（果树学专业论文）苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因功能的初步分析.pdf

摘要 目前在模式植物上已克隆到许多与吸收利用铁相关的基因，大多数为功能基因，调控基因很 少。m x m y b l 是从小金海棠中利用探针筛库的方法克隆到的一个m y b 类转录因子，m x m y b l 基 因全长1 1 3 4 b p ，5 非翻译区1 1 6 b p ，3 非翻译区1 1 2 b p ，o r f 含3 0 2 个氨基酸，m x m y b l 蛋白 只含有一个m y b 重复区。利用生物信息学方法在t a i r 数据库中检索，找到a t l g t o o o o 基因与 m x m y b l 的同源性较高，氨基酸比对同源性达3 7 。通过构建3 5 s ：m x m y b l 基因的超表达载体 和其反义载体，以及分析a t l 9 7 0 0 0 0 的三个t - d n a 插入突变体 ( s a l k _ 1 4 3 0 5 5 ，s a l k0 4 5 9 0 5 ，s a l k _ 0 2 5 5 7 7 ) 的表型来初步分析m x m y b l 基因在植物体内的功能。 结果表明，s a l k _ 1 4 3 0 5 5 ，s a l k _ 0 4 5 9 0 5 ，s a l k _ l y 2 5 5 7 7 突变体在缺铁培养基上都出现了明显的黄化 现象，表明a t l 9 7 0 0 0 0 基因对铁的吸收利用有一定的调控作用。转化3 5 s ：反义表达载体的拟南 芥在缺铁条件下与野生型植株无明显差异，有可能是小金海棠的m x m y b l 基因在拟南芥中没有将 其同源基因抑制掉或抑制不完全，使得反义转化植株没有什么明显的表型。 综上所述，小金海棠m x m y b l 在拟南芥中的同源基因a t l 9 7 0 0 0 0 对植物铁营养的吸收和利用 具有一定的调控作用。a t l 9 7 0 0 0 0 基因的t - d n a 插入突变可能导致植物吸收或利用铁的能力下 降，出现黄化表型。初步分析得出m x m y b i 及其回源的a t l 9 7 0 0 0 0 基因编码的产物可能是与植物 铁吸收利用有关的调控蛋白。 关键词：苹果属小金海棠，m x m y b l 基因，铁胁迫，表型分析 a b s t r a c t t h e r ea mm a n yi r o nu p t a k er e l a t i v eg e n e sc l o n e ds of a r b u tt h em a j o r i t yo ft h e me n c o d e t r a n s p o r t e rp r o t e i n ，f e wt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r ec l o n e d t a m e r - b pf r a g m e n tw a su s e da sp r o b ef o r m a l u sx i a o j i n e n s i sc d n al i b r a r ys c r e e n i n ga n df u l ll e n g t hm x m y b lg e n ew a so b t a i n e d m x m y b l e x p r e s s i o nw a si n d u c e db yi r o n m x m y b le x p r e s s i o nw a su n d e t e c t a b l eb yr n ag e lb l o ta n a l y s i s u n d e ri r o ns u f f i c i e n tc o n d i t i o n s ，i tw a si n d u c e dg r e a t l y3d a y sa f t e rb e i n gt r a n s f e r r e dt oi r o n - - d e f i c i e n t m e d i u m a t l 9 7 0 0 0 0i sah o m o l o g o u sg e n eo fm x m y b li na r a b i d o p s i s t h e i ra m i n oa c i dh o m o l o g yi sa s h i g ha s3 7 t h r e et - s a l kl i n e s 扛a l k _ 1 4 3 0 5 5 ，s a l k _ 0 4 5 9 0 5 ，s a l k _ 0 2 5 5 7 7 ) o fa t l 9 7 0 0 0 0g e n ew e r e a n a l y z e d w h e nt - s a l kl i n e sw e r eg r o w no ni r o n d e f i c i e n ta n d3 0 0 u mf e r r o z i n em e d i u m ，t h e y s h o w e ds e v e r ec h l o r o t i c ，w h i c hc o u l db er e s c u e db yt h ea d d i t i o no fs u p p l e m e n t a li r o n i ti n d i c a t e dt h a t t h e s et - s a l kl i n e sa mf e d e f e c tm u t a n t s i ti n d i c a t e dt h a tm x m y b la n di t sh o m o l o g o u sa t l 9 7 0 0 0 0 g e n em i g h tp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ni r o nu p t a k ea n dm o b i l i z a t i o n k e yw o r d s ：m a l u s ，a r a b i d o p s i s ，m x m y b l g e n e ，i r o n 。d e f i c i e n c y , m u t a n t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：如毛乏 时间： 。町年月，) 臼 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： i 苞未、 时间： 3 “厂年月厂、日 导师签名。岛哆 时间：a r 洲r年r 月，) 日 第一章文献综述 铁作为植物生长发育所必需的矿质营养元素之一，在植物体的生理代谢过程中起着极为重要 的作用。植物轻度缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁导致叶绿素合成停止， 新叶变黄，生物量大幅度下降( z h o u 等，1 9 8 4 ) 。植物缺铁不仅影响植物的生长发育，造成巨大 的经济损失。而且也影响动物和人类对铁的吸收，从而导致贫血病的发生( g u e r i n o tm l 等) 。 虽然地壳中铁的含量很丰富，但由于受p h 和氧的影响，在土壤中铁一般是以比较稳定的氧化物 形态f e ( 1 i i 府在，能被植物吸收利用的铁所占比例很小，目前全世界有1 ，3 以上的土壤处于缺铁 状态，尤其在干旱和半干旱石灰性土壤上的缺铁现象更为严重( n o v c r ，1 9 9 1 ) 。 自从1 9 世纪发现植物缺铁失绿症以来，研究者进行了大量的实验研究以解决植物的缺铁失 绿，目前采取的生物学途径解决铁缺乏问题是从以下几个方面进行：( 1 ) 抗缺铁黄化基因型种 或品种的筛选；f 2 ) 与缺铁有关的关键基因转录因子基因的筛选和克隆，并研究其基因表达 的调控机制；( 3 ) 寻找f r d 2 、n a a t , 和n a s 等基因的启动子区：( 4 ) 鉴定f e “- - 2 m a s 特异的质 膜转运基因。最终达到提高植物的铁营养效率( 曹慧等，2 0 0 2 ) 。 1 1 植物吸收、利用铁的特点及机理 f e 3 + 是土壤中铁元素存在的主要形态，f e 2 + 是植物的吸收形态。在正常情况下，通过质流和扩 散供给的无机铁远低于植物的需要，只占植物总吸收铁量的3 - 9 ，而根在土壤孔踪伸展过程中 接触和置换吸收的铁占2 3 5 6 ( 章艺等，2 0 0 4 ) 。目前己较为清楚地认识到，缺铁条件下高等 植物产生了两种独特的机制将根际中的铁活化并由根吸收( r o m h e l d 等，1 9 8 6 ) 即机理1 和机理i i 。 机理l 植物包括双子叶植物和非禾本科单子叶植物。机理i 植物由两部分组成：一个f e ( 1 i d 还原酶系统和一个质子外泌泵，这两部分均位于根表皮细胞的细胞质膜上，并有效地对缺铁胁迫 发生反应( r o m h e l d ，1 9 8 6 ：c b a n e y 等，1 9 7 2 ) 。f e ( 1 i d 必须还原为f e ( u ) 才能被植物吸收 利用( r - m h e l d ，1 9 8 7 ；c h a n e y 等，1 9 7 2 ；y i 和g u e r i n o 。1 9 9 4 ：b a g n a r e s i 和b a s s o 1 9 9 6 ) 。在缺 铁胁迫的条件下，机理i 植物通过激活一种特异的h + - a t p a s e 而使土壤酸化( g u e r i n o t 和y i ， 1 9 9 4 ) ，从而增加铁的可溶性，并通过一种特异的铁还原酶将f e ( 1 i d 一整合物还原( g u e r n o t 和 y i 1 9 9 4 ；b r i a t 等，1 9 9 5 ：b i e n f a i t ，1 9 8 5 ) ，i c e ( 1 i d 还原为f e ( 1 1 ) 后，f e ( 1 1 ) 通过细胞膜上的 转运蛋白跨越根部的细胞质膜而被转运( f o x 等，1 9 9 6 ) 。 机理】l 仅限于单子叶禾本科植堪日( r a k a g i 等，1 9 8 4 ；r o m h e l d ，1 9 8 7 ) ，麦根酸( m u g i n e i ca c i d ， m a ) 和天然螯合剂的发现证实了这一吸收系统的存在( r o m h e l d 和m a r s c h n e r ，1 9 8 6 ；t a k a g i 等，1 9 8 4 ；t a k a g i ，1 9 7 6 ) 。其主要特点是这类作物在缺铁时能分泌一类麦根酸类植物铁载体m a s c f 撒百等，1 9 8 4 ；t a k a g i ，t 9 9 3 ) ，这种载体对f e ( 1 1 1 ) 亲和力强，并能形成稳定的三价铁螫合 物1 e ( 1 i d m a s 】。禾本科植物缺铁时，根际通过对难溶性铁的活化以及对f e ( 1 i d - m a s 螯厶物 中国农业大学硕士论文文献综述 的专性吸收来适应缺铁胁追环境，这一过程受土壤p h 的影响较机理l 植物1 吸收铁要小得多。后来 发现植物缺锌亦能导致分泌m a “z h g 等，1 9 8 9 ，1 9 9 1 ) ，从而改变了以前认为只有缺铁才能诱 导分泌植物铁载体的认识。 在缺铁胁迫下，单子叶和双子叶植物的根尖膨大、变粗，根毛增多，并在根尖部位形成大量的 转移细胞，使根吸收铁的能力显著增强( r o m h e l d 等，1 9 8 1 ；c h a n e y 等，1 9 7 2 ；h a n 等，1 9 9 8 ) ： 根尖主动向外界分泌大量的i t ( c h a n e y 等，1 9 7 2 ；m o o g 等1 9 9 4 ；h a n 等，1 9 9 8 ：l a n d s b e r g 等 1 9 8 4 ) ：酚类等还原物质或有机酸分泌量显著增加( r - m h e l d 等，1 9 8 6 ：r - m h e l d 等，1 9 8 7 ： h a n 等，1 9 9 8 ；l a n d s b e r g 等，1 9 8 4 ) ；根尖表皮细胞原生质膜上还原酶活性增强( r o m h e l d 等， 1 9 8 7 ；y i 等，1 9 9 1 ：b u c k h o u t 等，1 9 8 9 ：b r t l g g e m a n n 等1 9 9 0 ) 。其中，f e ”还原酶活性的 提高是机理i 植物展典型的特征，且可能是铁有效性的首要决定因素。f e ”还原酶位于根表皮 的细胞质膜上，可以受短时间供铁而激活( b u c k h o u t 等。1 9 8 9 ) 。 1 2 与铁吸收利用相关基因的研究进展 1 2 1 酵母铁吸收转运系统相关基因 单细胞真核生物酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的铁吸收机制和双子叶植物有许多相似之处 ( g u e r i n o t 和y i ，1 9 9 4 ) 。酵母细胞吸收外界环境中的铁必须通过两个步骤来完成：( 1 ) 位于细胞 质膜上的f e ( 1 1 1 ) 还原酶将f e ( 1 i d 还原为能被细胞直接吸收的f c ( 1 1 ) 形式( g u e r i n o t 和y i ，1 9 9 4 ) ； ( 2 ) f e ( 玎) 再被一种低亲和力或高亲和力的铁转运系统运到细胞i 匈( s t e a r m a n 等，1 9 9 4 ) 。目前 已克隆到的酵母细胞铁转运系统的相关基因有：自1 、f r e 2 、f t r l 、l e t 3 、l e t 4 、c t r l 、c c c 2 和m a c l 等( 表1 1 ) 。 表l 1 酵母铁转运系统中的相关基因( 印莉萍等，1 9 9 9 ) t a b l e l 1 t h e g e a e s l n l r e a t r a m p e r t s y s t e m o f y e a s t 2 续表1 1 1 2 2 植物中铁转运相关基因及其基因表达 植物为了从外界环境获得充足的铁营养元素，经过长期的进化已经形成了具体的机制，产生了 多种信号调节与铁转运相关基因的表达。拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 是铁高效型机理l 植物r o b i n s o n 等( 1 9 9 9 ) 首次从拟南芥中分离到了f e ( 1 ) 一螯合物还原酶基因日t 0 2 ，缺铁胁迫条件下在拟南 芥根部表达属于一个跨膜转运电子的b 型细胞色素大家族。r o b i n s o n 等( 1 9 9 9 ) 又根据f r o 家 族的保守基序设计引物，从拟南芥基因组d n a 中扩增出几种p c r 产物，选用此p c r 产物筛选拟 南芥的基因组文库和c d n a 文库，获得含有两个紧密相关基因( f r o l 和肿2 ) 的基因组片段。 序列分析表明f r 0 2 和f r 0 1 具有6 1 9 的一致性和9 0 - 5 的相似性。然后利用拟南芥的f r d l 突变 体( 不能诱导出f e ( i ) 一螫合物还原酶活性) 进行功能互补验证，证明功能型f r 0 2 在转基因 植物中互补了f i d l 的表型，确定拟南芥根部的f r 0 2 具有f e ( 珊) 一螯台物还原酶活性。 除了f r 0 1 和f r 0 2 外，r o b i n s o n 等( 1 9 9 7 ) 从拟南芥中最少还鉴定出了三个其他的f r o 基因，它们的产物可能在不同的器官或特定的细胞类型中起作用，介导铁的转运。在缺铁胁迫下 机理i 植物除了f e ( 1 i d 一螯合物还原酶活性增强外，h + 的释放也增强，h + 的增强能降低根际p h 值，进而增强了f e ( m ) 的可溶性。 利用酵母的双重突变体f e t 3 f e t 4 ，通过功能异源互补法从拟南芥中克隆到第一个高等植物的 f c ( j 1 ) 一转运蛋白基因i r t l ( i r o nr e g u l a t e d 仃s p o r ) ( e i d * 等，1 9 9 6 ) 。研究发现i r t l 基因与 酵母和细菌的f c ( 1 1 ) 专一转运蛋白不具有同源性，同时i r t l 的表达是依赖时间、温度及f e ( n ) 的浓度。i r t l 在拟南芥中的表达是在转录水平被调控，而且其表达是被缺铁胁迫所诱导，尤其在 根部是高水平表达。1 9 9 8 年c o h e n 等人利用酵母铁和锌的突变体从豌豆( p i s u ms a f i v u m ) 根中分 离得到了又一个f c ( 1 1 ) 专一转运蛋白基因r i f t ，它也受外界环境缺铁胁迫在根中增强表达。禾 本科植物具有特异的“高铁载体”吸收系统，但近来报道拟南芥的8 个y s l 基因和玉米中编码 f e ( 1 1 1 ) 鳌合物高亲和转运蛋白基因y s l 高度同源( c u r i e 等，2 0 0 1 ) ，目前对y s l 转运蛋白的 功能还不清楚，但通过组织定位表明这些基因可能参与细胞内部金属离子的运输和贮藏( s t e p h a n 和s c h o l z ，1 9 9 3 ；p i c h 等，2 0 0 1 ) 。拟南芥n r a m p 家族可以维持铁的动态平衡，可能在细胞水 3 中国农业大学硕士论文 文献综述 平上对金属起区隔化作用( c u r i e 等，2 0 0 0 ；t h o m i n e 等，2 0 0 0 ) 。 对于机理植物来说，禾本科植物在碱性土壤中缺铁失绿症相对较小，主要是因为它能分泌 释放高铁载体，高铁载体与f c ( 1 i d 结合形成复合物。在质膜上存在一种对铁载体- f e ( 1 ) 复 合物具有高度亲和力的吸收转运系统，从而使植物可以有效地吸收利用f c ( 1 i d 来对抗环境的铁 胁迫。至今已经鉴定的高铁载体有麦根酸、脱氧麦根酸和羟化麦根酸等几种。 1 。3m y b 转录因子 m y b 类家族是指含有m y b 结构域的一类转录因子。m y b 结构域是一段约5 1 。5 2 个氨基 酸的肽段，其中禽有3 个色氨酸残基，这3 个残基被1 8 - 1 9 个氮基酸残基隔开，组成一个疏水核， 包含一系列保守的氨基酸残基和间隔序列，使m y b 结构域折叠成螺旋转角螺旋结构。是植物 中最大的转录因子家族，拟南芥中大约有1 8 0 个成员，玉米中大约有2 0 0 个成员。由于m y b 转录 因子在植物中数量最多、功能最具多样化，因而植物通过m y b 转录囡子的调控作用就显得尤为重 要( m a r t i n 等，1 9 9 7 ) 。 和动物m y b 蛋白的m y b 结构域由三个不完全重复区( r - r 2 r 3 ) 组成相比，植物和酵母的 m y b 蛋自大多含有两个不完全重复区( r 2 r 3 ) ，在植物中还发现了含一个重复区的m y b 蛋自( 1 r ) 以及含3 个不完全重复i - 的m y b 蛋白( r l r 2 r 3 ) 。s t m y b l ；黾植物中鉴定的第一个1 r m y b 蛋白( n a d j a 等，1 9 9 4 ) ，随后相继发现了i b p l 、r t b p l 、c c a l 和l i i y 等只含一个重复区的m y b 蛋白( y u 等， 2 0 0 0 ) 。 m y b 转录因子广泛参与植物特有代谢和发育过程的调节，己发现植物m y b 类转录因子在次 级代谢的调控，细胞形态建成和分化，植物激素应答，抗病反应以及细胞周期调控等过程中起重 要作用( m a r t i n 和p a z - a r e s ，1 9 9 7 ；j i n 和m a r t i n ，1 9 9 9 ：r a b i n o w i c z 等，1 9 9 9 ) 。苯丙烷类代谢 是植物三条主要的次生代谢途径之一，m y b 蛋白作为一种调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径 的调控；植物m y b 转录因子另一个研究的较清楚的功能是控制细胞的形态和模式建成。金鱼草 的m i x t a 基因，矮牵牛的p h m y b i 对花瓣表皮细胞的形成是必需的，拟南芥的g l i 基因与叶 和茎的表皮毛形成有关( o p p e n h e i m e r 等，1 9 9 1 ；p a y n e 等，2 0 0 0 ) ；在植物激素应答方面，m y b 类转录因子也起到了重要的调控作用，拟南芥中的a t m y b 2 基因是第一个被发现受a b a 诱导表 达的r 2 r 3 - m y b 基因( a b e 等，1 9 9 7 ) ：在调控细胞周期方面，c m y b 的部分作用是通过对c d c 2 激酶的调控从而控制细胞从g 1 到s 期的分裂( k u 等，1 9 9 3 ) 。 1 4 果树铁营养研究进展以及存在的问题 全世界缺铁的土地面积约占总砸积的4 0 ，大部分的果树面临缺铁问题，缺铁对果树的生长 4 中国农业大学硕士论文 文献综述 发育、产量和果实品质都会产生不良影响。研究表明，缺铁会导致叶绿素酸酯不能形成叶绿素， 严重影响植物的物质和能量代谢。缺铁胁迫还对果树叶肉细胞、栅栏细胞及主脉内薄壁细胞的形 状和结构都会造成严重影响，干扰了果树一系列生理作用的正常进行。同时，根部铁三价还原酶 活性增强，根系吸收铁的速率和总量都有所增加，果树叶片的总呼吸强度低于正常叶片，苹果缺 铁时叶和根中苹果酸和柠檬酸均显著提高，这对酸化根际和铁的还原有利。另外，缺铁对果实内 总糖量、总酸量、果实色泽和硬度以及其它营养的正常积累等都有严重的负面影响。 对苹果铁素营养的研究近年来取得了较大的突破，现已筛选出一个苹果铁高效基因型一小金 海棠( m a l u s x i a o j i n e n s i sc h e n g e tj i a n g ) 。研究表明，在缺铁胁迫下，小金海棠表现出典型的机理 1 型植物的缺铁适应性反应( 韩振海等，1 9 9 1 ；刘书娟，1 9 9 3 ；平吉成，1 9 9 4 ) 。与铁低效苹果 基因型山定子相比，在缺铁胁迫下，小金海棠根系的a t p 酶活性高、根系分泌物的电导率高，而 且对铁的亲和力和吸收能力均较强( 王永章，1 9 9 4 ) ；根系对f e ( 1 1 1 ) 的还原能力远高于山定子 ( 韩振海等，1 9 9 5 ) ；根系自由空间铁积累量大，对铁的活化利用能力强( 张福锁等，1 9 9 6 ) ； 根系具有较高的阳离子交换量。 目前生产上常用的苹果砧木如八棱海棠、平邑甜茶等抗缺铁能力中等。山定子抗缺铁能力极 差，缺铁黄化严重，不能在缺铁地区使用。目前除本试验室筛选出的铁高效基因型小金海棠外， 张凌云( 2 0 0 2 ) 以国内重要的1 1 种苹果砧木为试材，研究了其对缺铁胁迫的适应性反应及其中9 种砧木根系对铁的吸收特性，确定砧术对铁的吸收动力学、根际酸化能力、根系还原能力作为评 价铁高效苹果砧木的指标还筛选出l u 0 2 、l u o l 为铁高效基因型苹果砧木。l u 0 2 、l u o l 是山东 农大罗新书教授筛选培育的苹果砧木新品系，该砧木抗逆性较强。抗盐、抗缺铁，适合在中度盐 碱地和缺铁地区推广使用( 翟衡等，1 9 9 9 ；杜中军等，2 0 0 2 ) 。 寻找一种有效的解决果树缺铁的途径一直是研究者关注的热点。目前我国学者已经成功的寻 找到了铁高效基因型的小金海棠和八楞海棠。并以此为基础进一步探究铁的运输、分配、利用及 再利用的机理，进一步加强不同果树品种问铁的比较生理学研究。 1 5 立论依据和研究意义 目前对植物铁吸收利用的功能性基因已经有了比较深入的研究，但是在植物感应铁信号以及 植物体中铁信号的转导方面却知之甚少。m x m y b l 是从小金海棠中利用探针筛库的方法克隆到的 一个m y b 类转录因子，小金海棠在缺铁胁追下m x m y b l 基因在缺铁胁追下加强表达，尤其在缺 铁第三天时表达量最大。据此分析其有可能参与到铁信号的转导过程中，本论文通过对m x m y b l 基因功能的初步分析，希望能从转录因子参与调控的角度研究植物吸收利用铁的过程，从而为阐 明转录因子调控高等植物铁吸收利用的机制提供证据。 5 2 1 实验材料及试剂 2 1 1 植物材料 第二章材料与方法 选取均匀饱满的小金海棠( m a l u s x i a o j i n e n s i s ) 种子，用饱和漂白粉溶液消毒1 5 m i n ，洗净后 浸种过夜，4 c 层积。选取发芽基本一致的种子播种于蛭石内，室内培养。待幼苗出土并长至2 片真叶时，移至营养液中培养( h a r t 等，1 9 9 4 ) 。营养液的初始p h 为6 , 0 ，每周更换一次营养液， 每天定时通气。日光灯恒定光源，光暗时间比为1 6 h 8 h 。光强4 0 q u m o l p h o t o n s m 2 s ，室温2 4 2 8 ，相对湿度8 5 。当幼苗长至1 2 1 4 片真叶时进行实验处理，取白色新生根的根尖部分，将其 立即放入液氮冷冻后置于8 0 低温冰箱保存待用。 拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 种子在o 5 次氯酸钠( 含0 0 1 t r i t o n x - 1 0 0 ) 中消毒1 5 r a i n ，用灭菌 水漂洗5 次，播种于m s 培养基上。4 c 黑暗下春化2 3 天后，移至光照培养箱中，2 2 c ，2 4 小 时光照培养，光强为3 0 - - 4 0 u m o l m 一2 s 。若用组培苗做实验，则让它继续在光照培养箱中生k ： 若用成熟植株做实验和需要收种子，则7 天后移到土里在2 2 3 2 ，1 6 h 光，8 h 暗f 继续生长，直 至收种子。 2 1 2 试剂 限制性内切酶，r n m e a ，卡那霉素，氨苄青霉素为m 瑚和- t j l l e r e s c o 公司产品：t 4 连接酶为 p r o m e g a 公司产品；d n t p 、t a q 酶、l a t a q 酶、高保真酶、玻璃奶回收试剂盒为t a k a r a 产品； f e r r o z i n e 购自s i g m a 和上海生工：1 h z o l 购白l n v i t r o g e n ；其它常用试剂和药品购自s i g m a 、p r o m e g a 等公司或国产纯； 2 2 实验方法 2 2 1 碱裂解法少量提取质粒d i q a 将单菌落接种于3 m l 含相应抗生素的l b 培养基中，3 7 振荡培养过夜。1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ， 收集菌体。加2 0 0 t l 溶液i ( 含r n a s a 1 0 q u e , m 1 ) ，振荡悬浮菌体。加2 0 即l 新配制的溶液i i ，颠 倒混匀。溶液澄清后，立即加入预冷的2 0 0 u 1 溶液，混匀后冰上放置5 - l o m i n 。4 、l 加o o r p m 离心1 5 m i n ，取上清，加0 7 倍异丙醇混匀沉淀3 0 m i n 。1 2 0 0 0 r r , m 离心l o m i n ，7 0 乙醇洗涤沉 淀，抽干后溶于适量水或t e 缓冲液中，2 0 保存备用。 6 2 2 2 碱裂解法大量提取质粒d n a 将活化的菌体接种于5 0 m ll b 液体培养基( 加相应抗生素) ，于3 7 c 振荡培养过夜。9 0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，收集菌体。2 m l 溶液i ( 含r n a s e a l 0 0 u g m 1 ) 振荡悬浮稿体。加入2 m l 新配制的溶 液i i ，缓慢颠倒混匀，室温放置5 m i n ，促进菌体裂解。加入2 m l 溶液( 预冷) ，颠倒离心管混匀， 冰浴1 0 m i n 。1 2 0 0 0 p m 、4 离心1 5 r a i n ，取上清，加入0 7 倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放 置1 0 m i n 。1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 r a i n ，弃上清，7 0 7 , 醇洗涤沉淀，真空抽干，溶解于适量水或t e 缓冲液中，2 0 保存备用。 2 2 3 小金海棠基因组d n a 的提取 取若干1 s m l 离心管，各加入8 0 0 u lc t a b 提取液在恒温水浴中预热至6 5 。称取0 1 旬缸 苹果叶片放入研钵中，迅速加入液氮并研磨至细粉末状。将叶片粉末快速而又小心地倒入已预热 好的盛有提取缓冲液的离心管中，摇匀，保温3 0 m i n 。取出离心管放入冰中，迅速冷却到室温， 1 2 0 0 0 r m p 离心1 0 m i a 。将上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，缓慢翻转 离心管使内含物充分混匀后形成乳蚀液，在1 2 0 0 0 r m p 离心1 0 m i n 使其分层，取水相转入另离 心管中。重复上一步，即再抽提一次。在两次抽提后的水相中加入2 3 体积冰冷的异丙醇，置于 一2 0 至少3 0 r a i n 1 2 0 0 0 t m p 离心1 0 r a i n 收集沉淀，加入5 0 0 , u l 7 0 7 , 醇洗涤沉淀( 1 2 0 0 0 r m p 离心 l m i 神。在室温下自然风干4 - 5 r a i n 。将此沉淀溶于3 0 0 - 4 0 0 9 l 0 1 t e 中，加入1 肛l1 0 r a g m l r n a s e a 储备液，3 7 。c 保温2 0 - 3 0 m i n 以裂解r n a 。保温后用等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 再抽提一次，将 水相转入另一离心管中加入1 5 体积1 0 m 的醋酸铵( 使其终浓度为2 m ) ，然后加入2 体积无水乙 醇，置于一2 0 至少3 0 m n 。1 2 0 0 0 r m p 离心l o m n ，收集沉淀。用7 0 乙醇洗涤沉淀两次，置于 室温下自然风干至无乙醇味。视沉淀多少加入3 0 - 4 0 9 l0 1 t e 缓冲液，待溶解后放于一2 0 保存 或4 备用。 2 2 4 小金海棠r n a 的提取 采用改进的s d s 一苯酚法( 刘彦华，1 9 9 9 ) ，对根或叶总r n a 进行提取。 2 2 5 拟南芥r n a 的提取( t r i z o l ) 匀浆化用l m lt r i z o l 试剂匀质化5 0 - - 1 0 0 r a g 组织材料，在g l a s s - t e f l o n 或搅拌器样品体 积不能超过所用t r z o l 试剂体积的1 0 。 分离把提取样品在1 5 - - 3 0 度静置5 m i n 来保证核蛋白复合体的完全分离，加0 2 n i l 氯仿 f 对于l m l t r i z o l ) ，盖盖，用力摇晃1 5 秒，然后在1 5 - - 3 0 度静置2 - - 3 分钟，1 2 0 0 0 9 、2 - - 8 度 离心1 5 分钟，离心后，混合物分为三部分，底部为红色的苯酚一氯仿相，中间相t 上层相为无 色的水相( a q u e o u s ) ，r n a 专一地留在水相里。水相地体积大约是用于匀浆化的t r i z o l 体积的 7 中国农业大学硕士论文 材料与方法 6 0 。 r n a 沉淀把水相转移到一个新的管中，如果要分离d n a 或蛋白质可以保存有机相。用 0 5 m l 异丙醇从水相里沉淀r n a 。在1 5 3 0 度静置1 0 m i n ，1 2 0 0 0 9 、2 8 度离心1 0 分钟、离心 前一般看不到r n a 沉淀，在管的底或边上形成凝胶球。 r n a 冲洗移走上清液，用至少l m l 7 5 的乙醇洗涤沉淀一次，通过沃旋混合样品，然后 7 5 0 0 9 、2 8 度离心5 分钟。 r n a 的再溶解在试验的最后，简单地干燥r n a 沉淀( 空气或真空干燥5 - - 1 0 r a i n ) 不能 完全干燥否则会大大降低r n a 的溶解度。部分溶解的r n a 样品的a 2 6 0 2 s o 1 6 用r n a - f r e e 水或 0 5 的s d s 溶液通过枪头的反复吹打溶解r n a ，在5 5 6 0 度静置1 0 m i t ( 如果r n a 用于酶促反 应，不用s d ，r n a 也可以从新溶解在1 0 0 去离子( d e i o n i z e r d ) 的甲酰胺( f o r m a m i d e ) 里， 保存在- - 7 0 度。 2 2 6 总r n a 的反转录 使用t a k a r a c d n a 合成试剂盒，按说明书上的步骤操作。 2 2 7t - d n a 插入突变体的鉴定 ( 1 ) 基因组d n a 的提取 取一片叶片在e p 管中研磨后，加入8 0 0 u lt eb u f f e r ( 含2 0 0 r a mt r i s c i ，p h 7 4 ，2 5 0 m m n a c i ，2 5 m me d t a ，p h 8 0 ，0 5 s d s ) 摇匀。1 2 0 0 0 t p m 离心1 0 m i n 。将上清转入另一个e p 管 中，加入8 0 0 u l 异丙醇沉淀d n a 。在2 0 放置3 0 m i n 后，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。沉淀用7 5 7 , 醇洗涤，充分干燥后，溶于3 0 u l d d h 2 0 中。 ( 2 ) p c r 鉴定突变体的纯合植株 8 l p5 c c g t c g 茂r b 蛔门 i t r i t a a c c g t 3 r p5 c n 卫b t c c a t g g a g t r c c r aa a t r c3 l b a l5 t g g t r c a c g t a g t g g g c c a t c g 3 p c r 扩增条件如下： 9 4 1r a i n 9 4 c5 m i n 5 8 3 0 si3 0 个循环7 2 1 0 m l n i 7 2 l m i n - j 2 2 8 构建表达载体 2 2 8 1 构建3 5 s ： m x m y b l 载体 高保真酶扩增m 0 4 y b l 基因的c d n a 序列，用p e n t r r m d i r e c t i o n t o p o c l o n i n g k i t 将目的 片断克隆到入门载体上。 9 m x m y b lp c r 产物0 5 t o4 e l s d ts o l u t i o n l u l s t e r i l ew a t e r a d dt oaf i n a lv 0 1 l 1 0 1 eo f 5u l 1 d p ov e c t o r 1u l 通常用1 4 体积即可完成反应； 2 轻柔的混合，室温下温浴3 0 s - - 5 m i n ； 3 放在冰上，将反应液转入大肠杆菌感受态细胞中。 将构建好的p t o p o - - m x m y b l 用e r v p v ui 双酶切，将载体切成线性，与表达载体 p m d c 3 2 等量反应，2 5 ，过夜。反映体系如下： 5 x l r b u f f h1u l 酶m i x1 u l p 1 d p o - 埘耐je c o r v p i2 5 n g p m d c 3 22 5 n g t e b u f f e r ( p h 8 0 ) a d d t 0 5 0 u l 转化 菌p c r 鉴定阳性克隆 提质粒，质粒p c r ，酶切鉴定，测序。 2 , 2 8 2 构建3 5 s ： a t l g t 0 0 g 0 - - e d n a 载体 ( 步骤同2 2 & 1 ) 2 2 8 3 构建3 $ s ：a t l l g t 0 0 0 0 - - d n a 载体 ( 步骤同2 2 8 1 ) 2 2 8 4 构建3 5 s ：m x m y b l 基因的反义表达载体 将p f g c l 0 0 8 和m x m y b l 的p c r 产物分别用a s c i 、b a m hi 双酶切，连接，鉴定，送公 司测序。 2 2 9 大肠杆菌感受态的制备及转化( 热击) 细菌培养从于3 t c 培养1 6 - 2 0 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有1 0 0 m ll b 培养基中。于3 t c 剧烈振摇培养约3 小时( 旋转摇床，3 0 0 转份) 。在无菌条件下将细菌转移到 一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的5 0 m l 聚丙烯管( f a l c o n2 0 7 0 ) 中，在冰上放置1 0 分钟， 使培养物冷却至0 。切记：下述所有步骤均需无菌操作。 集菌于4 用s o r v a u g s 3 转头( 或与其相当的转头) 以4 0 0 0 转，分离心1 0 分钟，以回收细 胞。倒出培养液，将管倒置1 分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。 1 0 中国农业大学硕士论文 材料与方法 制备以1 0 m l 用冰预冷的0 i m o l lc a c l 2 重悬每份沉淀，放置于冰浴上于4 以4 0 0 0 转，分 离心1 0 分钟，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1 分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。每 5 0 m l 初始培养物用2 m l 用冰预冷的0 1 m o l l c a c l 2 重悬每份细胞沉淀。 分装此时可将细胞分成小份，放于7 0 冻存。 转化用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取2 0 0 ul 转移到无菌的微量离心管中， 每管加d n a ( 体积0 0 1 0 u l ，d n ac 0 5 0 n g ) ，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置3 0 分钟。将 管放到预加温到4 2 的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放景9 0 秒，不要摇动试管。快速将管 转移到冰浴中，使细胞冷却1 2 分钟。每管加8 0 0 l soc 培养基( 见附录a ) 。用水溶将培 养基加温至3 7 。c ，然后将管转移到3 7 。c 摇床上，温育4 5 分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗 生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞( 转速不超过2 2 5 转，分) 。铺板。涂菌将平板置于室温直至液体被吸收。 2 2 1 0 大肠杆菌感受态的制备及转化( 电击转化) 挑取宿主菌单菌落，接种于5m 1l b 培养基中，3 7 c 振荡培养过夜。以i ：1 0 0 的比例将菌液接种 至5 0 0 m l l b 培养基中，3 t c 振荡培养1 5 - - 3 小时至o d 6 0 0 n m 为0 4 0 。将培养菌置冰浴1 0 分钟，4 1 c 5 0 0 0r p m 离心1 5 分钟尽量除去培养基，细菌重新悬于5 0 m l 预冷的去离子水配制的1 0 甘油中， 充分洗涤，冰浴2 0 分钟，5 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，再将细菌悬浮于预冷的1 0 的甘油中，离心。重复2 次后将细菌悬浮于适当体积的1 0 的甘油溶液中，使细菌浓度为3x1 0 1 0 m l o 分装于1 5m l 离心 管中，- 7 0 c 保存。为了提高电转感受态细胞的转化效率，制备感受态细胞时需要尽可能保持低温操 作所用离心筒，离心管，溶液等均应预冷处理。 2 2 1 1 大肠杆菌阳性克隆的鉴定 p c r 鉴定 在菌板上挑取单菌落，进p c r 扩增，鉴定目的基因是否克隆至载体上。 l o xb u f f e r l u l d n t p ( 1 0 m m ) o 2 u l 1 h a 0 3 u l 正向引物( 2 0 u m ) 0 1 u l 反向引物( 2 0 u m ) o 1 u l h 2 0 8 3 u l t o t a l 1 0 0 u l 混匀，略离心沉底，按以下循环步骤进行扩增 1 1 9 4 l m i n 9 4 * ( 25 m i n 5 8 c 3 0 s7 2 ( 21 0 m i n 4 保存 7 2 l m i ni 酶切鉴定 根据质粒酶切图、目的片断酶切图谱建立如下酶切反应体系( 2 0 u 1 ) 待酶切质粒2 u l 1 0 xb u f f e r2 u l 内切酶05ul h 2 01 5 5 u 1 混合后放于3 7 。c 水浴2 小时，0 8 ( w ，v ) 琼脂糖凝胶电泳分析。 2 2 1 2 农杆菌感受态的制备及转化 挑取单菌落g v 3 1 0 1 接种至2 m l y e b 液体培养基( r i f 抗性) 中2 8 振荡培养过夜，将过夜 培养物按1 ：5 0 接种于y e b 中2 8 。c ，2 0 0 r p m 培养至0 1 ) 6 0 0 为0 5 左右( 大约6 个小时) ，冰 浴3 0 r a i n ，2 5 l o g ( 5 , o o o r p m ) 离心5 分钟，加入l o m l o