r en o tc o n s i s t e n ta m o n gt h et h r e eg e n e s k e y w o r d s ：c o m m o nc a r p ；i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o rb i n d i n gp r o t e i n ；e d n ac l o n i n g ，e x p r e s s i o n p a t t e r n ；s i g n a lt r a n s d u c t i o n v l 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：鸿，互收日期：砷年占月 l 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：诲又炊日期：1 年 月二日 导师 签名：僦日期：1 年参月占日 陈文波中大学博十学位沧文2 0 0 9 年6 月 引言 下丘脑垂体一肝脏轴( h y p o t h a l a m i e p i t u i t a r y - l i v e ra x i s ) 分泌各种神经内分泌因 子和生长因子。动物的生长就是受制于各种生长园子和激素网络所控制的细胞内 信号传导通路的一个运作过程。最近的研究表明，类胰岛素生长因子 ( i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r s ，i g f s ) 信号系统是这个激素调控网络的核心部分。在 脊椎动物许多组织或发育阶段中，g f s 能通过内分泌、自分泌或旁分泌形式刺 激细胞的生长、分化和增值8 ”，同时在动物早期胚胎发育和出生后的生长生殖 中发挥着重要的作用【4 “。 近年来，对哺乳动物i g f s 系统的研究已经相当深入，而关于鱼类i g f s 系统 的研究相对滞后。1 9 8 9 年，c a o 等首次从鱼类中克隆出i g f - i c d n a 叫。此后对鱼 类研究的开始重视，但目前主要集中在鲑鳟鱼类、同奉鳗鲡、鲤科鱼类和鲈形目 等少数几个品种p i 。i g f s 系统在鱼类的生长、繁殖和免疫方面的作用已经成为鱼 类内分泌学和分子生物学研究的热点。之前，奉实验室对斜带石斑鱼i g f s 及其 受体的研究做了部分工作，但是尚未开展对i g f b p s 的研究。所以现将i g f s 系 统特别是关于1 g f b p s 的研究进展进行综述，然后提出本论文的研究目的和意义。 1 i g f s 系统的配体和受体 目前认为，1 g f s 信号系统主要有三部分组成：配体( u g a n d ) i g f s 、受体( r e 。e p t o r ) i g f i r 、i g f i i r 和结合蛋白i g f b p s ( 虱i - 1 1 。另外，还有一个8 8 k d a 左右的酸 不稳定亚单位( a c i d l a b i l es u b u n i t ，a l s ) ，在血液循环中可以和i g f b p 一3 或i g f b p 一5 结合后共同与i g f s 组成三聚体复合物嘲。 r y。，- 幽b li g f 信号系统组成t 参照d u a n ，2 0 0 3 1 1 ) 陈文波中山大学博士学位论文2 0 0 9 年6 月 1 i配体i g f s 19 5 7 年，s a l m o n 和d a u g h a d a y 在研究生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 的过程 中，首先发现给与切除垂体的大鼠g h 后其血清能刺激3 5 s 渗入体外培养的软骨 中，但培养液中直接加入g h 却没有作用，故认为g h 本身不能直接刺激软骨生 长，而是通过一种“硫化因子”起作用的【9 】，这种后来被称为生长调节烈1 0 1 。1 9 6 3 年f r o e s h 等发现血清中肌肉和脂肪细胞的胰岛素样作用只有小部分被胰岛素的 抗血清抑制，剩下不被抑制的胰岛素样活性可溶于酸化乙醇中，并命名为n s i l a 即不被抑制的胰岛素样活性( n o n - s u p p r e s s i b l ei n s u l i n l i k ea c t i v i t y ) 。1 9 7 2 年p i e r o n 和t e m i n 从牛血清中纯化出一种能刺激细胞分裂的因子，它能刺激鸡胚成纤维细 胞增值和d n a 合成，命名为“增值刺激活性。在上述一系列实验完成后，人 们发现了上面三种物质所具有的不可抑制的胰岛素样活性及生长刺激作用。随着 分子生物学技术的发展，1 9 7 8 年人们纯化了两种形式的n s i l a ( i 、i i ) 并发现其 结构与胰岛素原相似，分别命名为类胰岛素生长因子i 和i i 。 类胰岛素生长因子i 和i i ，二者都是进化上较为保守的单链多肽，因其化学 结构类似于胰岛素前体而得名 1 1 , 1 2 】。i g f s 的一级结构已经阐明，大致分为四个 区域：b c a d 。其中b 和a 区域分别与胰岛素原的b 链和a 肽同源，序列同 源性分别为4 3 和4 1 。与胰岛素原不同的是，i g f s 在羧基末端多了一个d 区 域。虽然它们的结构有较高的同源性，生理功能也有部分交叉，但是蛋白质折叠 行为有很大差别13 1 。基因结构分析发现，i g f i 基因有六个外显子组成【1 4 】，其中 外显子1 和2 编码5 端非编码区和i g f i 的信号肽序列；外显子3 和4 编码i g f i 的主要片段，外显子5 和6 编码e 结构域。在成熟的i g f i 中未发现信号肽和e 肽段，对于e 肽段的功能目前还不清楚。 目前为止，一些硬骨鱼类的i g f i 和i g f i ic d n a s 已被克隆，对它们的表 达也做了研究 6 , 1 i , 1 2 , 1 5 - 2 7 】。对这些序列进行比较显示，鱼类i g f i 和i g f i i 的一级 结构与其它脊椎动物i g f s 具有高度的相似性。以斑马鱼( d a n i or e r i o ) 为例，斑马 鱼i g f i 和i g f i i 可以划分为b 、c 、a 、d 、e 结构域，分别在b 6 、b 1 8 、a 6 、 a 7 、a ll 、a 2 0 位置上含有6 个半胱氨酸残基，负责维持i g f s 的三级结构【27 1 。 在氨基酸水平上，鱼类i g f s 也和哺乳动物高度相似，如大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u s t s h a w y t s c h a ) 和人i g f i 的7 0 个氨基酸只有1 4 个不同【6 | ，比目鱼( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 陈文波中山大学博士学位论文 2 0 0 9 年6 月 和人成熟的i g f i 和i g f i i 的氨基酸分别有7 5 和7 4 的相似性【2 8 】。斑马鱼i g f i 与鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 、大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u st s h a w y t s c h a ) 和人分别有9 7 、9 4 、 8 0 相同，i g f i i 与虹鳟( o n c o r h y n c h u s m y k i s s ) 和人分别为7 6 和7 1 t 2 7 1 。 d u g u a y 等对i g f i 基因表达进行了研究，并首次报道了多种i g f im r n a 转录产物的存在【1 7 】。随后在虹鳟、罗非鱼