（药剂学专业论文）超临界流体萃取松花粉的质量评价及其药效学研究.pdf

学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口， 在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密囱。 学位论文作者签名： 留p 讳 导师签名： 签字日期：c f 年石月l fe t 签字日期：沙f 年石月l 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 独创性l 声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： p 宵 日期：夕pf 1 年 莎 月f日 江苏大学硕士学位论文 摘要 松树作为耐干旱适应性强的一种长寿植物，它的常青秘密就在于它的雄性生 殖细胞松花粉。松花粉药食兼用的历史已逾数千年，历代药典中松花粉的药 用价值也被广泛记载。利用松花粉的历史可追溯到2 4 0 0 年前，东汉的神农本 草经中就有记载，现代中国药典也将松花粉收录其中。在民间松花粉更是 以其神奇的功效被奉为“仙药”。古医籍称松花粉“甘、温、无毒 ，有“润心 肺、益气、祛风止血、壮颜益志 等功能。 松花粉是天然的微型营养库。作为优良的保健食品，松花粉的营养成分可以 分为糖、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和生物活性物质六大类。其所含的多 种酶、激素、黄酮等生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用。花粉的 结构可分为花粉壁和内含物，花粉壁含有复杂的有机化合物，能抗高温，耐强酸 强碱、耐反射性。因此，花粉中营养成分、生命活性物质的提取、精制技术是松 花粉能否有效利用的关键。超临界c 0 2 萃取( s f e c 0 2 ) 是一种全新的提取分离 技术，具有无易燃性、无化学反应、无毒、无污染、安全性高、操作简单等优点， 在天然产物提取中越来越受到重视。传统中药达到符合国际标准的现代化可以通 过s f e c 0 2 技术来实现。因此，本实验利用经超临界萃取技术提取后的松花粉， 运用紫外可见分光光度法和h p l c 法对其中的活性成分进行分析研究。 本文以超临界流体萃取松花粉( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t o fp i n e p o l l e n ， s f e p p ) 为研究对象，对松花粉提取物的总黄酮，总磷脂以及甾醇类活性成分 进行了分析和含量测定，同时通过建立小鼠力竭游泳运动模型和大鼠高脂血症模 型，研究超临界萃取后的松花粉的抗疲劳和降血脂作用，以期对松花粉的进一步 开发提供研究基础。 第一部分综述 主要对松花粉的药用活性成分及疲劳和高脂血症进行综述。主要包括：松花 粉的历史及研究现状，松花粉的活性成分分析及药理作用，疲劳的中西医认识、 产生机理及抗疲劳的检测指标，高血脂症的中西医治疗及其检测指标等，为论文 后续实验工作的开展奠定理论基础。 超临界流体萃取松花粉的质量控制及其药效学研究 第二部分超临界萃取松花粉的活性成分的含量测定 s f e p p 中总黄酮含量测定：建立紫外可见分光光度法测定松花粉提取物中 总黄酮含量的方法，利用黄酮类化合物可与铝盐反应生成有色络合物的性质进行 测定。实验结果表明在7 5 6 0g g m l d 的浓度范围内，芦丁的吸光度与浓度呈良 好的线性关系，y = 0 0 0 9 9 x + 0 0 2 8 9 ( r = o 9 9 9 0 ，n - - 5 ) ；总平均回收率9 8 7 1 。 根据本方法进行测定，松花粉提取物中总黄酮的含量为1 4 2 + 0 0 2m g g - 1 ( n _ 3 ) ， r s d 为1 0 7 。 s f e p p 中总磷脂含量测定：建立紫外分光光度法测定松花粉提取物中总磷 脂含量的方法，将试样中的有机磷转变成无机磷，利用磷酸根离子与钼酸铵作用 的产物磷钼酸铵，遇抗坏血酸被还原成蓝色络合物钼蓝的性质进行测定。实 验结果表明在0 3 4 2 1 7 1 0l a g m l 。1 的浓度范围内，磷标准液的吸光度与浓度呈良 好的线性关系，y = 0 3 9 3 9 x + 0 0 0 4 1 ( r = o 9 9 9 7 ，n - - 5 ) ；总平均回收率9 9 0 3 。 根据本方法进行测定，松花粉提取物中总磷脂的含量为3 0 0 4 士0 3 4m g - g - 1 ( i 一) ， r s d 为1 1 4 。方法建立后分别对显色条件( 料液比、消化时间) 进行单因素考 察，确定料液比为4 ：1 0 ，反应3h 为最优。 s f e p p 中b 一谷甾醇含量测定：通过g c 。m s 分析，确定试样中甾醇类主要 成分是p 一谷甾醇。建立高效液相色谱法测定松花粉提取物中p 一谷甾醇含量的方 法。实验结果表明在1 0 1 0 0l a g m l 。1 的浓度范围内，p - 谷甾醇标准品的峰面积与 浓度呈良好的线性关系，y = 2 1 4 1 1 x + 11 4 6 3 ( r = 0 9 9 9 9 ，n = 5 ) ；总平均回收率 9 7 9 4 。根据本方法测定得松花粉提取物中p 谷甾醇的含量为3 1 9 5 士0 2 5m g g - 1 ( n - - 3 ) ，r s d 为0 7 9 。方法建立后，以正交实验对料液比、k o h 醇溶液浓度 及皂化反应温度这三个条件进行优化，确定最优提取条件为：料液比l ：2 0 ，k o h 醇溶液浓度1m o l l ，皂化反应温度9 5 0 c 。以上述最优条件对皂化反应提取时 间进行单因素考察，得出3h 为最佳提取时间。 第三部分超临界萃取松花粉提取物的抗疲劳研究 在s f e p p 抗疲劳作用研究中，采用小鼠力竭游泳运动模型，2 4 0 只小鼠随 机均分为5 组：空白对照组，阳性对照组，s f e p p 低中高三个剂量组。阳性对 照组和s f e p p 低中高三个剂量组分别给以4 1 lm g k 9 1 人参o 5 c m c - n a 混悬 液和不同浓度的s f e p p0 5 c m c n a 混悬液灌胃，空白对照组以0 5 c m c - n a 江苏大学硕士学位论文 灌胃，连续3 3d 。通过小鼠负重游泳实验测定小鼠游泳时间；测定小鼠本身肝糖 原含量及不负重游泳后测定小鼠血清尿素氮( b u n ) 含量、血乳酸( l a ) 含量 及观察了s f e p p 的抗疲劳作用。 结果表明，s f e p p 低、中、高剂量组和阳性对照组均可延长小鼠负重游泳 时间，提高小鼠的肝糖元含量，降低疲劳小鼠b u n 含量，降低小鼠游泳1 0m i n 后l a 含量，证明s f e p p 有一定的抗疲劳作用。 第四部分超临界萃取松花粉提取物的调节血脂研究 利用高脂饲料饲喂s d 大鼠，成功建立了高脂血大鼠模型。4 8 只大鼠随机分 为6 组：空白对照组，高脂模型组，阳性对照组，s f e p p 低中高三个剂量组。 阳性对照组和s f e p p 低中高三个剂量组分别以2 2 0 6m g k g 以大豆卵磷脂 0 5 c m c - n a 混悬液和不同浓度的s f e p p0 5 c m c n a 混悬液灌胃，空白对照 组和高脂模型组以0 5 c m c n a 灌胃，连续4 5d 。通过测定血清t g 、t c 、l d l c 、 h d l c 指标评价s f e p p 的降血脂作用。 结果表明，s f e p p 低、中、高剂量组和阳性对照组相比高脂模型组对高血 脂有显著降低t g 、t c 、l d l c 水平和升高h d l c 水平的作用。 关键词：s f e p p ，有效成分，含量测定，药效学，抗疲劳，调节血脂 超临界流体萃取松花粉的质量控制及其药效学研究 a b s t r a c t t h es e c r e to ft h ep i n ea l w a y sb e i n gg r e e na n dn e v e ra p p e a r i n gs e n i l et h r o u g h t h o u s a n dy e a r sl i e si nt h a ta sas p e r mc e l lo fp i n e ，p i n ep o l l e ni st h es o u r c eo fl i f e p i n ep o l l e n ，ah e a l t h yf o o da sw e l la sat r a d i t i o n a lh e r b ，h a sb e e nc o m m o n l yu s e di n p r e v e n t a t i v ea n da d j u n c t i v et h e r a p yo fd i s e a s e sf o rt h o u s a n dy e a r s i th a sb e e n r e c o r d e db y “s h e nn o n gb e nc a os c r i p t u r e ”2 4 0 0y e a r sa g o i ta l s oh a sb e e n r e c o r d e db yt h e c h i n e s ep h a r m a c o p o e i a t o d a y p a r t i c u l a r l yi tw a s r e g a r da sa t a o i s t m a g i cd r u g ”i nc i v i l i a n w o r l db e c a u s eo fi t sm a g i ce f f e c t f r o mc h i n e s ea n c i e n t p h a r m a c o p o e i a s ，t h e r ea r es om a n yr e c o r d st h a tp i n ep o l l e nt a s t e ss w e e ta n dp e a c e f u l w i t h o u ta n yp o i s o n ，c h i e f l yc o p i n gw i t hv i c i o u sq if r o mc o l da n df e v e ri nh e a r ta n d a b d o m e n ，e a s yu r i n a t i n g ，r e m o v i n gb l o o dc l o t ，l i g h t i n gw e i g h t ，n o u r i s h i n gq ia n d c o m i n gu pw i t hm a c r o b i o s i sw h e nl o n g t e r mt a k i n gi t p i n ep o l l e ni si n d e e dak i n do fn a t u r a lm i n i n u t r i t i o nt r e a s u r y t h en u t r i t i o n a l m a t e r i a lo fp i n ep o l l e nc a nb ed i v i d e di n t os i xg r o u p sw h i c ha r ec a r b o h y d r a t e ，p r o t e i n ， f a t s ，v i t a m i n s ，t r a c ee l e m e n t sa n da c t i v es u b s t a n c e s t h ea c t i v es u b s t a n c e ss u c ha s e n z y m e s ，h o r m o n e sa n df l a v o n o i d sa r ee s s e n t i a lf o rh u m a nh e a l t ha n dp l a ya n i m p o r t a n tr e g u l a t o r yr o l ei nt h ea c t i o n so fh u m a nb o d y t h ep o l l e nc a nb ed i v i d e di n t o t w od i s t i n c tr e g i o n s ：p o l l e nw a l la n di n c l u s i o n s p o l l e nw a l lw h i c hc o n t a i n st h e c o m p l i c a t eo r g a n i cc o m p o u n dh a st h eh i g ht e m p e r a t u r e ，a c i da n da l k a l ir e s i s t a n c ea n d t h ea n t i r a d i a t i o nc h a r a c t e r b e c a u s eo ft h ec h a r a c t e r sa b o v e ，e x t r a c t i o no fn u t r i e n t s f r o mp i n ep o l l e nm u s tb es o l v e df i r s t l y n o w a d a y s ，s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ef l u i d e x t r a c t i o nt e c h n o l o g yh a sb e e nw i d e l yu t i l i z e di nf o o da n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y t h i st e c h n o l o g yo f f e r sd i s t i n c t s t r e n g t h s ，i n c l u d i n gn o n f l a m m a b l e ，n o n t o x i c ， c o n t a m i n a t i o nf r e e ，h i g he x t r a c t i o ne f f i c i e n c y , m i l do p e r a t i n gt e m p e r a t u r ea n dl o w r u n n i n gc o s t a tp r e s e n tt h i sn e wt e c h n o l o g yi nt h ec h e m i c a lr e a c t i o n ，s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n h a sb e e n w i d e l yi n - d e p t h s t u d i e di nt h ew h o l ew o r l d s f e - c 0 2 t e c h n o l o g yi sa ni m p o r t a n tw a y t oa c h i e v et h em o d e r n i z a t i o no ft r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n ei n d u s t r yw h i c hw o u l db ei n l i n ew i t ht h ei n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d t h i ss t u d y i v 江苏大学项士学位论文 w a sp e r f o r m e dt oa n a l y s et h em a j o rn u t r i t i o n a lc o m p o n e n t sw h i c hw e r ee x t r a c t e db y s f e c 0 2t e c h n o l o g yu s i n gh p l ca n du v - v i ss p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o d s i nt h i ss t u d y , t h ea c t i v ec o m p o n e n t so ft h e s u p e r c r i t i c a lf u i de x t r a c to fp i n e p o l l e n ( s f e - p p ) i n c l u d i n gt o t a lf l a v o n o i d s ，t o t a lp h o s p h o l i p i d sa n dp h y t o s t e r o lw e r e d e t e r m i n e dt oc o n f i r mt h ec o n t e n to ft h e m a j o rc o m p o n e n t s m e a n w h i l et h e e x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt oe v a l u a t et h ea n t i f a t i g u ea c t i v i t yo ft h es f e p pi nm i c e f o rf a t i g u e t h ee f f e c to ft h es f e p po nt h er e g u l a t i o no fb l o o dl i p i da c t i v i t yi na h y p e r l i p i d e m i ar a t sm o d e lw a ss t u d i e da tt h es a m et i m e p a r to n e ：r e v i e w t h ea n a l y s i so ft h em e d i c i n a li n g r e d i e n t s ，t h ea c t i v i t yo fa n t i f a t i g u ea n dt h e r e g u l a t i o no fb l o o dl i p i da r eb r i e f l yd i s c u s s e di nt h i sp a r t ，w h i c hm a i n l yi n c l u d et h e h i s t o r ya n dr e s e a r c ho fp i n ep o l l e n ，t h eb i o a c t i v ec o m p o n e n t sa n dp h a r m a c o l o g i c a l e f f e c t si nt h ep i n ep o l l e n ，t h eu n d e r s t a n d i n go ff a t i g u ei nw e s t e r nm e d i c i n ea n dt h e t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，t h em e c h a n i s mf o rf a t i g u ea n dt h e i n d i c a t o r so f a n t i f a t i g u e ；t h et r e a t m e n to fh y p e r l i p i d e m i ai nw e s t e r nm e d i c i n ea n dt h et r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e ，t h ei n d i c a t o r so f l i p i dl e v e l s t h i sw o r km a yb er e g a r d e da sab a s i s f o ro u r s u c c e e d i n gs t u d y p a r tt w o ：d e t e r m i n a t i o no ft h ea c t i v ec o m p o n e n t si nt h es f e p p d e t e r m i n a t i o no f t o t a l f l a v o n o i d si nt h es f e - p p o b j e c t i v e ：t oe s t a b l i s ham e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no ft o t a lf l a v o n o i d sc o n t e n ti n t h es f e p p m e t h o d s ：f l a v o n o i d sc a nf o r mc o l o r e dc o m p l e xw i t ha l u m i n u m t h i s n a t u r ew a su s e d t od e t e r m i n et o t a l f l a v o n o i d sc o n t e n tw i t hu v - v i s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t r y r e s u l t s ：t h er u t i np r e s e n t e dl i n e a rw i t h i nt h er a n g eo f7 5 。6 0 p g m l ，y2 0 0 0 9 9 x + 0 0 2 8 9 ( r = 0 9 9 9 0 ，n = 5 ) ；t h ea v e r a g er e c o v e r yw a s9 8 71 a c c o r d i n gt ot h i sm e t h o do fm e a s u r e m e n t ，t h et o t a lf l a v o n o i d sc o n t e n ti nt h es f e p p w a s1 4 2 + 0 0 2m g 百1 ( n = 3 ) ，r s dw a s1 0 7 d e t e r m i n a t i o no f t o t a l p h o s p h o l i p i d si nt h es f e - p p o b j e c t i v e ：t oe s t a b l i s ham e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no ft o t a lp h o s p h o l i p i dc o n t e n t i nt h es f e _ p em e t h o d s ：an e w t e c h n i q u ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp h o s p h o r u sb yt h e m o l y b d e n u mb l u em e t h o dw a su s e d t h i sm e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et o t a l v 超临界流体萃取松花粉的质量控制及其药效学研究 p h o s p h o l i p i dc o n t e n tw i t hu vs p e c t r o p h o t o m e t r y r e s u l t s ：t h er e g r e s s i o ne q u a t i o n w a sy = 0 3 9 3 9 x + 0 0 0 41 ag o o dl i n e a r i t y ( r = 0 9 9 9 7 ) w a ss h o w nw i t h i nt h er a n g e o f0 3 4 2 1 710 陷m l t h ea v e r a g er e c o v e r yw a s9 9 0 3 a c c o r d i n gt ot h i sm e t h o d o fm e a s u r e m e n t ，t h et o t a lp h o s p h o l i p i dc o n t e n ti nt h es f e p pw a s3 0 0 4 4 - 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p pc o u l ds i g n i f i c a n t l yl e n g t h e n e dt h ee x h a u s t i v es w i m m i n gt i m ea n di n c r e a s e d t h ec o n t e n t so fl i v e rg l y c o g e n ，w h i l er e d u c i n gt h a to fs e r u mu r e an i t r o g e na n dl a c t a t e i nb l o o ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u pa f t e rs w i m m i n g t h e r e f o r e ， p i n ep o l l e nc a ni n c r e a s ea ne n d u r a n c ec a p a c i t ya n df a c i l i t a t er e c o v e r yf r o mf a t i g u e p a r tf o u r ：e f f e c to ft h es f e - p po nb l o o dl i p i di nh i g hf a tr a t s t h es f e p pw a se x a m i n e dt ob ep r o v e dt oh a v et h ee f f e c to ft h er e g u l a t i o no f b l o o dl i p i d s t h er a t sw e r er a n d o m i z e di n t o6g r o u p se q u a l l yo f8a n i m a l se a c h ：b l a n k c o n t r o lg r o u p ；h fm o d e lg r o u p ；p o s i t i v ec o n t r o lg r o u pa n dl o w , m e d i u m ，h i g h d o s eo f t h es f e p pi n t e r v e n t i o ng r o u p s r a t si nc o n t r o lg r o u pw e r ea l l o w e df r e ea c c e s st o b a s i cd i e t ，w a t e ra n do r a l l ya d m i n i s t r a t e dw i t ho 5 c m c - n as o l u t i o nf o r4 5 c o n s e c u t i v ed a y s r a t si nt h eo t h e rg r o u p sw e r ea l l o w e df r e ea c c e s st oh i g h - f a td i e t ， w a t e ra n dt r e a t e dw i t ho 5 c m c n as o l u t i o n ，s o y b e a nl e c i t h i n ( 2 2 0 6m g k 9 1 ) a n d t h es f e p pa tt h ed o s eo f5 0m g k 9 1 ，1 0 0m g 蚝，2 0 0m g k g 1s u s p e n d e di no 5 c m c - n as o l u t i o nf o rt h es a m ep e r i o d ，r e s p e c t i v e l y p l a s m at o t a lc h o l e s t e r o l ( t c ) ， t r i g l y c e r i d e ( t g ) ，l o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l ( l d l - c ) ，a n dh i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l ( h d l c ) l e v e l si nh f m o d e lw e r ed e t e r m i n e d i nt h er a t ss t u d y , t c ，t g