（分析化学专业论文）生化分析中的毛细管电泳安培检测联用技术研究.pdf

陈相硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 徐通敏教授华东师范大学主席 鲜跃仲副教授华东师范大学委员 施国跃副教授华东师范大学委员 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发 表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意 作者签名：豆垒趔 日期：楚竺：! 笪 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版保密的学位论文在解密后适用本规定 学位论文作者签名：两、相 导师签名 坼刚 日期：逊= 篁：! g日期：互：堕：幻 摘要 生化分析中的毛细管电泳一安培检测联用技术研究 摘要 毛细管电泳是近二十年来发展最为迅速的分离分析技术之一。它把传统的电泳技 术和现代高效液相色谱技术的优点结合在一起，将分离柱效提高到上百万理论塔板 数，进样量也从微升水平进入纳升水平，由于毛细管电泳具有多种分离模式，其研究 和应用涉及到药物分析、生化分析、食品分析、环境分析等几乎所有的分析化学领域。 但毛细管电泳的较小的进样量和极细的毛细管内径也给其检测带来了很大的困难。紫 外检测、激光诱导荧光检测、化学发光检测、质谱检测等各种检测方法都具有一定的 优点，但往往存在仪器比较昂贵、衍生化步骤坝琐等缺点。电化学检测中的安培检测 技术，具有高的灵敏度，且仪器设备简单、价格j 茏本低、线性范围宽、操作简便、死 体积小等特点，因而其与毛细管电泳联用后在分析化学领域得到了广泛的研究和应 用。 同高效液相色谱分离相比，毛细管电泳在分离效率和仪器设备等方面有明显的优 势。但由于毛细管电泳进样量远远小于液相色谱，利用紫外或荧光检测时光程很短， 导致浓度检测灵敏度较低，不能满足有些痕量分析的要求。利用毛细管电泳本身的一 些特殊性质，通过改变其进样和分离时的一些条件，如采用电堆集、场放大进样和等 速电泳等简单易行的方法，可以显著提高毛细管电泳检测灵敏度。 本论文研究了毛细管电泳安培检测联用技术在生化分析中的一些应用。同时也 探讨毛细管等速电泳安培检测联用技术中提高灵敏度的方法，包括场放大进样和等 速电泳富集等。主要内容共分为四章： 第一章为绪论。在该章中综述了毛细管电泳的特点、分离模式和进样技术、样品 富集技术、毛细管电泳安培检测的联用技术的发展现状等，并简单介绍了本论文的 研究目的和意义。共引用文献1 9 6 篇。 第二章内容是血浆中水溶性小分子抗氧化剂的毛细管电泳一电化学检测研究。人 体内的水溶性小分子抗氧化剂包括抗坏血酸( v c ) 、谷胱甘肽( g s h ) 、尿酸( u a ) 、色 氨酸( t r y ) 和半胱氨酸( c y s ) 等。这些小分子抗氧化剂物质的分析主要以高效液相色谱 一紫# b 电化学检测联用为主，其中电化学检测比紫外检测有更高的灵敏度。本文应用 毛细管电泳一电化学检测方法，以金属铜电极为检测电极，探索了测定人姐浆中水溶 性小分子抗氧化剂谷胱甘肽( g s h ) 、尿酸( u a ) 、色氨酸( t r y ) 和半胱氨酸( c y s ) 的最佳 华东师范人学2 0 0 5 年申请硕j j 学位论义 摘舞 条件。在最佳实验条件下各组分的线性范围在j o x l o 一一5 o x l o - 1 m 0 1 l “内，检测限在 1 0 4 m o l u 数量级。该法具有分析速度快、灵敏度高等优点对血浆样品的测试获得 了满意的结果。 第三章内容是毛细管电泳一安培检测法测定腺嘌岭( a ) 和鸟嘌呤( g ) 来间接测定酵 母菌中核糖核酸( r n a ) 含量。探讨了电极电位、运行缓冲溶液、分离电压及进样时 问等对毛细管电泳分离一安培检测的影响，得到了较为优化的测定条件。在3 0m m o l l 的硼酸盐缓冲液( p h9 0 ) 中，上述两组分可在1 8m i n 内完全分离。腺嘌呤和乌嘌呤 的检测限分别为2 0 1 0 。m o l l 和i 7 x1 0i m ol l 。该法具有较好的重现性和灵敏 度，可以用于食品中酵母菌中核糖核酸的快速测定。 第四章内容是毛细管瞬时等速电泳一安培检测法间接测定自由基捕获产物的研 究，文中探讨了毛细管电泳安培捡测中的等速电泳富集现象。由于人体内新陈代谢 产生的自由基的浓度极低，如在尿样中羟自由基捕获剂的浓度在1 0 。m o l 1 数量级， 所以毛细管电泳一安培检测法尚不能直接进行生化样品中羟自由基的测定。我们尝试 了用毛细管瞬时等速电泳的方法对2 ，3 - 二羟基苯甲酸( 2 ，3 - d h b a ) 进行了毛细管内 富集，选用对甲基苯甲酸为前导电解质。运行缓冲溶液为终止电解质，使2 ，3 - d h b a 的检测限降低了2 0 倍。在灵敏度上达到了进行生化样品中羟自由基分析的要求。本 文对适合于毛细管电泳一安培检测特性的等速电泳条件也作了初步的探讨。 关键词：毛细管电泳；安培检测；场放大进样：瞬时等速电泳：抗氧化剂；核糖核酸 羟自由基； 华东师范人学2 0 0 5 年申请颂l ：学位论文 a b s t r a c t s t u d yo nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o ni n b i o a n a l y t i c a lc h e m i s t r y a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i so neo ft h em o s ti m p o r t a n ta n dr a p i d l yg r o w i n g s e p a r a t i o nt e c h n i q u e s i nr e c e n tt w e n t yy e a r s ，i ta b s o r b e dt h ev i r t u e so fb o t ht h e c o n v e n t i o n a l e l e c t r o p h o r e s i sa n dm o d e r nh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，b e c a u s et h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e ri sg r e a td e v e l o p e dt ot e n so ft h o u s a n d sa n d e v e nm i l l i o n sa n dt h ev o l u m eo fs a m p l ei n j e c t i o nr e a c h e sn a n om i l l i l i t e rl e v e li nc e a n a l y s i s ，c ei n c l u d e sm a n ys e p a r a t i o np a t t e r n s ，i ti ss t u d i e da n da p p l i e dt om o s ta n a l y t i c a l a r e a s a n de x c e l l e n tp r o s p e c t so fc eh a v eb e e ns h o w ni nt h ef i e l d so fp h a r m a c e u t i c a l a n a l y s i s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，f o o da n a l y s i s ，a n de n v i r o n m e n t a la n a l y s i s h o w e v e r , t h e s m a l ls a m p l ei n j e c t i o nv o l u m ea n dv e r yt h i nc a p i l l a r yb r i n ga b o u td i f f i c u l t i e st od e t e c t i o n s t h ec o m m o nu s e dd e t e c t i o nm e t h o d sa r eu l t r a - v i o l e t ( u v ) ，l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) ，l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ，m a s ss p e c t r a ( m s ) e v e r yd e t e c t i o nm e t h o dp e r f o r m s s o m ea d v a n t a g e sa n ds u f f e r sf r o ms o m es h o r t a g e st o o f o re x a m p l e ，l i fa n dm sa r ev e r y s e n s i t i v eb u tt h ei n s t r u m e n t sa r ev e r ye x p e n s i v e ，a n ds o m ec o m p l i c a t e dd e r i v a t i o n p r o c e d u r e sa r en e e d e d a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ( a d ) ，o n ek i n d o fe l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n s ( e d ) ，i sm o r es e n s i t i v et h a nt h ec o m n l o nu s e du vd e t e c t i o n ，a n dh a v em a n y m e r i t so nw h e ni tc o u p l e dw i t hc e ，s u c ha ss i m p l ei n s t r u m e n ta n do p e r a t i o n ，l o wc o s t ， w i d el i n e a rr a n g e ，s m a l ld e a dv o l u m e ，e t c s ot h ec o m b i n a t i o no fc ew i t ha di s e x t e n s i v e l ys t u d i e da n da p p l i e d i nm o s ta n a l y t i c a lf i e l d sf o ri t sa b o v ea d v a n t a g e s t h ea d v a n t a g e so fc ei ns e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n di n s t r u m e n t sa r eo b v i o u sw h e n c o m p a r e dt oh p l c h o w e v e r , t h ec o n c e n t r a t i o nd e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fc ei sm u c hl o w e r t h a nh p l co w i n gt oi t ss m a l l e rs a m p l i n gv o l u m ea n dt h es h o r tl i g h td i s t a n c ew h e n c o u p l e dw i t hu vo rl i fd e t e c t o r s t h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fc ec o u l db eg r e a t l y i m p r o v e db y s o m es p e c i a lc h a r a c t e r s o fi t s e l fs u c ha s e l e c t r o s t a c k i n g a n d f i e l d a m p l i f i c a t i o n - i n j e c t i o n ( f a i ) a n di s o t a c h o p h o r e s i s ( i t p ) 华东师范人学2 0 0 5 年申请硕士学位论文 3 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o ni st o s t u d yo nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i c d e t e c t i o n ( c e a d ) o fb i o c h e m i c a la n a l y s i s ，a n di ta l s oe x p l o r e st h em e t h o d so fi m p r o v i n g t h es e n s i t i v i t yo fc e - a d t h em e t h o d si n c l u d ee l e c t r o s t a c k i n ga n df i e l d a m p l i f i c a t i o n - i n j e c t i o n ( f a l ) a n dl s o t a c h o p h o r e s i s ( i t p ) t h ec o n t e n t so ft h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d ef o u r c h a p t e r s ： i nt h ef i r s tc h a p t e r , i ti n t r o d u c e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e ，t h es e p a r a t i o nm o d e sa n d i n j e c t i o nt e c h n o l o g i e so fc e ，s a m p l ee n r i c h m e n tt e c h n o l o g i e s ，t h es e n s i t i v i t y - e r t h a n c e d m e t h o d s ，t h ep r o g r e s so fc e a da r ed i s c u s s e d t h eg o a la n ds i g n i f i c a n c eo ft h i s d i s s e r t a t i o na r ei n t r o d u c e dt o o 19 6r e f e r e n c e sa r ec i t e di nt h i sd i s s e r t a t i o n c h a p t e r2i sd e t e r m i n i n gt h es m a l lw a t e r - s o l u b l ea n t i o x i d a n t si np l a s m ab yc e - a d t h es m a l lw a t e r - s o l u b l ea n t i o x i d a n t si np l a s m ai n c l u d i n gg s h ，u a ，t r ya n dc y sa r ev e r y i m p o r t a n tt oh u m a nb e i n gh e a l t ha n dt h e i rd e t e c t i o ni ss i g n i f i c a n tt o o t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so fd e t e r m i n i n gg s h ，u a ，t r ya n dc y sb yc z e a db a s e do nm e t a l l i cc o p p e r e l e c t r o d ew e r ed e t a i l e ds t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fc z e a dw e r es e p a r a t i o n v o l t a g e1 5k v , r u n n i n gb u f f e r2 5 m m o l l n a 2 8 4 0 7 5 0 m o l l 。n a h 2 p 0 4 ( p h7 9 ) 。k i n e t i c i n j e c t i o nt i m e3 0sa n dd e t e c t i o np o t e n t i a l0 5vt h el i n e a rr a n g e so ft h ef o u ra n a l y t e s w e r e ( 1 o 5 o ) 1 0 6 5 o 1 0 _ 4 m o l l a n dt h el i m i t so fd e t e c t i o nw e r ea b o u t1 0 - 6 m o l l q u n d e rt h eo p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h i sm e t h o dp e r f o r m e ds o m ea d v a n t a g e si n q u i c k n e s s ，h i g hs e n s i t i v i t ya n ds i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n ，a n ds a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r e o b t a i n e dw h e ni tw a sa p p l i e dt oa n a l y z i n gh u m a np l a s m as a m p l e s t h ei n d i r e c td e t e r m i n a t i o no ft h ec o n t e n t so fr n ai ny e a s tb ya n a l y z i n ga d e n i n e ( a ) a n dg u a n i n e ( g ) w i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ( c e - a d ) w a sr e p o r t e di nc h a p t e r3 t h ee f f e c t so fp o t e n t i a lo fw o r k i n ge l e c t r o d e ，r u n n i n gb u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g ea n di n j e c t i o nt i m eo nt h ec e - a d d e t e r m i n a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d a d e n i n ea n dg u a n i n ec o u l db ew e l ls e p a r a t e di na3 0m m o l lb o r a t eb u f f e r ( p h9 0 ) w i t h i n18m i nu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h e i rd e t e c t i o nl i m i t so fa d e n i n e ( s n = 3 ) o f 2 0 1 0 - 7m o l la n d1 7 1 0 m o l l r e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d t h a tt h i sm e t h o dw a so fh i g hs e n s i t i v i t ya n dh i g hr e p e a t a b i l i t y , a n dp o t e n t i a lt ob eu s e di n t h eq u i c ka n a l y s i so f y e a s ti nf o o d s i nt h ec h a p t e r4 ，t h em e t h o do f t r a n s i e n tc a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r s i sw i t ha dw a ss t u d i e d o静东师范j(学2005年申请碗：学位论史4 a b s t r a c t b e c a u s et h ec o n c e n t r a t i o no fo h p r o d u c e dd u r i n gt h em e t a b o l i s mi nh u m a nb e i n g si sv e r y l o w , s u c ha si ti sa b o u ta t1 0 一m o l f ll e v e li nu r i n es a m p l e i ti si m p o s s i b l et od e t e c to h i n b i o c h e m i c a ls a m p l e sb yc e - a dd i r e c t l y 。w et r i e dt og a t h e r2 ，3 - d h b a2 0t i m e sb y t r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e s i sb ys e l e c t i n gp - m e t h y lb e n z o i ca c i da sl e a de l e c t r o l y t ef l e ) a n d r u n n i n gb u f f e ra st e r m i n a t ee l e c t r o l y t e ( t e ) ，s ot h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yc o u l dr e a c ht h e r e q u i r e m e n to fb i o c h e m i c a la n a l y s i s t h es p e c i a lc o n d i t i o n so ft r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e a i s c o u p l e dw i t ha d w e r et e n t a t i v e l ys t u d i e dt o o k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ；f i e l d - a m p l i f i c a t i o n i n j e c t i o n ；t r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e s i s ；a n t i o x i d a n t s ；r i b o s en u c l e i ca c i d ( r n a ) ；h y d r o x y lr a d i c a l ； 华东9 i f i 范人学2 0 0 5 年申清坝i 学位论史 铺一帝绪论 第一章绪论 第一节毛细管电泳概述 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 或毛细管电分离法( c e s m ) ，是2 0 世 纪8 0 年代问世并且迅速发展的一种新型液相分离分析方法，是经典电泳技术和现代 微柱分离技术相结合的产物。它一出现就引起分离科学界极大的关注，目前，它已成 为和2 0 世纪5 0 年代末、6 0 年代初出现的气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y , g c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出现的液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 相 媲美的一种分离技术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题，也是近二 十年来发展最快的分离分析技术之一，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大 进展，它将分离柱效提高到上百力i 理论塔板数，它使分析科学从微升水平进入纳升水 平。其研究和应用涉及到药物分离、环境分析、生化分析、食品分析等几乎所有的分 析领域，尤其是多通道集成芯片毛细管电泳技术的出现，极大提高了d n a 测序的速 度，使人类基因组草图的绘制工作提前三年完成。 毛细管也泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，依据样品中 各个组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类新型液相分离技术。在高压 直流电场的作用下，缓冲溶液中的带正电荷的离子会从j 下极往负极移动，带负电荷的 离子会从负极向正极移动，从而达到分离。实际上，石英毛细管在p h 大于3 时，其 表面带有负电荷，和缓冲溶液形成双电层，当外加电压时，双电层中的水合阳离子层 会导致缓冲溶液整体向负极移动，形成屯渗流( e o fo 因而离子在毛细管内的实际迁 移速率为其电泳速率和电渗流速率的矢量和。 毛细管电泳技术是瑞典科学家h j e r t e n 【l 】首先提出的，他用壁涂甲基纤维素的3 h u ni d ( 内径) 石英管进行电泳分离。1 9 7 0 年，e v e r a e r t s 等【2 】用等速电泳系统做c z e 分离，由于柱效较低而没有引起关注。1 9 7 9 年，m i k k e r s 等f 3 】进行了理论研究，通过 减少进样量并采用较细的毛细管可以抑制区带电场畸变和对流，从而获得高效率。实 验证明在p m o l 级进样量下，2 0 0 u m i d 的管子可以获得小于1 0 p m 板高的效率。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 【4 】采用7 5 pm1 d 的熔融石英毛细管，在3 0k v 的电压 下进行电泳，可以产生4 0 力i 理论塔板数的效率，并实现了正、负离子的同时分离， 华东师范大学2 0 0 5 年申请碰j ：学位论文 6 第一章缔论 同时对高电场和小内径对柱效的决定性影响、分离机理等问题进行了探讨。他们的研 究使毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 取得了突破性进展，奠 定了毛细管电泳的理论基础。1 9 8 3 年后 i j e r l c n 5 先后用提出了毛细管凝胶电泳 ( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p b o r e s i s ，c g e ) 和毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yl s o e l e c l r i cf o c u s i n g , c l e f ) 。1 9 8 7 年，c o h e n 和k a r g e r 6 】发表了所做的毛细管凝胶电泳工作( c a p i l l a r y g e l e l e e t r o p h o r e s i s ，c g e ) ，这是现代效率最高的分离方法。到1 9 8 8 年，出现了第一批毛 细管电泳商品化仪器，c e 开始突飞猛进的发展。上个世纪9 0 年代以来，毛细管凝胶 电泳的论文数几乎成直线上升，应用范围迅速扩大，犬有取代目前广泛应用的高效液 相色谱( h p l c ) 之势。 与传统的电泳相比，毛细管电泳的主要特点有： a ) 高效，在毛细管区带电泳中，柱效一般为每米几十万理论塔板数，高的可达 每米1 0 0 力以上，而在凝胶电泳中可达几百万甚至上干万： b ) 快速，分析时间一般不超过3 0m i n ： c ) 微量，在采用安培法检测时，毛细管电泳的绝对检测限可达1 0 - 1 3 _ 1 0 。5 m o l ， 因此样品用量仅为纳升级。 而与其他色谱相比较，毛细管电泳具有多方i 面的优势： a ) 分离效率高，灵敏度高。在毛细管电泳中，柱效一般为每米几十万理论塔板 数高的可达每米1 0 0 万以上，而在凝胶电泳中理论塔板数可达到几百万甚至上千万， 可以完成其他分离方法不能完成的手性分离等。在采用电化学检测器时，毛细管电泳 的绝对检测限可达1 0 。3 1 0 。5 m o l ，而激光诱导荧光检测器的灵敏度更高，可达到单分 子检测的水平。 b ) 分析速度快。使用细内径( 2 5 - - 7 5pm ) 的毛细管，它具有电阻高，能使用高的 电场( 1 0 0 5 0 0v c m ) 。高电场的应用提高了分离效率缩短了分离时间，通常只需 几十秒至几十分钟内就可完成分离。芯片式c e 则更快，能以秒计算。 c ) 样品对象广。广泛应用于多种化合物，如糖类、氨基酸、维生素、杀虫剂、 无机离子、有机酸、表面活性剂、药物、多肽、蛋白质、神经递质以及r n a 和d n a 片段等。近年柬。毛细管电泳在手性化合物的分离、药物分析、d n a 分析和环境分 析等领域中得到越来越广泛的应用。 d ) 分离模式多样化。在同仪器设备条件f 可以提供毛细管区带电泳( c z e ) ， 胶束电动力学毛细管色谱( m e k c ) ，毛细管色谱( c e c ) ，毛细管等速电泳( c i t p ) ， 挣东帅托人学2 0 0 5 年申请碗i j 学位论文 7 第一章宝荷论 毛细管等电聚焦( c i e f ) ，毛细管凝胶电泳( c g e ) 等多种分离模式，这样可根据样 品的不同理化特性，选择合适的分离模式。 e ) 样品、试剂用量小。c e 的样品用量只需几纳升，缓冲液只需几毫升，仅为 h p l c 的几百分之一。而且c e 有很大的选择性，可以根据分子的性质( 如大小，电 荷数，手性，疏水性等) 对极广泛的对象进行有效分离，为达到相似的目的，h p l c 则要消耗许多价格昂贵的柱子和溶剂。 f ) 易微型化。毛细管电泳技术中的石英毛细管柱内径为几十微米，外径为3 0 0 5 0 0 微米左右，分离通道可以较短，由于进样量、缓冲溶液流量都相当小，样品池可以很 小，这样各个系统可以集中制作在一片玻璃或硅胶片上，实现微型化。 毛细管电泳之所以有上述优点，是因为它采用了细内径毛细管；同样，正因为它 使用毛细管，也给c e 带来问题，比如：制备能力差，根本无法与h p l c 相比； 光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品蜂：凝胶、色谱填充管需要专门的灌制 技术；大的侧面截面积t i i “放大”吸附的作月】，导致蛋白质等的分离效率下降或 无峰；吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难以定量控制f 乜渗。 第二节毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳作为一种技术在不断扩大应用范围，深入解决应用领域所遇到的各种 问题的同时，着重注意自身的完善和发展。一般地说，这种完善和发展主要涉及到毛 细管电泳的分离模式、进样技术以及检测方式等几个重要方面。毛细管电泳的分离模 式主要有以下儿种： 2 , 1 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 毛细管区带电泳是一种最简单的毛细管电泳分离技术，是目前毛细管电泳中最基 本、应用最为广泛的种分离模式。整个分离过程在内部充满缓冲液、两端施加高压 的石英毛细管中进行。其机理是溶液中的被检测物在电场的作用下根据不同的荷质比 发生迁移，由于粒子淌度不同而实现分离。但是，c z e 只分析荷电粒子，对于中性 粒子，由于其不存在淌度差异而不能实现多种粒子的分离【4 】。 毛细管电泳中带电离子的迁移速度和淌度( 电迁移率) 为： f 。e( t ： 迁移速度， 。： 电泳迁移率， e ：电场) 儿m = q 6 硼r( q ：离子电荷数， r l ：溶液粘度， r ：离子半径) o 芦东师范人学2 0 0 5 年申请硕j 二学位论义 第一章绪论 但由于毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而导致电渗，其速率为 o = ( 4 冗1 1r ) ( p e o ：电渗率，1 1 ：黏度， ：管壁的电动势，r ：毛细管半径) 因此，h 带电离子在毛细管电泳巾的实际迁移速率为 儿h 2ue m + i - t e o 在c z e 模式中影响分离的撮主要因素是缓冲液的成分和p h 值。一种理想的缓冲 液应该使电导率低( 为了在高电压下不产生高电流) 且对分离的干扰最小，常见的有 磷酸、硼酸、柠檬酸、磷酸硼酸缓冲液。c z e 可应用于蛋白质和肽类的分离，但由 于会在毛细管表面产生一电势造成区带扩展或分离失败，所以分离设定的p h 值应 高于被检物等电点1 2 个单位，或者增加缓冲液的离子强度。 2 2 胶束电动毛细管龟谱( m i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e k c ) 1 9 8 4 年，t e r a b e 等【7 用含s d s ( 十二烷基磺酸钠) 的胶束溶液分离了中性分子， 建立了毛细管电泳的一个重要分支，即胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 。m e k c 弥补 了c z e 分离模式的不足，它不仅可以测定荷电离子，而且可以测定中性粒子。在浚 分离模式中，要向缓冲溶液中加入表面活性剂( 如十二烷基磺酸钠，s d s ) 使之与被 测物分子形成胶束，它可以作为“准固定相”，出于胶束相的电泳速度不同，从而达 到各种粒子的分离。在分离过程中电场产生了驱动力，同时发生了层析作用。近年来， 各种各样的表面活性剂得到了研究，如坏糊精、浆乙烯蚍啶等，并在许多样品测试中 得到了应用【8 1 0 】。 2 3 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l c c t r i cf o c u s i n g ，c l e f ) 由于两性电解质在分离介质中的迁移造成了p h 梯度，由此可以使蛋白质根据 它们各自不同的等电点进行分离。由于蛋白质在j ( 等电点时的溶解度最小，因此当蛋 白质顺着这一梯度迁移到相当于它们的等电点的那个位置，就在浚点停下，出此产生 种非常窄的聚焦区带，并使不同等电点的蛋白质聚焦在不同的位置上，所形成区带 位置不同，从而实现蛋白质的分离。这就是毛细管等电聚焦fc l e f ) 分离的基本原理 5 。c i e f 有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于0 0 lp h 单位的两种蛋白 华东师范 = 学2 0 0 5 年申请硕j ：学位论文 9 第章缔论 质。因此，该分离模式可以用来测定蛋白质的等电点，分离异构体或其它方法难以分 离的蛋白质，而且由于其分辨率极商，可以用束准确地对生化样品进行分析以及获取 适量的蛋白质纯品【1 l 】。 2 4 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 由于凝胶粘度大、抗对流、能减少溶质的扩散。因此从理论上讲，它是毛细管电 泳的理想介质，能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效极高 1 2 。由于溶质和凝 胶生成络合物，使分离度增加，同时它能防止溶质在毛细管管壁的吸附并减少电渗流， 鉴于上述原因，毛细管凝胶电泳能使组分在短柱上实现极好的分离。毛细管凝胶电泳 是以凝胶为载体的电泳方式，常用的凝胶是聚丙烯酰胺和琼脂糖，其原理为交联的聚 丙烯酰胺具有三维多孔结构，是一种优良的筛分介质溶质按分子大小进行分离。该 分离模式在d n a 测序和限制片段分析方面展现出优异性能，成为蛋白质、多肽、寡 核苷酸和d n a 等生物大分子分离分析的有利工具。由于在毛细管中灌制凝胶有定 的难度，近年来发展了非胶筛分介质，如线性聚丙烯酰胺，甲基纤维素、羟丙基甲基 纤维素、聚乙烯醇等，这些物质适合于d n a 测序。毛细管凝胶电泳和无胶筛分技术 己被广泛用于蛋白质和d n a 片段的分离，出于对快速、低耗、高效分离d n a 序列 产物的需求，毛细管凝胶电泳很有可能发展成第二代d n a 测序仪【1 3 ，1 4 】。 2 5 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) 毛细管等速电泳( c i t p ) 是一种“移动边界”电泳技术，它采用两种不同的缓冲 液体系，一种是前导电介质，充满整个毛细管柱，另一种称尾随电介质，置于一端的 电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，当毛细管两端 加上电压后，样品带在给定p h 值下，按其淌度和电离度大小依次连接迁移，得到了 互相连接而又不重叠的台阶或梯形区带。c i t p 可使用较大内径的毛细管作为分离柱， 在微制备中很有用处，但其缺点在于需要采用不连续缓冲体系空间分布率差，目前 应用不多。 2 6 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y , c e c ) 毛细管电色谱是将高效液相分离技术中的诸多固定相微粒填充到毛细管中，以样 品与固定相之闽的相互作用为分离机制，以也渗流为流动相驱动力的色谱分离技术。 它突出的优点是可以同时分离带电离子与中性分子，而且通过控制分离条件实现更好 的分离效率。它结合了毛细管电泳和高效液相的优点既有毛细管电泳的高效率，又 有高效液相的高选择性，是一种很有发展前景的分离模式，在药物分析中已经取得了 华东帅范人学2 0 0 5 年中请硕士学位论文 1 0 第一章绪论 广泛的应用【1 5 ，1 6 1 。 2 7 阵列毛细管电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 阵列毛细管电泳( c a e ) 是将几十根甚至上百根等长的毛细管平行并列在一起，同 时分离检测大量样品 1 7 】。它是在常规c e 原理和技术的基础上，结合微型制造技术设 计出来的一种检测技术，它具有物料通量大，可以实现几十或几百个样品同时分析， 单个样品分析成本低的特点，同时，由于毛细管很多，起到了分流作用可以施加更高 的电压，在保证分离效率的同时减少了分离时问。c a e 在高效快速的分离、高灵敏 度的检测、灵活性的设计和多功能单元的集成方面的潜力已逐渐显示出来。如将p c r 反应器集成在芯片上，可实现对p c r 扩增的实时监测 18 。所以，c a e 对于d n a 快 速测序具有其它方法无可比拟的优越性。 2 8 亲和毛细管电泳( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 亲和毛细管电泳( a c e ) 是利用生物分子或其它受体分子与其相应的专一分子可 逆特性，来进行电泳分离的 1 9 。受体分子与配体之问形成专一的可解离的溶合物的 能力称为亲和力。因为它们是通过一些次级键结台，而并非形成很强的化学键。目前， 应用较多的是亲和毛细管区带电泳和亲和毛细管凝胶电泳。前者是在电泳缓冲液中加 入与样品中欲测成分具有专一作用的配体，使两者形成络合物，从而达到使被测成分 与存在的杂质分离而单独测定。后者是将专一性的配体通过化学反应键合在凝胶载体 上，再通过电泳进行专一性分离。此法对于生物大分子的测定特别有用，具有专一、 高效、快速、准确、易于自动化的特点。 2 9 芯片毛细管电泳( m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 芯片毛细管电泳【2 0 】是“芯片实验室”( 1 a bo nac h i p ) 的一个重要方面，它通过石