（植物病理学专业论文）链霉菌F1013的种类鉴定及其生理活性分析.pdf

独创。陛声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研 究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方 外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志， 都在论文中作了明确的说明并表示了谓 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人 承担应有的责任。 者亲许褥嗍：弦 7 ) 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有权 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 论文作 指导教师亲笔签名： 同期：加d 占p 占、，c 7 同期：彦仇移彩夕 塑鲨坐塑查堂堕! ：堂垡堕壅 塑望 一 链霉菌f 1 0 1 3 的种类鉴定及其生理活性分析 摘要 对分离自海洋虾壳的菌株链霉菌f 一1 叭3 进行形态学特征、培养性状、生理 生化特征分析及1 6 sr d n a 序列分析，该菌株的孢子丝呈螺旋状，孢子圆形、长 圆形或卵圆形，表面光滑；基丝较直，平缓，有较多细小分枝；在察氏培养基、 p s a 培养基、黄豆粉培养基和s 培养基上气丝丰富，在c m a 培养基上生长一般， 在甘油精氨酸琼脂培养基上生长弱；该菌能分解纤维素、水解淀粉、使牛奶凝固 及胨化、能产生硫化氢、不能利用酪氨酸产生色素，能较好地利用阶乳糖、麦芽糖、 d 果糖和肌醇、d 木糖、甘油、甘露醇和葡萄糖等，不利用蔗帮豁口乙酸钠。链霉菌f - 1 0 1 3 的上述特征与玫瑰黄链霉菌( s t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u sa r a i ，1 9 5 1 ) 的特征相吻合。 对菌株f - 1 0 1 31 6 sr d n a 测序并进行聚类分析，结果表明该菌与玫瑰黄链霉菌 1 6 sr d n a 序列的相似性达到了9 9 9 3 ，二者的1 2 0 b p 吖可变区序列完全相同。 根据形态学特征、培养性状、生理生化分析及1 6 sr d n a 序列测定结果，将链霉 菌f 1 0 1 3 鉴定为玫瑰黄链霉菌f - 1 0 1 3 ( s t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u sf - 1 0 1 3 ) 。 链霉菌f 1 0 1 3 在p h 8 9 、5 的虾壳粉培养液中发酵5 - 7 d ，甲壳低聚糖含量 达到o 3m g m l ，产菌量优于其它基质的培养基。利用链霉菌f - 1 0 1 3 虾壳发酵液 进行抑菌实验，该菌对炭疽菌( c o i l e t o t r i c h u ms p ) 、水稻纹枯病菌( r h i z o e t o n i a s o l a n i ) 、香蕉枯萎病菌( f u s a r i u mo x y s p o r u mf s p ) 等植物病原真菌有明显的抑 制作用，平板测定结果表明，对以上3 种植物病原真菌的抑菌率分别达到1 0 0 、 9 6 3 、9 4 7 。 用链霉菌f - 1 0 1 3 虾粉发酵液处理黄瓜种子，对黄瓜幼苗具有促生和诱导几 丁质酶活力的能力。与对照相比，发芽率、平均幼苗长度分别提高了2 8 5 、 8 3 3 ，幼苗总鲜重达到对照的2 - 3 倍；几丁质酶活力达到7 0 0 u ，为对照的9 ，8 倍。 关键词：链霉菌f - 1 0 1 3 、分类鉴定、生理活性、培养基 福建农林大学硕i ：学位论文 摘要 i d e n t i f i c a t i o no f s t r e p t o m y c e ss p f 一1 0 1 3a n da n a l y s i so fi t s p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s a b s t r a e t t h em o r p h o l o g i c a l ，c u l t u r a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s t r a i ns t r e p t o m y c e sf 一1 0 1 3w h i c hw a si s o l a t e df r o mt h es h e l lo fs h r i m pw e r e a n a l y z e d ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea e r i a lh y p h a eo f s t r e p t o m y c e sf - 1 0 1 3p r e s e n t e d s p i r a lf o r m ，t h es p o r ew a sr o u n do re l l i p s ea n di t ss u r f a c ew a ss m o o t h ；t h es u b s t r a t e m y c e l i aw a ss t r a i g h ta n dh a dm a n yd i v a r i c a t i o n t h es t r a i nf - 1 0 1 3g r e wb l o o mo n c z a p e k sm e d i u m ，p s a ，s o y b e a nm e d i u ma n dsm e d i u m ，g r e wg e n e r a l l yo nc m a a n df e e b l yo ng l y c e r o l a r g i n i n ea g a rm e d i u m s t r e p t o m y c e sf - 1 0 1 3c o u l du t i l i z e c e l l u l o s e ，h y d r o l y z eo fs t a r c h ，c o a g u l a t ea n dp e p t o n i z em i l ka n dp r o d u c eh 2 se t c ，b u t c o u l dn o tp r o d u c ep i g m e n t sb ym a k i n gu s eo ft y r o s i n e s t r e p t o m y c e sf - 1 0 1 3c o u l d u t i l i z ec 【- l a c t o s e ，m a l t o s e ，d f r u c t o s e ，l - i n o s i t o l ，d x y l o s e ，g l y c e r o l ，d m a n n i t o la n d g l u c o s e ，b u tc o u l dn o tu t i l i z es u c r o s ea n ds o d i u m a l lt h e s ec h a r a c t e r i s t i c sw e r ev e r y s i m i l a rt ot h o s eo fs t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u sa r a i ，19 51 i na d d i t i o n ，16 sr d n a s e q u e n c ei n d i c a t e dt h a ts l r e p t o m y c e sf - 1 0 1 3a n ds t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u sh a st h e i d e n t i t yo f 9 9 9 3 a n do f1 0 0 b e t w e e nt h e1 2 0 b p tr e g i o n so f1 6 sr d n ao f t h et w o s t r a i n s a c c o r d i n g l y , s t r e p t o m y c e sf - 1 0 1 3i d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u s f 1 0 1 3 c o n t r a s t i n gw i t ho t h e rf e r m e n t a t i o nl i q u o r , b ya d j u s t i n gp h 8 - 9a n df e r m e n t i n g5 - 7 d a y s ，t h es h r i m pf e r m e n t a t i o nl i q u o rw a st h eb e s to fa l li nt h ea b i l i t yo fp r o d u c i n g g e r ma n dc h j t o s a n ，t h es o l u b l ec h i t o s a nc o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c ho 3 m g m l t h e e x p e r i m e n to fa n t a g o n i s t i ce f f e c ta g a i n s tp l a n tp a t h o g e n i cf u n g ii n d i c a t e dt h a ts h r i m p f e r m e n t a t i o no fs t r e p t o m y c e sr o s e o f l a v u sf - 1 0 1 3h a dd i s t i n c t a n t a g o n i s t i ce f f e c t a g a i n s tp l a n tp a t h o g e n i cf u n g is u c h a sc o l l e t o t r i c h u m s p ，r h i z o c t o n i as o n n i ， f u s a r i u mo x y s p o r u mf s p t h ea n t a g o n i s t i cr a t ec o u l dr e a c h10 0 9 6 3 a n d9 4 7 2 福建农林大学砸l 学位论文 摘要 r e s p e c t i v e l y c u c u m b e rs e e d sw e r et r e a t e dw i t hs h r i m pf e r m e n t a t i o no fs t r e p t o m y c e s r o s e 卵d v “sf - 1 0 1 3 ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nl i q u o rh a dp h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e so fp r o m o t i n gg r o w t ha n di n d u c t i n gc h i t i n a s er e s p o n s e c o m p a r e dw i t h b l a n k t h eg e r m i n a t i o nr a t ea n da v e r a g el e n g t ho fs e e d l i n gw e r ei n c r e a s e d2 8 5 a n d 8 3 3 r e s p e c t i v e l y , t h et r e a t e ds e e d l i n gw a s2 3t i m e st h ew e i g h ta sb l a n k ；c h i t i n a s e a c t i v i t yr e a c h e d7 0 o u ，9 8t i m e st h ea c t i v i t ya sb l a n k k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e s ，i d e n t i f i c a t i o n ，p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s ， c u l t i v a t e m e d j l a m 福建农林人学瑚卜学位论文第一章综述 第一章综述 1 链霉菌的分类地位 链霉菌在分类学上属于放线菌纲( a c t i n o b a c t e r i a ) 放线细菌亚纲 ( a c t i n o b a c t e r i d a e ) 放线菌目( a c t i n o m y c e t a l e s ) 放线菌亚目( s t r e p t o m y c i n e a e ) 链霉菌科( s t r e p t o m y c e t a c e a e ) 链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 。 链霉菌属是放线菌类中种类最多而且产生抗生素种类也最多的一个属，至今 已有一千种左右。链霉菌的孢子丝发育良好，常为直、柔曲、初旋或螺旋形 ”。 链霉菌共分为1 2 个类群，如粉红孢类群、白孢类群、黄色类群、青色类群等等。 1 9 6 3 年，随着国际链霉菌计划( i n t e r n a t i o n a ls t r e p t o m y c e sp r o j e c t ，i s p ) 的实 施，链霉菌的分类取得很大进展，至1 9 9 6 年发表有效种4 6 4 个、亚种4 5 个。 我国从二十世纪5 0 年代起，由于抗生素工业发展的需要，开始了资源调查和分 类鉴定工作，据统计，我国学者用中文描述发表的键霉菌已多达1 8 7 种【3 】。 2 链霉菌的分类研究进展 自从w a k s m a n 和h e n r i c 于1 9 4 3 年建立链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 以来，链霉菌已 成为细菌域中种的数量最大的一个属。由于链霉菌是产生抗生素等生物活性物质 种类最多的一类微生物，至今各国学者仍在不断研究设计新的分离、培养、鉴定 和分类方法，以指导新的天然生物活性物质的寻找。通过表观型建立的分类系统 存在一定的局限性，已不能完全客观地反映链霉菌的自然分类关系。 二十世纪7 0 年代化学分类( c h e m o t a x o n o m y ) $ n 8 0 年代分子分类( m o l e c u l a r t a x o n o m y ) 的发展，为分类学研究注入了新的活力。现在链霉菌分类学发展成为 把传统的表型分类( 形态和生理生化特征) 、数值分类、化学分类和分子分类等 各种信息综合考虑，来确定菌株的分类地位的多相分类( p o l y p h a s i ct a x o n o m y ) 。 多相分类被认为是目前研究各级分类单位的最有效手段，能更客观地反映生物问 的系统进化关系。 2 1 早期的形态分类 2 1 1 形态特征 主要包括基内菌丝体的发育程度，是否断裂，有无气生菌丝体和孢子、孢 囊、菌核以及其它结构，此外还要说明孢子链、孢子、孢囊、孢囊孢子的形状、 福建农林大学硕 学位论义 第一章综述 大小、数目等；各类繁殖小体是否有能游动的鞭毛以及鞭毛的位置”1 。 2 i 2 培养性状 放线菌分类中基丝和生孢子气丝的颜色一向受到重视，- - - - 1 廿幺7 6 0 年代后 期到7 0 年代初发表的国际链霉菌计划( i s p ) 试验结果也是以生孢子气丝颜色为 主，基丝和可溶色素的颜色为辅，新增加的色素对酸碱度是否敏感的方法，极具 鉴别价值t ”。中科院微生物所1 9 7 5 年出版的链霉菌鉴定手册一书中也是根据 基丝和气丝的颜色特征对链霉菌进行分群【5 j 。 2 1 3 生化生化分析 在链霉菌属各个种的鉴定中，所测定的生化指标包括酶的种类及其活性测 定，如明胶液化、牛奶凝固和胨化、淀粉水解、纤维素分解或在其上生长、硝酸 盐还原等。国际链霉菌计划规定用胰胨酵母精培养液测定产生类黑色素的能力； 用酪氨酸琼脂测定是否产生酪氨酸酶；用蛋白胨酵母精铁琼脂测定是否产生硫化 氢，但这三者的反应时常并非总是一致的。除此之外，对于各种碳源的利用逐渐 成为必不可少的测定项目。 2 1 4 生态条件 主要是好气与嫌气、腐生与寄生、中温与嗜热( 少数嗜低温) 以及对酸碱度 ( p h ) 的要求等。绝大部分放线菌都是中温、好气、腐生的，其中几种链霉菌能够 寄生在植物上。 2 2 数值分类 数值分类( n u m e r i c a lc l a s s i f i c a t i o n ) 是通过计算分析大量的特征( 5 0 ) ，计算 出相似值来考察菌株间的相互关系，它是建立在计算机应用上的一种分类方法。 链霉菌数值分类的应用最早是在1 9 6 2 年，g i l a r d i 等报道了以大量特征进行数 值分类研究，并把结果编算成概率鉴定特征表。此后有大量的数值分类报道，但 这些研究所用的特征都相对有限。直到八十年代，随着计算机的普及和性能的提 高，数值分类才得到了实际运用。通过数值分类研究，链霉菌混乱的分类系统得 到了清理，并趋于客观。但特征选择、实验误差、统计方法的差异及菌株的不稳 定均会影响数值分类的结果。同时，用概率矩阵方法鉴定链霉菌所需的最少实验 数仍然很大，且不能在同一矩阵中鉴定大、小和单株群，是一项费时费力的工 作其结果有时也非常难以解释吼 福建农林人学硕_ ：学位论文第一章综述 2 3 化学分类研究 放线菌化学分类系统是研究放线菌细胞的不同化学特性，并利用这些特性对 它们进行分类与鉴定。用作分类指征的特异性生化学组分包括细胞壁化学组分、 醌、磷酸类脂、枝菌酸、脂肪酸等。从2 0 世纪6 0 年代初期开始，l e c h e v a l i e r 等放 线菌分类学家进行了放线菌化学分类学的研究，建立了一整套放线菌细胞化学分 析方法，使放线菌分类学的内容从表观水平深入到了细胞水平，从而使放线菌分 类进入了化学分类( c h e m o t a x o n o l o g y ) 期。从7 0 年代开始，这些化学分类技术被 各国放线菌分类学家所采纳吼 从二十世纪6 0 年代至8 0 年代，经过2 0 年的发展，已形成一套完整的化学分类 方法，它与传统分类学、分子分类学的方法相结合来鉴别放线菌的属种，已广泛 用于放线菌分类学研究”。 2 4 分子分类研究 s t a c k e b r a n d t 和w o e s e 在8 0 年代根据16 s r r n a 相似性、d n a r r n a 及 d n a r n a 杂交的结果构建了放线菌和其他生物之间的系统发育树，标志着放线 菌分子分类( m 0 1 e c u l a rt a x o n o m y ) 时期的开始吼 目前经常用到的分子特征包括d n a 的g + c m 0 1 、d n a 分子指纹分析、 d n a d n a 杂交、d n a r n a 杂交及16 sr r n a 序列分析、r d n a 转录间隔区 ( i n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r ，i t s s ) 序列分析等【2 1 。 2 4 1d n a 碱基分析 由于p c r 技术的应用，d n a 合成仪、d n a r 瞬序分析仪的普及，使分子分类 不但需要而且变得容易。近几年，每年测定大约1 0 0 种r r n a 的全顺序，可见进展 之快【”。 2 4 2d n a d n a ( r r n a ) 分子杂交技术 研究表明：d n a - d n a ( r r n a ) 分子杂交技术在属种水平上研究细菌、放线 菌分类地位，可以用来解决传统分类方法中许多难以解决的问题。d n a 。d n a 同 源性可以揭示种间和种内的亲源关系，而d n a r r n a 杂交在属的水平上则会发挥 更大的作用9 1 。但是分子杂交技术必须以形态和分子分类特征的结果为基础，这 样才有其针对性。 2 4 31 6 s r r n a 寡核苷酸编目分析 福建农林大学硕士学位论文笫一章综述 1 6 sr r n a 寡核苷酸编目分析法应用于放线菌分类研究之后，给放线菌分类 体系带来了深刻的变革。通过对放线菌中不同菌种的寡核苷酸序列分析，它们之 间的亲缘关系也日趋明朗，g c m 0 1 含量在5 5 p a 上的革兰氏阳性菌还包括双歧 杆菌属和丙酸杆菌属，这两属都是厌气菌，它们在放线菌的进化路线上形成最早 的分支( s a b 值分别为0 4 0 f h 0 4 8 ) 。 近年来许多人开始用1 6 sr r n a 1 6 sr d n a 部分序列区分微生物不同的基因 种。中科院微生物所阮继生等人选用核糖体中的另一种r n a 一2 3 sr r n a 部分序 列区分放线菌，结果发现，选用生二素链霉菌的p 4 5 7 为引物2 3 sr r n a 4 0 1 5 4 2 这 一序列，它不能区分丌同一属内不同种或菌株，但能区分丌不同属的菌，用形念、 化学分类指征与2 3 sr r n a 序列分析结合区别属，可由表及罩地在分子水平上识 别放线菌【9 】0 随着核酸测序技术的发展，1 6 sr d n a 序列越来越多的被用于放线菌的系统进 化研究，并已成为确立放线菌新分类单位的必要数据。研究人员通常首先对研究 菌株的1 6 sr d n a 测序，得到的序列送至l j g e n e b a n kl l 较，再根据返回的相似性数 据从g e n e b a n k 寻找相似性较高的序列构建系统发育树。 选择1 6 sr d n a 作为研究生物进化的大分子，是因为1 6 sr d n a 具备如下特点 ： 作为蛋白质合成的必要产所，1 6 sr d n a 存在于所有生物的细胞中并执行相 同的功能； 具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢，能后跨越整个生命进化过程； 分子中含有进化速度不同的区域，既有高度保守的区域又有相对可变的区 域，可用于进化程度不同的生物之间的系统发育研究； 其大小为1 5 0 0 b p 左右，所代表的信息量既能反映生物界的进化关系，又比 较容易进行操作，可是用于各级分类单元。 k a t a o l a 、a n d e r s o n 和w e l l i n g t o n 证明1 6 sr d n a 基因中的y 高变区1 2 0 碱基部分 序列具有种的特异性。此序列构建的进化属于w i l l i a m s 报道的表观群有较好的一 致性，并测定了基本覆盖链霉菌5 0 0 个有效菌株的y 高变区1 2 0 碱基序列，在缺乏 完整序列的情况下与包含5 0 0 株链霉菌部分序列的数据库做比较，可以为分类研 究提供线索2 1 。 福建农林大学硕士学位论文第一章综述 2 , 5 多相分类研究 c o l w e l l 于1 9 7 0 年提出了多相分类( p o l y p h a s i c t a x o n o m y ) 的概念，即综合利 用微生物多种不同信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，进行分类的方法。 多相分类被认为是目前研究各级分类单元的最有效手段| 6 j 。 随着科学技术的发展，人们对放线菌的认识已由早期的描述分类发展到现代 的化学分类( c h e m o t a x o n o l o g y ) 和分子分类( m o l e c u l a r t a x o n o m y ) ，以至于现 在的多相分类( p o l y p h a s i ct a x o n o m y ) 【l l l o 3 链霉菌生理特性及其在植物病害防治中的应用 3 , 1 链霉菌复杂的发育分化周期 链霉菌属是革兰氏阳性的好氧丝状原核细菌。链霉菌的分化过程与真核生物 中的丝状真菌类似，具有复杂的发育分化周期。它从孢子萌发逐渐形成基质菌丝， 基质菌丝进而分化形成气生菌丝，气生菌丝经过螺旋和进一步紧密螺旋，然后发 生分隔，形成孢子链，逐渐形成有颜色的成熟于乜子【2j 。 3 2 链霉菌丰富的次级代谢物 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 可产生多种类型的具有重要应用价值的次级代谢产 物，如抗生素、免疫调节剂等，这些次级代谢产物的产生与细胞复杂的分化密切 相关2 1 。 链霉菌是微生物中产抗生素最多的种属，很早就被开发利用的有抗细菌，抗 真菌，抗肿瘤活性的各种抗生素。随着天然化学和病理学研究的深入，人们逐渐 发现链霉菌还产生其他生物活性物质，利用这些生物活性物质开发的主要产品 有：酶制剂、药理活性物质、免疫调节物质、杀虫杀螨和除草剂、抗菌剂、植物 生长调节剂等，在医学，农业和环境等领域起到了较重要的作用 t 3 1 。宋普球( 1 9 9 9 ) 从土壤中分离筛选的放线菌9 7 0 5 ，能产生核苷类抗生素，抗菌和抗肿瘤活性试验 结果显示，它具有抑菌活性和较强的抗肿瘤活性，特别是对神经系统癌具有选择 性作用，因而具有一定的丌发应用前景；r o dm h e i s e y ( 1 9 8 8 ) 等通过对一种非 典型的灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) 菌株的分离，发现其培养液具有很强的 杀蚊子幼虫活性。化学分析揭示存在种杀虫抗生素一缬氨霉素( v a l i n o m y c i n ) 该化合物可用来杀虫、杀线虫和杀螨 ”1 。 海洋链霉菌处于低温、高压、寡营养的特殊环境，生物多样性远远超过陆地 福建农林大学硕士学位论文 第一章综述 生物，其许多重要次级代谢产物是陆地生物所没有的，因此，是寻找和发现新药 活性先导化合物的重要资源【1 6 , 1 7 1 ，这些代谢物主要有生物碱、大环内酯和聚醚类、 环肽、醌类等等。 从海洋放线菌中发现的众多生物碱中主要结构类型有吡咯、吲哚、咔唑、吡 啶、噻唑、吩嗪等常见的杂环生物碱，还有一些特殊的大环生物碱和其它生物碱 类化合物，这些生物碱均具有重要生物活性。 来源于海洋微生物的大环内酯和聚醚类化合物一般都具有特殊结构和显著 的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒等。从上世纪8 0 年代起，对这两类化合物 的研究一直是海洋天然产物研究的热点和难点之一。目前发现的大环内酯和聚醚 类化合物主要是从海绵和软体动物中分离的。但随着现代分离技术的提高，近来 从海洋放线菌中也分离得到有意义的化合物，如生物碱、萜类、大环内酯、聚醚 类、环肽及醌类等等。张帆( 2 0 0 1 ) 认为，不同种的链霉菌菌株可产生相同类 型的抗生素，同种的不同菌株可产生不同类型的抗生素，甚至同一菌株也可以产 生几种类型的抗生素，因此，抗生素的产生具有菌株特异性而非种的特异性【1 ”。 3 3 链霉菌多样化的胞外水解酶 3 3 1 几丁质酶 几丁质酶能将几丁质降解生成几丁二糖等低聚几丁糖。许多生物，包括多种 细菌、放线菌和真菌以及动植物，可产生几丁质酶【2 0 】。 杨文博( 1 9 9 7 ) 从土样中分离获得的链霉菌s 0 1 菌株在产酶培养基中，2 8 振荡培养7 天，其胞外几丁质酶活力可达1 8 0 9 u m l 2 ”。陈亚成( 1 9 9 8 ) 从2 7 个土 样中分离到1 4 7 株产碱性几丁质酶的菌株，摇瓶试验表明，链霉菌s 1 0 0 1 的产酶能 力最强1 2 。王石磊( 2 0 0 4 ) 则采用离子注入技术对扶褐链霉菌s 1 0 0 1 进行诱变、 筛选，选出了突变株e i i l l1 ，结果表明，突变株e i i l l1 产生碱性几丁质酶能力为 1 6 5 u m l ，比出发菌株提高了5 倍多。郑志成( 1 9 9 2 ) 还从闽南地区潮间带红 树林根际海泥中分离到能产生几丁质酶的链霉菌3 0 0 余株，并研究了各种诱导物、 碳氮源及培养条件对链霉菌s 1 2 8 菌株几丁质酶生物合成的影响2 4 1 。 3 3 2p 1 ，3 一葡聚糖酶 在微生物产生的多种细胞壁降解酶中，b 1 ，3 一葡聚糖酶有独特的作用。它能 够降解含p l ，3 - 葡聚糖的微生物，而p 1 ，3 葡聚糖是高等真菌细胞壁的主要成分， 祸建农林大学硕土学位论文 第一章综述 因此，b 1 ，3 葡聚糖酶可以破坏很多植物病原真菌的细胞壁，使细胞失去支撑， 从而破裂死亡。另一方面，d l ，3 葡聚糖酶也可以在植物中诱导产生。这两种来 源的b 一1 ，3 一葡聚糖酶都可以抑制真菌菌丝的生长，由于这些原因，p - 1 ，3 一葡聚糖酶 在植物病害防治中具有重要意义【2 5 1 。万平平( 2 0 0 4 ) 从大白菜植株根际土壤中取 样，通过茯苓粉琼脂培养基的透明圈试验，分离筛选到4 株产p 一1 ，3 - 葡聚糖酶的链 霉菌菌株，其中r l5 ( s t r e p t o m y c e ss p ) 1 3 - l ，3 葡聚糖酶的活力最强i 2 6 j 。 3 3 3 碱性纤维素酶 目前己发现芽孢杆菌和链霉菌能产生多种碱性纤维素酶，碱性纤维素酶在 碱性条件下具有内切d 一1 ，4 一葡萄糖苷酶活力，在加酶洗涤剂等行业具有重要的应 用价值( 2 7 】。 此外，许多链霉菌还能够分泌淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、脂肪酶等等。 3 4 链霉菌对植物的诱导抗性 利用链霉菌可以对植物进行抗性诱导。如杨文香( 2 0 0 5 ) 用l 1 0 6 c f u m l 的链 霉菌孢子悬浮液浸泡黄瓜种子和进行叶面喷雾，对黄瓜白粉病的平均防效可达到 5 0 以上。链霉菌浸种的防治效果显著高于清水浸种对照，说明链霉菌可能产生 了能够诱导黄瓜对黄瓜白粉病抗性的物质【2 8 】。 3 5 生防链霉菌的筛选方法 新报道的链霉菌生产的抗生素不断减少的原因可能有以下几个：发现新化合 物的可能性减少，影响建立新筛选方法；链霉菌产生的新化合物的种类的减少和 研究重点由药物筛选转向化学合成和药物鉴定等等i l 。 3 5 1 琼脂平板测定 采用“十”字交叉法，即在p d a 平板培养基上，以原点为中心划直的“十” 字，中心接病原菌，十字一条线的两端接相同的放线菌，另一条线接另一种放 线菌。培养一定时间，看是否有抑菌圈产生；有抑菌圈的，测量其半径【2 9 1 。 3 5 2 水解酶活性的筛选 任光文( 2 0 0 4 ) 等在添加变链球菌菌体的双层平板( 底层培养基为2 的琼 脂与营养盐液，上层培养基比底层培养基多加1 m g m l 的变链球菌菌体) 上，通 过测定液体发酵培养液的溶菌活性筛选到一株产溶菌酶能力较高的放线菌 r x - 1 7 【3 0 】；周晓云( 1 9 9 9 ) 等从土样中筛选出一株野生型的链霉菌，经物理和 塑堡坐笪查堂堕! ：兰垡笙壅 塑二兰箜垄一一 化学等五代诱变处理，获得了产碱性脂肪酶活力较高的z 9 4 - 2 m “。 3 6 链霉菌分布的环境 3 6 1 土壤 土壤是链霉菌分布最为广泛的环境。宋漳等( 1 9 9 6 ) 研究了不同森林土壤中 的链霉菌数量分布差异，调查表明杉木林土壤中分布的数量最多。在杉木林中主 要分布自孢类群、灰红紫类群、烬灰类群和坎褐类群，其中可以筛选到抗绿色木 霉的菌株【3 2 i 。 3 6 2 海洋 在新的天然生理活性物质的筛选工作中，2 0 世纪6 0 年代后期就有人开始注意 到海洋生物的潜力。随后陆续从一些海洋动植物中发现了许多具有特殊功能的生 理活性物质，其中不少具有抗肿瘤功能。海洋微生物也以其种类繁多、所处环境 特殊等得天独厚的条件逐渐引起人们重视。罗文新( 1 9 9 8 ) 等研究培养条件对 来自海洋的1 2 株链霉菌抑菌活性的影响，结果表明，用海水制备的高氏1 号培养 基培养时，能表现抑菌活性的菌株数最多；但减少培养基的营养成分，改变氮源， n a c l 浓度，p h 和培养温度，部分菌株可表现新的抑菌活性，或使原有的抑菌活 性有较大提高1 。黄维真( 1 9 8 9 ) 等从厦门鼓浪屿水域海泥中分离得一株链霉菌 8 5 1 0 ，它的代谢产物具有广谱的抗菌谱，特别是对绿脓杆菌等有明显的抑制作用， 而且毒性低f 3 5 j 。 3 6 3 植物内生链霉菌 最近的研究表明，许多植物体内分离到链霉菌。内生链霉菌不仅可促进植物 生长、提高作物产量，而且可以增加植物对病原菌的抗性。与通常使用根际微生 物进行植物病害生物防治相比，内生放线菌定居在植物根内部，避免了同根际众 多微生物的竞争，因而更具有竞争优势。利用内生放线菌防治小麦全蚀病的温室 试验显示，可降低病害损失7 0 以上，其次，内生放线菌可在植物组织中产生抗 生素、溶解酶等拮抗物质【3 6 1 。 3 7 链霉菌对植物病害的防治 生防链霉菌可以用于防治植物细菌性病害、真菌性病害、线虫及虫害等等， 其中报道最多的是对植物病原真菌的抑制作用。据报道，链霉菌可以防治如下植 物病害：黄瓜白粉病( s p h a e r o t h e c a f u l i g i n e a ) f 2 9 l ；烟草赤星病( a l t e r n a r i a 。l t e r n a m ) 福建农林人学硕士学位论文 第一章综述 3 7 1 ：马铃薯疮痂病( s o l a m m b ) 3 8 1 ；玉米弯孢菌叶斑病( c w v u l a r i a l u n a l a ) 3 9 1 等等。 链霉菌也可用于防治植物线虫病害，如鄢小宁( 2 0 0 4 ) 通过生物测定和温室 防病试验，对3 4 4 株放线菌菌株进行筛选，得到了l 株对南方根结线虫有较高生物 活性的链霉菌菌株l h l 2 1 ，该菌株最终被鉴定为玫瑰暗黄链霉菌( s t r e p t o m y c e s r o s e o f u l v u s ) 。 4 适合链霉菌生长的培养基 放线菌的分离，一般都用选择性培养基。大都是以甘油、淀粉、甲壳质作为 碳源，门冬酰胺、精氨酸作为有机氮源，培养基的反应调节到中性，有时调节到 微碱性【4 ”。本研究设计选用甲壳质作为培养基，通过实验证明，以甲壳质作为碳 源适合于某些高产几丁质酶的链霉菌。这些链霉菌能够将甲壳质分解为小分子量 的壳聚糖，但目前，利用虾壳甲壳质作为培养基的例子国内外尚无相关报道。 5 甲壳素和壳聚糖 5 1 甲壳素和壳聚糖的来源及结构 甲壳素( c h i t i n ) 又叫甲壳质、几丁质，广泛存在于水生甲壳类动物、软体动 物和节肢动物外壳中以及真菌或酵母等微生物的细胞壁中【4 2 】。壳聚糖( e h i t o s a n ) 是甲壳素脱乙酰基后的产物。甲壳素是自然界中来源极丰的天然高分子化合物， 生物合成量每年高达几百亿吨之多 4 3 1 。甲壳素、壳聚糖的研究早在5 0 年代就开 始进行，8 0 年代才开始大规模的应用。 甲壳素是一类由2 - 乙酰氨基2 脱氧一葡萄糖通过d 1 ，4 一糖苷键连接而成得直链 多糖，壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物。二者的结构式为： o 一0睑h 0 甲壳素寡糖壳聚糖寡糖 5 2 链霉菌水解酶对甲壳素的降解 某些微生物体内存在几丁质酶、壳聚糖酶和甲壳素脱乙酰酶。尤其是几丁质 酶，还可被培养基中的粉状几丁质诱导合成【4 4 】。几丁质酶和壳聚糖酶主要降解直 堡堡坐丛查兰堡圭兰些堡兰塑二皇堡垄 链多糖的3 - 1 ，4 糖苷键，释放出。o h 。所不同的是几丁质酶被认为是一种催化水 解至少含有一个g l c n a c 基团的糖苷键，而壳聚糖酶则是水解至少含有一个 一g i c n 基团的糖苷键45 1 。甲壳素脱乙酰酶主要降解甲壳素分子内的n 一乙酰氨基 释放出n h 2 。故产几丁质酶的链霉菌降解完全可以降解虾分发酵液中的甲壳素， 生成甲壳低聚糖。 壳聚糖经过适当的方法降解可得到分子量在2 0 0 0 3 0 0 0 的壳寡糖。壳寡糖具 有一系列优良的性质，在生物医药、日用化妆品、农业等方面都得到了广泛的应 用【4 6 1 。 5 3 甲壳低聚糖( 壳聚糖) 的生理活性 甲壳低聚糖较甲壳素和壳聚糖具有更优越的理化性质和功能活性，成为国际 上近年来新兴发展的功能性低聚糖。甲壳低聚糖具有抗菌作用、抗肿瘤作用、抵 抗细菌侵染的防御能力、调节植物生理、促进双歧杆菌增殖、抗诱变等生理活性 4 7 1 。 5 3 1 抗菌作用 甲壳低聚糖因分子中有游离氨基，是一种带阳电荷的离子化合物，对真菌 和微生物的生长有抑制作用【4 7 1 。目前认为甲壳低聚糖抑菌作用的机理有：改变病 原菌细胞膜的流动性和通透性，干扰病原菌d n a 的复制与转录及阻断病原菌代 谢1 4 8 。 刘明河( 2 0 0 5 ) 等研究发现甲壳低聚糖对同常生活中特别是食品中些常见 的细菌、霉菌、酵母菌具有抑菌作用，其抑菌率明显超过对照组，相应最小抑菌 质量浓度为1 一l o 扎，随着甲壳低聚糖质量浓度的增加，抑菌作用逐渐变强1 4 9 】。 钟秋萍( 2 0 0 5 ) 等研究认为在任何实验条件下，壳聚糖的抑菌率随着壳聚糖浓度 的提高而提高。壳聚糖对芒果炭疽病菌和蒂腐病菌的抑制能力较强，是种在芒 果保鲜领域极具开发潜力的活性物质1 5 0 l 。叶磊( 2 0 0 4 ) 等的实验表明，壳聚糖的 分子质量对其抑菌性能有很重要的影响，在定范围内( 5 0 2 0 0k d ) ，随着分子 质量的提高，壳聚糖的抑菌效果相应降低，壳聚糖良好的热稳定性为其广泛应用 带来了一定的方便。环境中某些金属离子的存在可能会影响到其抑菌性能的发挥 5 h 。 壳聚糖的抑菌作用已得到了许多实验的证实，但是由于壳聚糖的抑菌机理比 较复杂，对不同种类的微生物其抑制作用可能不同，而且影响壳聚糖抑菌能力的 福建农林人学硕士学位论文第一章综述 因素较多。另外，大部分的壳聚糖需要在溶解的条件下才能很好地发挥其抑菌能 力等等，这就要求在使用前进行相关的研究，只有这样才能更好地发挥壳聚糖的 功效【) “。 5 3 2 促生作用 据魏新林( 2 0 0 3 ) 报道，甲壳低聚糖能调节植物基因的关闭与丌放，促进 植物细胞的活化，刺激植物生长，能参与调节植物生长发育和调节生长状态，促 进植物开花、结果，促进植物对营养物质的吸收和利用，从而提高农作物的产量 和质量h ”。近年来，国内外研究表明壳聚糖是一种生长调节物质，改善农产品品 质，诱导植物的广谱抗病性，对人畜无毒5 ”。 隋雪燕等( 2 0 0 2 ) ，用壳聚糖包衣对油菜种子萌发和幼苗生长及几个生理生 化指标的影响进行了研究，他们认为，用不同酸溶剂与不同分子量的壳聚糖包衣 均促进油菜种子萌发和幼苗生长【5 4 】；周天( 2 0 0 3 ) 的实验表明，壳聚糖可以引起 作物的生理效应，可提高作物的叶绿素含量及作物种子中的贮藏蛋白含量，从而 提高作物产量、品质f 5 5 】：师素云( 1 9 9 9 ) 等，以不同浓度的羟甲基壳聚糖( n c m c ) 处理玉米种孑，其种子发芽势、发芽率、幼苗株高及幼苗叶片的叶绿素含量均有 不同程度提高1 5 6 1 。 5 3 3 诱导作物抗性 魏新林f 4 7 1 认为，甲壳低聚糖能够对植物组织局部和整个植株都产生诱导作 用。甲壳低糖对植物抗毒素有诱导活性，壳聚糖、壳聚低糖或其赫类对植物病原 菌具有抗菌活性，将二者配合使用效果更佳。植物体内不含甲壳素、壳聚糖成分， 但却具有甲壳索酶、壳聚糖酶，这些酶能与植物病原菌或害虫外皮甲壳索反应， 并阻止其侵入植物组织内，从而增强了植物自身对病虫敌害的防御能力f 5 5 】。 外源施用壳聚糖或受病原菌攻击时，许多植物一病原菌作用系统中都可诱导 产生大量几丁质酶和p 1 ，3 葡聚糖酶，但在高等植物中尚未发现这两种酶的底物， 因此推测其具有抗病菌的作用，而在植物自身代谢中没有作用【4 8 】。 e 1g h a o u t h ( 1 9 9 4 ) 等指出，在溶液培养条件下，壳聚糖可诱导黄瓜根、叶 中的几丁质酶和p 一1 ，3 一葡聚糖酶活性提高。这种现象在其他研究中也得到了证实 ”“。在经壳聚糖处理后的草莓果实中，几丁质酶活性的提高与其抗腐能力呈显著 正相关：壳聚糖诱导的菜豆几丁质酶和p 1 ，3 一葡聚糖酶的活性的提高与其抗病 福建农林大学硕士学位论文第一章综述 性能有密切关系 5 9 1 。据此认为，壳聚糖是通过诱导几丁质酶和d 1 ，3 葡聚糖酶的 活性来提高植物的抗病能力的。 我省地处沿海，虾壳废料来源丰富，充分利用虾粉作为发酵的原料，不仅能 够经济有效的利用资源，而且通过施用虾粉发酵液诱导植物的抗病反应来提高植 物自身对病害的抗性，可以大大减少化学农药的施用量。 5 4 壳聚糖对植物病害的抑制作用方式及机理 目前认为壳聚糖对植物病害的抑制机理包括5 3 】： 诱导植物自身防卫反映、产生广谱抗性。壳聚糖可诱导植物抗性蛋白、木 质素的产生，改变植物的酚类代谢，并诱使植物产生愈创葡聚糖( c a l l o s e ) ，增强 植物细胞壁； 对植物病原微生物的直接抑制作用。壳聚糖抗植物病原细菌、病毒、类病 毒及病原真菌； 壳聚糖可以在植物表面形成半透膜。 福建农林大学硕一l 学位论文 第二章链霉菌f i0 13 种的糌定段1 6 sr d n a 序列分析 第二章链霉菌f 一1 0 1 3 种的鉴定及1 6 sr d n a 序列分析 本实验旨在对链霉菌f - 1 0 1 3 进行形态学特征、培养性状、生理生化特性及 分子生物学特征的观察、分析及鉴定，以明确它的分类地位。 1 材料与方法 1 1