（分析化学专业论文）用于活细胞内金属离子原位成像的研究及应用.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：彳反疋l 导师签字： 。、，t 1 学位论文版权使用授权书 之， 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：弘爻幸 导师签字： 签字日期：2 0 0 9 年 月叫日 签字日期：2 0 0g 年r 月凹日 方 y j妙 夕1_j 山东帅范人学硕i ：学位论义 中文摘要 随着生物化学与分子生物学的发展与各种物理、化学、生物学的研究手段的 应用，使生物体内的化学反应过程逐渐得到阐明。但是，与此同时越来越多的实 验证据表明在试管里研究得到的结果未必就完全反映了活体内的情况。因此，要 真正了解生命，必须了解生物各种活性物质的实时变化。 荧光光谱分析及成像技术由于其方法的灵敏度高、选择性好，在分析化学， 特别是生物分析领域中应用广泛。大多数生物分子本身无荧光或荧光微弱，检测 灵敏度较低，为使之高灵敏地检出，人们用荧光标记试剂或荧光生成试剂与待测 物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，大大降低 检出限。此外，借助于荧光共聚焦成像技术可以绘制活细胞内离子的时空分布。 因此，设计合成对某种金属离子或人体内的其它活性物质有高选择性、灵敏度以 及合适光谱性质的荧光探针，结合荧光成像技术，实时、在线检测细胞内某种金 属离子的浓度变化及在各个区域的分布，探讨各种金属离子在生命活动中所发挥 的作用以及对某种离子缺陷时出现的病理进行研究，实现自由基的生物活体内 ( i nv i v o ) 与直接原位湎s i t u ) 的检测，探索自由基爆发时的致病机理，将为生物 学以及医学的研究提供必要的依据。目前，荧光探针已经被广泛的应用于细胞内 许多物种的检测，如锌离子，超氧自由基，柠檬酸根离子，单线态氧以及一氧化 氮自由基等等。 众所周知，人体内的金属离子在许多生理过程中都发挥着重要的作用。其中， 铜离子是人体的一种必需微量元素，其参与体内许多生化反应，如：维持铁的代 谢平衡；参与细胞内的呼吸；作为辅助因子，参与酶的功能性活动等等。但是， 如果生物体内，有机组织中，以及活细胞内的铜离子稳态水平失调，则可导致严 重的神经变性疾病，包括门凯氏病和肝豆状核变性征，家族性肌萎缩性侧索硬 化，阿尔茨海默病，以及疯牛病等。一方面，适量的铜离子对于生命体起着重 要的作用；另一方面，过量的铜离子有机体有很大的毒害作用。因此，研究铜离 子在生物组织甚至活细胞中的动态原位成像对于阐明其在生理及病理中的作用 非常有意义。 旷也是细胞中一种重要的目标靶分子。众所周知，细胞内的矿浓度变化对细 胞生长，细胞凋亡，钙调控作用，细胞内吞作用，细胞趋化作用以及其它细胞活 动起了重要的调控作用。因此，对活细胞内的p h 变化进行动态检测，进而进行 山东师范人学硕i j 学位论文 相关功能研究，对于认识生命过程及剖析重大疾病发生机制都具有重要意义。 此外，人体内的许多阴离子在生物过程中扮演着十分重要的角色，许多酶的 反应中都需有阴离子参与。氟，是人体必需的微量元素之一，也是有毒有害元素， 缺乏或过量均会引发各种疾病；过量氟对蛋白质和d n a 的合成具有抑制作用， 对动物的造血功能有明显影响，能阻止原卟琳的合成，使血红蛋白减少，从而导 致贫血。高氟还会使与钙、锰、镁、铜、铁、锌等有关酶的活性降低，直接导致 脂肪的利用率下降及糖代谢紊乱，从而影响动物的生长发育。氟离子还能促进自 由基的氧化过程，其含量多少与自由基的生理作用有着重要的关系。迄今，如何 获得对氟离子的专一性的识别以及如何将这种识别转化为检测信号仍是问题的 关键。目前，科研工作者已成功的研制出了多种用于检测环境及饮用水中氟离子 的荧光探针。但是，至今能真正适用于检测活细胞内氟离子水平以及用于细胞内 氟离子荧光成像的荧光探针还未见诸报道。 本论文基于生物体内的金属离子，氢离子以及阴离子，如：氟离子等，与荧 光探针作用导致荧光性质的改变，开展了三方面的工作。 ( 一) 设计并合成了一种基于罗丹明染料的新型荧光探针，能选择性检测模拟生 物体系内的c u 2 + ，实现了对洲2 6 4 7 巨噬细胞中的c u 2 + 荧光成像。 ( 二) 设计并合成了一种基于罗丹明染料的新型荧光探针，该探针对h + 具有非常 高的灵敏度，选择性检测了p h 的变化，并实现了对肝癌细胞中的氢离子的荧光 成像。 ( 三) 提出了一种新型的用于检测生物体内氟离子的荧光探针，描述了它的设计 及合成。 关键词：金属离子氢离子荧光探针氟离子激光共聚焦扫描显微镜 2 山东师范人学颀f ：学位论义 a b s t r a c t 、斫t ht h ep r o g r e s so fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g ya j l dt h eu s i n go f c h e m i s n y ，p h y s i c s 锄db i 0 1 0 9 y ，t h ec o u r s eo fc h e m i c a lr e a c t i o ni no r g 枷s mw a s e l u c i d a t e dg r a d u a l l y b u tm o r ea i l dm o r ee x p 洳e n t a le v i d e r l c e ss u g g e s tt h a tt h e r e s u l t sc i b t a i n e df - r o mt h er e a c t i o no c c u r r e di nt e s tt l i b e sc a n n o tr e n e c tt h ei n s t a n c ei n l i v i n go b je c t s oi ti sn e c e s s a r yt oe x p l o r et h er e a l t i m ec h a n g e so fa c t i v es u b s t a n c e s i no r d e rt oc o m p r e h e i l dt h e1 i f e f 1 u o r e s c e n c ea n a l y s i sa n di i n a 百n gt e c h e n o l o g yw 弱w i d e l yu s e di i l b i o l o 百c a l a 1 1 a l y s i sf i e l db e c a u s eo ft h e i r1 1 i 曲s e n s i t i v 时a n ds e l e c t i v i 哆m o s to f b i o l o 百c a lc e l l s h a v en oo rw e a kn u o r e s c e n c e ，w l l i c hm a l ( et h e i rs e 邶i t i v i t yv e r y1 0 w t h ei n t e r f 打e n c e w 硒l o w e dl a r g e l y f 1 u o r c s c tp r o b ew 勰w i d e l yu s e d 协b i o l o 百c a ls c i e i l c ef i e l d b e c a u s eo fm e i rs p e c i a lp h o t o p h y s i c sa 1 1 dp h o t o c h “c a lc h a r a c t e 璐，1 1 i g l ls e i l s i t i v i 劬 w i d er e s p o n s er 锄g ea n da p p r o 埘a t ec o n d i t i o n s ow en e e dt 0d e s i 印a i l ds ) ，i l t h e s i z e n u o r e s c e l l c ep r o b ew i m 印p r o p r i a t es p e c 仃i 】l l lc h a r a c t e r t h 饥w e 懿| p l o r et h ep r o p e r t y i l lc h 肌i c a lc i r c u m s t a n c ea n db yh l t e 酉a t i n gw i t l ln u o r e s c e n c e i l i l a g i l 玛t e c l l l l o l o g yt 0 d e t e c t l ec o n c e n 仃a t i o nc h a l l g e so fm e t a li o n s 肌dm ed i s t r i b u t i o ni nc e l l0 nl i n e w e t l l c i le x p l o r e dt h e 如n c t i o no fm e t a li o l l si nl i f ca c t i v i t y 觚dp a m 0 1 0 9 ) ，o f l es h o m l e s s o fm e t a l i o n st 0a c h i e v et t l cd e t e c t i o no fr e a c t i v e0 x y g 朗s p e c i e si nv i v oa n di i ls i t u ， e x p l o r et h ep a 1 0 1 0 9 yo fr c a c t i v eo x y g e l ls p e c i e sb l l r s t ，w h i c hw i l la f r o r de s s e n t i a l b 弱i sf o r b i o l o g ) ，锄dm e d i c i n es t u d y ， t a c em e t a li o n si i lo r g a m s m sp l a ye s s e n t i a lr o l e si nm 趾l yb i o l o 舀c a lp m c e s s e s a m o n gm e m ，r e d o x a c t i v ec o p p e ri o ni sac m c i a le l 锄e n ti 1 1e r 屹y m e 舢【1 c t i o n s 锄d 衄塔c r i p t i o n a l e v e n t s a na l t e r a t i o no f 证仃a c e l l u l a rc o p p e ri o nh o m e o s t 嬲i si s c o 衄e c t e dt ov a d o u sn e u r o d e g e l l c r a t i v e d i s e 舔e s ，i n c l u d i n gm e l l l 【e s a n dw i l s o n d i s e 嬲e s ，f 锄i l i a l 锄y o 押o p i cl a t e r a ls c l e r o s i s ，a k h e i m e r sd i s e a s e ，a n dp r i o nd i s e a u s e ，r h u s ，o no n eh a i l d ，a p p r o p d a t el e v e lo fc 十i si i i l p o n a n tf o r l i 魑0 nt h eo t h e rh a l l d ， e x c e s s i v ec u 。2 + i sl l i 曲l yt o x i ct 0o 唱枷s m s f 0 rt h e s er e a s o i l s ，t h eq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o no fi n 仃a c e l l u l a rc 矿i so fg r e a ti m p o r t 觚c ef o re l u c i d a t i n gm cc o m p l e x p h y s i o l o 百c a la n dp a t h 0 1 0 西c a lr o l e so fc o p p 瓯 p r o t o n sa r eo n eo fm em o s ti m p o n a n tt a 玛e t s 锄o n gm ei i l 咖c e l l u l a rs p e c i e so f i n t e r c s t ，弱i ti sw e l l - k n o 帅m a tm t r a c e l l u l a rp hp l a y sac e n t r a lr o l ei nm a n yc e l l u l a r e v e n t ss u c ha sc e l l 伊。叭h ，c a l c i 啪r e g u l a t i o n ，e n d o c ”o s i s ，c h e m o t a x i s ，c e l la d h e s i o n ， 锄do t h e rc e l l u l a rp r o c e s s e s t h u s ，i tw o u l db ee x t r e m e l yd e s i r a b l et oh a v ea c c e s st oa 3 山东师范人学硕i ：学位论文 b r o a dv 撕e t yo f “a c i d i c p r o b e s w i t hh i 曲s e n s i t i v i t y 锄ds e l e c t i v i t y 9 0 0 d p h o t o s t a b i li t ya n dm e m b r a n e p e 肿e a b l e ha d d i t i o n ，a i l i o n sp r e s e n t 证t h eh 啪a nb o d y ，p l a ye s s e n t i a lr o l e si nm a i l y b i 0 1 0 百c a lp r o c e s s e s p a n i c u l a r l y ，n u o r i d ei si n d i s p e n s a _ b l e 仃a c ee l 锄e n ti 1 1c r e a t u r e v i t a la c t i v i t y t h ee f f e c to ff l u o r i d eo nh u m a n sh a sad u a lr 0 1 e 弱a 1 1e s s e i l t i a le l 锄e n t a n da tl l i g h1 e v e l s 勰at o x i cs u b s t a n c e e x c e s sn u o r i d ei o nr e s u l t si 1 1f l u o r o s i s 锄d r 朗a l ，g a s t r o i n t e s t i n a la n di m m u n o l o 百c a lt o x i c i t y t h u s ，t h ep r o c e s so fq u 锄t i f 弭n g 仃a c en u o r i d ea l l i o nw i t m n b i o l o 百c a ls 锄p l e s ， e l u c i d a t i o no ft h e c 0 l p l e x p h y s i 0 1 0 西c a la n dp a t h o l o 百c a lr o l e sp r 0 v i d em o t i v a t i o nf o rd e v e l o p 访gn e ww a y st 0 s t u d yd y n 锄i cn u o d d ec h e i i l i s 仃yi n1 i v i n gs y s t e m s u pt 0i l o 、，t l l e r ei sn 0s m a n m 0 1 e c u l e sh a v ee v e rb e e l la v a i l a b l ef o rd e t e c t i o n 肌di i i l a g i n gn u o r i d ei nl i 、r i n g b i o l o 西c a ls y s t e m s b 嬲e do nt h ec h a i l g e si ns p e c t l l l mc h a r a c t e r so f l en u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i i 培w i t l l m e t a li o n s ，p m t o n s 锄df l u o r i d e ，w el 谢v ec a r r i e do u tt 1 1 r e e 嬲p e c t so f i l e s t i g a t i o n ： f i r s t ，w ed e s i 印e da 1 1 ds y i l m e s i z e dan o v e ln u o r e s c e n c ep r o b eb 嬲e do nr h o d 锄i n e d y e sf o rc 一+ a n do p t i i l l i z e dt h ed e t e c t i n gc o n d i t i o n t h er e a c t i o nm e c h a i l i s m 、v 嬲 s t u d i e d 锄dt h ep r o p o s e dm e m o d sw e r et l l e l la p p l i e dt 0d e t e 衄i n ec u 2 十i ni 乙气：、2 6 4 7 m a c r o p h a g e s s e c o n d ，d e s i 印e da 1 1 ds y n m e s i z e da i la c i d i cn u o r e s c e n tp r o b eb 弱e do nf h o d 锄i n e d y e sf o r 矿砌o p t i m i z e dt l l ed e t e c t 啦c o n d i t i o n 皿er e a c t i o nm e c h a l l i s m 、懈 s t u d i e d 锄d l ep r o p o s e dm e t l l o d sw e r ct h e i l 印p l i e dt 0d e t e m l i n e 矿i nh 印c 挖c e l l s t h i r d ，m e s ep 印e r sp r e s e n t e dt l l es y n t h e s i san c - wn u o r e s c e i l tp r o b e 趾d 鹊s 啪em e p r o b ec a l ld e t e c tf l u o r i d e 证a q u e o u ss o l u t i o l l s k e yw o r d s ：m e t a l i o n s ，p r o t o n s ，f l u o r e s c e n c ep r o b e ，a n a l y t i c a lm e t h o d ，n u o r i d e c a t e 9 0 d ，n 邶曲e r ：0 6 5 7 3 4 山东师范人学硕i j 学位论义 第一章绪论 生命活动是许多具有生物活性的物质参与各种化学反应的总结果，人体内的 微量金属元素就是其中非常重要的一种。虽然微量金属离子在人体内的含量很 少，但其在生命科学中占有重要的地位，没有它们，人们也就不能健康地继续生 存。因为有些微量金属元素是酶的组成成分，它们可以使酶更好的发挥催化作用， 使体内生化反应显著加速，甚至缩短几万至几十万倍，使那些本来在自然条件下 需要极高温度才能进行的生化反应，能在体温的条件下顺利进行；有些微量金属 元素是调节人体重要生理功能的激素或维生素的组成成份，没有这些微量元素， 激素或维生素就起不了作用。现在认为人体必需微量金属元素有下列1 0 种：锌、 铁、铜、钒、铬、锰、钴、镍、钼、锡，各种微量金属在生命体内各自起着不同 的作用。 铜在人体内的主要作用是进行氧化还原反应，在生物系统中起着独特的催化 剂，参与造血过程和及铁的代谢，参与一些酶的合成和黑色素合成。此外，铜还是 许多细胞液，线粒体以及具有生理功能的酶保持其活性所必需的【1 1 ，但是一些不 可控的铜离子与氧和活性氧的反应也能导致对蛋白质，核酸，以及脂的损伤【2 。5 1 。 如果生物体内，有机组织以及活细胞内的铜离子稳态水平失调，则可导致严重的 神经变性疾病，包括门凯氏病和肝豆状核变性征【锄】，家族性肌萎缩性侧索硬化 【2 ，3 】，阿尔茨海默病【4 1 ，以及疯牛病掣5 1 。锌是构成多种蛋白质分子的必需元素。 人体内含锌量为1 4 2 4g ，在各类金属酶中，对锌酶的研究最为详尽。目前已发 现的锌酶有数百种，它们参与糖类、脂类、蛋白质和核酸的合成与降解等代谢过 程。近来还发现锌酶可以控制生物遗传物质的复制、转录与翻译。微量元素锌虽 然是生命过程中不可缺少的元素，如缺锌时可引起人体免疫缺陷，但如果锌过量 也易成慢性锌中毒，主要表现为顽固性贫血，食欲不振，血红蛋白含量降低，血清 铁及体内铁贮存减少；f e 是人体中最丰富的金属，一般人含铁4 2 6 1g ，各种各 样的代谢活性分子中都含有铁。在哺乳动物中，7 0 的f e 是以卟啉配合物的形式 存在的。如血红蛋白、肌红蛋白等。把氧气从肺部输送到组织中去靠血红蛋白和 肌红蛋白的共同作用。血红蛋白负责把0 2 从空气中提取出来，并从肺部输送到肌 肉组织，转交给肌红蛋白。微量元素铁虽然是人体很重要的元素，但只要不偏食， 成人一般不会缺铁，并且体内积聚过多，将会适得其反，微量元素铁过剩将表现为： 山东师范人学硕l ：学位论文 血色素沉着，肝脾肿大，肝硬化，性机能下降，免疫功能低下；铜化合物有毒，但微 量铜是必需元素。钴对铁的代谢，血红蛋白的合成和红细胞的发育成熟等有重要 作用。钴的主要功用是作为维生素b 的必需组分。每立方米血液中只含有2 1 0 一4 g 的维生素b 1 2 。维生素b 1 2 完全依赖于食物，b 1 2 以及它的衍生物都是钴的配合物， 维生素b 1 2 可以治疗恶性贫血症。它们参与d n a 和血红蛋白的合成、氨基酸的代 谢等生化反应，在c 0 2 + 和c 0 3 + 配合物之间起电子传递作用；钼以m 0 0 4 2 的形式存 在于生命体系中，钼是人体多种酶的重要成分，对细胞内电子的传递、氧化代谢有 作用；c ，是胰岛素参与作用的糖代谢和脂肪代谢过程所必需的元素，也是正常 胆固醇代谢的必需元素。精制食物造成铬的损失，缺铬后血脂和胆固醇含量增加， 糖耐受量受损，严重时出现糖尿病和动脉硬化；锰是丙酮酸羟化酶、超氧化物歧 化酶( s o d ) 、精氨酸酶等的组成成分，对动物的生长、发育、繁殖和内分泌有 影响。锰在人体中具有促进细胞内脂肪的氧化作用，减少肝脏内脂肪的含量，促进 胆固醇的合成。成人缺锰时，常出现食欲不振，体重下降，性机能障碍，人体内锰过 量，会影响体内氧化还原和水解过程，主要作用于神经系统。可见微量金属元素在 生命化学中扮演重要角色，各种必需微量金属元素在人体内都有一定的浓度范围， 过量或缺乏都对机体有害。 酸碱平衡对维持细胞的生理学特性有非常重要的作用。在酸性的p h 条件下， 许多细胞反应的水平都降低了，如膜关联的酶反应、离子转运、蛋白和d n a 的 合成和钙离子水平等。如果适当地改变感染和炎症部位微环境的p h ，可以调节 免疫细胞的功能炎症发生的一个典型特征是炎症部位出现酸化。另外，肿瘤和脓 肿的组织液p h 值一般小于6 0 2 。酸性的声环境会抑制免疫细胞的功能如中性粒细 胞0 0 1 y i l l o 叩h o n u c l e a n l eu 仃d p l l i l ，p m 的呼吸爆发。因此，h + 作为细胞中一种 重要的目标靶分子，其浓度变化对细胞生长【9 1 ，细胞凋亡【1 们，钙调控作 用【1 1 1 ，细胞内吞作用【12 1 ，细胞趋化13 】作用以及其它细胞活动【1 4 1 6 1 起了 重要的调控作用。进入2 0 世纪9 0 年代，由于细胞凋亡的特殊生物学意义， 细胞凋亡的研究手段再次引发了发育生物学、细胞生物学、免疫学、分 子生物学、肿瘤学和老年学研究者的广泛兴趣，形成了一个新的研究热 点。由于各种物理和化学刺激诱导的细胞凋亡都同时出现细胞内酸化， 这种细胞酸化与细胞凋亡之间的关系就成为人们关注的热点，阐明两者 之间的关系无论对于细胞生长机制或是对于用药物干预细胞内p h 进而 6 山东帅范人学硕i ：学位论义 影响细胞凋亡都具有重要意义。 此外，人体的各种疾病也与体内各种元素的平衡失调密切相关。微量元素对 生命起着重要的调控作用。氟是人体必需的微量元素之一，对生长发育、骨骼代 谢等都有重要的影响。人体摄入适量的氟有益于身体健康：有利于牙齿硬组织的 形成和骨钙的沉积，有利于人体对钙和磷的吸收，加速骨骼的形成，增强牙齿的 抗龋能力。还可以改善其甲状腺、胰腺、肾上腺、性腺等的内分泌功能，从而使 各种脏器和器官免受损伤，对生长发育和繁殖意义重大。但摄氟过量会导致氟中 毒：对细胞膜和原生质均有毒害作用，对蛋白质和d n a 的合成具有抑制作用，对 动物的造血功能有明显影响，能阻止原卟琳的合成，使血红蛋白减少，从而导致 贫血。高氟还会使与钙、锰、镁、铜、铁、锌等有关酶的活性降低，直接导致脂 肪的利用率下降及糖代谢紊乱，从而影响动物的生长发育，使生产性能下降。氟 离子还能影响细胞氧化过程，促进自由基氧化。因此，氟离子的含量多少与自由 基的生理作用也有着重要的关联。目前，科研工作者已成功的研制出了多种用于 检测环境及饮用水中氟离子的荧光探针。这些探针主要是基于氟离子与探针分子 的特异性结合，如尿素或吡咯基团中的n h 与f 一间的氢键作用或者氟与硼以及硅 原子之间的强烈的亲和作用。借助于这种结合作用所导致的明显光谱变化，氟离 子可被选择性地检测。但是，至今真正能适用于检测活细胞内氟离子以及用于细 胞内氟离子荧光成像的荧光探针还未见诸报道。 随着金属离子，氢离子以及氟离子等生物活性物质对生物体的作用逐步获得 公认，人们也投入了大量精力研究他们的识别问题，对其检测已不再仅仅局限于 化学和模拟生物体系内，而更多的转向对它们的生成机制，生理作用及其动态损 伤生物机体的过程的研究。目前测定他们的方法主要有电子自旋共振法( e s r ) ， 或电子顺磁共振法( e p r ) 【1 7 18 1 、高效液相色谱法( 珈? l c ) 【1 9 l 、化学发光法( c l ) 【2 0 2 、荧光法【2 2 ，2 3 1 电化学方法【2 牝7 1 等。在上述方法中，荧光法不仅简单易 行，便于操作，具有高灵敏度、高选择性的特点，更加吸引人的是探针分子可以 在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的金属离子、氢离子或者氟离 子结合生成强荧光物质，并通过借助于激光共聚焦成像技术，实现细胞内待测活 性物质的“可视化”，从而对他们在生命体内进行“实时在线 的检测。近年来， 生物成像在活细胞的生物分子检测上取得了巨大进展，而荧光探针由于具有高灵 敏度，实时监测等优点而也成为生物成像最主要的工具。 7 山东帅范人学硕i j 学位论文 2 0 0 6 年c h r i s t o p h e rj c h a n g 等人设计合成了基于光诱导电子转移( p e t ) 的一 种新型荧光探针，探针选择性络合一价铜离子后而抑制了p e t 的发生，并伴随荧 光的增强，从而实现了对细胞内一价铜离子的定量检测2 8 ，2 9 1 。2 0 0 5 年j i n s m l gt a e 等人设计并合成了一种测定汞离子的探针。探针是基于罗丹明染料一种闭环( 无 荧光) 与开环结构( 强荧光) 的转化，探针本身是一种无荧光的闭环结构，当加 入汞离子后，汞离子催化反应使探针转化为强荧光的开环结构【3 们。该课题组并 在2 0 0 6 年将该探针应用到细胞及生物活体中，成功实现了细胞内及生物活体中汞 离子的检测【3 l 】。2 0 0 7 年x i a o j u i lp e l l g 等人设计合成了一种测定细胞内c d 2 + 。该探 针的检测机理是基于i c t 机理，当c d 2 + 存在时，抑制了探针分子内供体和受体之 间发生电子转移( e t ) ，随即可以观察到荧光显著增强的现象，此探针成功运 用于细胞内c d 2 + 的测赳3 2 1 。2 0 0 6 年n a g a i l o ，t 。课题组设计合成了一种近红外的 荧光探针用于检测锌离子【3 3 】。该荧光探针的激发和发射波长均处6 5 0 9 0 0 n m 的近 红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质( 如组织) 的光散射大大 降低，激发光的穿透性更大，因而自发荧光的背景干扰大大降低，使之更适用于 生物活体的检测。同年本课题组设计合成了选择性测定细胞内锌离子的近红外荧 光探针d p a c y ，探针自身不发荧光，当与锌离子结合后，产生强烈荧光。探针 加入锌离子的小鼠巨噬细胞，获得细胞的荧光显微成像，证实了探针对锌离子的 选择性识别作用【3 4 】。f r 觚c i s c og a l i i l d 0 ，课题组设计合成了一类检测细胞内氢离子 的探针【3 5 】，探针基于光诱导电子转移而产生荧光变化，检测范围4 0 6 5 ，这对于 检测细胞内酸性器官具有极大的价值。2 0 0 8 年b o n gr a ec h o 等人设计合成了双光 子探针a h l ，a h 2 ，a n da l l 实现了细胞内酸性组织及酸性器官的检测【3 6 】。但是目 前检测氢离子的探针在灵敏度及抗光漂白性妨还做的不够，这也影响此类探针在 生物活体中的应用。 oo gr h 9 近年来，科研工作者也成功的研制出了多种用于检测环境及饮用水中氟离子 矿u r 必 山东帅范人学硕l 学位论文 的荧光探针，2 0 0 3 年e u nj i nc h o 等设计合成了一种萘尿衍生物作为氟离子检测荧 光探针，检测机理是基于氟与尿素基团中的n h 与f 问的氢键作用伴随着荧光增 强现象来对f 一进行识别【3 7 1 。2 0 0 5 年z h u 等设计合成了一种花菁硅醚类新型荧 光探针，该荧光探针基于氟离子引起的羟基去保护原理，适用于检测水溶液中的 氟离子含量【3 8 】。2 0 0 6 年s w 锄y 等设计合成了一种荧光素的硼酸类衍生物荧光探 针，也成功的检测到有机相中微摩尔级的氟离子【3 9 】。但是到目前为止，还没有 能适用于检测活细胞内氟离子水平以及用于氟离子荧光成像的荧光探针见诸报 j 上 逼。 至今，本实验室已经基于多种荧光染料如罗丹明、荧光素、萘荧光素、花菁 等基础上合成了多个系列适用于生命体内金属离子，氢离子，活性氧以及阴子的 检测和荧光成像分析的可见一近红外分子荧光探针，通过将荧光检测技术与激光 共聚焦显微成像技术结合，实现了对活体细胞内金属离子等活性物质的实时、在 线检测。并成功地拍摄了探针与上述活性物质结合后的细胞显微荧光照片。根据 实验结果阐述复杂生命体内自由基的产生部位、作用机制和致病机理：某些离子 的代谢、转化、和致病原因，为新型药物的开发、实现某些重大疾病的早期诊断 和预防，基因表达，基因诊断等将具有重要的指导意义。 + 一 参考文献 【1 l i n d m c ；h a z e 曲一a z 锄，m 彳小z 鳓栉m 虮1 9 9 6 ，甜，7 9 7 s 一8 1 1 s 【2 v a l e n t i n e ，j s ；h a n ，p j p r d c 口珐彳c 口正- 趾tu & 4 2 0 0 3 ，j d d ，3 6 1 7 - 3 6 2 2 【3 】b m i j n ，l i ；m i l l c r ，t m ；c l e v e l 锄d ，d w 爿刀疗“尺p v 盹“，c f 2 0 0 4 ，2 7 ， 7 2 3 7 4 9 【4 b 锄h 锄，k j ；m a s t e r s ，c l ；b u s h ，a i 口六尺w d 嘴d 括c d v p 砂2 0 0 4 ，3 ， 2 0 5 2 1 4 【5 】b r o w n ，d r ；k 0 2 1 0 w s k j ，h 眈加以胁刀j 2 0 0 4 ，1 9 0 7 1 9 1 7 【6 】w a g g o n e r ，d j ；b 砒n i k 雒，t b ；g i t l i n ，j d 概，d 6 f d 正d 括既s p1 9 9 9 ，瓯 2 2 1 2 3 0 【7 v u l p e ，c ；l e v i n s o n ，b ；w 1 1 i t l l e y ，s ；p a c k m 觚，s ；g i t s c l l i e r ，j 口丘g 朗以1 9 9 3 ， 3 ，7 - 1 3 8 】b u l l ，p c ；t h o m a s ，g r ；r o m m e n s ，j m ；f o r b e s ，j r ；c o x ，d w 口丘g 铡p f 1 9 9 3 ，歹，3 2 7 3 3 7 9 】m a n i n e z - z a g u i l l nr ；g i l l i e sr j ；( 名盯伽f d zb f d c 办p 聊1 9 9 6 ，6 ，16 9 18 4 9 山东师范人学硕i j 学位论文 【1 0 】s a t o hh ；h a y a s h ih ；k a t o hh ；t e r a d ah ；k o b a y a s h ia 彳朋，p 枷f d ，胁口刀 c f 彤p 枷f d ，1 9 9 5 ，3 7 ，h 1 2 3 9 - h 1 2 4 8 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