（分析化学专业论文）共振光散射在核酸及生物分析中的应用.pdf

西南大学硕二 毕业论文 摘要 共振光散射在核酸及生物分析中的应用 分析化学专业硕士研究生王斌 指导教师黄承志教授 摘要 自从1 9 5 3 年沃生和克里克提出了著名的d n a 双螺旋结构模型后，核酸的研究 进入一个飞速的发展时期，如d n a 重组技术等已被人们广泛的关注，这些技术的 突破大大的推动了其他学科的发展。核酸定量分析在生命科学、生化药物、临床 医学以及食品检验中有着重要的作用。目前有很多种测定核酸含量的方法，如使 用较广的探针技术法、吸光光度法、荧光光度法、化学发光法以及新发展起来的 共振光散射法( r e s o n a n c el i 曲ts c a t t e r i n g ，r l s ) 。共振光散射技术是一种建立 在普通荧光分光光度计上的一种光散射分析技术。该技术方法操作简单、灵敏度 高，在分析化学领域被广泛的应用于核酸，蛋白质，药物及糖类的分析测定。本 文利用共振光散射研究了双苯甲亚胺与核酸的作用机理。结合双苯甲亚胺的荧光 性质，使用散射荧光比率法技术，建立了较稳定的核酸分析方法。具体研究内容 包括以下几个方面： ( 1 ) h o e c h s t 3 3 2 5 8 又名双苯甲亚胺是双苯并咪唑类物质的一种衍生物，是一 种多环芳香族小分子物质，具有一定的电化学性，能够特异性的与d n a 相互作用， 可作为d n a 的电化学杂交指示剂。用共振光散射( r l s ) 光谱来证实双苯甲亚胺与d n a 之间存在静电相互作用，此外，通过吸收光谱证实了双苯甲亚胺与d n a 之间的相 互作用是嵌入作用；且双苯甲亚胺与d n a 的主要作用在a t 区域。 ( 2 ) 荧光分光光度法和共振光散射法通常都只采用一种信号。对于有散射光 信号与荧光信号共存的体系，我们希望能够充分利用两种信号，提高检测灵敏度 和检测范围，同时能够更好的抵抗外界干扰。因此，对于同时具有散射和荧光信 号的生物微粒，可以通过测定一定波长下不同的光学信号的比值，建立散射荧光 比率分析法。本文基于脱氧核糖核酸( d n a ) 对有机染料双苯甲亚胺( h o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 的共振光散射增强效应和荧光淬灭效应，建立了一种测定d n a 的散射荧光比率 法。在p h 4 5 6 时，h o e c h s t 3 3 2 5 8 在3 5 2 n m 处的散射增强和5 0 0n 1 处的荧光猝灭的 比值与鱼精子d n a ( f s d n a ) 的浓度呈线性关系，线性范围为o 0 4 1 6 雌m l ，相 关系数为0 9 9 3 5 ，检出限为5 n gm 1 1 ( 3 0 ) 。该方法简便、快速，在一定范围染 西南入学硕士毕业论文摘要 料浓度及外来干扰影响小，成功用于合成样品中d n a 的测定。 ( 3 ) 流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ) 是7 0 年代发展起来的一种利用散射和荧光对 细胞等生物粒子的理化及生物学特性( 细胞大小、d n a r n a 含量、细胞表面抗原表 达等) 进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。另一方面，纳米药 物具有许多优点，如稳定性好、对胃肠刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、 具有靶向性和缓释功能等。本文研究了b s a 纳米粒子与c t c 作用后的药物缓释作 用的研究。当单独将b s a 纳米粒子与盒霉素简单混合而不是在一起共同搅拌2 4 小 时的条件下，在6 小时的作用下细胞受损和死亡百分率要明显高于b s a 纳米粒子 与会霉素共同搅拌2 4 小时的情况，说明b s a 纳米粒子为载体对于c t c 的释放确实 表现出缓释效应。 关键词：共振光散射核酸流式细胞仪b s ac t c i i 西南大学硕士毕业论文 a b s t r a c t e m i s s i o na 1 1 dl i g h ts c a n c r i n gs i g n a l s ，w ei i l t e n dt os i m u l t a r l e i t yt a k ea d v a n t a g eo ft l l e 觚os i 印a l st oi m p r o v et l l es e n s i t i v i 劬d 酏e c t i o n 啪g e 趾dr e s i s t i v i t yt ot l l ec x t e m a l i n t e r f e r e t h e r c f o r c ，f o rm 髓eb i o l o g i c a lp a n i c l e sw i t hb o t l ln u o r e s c e l l c ea n d1 i 曲t s c a t i e r i n gs i g n a l s ，w ec a nm e 龉u r ct l l er a d oo fd i f r c r c n to p t i c a ls i g n a l sa tc c n a i n w a v e l e n g t ha n de s t a b l i s hf l u o r e s c e n c ee m i s s i o n 锄dl i 曲ts c a t t e r i n g m t i om e t h o d h e r c n ，b a s e do nm ee r i l l a n c e dr e s o n a l l c el i 班ts c a t t e m g 卸dn u o r c s c tq u e n c h i n g e 腩c to fd n at oo 唱孤i cd y eh o e c h s t3 3 2 5 8 ，w ee s t a b l i s han u o r e s c c l l c e 锄i s s i o na i l d l i 曲ts c a i t 鲥n gr a t i om e t l l o df o rd e t e m i n a t i o no fd n a e x p e r i r n e n t ss h o w e dm a ti n b u 腩ro fp h4 5 6 ，m er a d oo fe i l h 锄c e dr e s o n 锄c e1 i g h ts c a t t e 曲ga t3 5 2n ma n d q u e n c h i n gf l u o r e s c e l l t 砌s s i o na t5 0 0 i l i na r ep m p o r t i o 船1t on l ec o n c e i l 托a t i o no ff i s h s p e r i l ld n a ( f s d n a ) a 1 1 do v e rt l l 景【j 】黑龙江畜牧兽医，2 0 0 3 (3)，1718【6 e r l a n dj f d b o v i n c semm舭砌i叫7-hydroxyco啪撕n-4-ac髓ic a c i d ) 未 越霎薹麓p j 雾蚕牲薹f 仲囊襄l 毒1 毒；委露目i ；哇攀鬟躺。；i l l 二* h ： ￥i i | 芎， 硝南大学硕士毕业论文缩写符号对照表 缩写符号对照表 英文名称中文名称缩写符号 b r i t t o nr o b i n s o n c h l o r t e t r a c y c l i n e d o u b l e s t r a n d e d d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 缓冲溶液 b r 金霉素 c t c 双链脱氧核糖核酸d s d n a f l o wc y t o m e t r y流式细胞术 h o e c h s t 3 3 2 5 8双苯甲亚胺 f c m h 3 3 2 5 8 l i g h ts c a t t e r i n ga n d散射荧光比率法 l s f lr a t i o n m e t r y f 1 u o r e s c e n c ee m i s s i o n c o u p l e dr a t i o n m e t r y p r o p i d i u mi o d i d e碘化丙啶 r e s o n a n c el i g h t共振光散射法 s c a t t e r i n gm e t h o d p i r l s s i n g l e s t r a n d e d单链脱氧核糖核酸 s s d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 金黄色葡萄球菌 s a v 蹦南大学硕十毕业论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 共振光散射技术的建立 光传播时因与物质中分子( 原子) 作用而改变其光强的空间分布、偏振状态 或频率的过程。源于光子与微粒相互的作用，光的散射现象广泛存在并在各个科 学技术部门中有广泛应用。如散射光的测量可以了解到散射粒子的浓度、大小、 形状及取向，通过散射光谱可用于确定物质分子与原子的特性。 根据入射光的波长和散射粒子大小的关系，可以分为折射和反射、丁达尔散 射、分子散射。在光的传播过程中，光线照射到粒子时，如果粒子大于入射光波 长很多倍，则发生光的反射；如果粒子小于入射光波长，则发生光的散射，这时 观察到的是光波环绕微粒而向其四周放射的光，即散射光。在散射过程中，光波 场与原子或分子的作用( 使入射光改变为散射光) 几乎是瞬时的，不同于光被吸 收后再发射出来，有可测量的时间延迟，如荧光、磷光等发光现象。根据入射光 的波长和散射波长的关系，可以分为弹性散射( 也称经典光散射或静态散射) 、准 弹性散射( 也称动态光散射) 、非弹性散射；根据信号检测的方向，可以分为前向 散射、直角散射、后向散射。 共振光散射技术是一项在普通荧分光光度计上进行测量的分析技术。1 9 9 3 年， p a s t e r n a c k 等“1 用普通荧光光度计通过匹配激发和发散单色器并进行同时扫描获 得了反式一双( l _ 甲基吡啶绘一4 一基) 2 一二苯卟吩及其c u ”的衍生物在d n a 上 的，一型堆积，以及新合成的金属嵌合剂与小牛胸腺d n a 作用的光散射信号，从 而建立了共振光散射( r l s ) 技术，将光散射技术和化学过程成功地联系在一起， 并将其用于生物大分子的识别、组装和聚集研究。1 9 9 6 年，童沈阳”1 研究小组用 共振光散射光谱法定量的测定了核酸。随着对共振光散射技术进一步的深入的研 究，该技术得到不断的完善和发展。 1 2 共振光散射技术的发展与应用 随着共振光散射技术在分析化学领域的不断发展和完善，已经被广泛的应用 于核酸、蛋白质、糖类、药物的分析测定。同时，共振光散射技术的不断完善， 各种新的改进后的共振光散射技术也相继被建立起来，例如：全内反射共振光散 射技术、共振光散射成像技术、流动注射共振光散射联用技术、基于双波长散射 比率法的共振光散射技术等。共振光散射技术在分析化学的各个领域得到了广泛 的发展：在不断的应用和发展中，共振光散射技术得到了更新和改善。 i 西南人硕十毕业论文第一章绪论 1 2 1 有机染料与生物大分子的作用 有机小分子与生物大分子物质如蛋白质。”、核酸分子“”作用时，结合数一 般都较大，相当于有机小分子在生物大分子物质上堆积，因而能产生强烈的共振 光散射增强信号。 有机小分子主要有溴乙锭及二聚体，h o e c h s t 3 3 2 5 8 和吖啶类等。”。研究具有 特征官能团的有机小分子与生物大分子之间的相互作用对探索生物大分子的结构 和功能，以及了解、模拟生物物理过程具有相当重要的意义”。 1 2 2 药物分析方面的作用 近些年来，麸振光散射技术已广泛应用于药物分析方面，如维生素、肝素、 盐酸小檗碱以及抗生素类药物等。7 。4 ”，其操作简单、灵敏度高、选择性好、取样 量少的特点使药物分析的效率及准确性都有很好的提高。 1 2 3 在其他方面的应用 在无机分子及纳米粒子方面的检测也已经很成熟，如汞的测定“8 州、铅的测定 m 0 1 金纳米粒子咖3 、银纳米粒子。“”1 等等，由于糖。”存在于细胞表面、细胞壁、 细胞质膜、细胞核和细胞间质中，是重要的信息分子，对于糖的研究与人们的生 活息息相关。因此对于糖的研究具有重要意义。 1 2 4 共振光散射技术的改进 随着共振光散射技术在分析化学中的广泛应用，共振光散射技术所存在的各 种问题被不断的发现，各种改进的共振光散射技术被相继的建立和发展，解决了 共振光散射技术所存在的各种问题。例如：为了解决共振光散射技术的选择性差 的问题，一种结合了液体萃取技术和全内反射技术的共振光散射技术被建立，通 过选择性的液体萃取解决了选择性问题，并通过全内反射原理实现了对分析物的 检测：又如，由于共振光散射技术是建立普通荧光分光光度计上的分析技术，其 分析结果是物质的散射光谱信息，而其他方面的信息，例如形态特征，却不能被 获取。基于此问题，一种结合显微成像技术的共振光散射成像技术被建立起来， 对生物大分子的聚集形态进行了深入的研究和探讨。 1 3 本文研究内容的确定 就目前共振光散射发展及应用方面来看，根据其操作简单、灵敏度高、选择 性好、取样量少的特点使化学分析的方式更加迅捷方便。 2 西南人学硕十毕业论文第一章绪论 利用共振光散射技术的特点对有机小分子与核酸的作用进行研究。针对双苯 甲亚胺与鱼精d n a 的作用来探讨其结合的机理。由于双苯甲亚胺荧光染料溶液自 身只发射很微弱的荧光，而它与d s d n a 的a t 碱基对特异结合( 非嵌入式) 后，荧 光强度显著增强。所以，利用三维光谱来排除荧光对该体系的干扰。本文利用共 振光散射技术对纳米药物的缓释作用进行了初步探讨。同时，还用共振光散射光 谱表征了经历不同时间细菌的浓度增长情况。 西南人学硕士毕业论文 第二章双苯甲胺与d n a 作川的共振光散射特征及其分析应用 第二章双 2 1 引言 研究具有特征官能团的有机小分子与生物大分子之间的相互作用对探索生物 大分子的结构和功能，以及了解、模拟生物物理过程具有相当重要的意义“”。在 核酸的分析中，基于核酸与有机小分子的作用涉及到两种类型的结合反应：一类 是基于核酸组成中的碱基，或糖与有机小分子如二苯胺，对硝基苯肼等发生共价 结合作用引起的光谱性质的变化来进行测定。另一类是基于核酸与一些有机小分 子作用后发生能量转移来实现定量测定，这类有机小分子主要有溴乙锭及二聚体， 双苯甲亚胺( h o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 和吖啶类等0 1 。 h o e c h s t 3 3 2 5 8 ( h 3 3 2 5 8 ) 是双苯并咪唑类物质的一种衍生物( 结构见图1 ) ，是 种多环芳香族小分子物质，具有一定的电化学活性，能够特异性的与d n a 相互 作用，可作为d n a 的电化学杂交指示剂“5 。h o e c h s t 3 3 2 5 8 溶液自身的荧光很微弱， 它与d n a 作用后，使其荧光强度得到极大增强，何品刚等利用h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 作用的荧光特性对其作用机理进行了详细的研究，证实了两者即有嵌入作用也有 非特异的静电作用，主要作用在a - t 碱基区域，并且磷酸根可以减弱二者的非特 异性静电作用”1 。孙逊等人利用h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 结合后荧光增强的特点测定 基因治疗非病毒载体中d n a 的含量，所建立的荧光分光光度法为载基因纳米粒、 脂质体制备工艺和质量标准的建立提供了依据”1 。但他们也发现d n a 与荧光染料结 合后发射的荧光随着时间的延长会有一定程度的衰减，所以其溶液必须在配置好 后立刻检测“1 。 本章应用共振光散射法( r l s ) ，结合吸收光谱对h o e c h s t 3 3 2 5 8 与核酸的结合 方式进行了研究。实验表明，单链d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 作用时其散射比双链作用 时强，证明h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 的作用除了相互嵌入外还有静电作用。实验发现， h o e c h s t 3 3 2 5 8 与核酸作用后产生增强的r l s 信号，其增强的r l s 强度与一定范围 内的d n a 浓度成正比。且时间对r l s 测定的影响很小。三维光谱说明该体系的荧 光对散射测定不产生干扰。 2 2 实验部分 2 2 1 主要仪器与试剂 f 一2 5 0 0 荧光分光光度计( 日立公司) ；卜4 5 0 0 荧光分光光度计( e ；j 立公司) 4 西南火学硕 j 毕业论文 第二章双苯甲弧胺与d n a 作用的共振光散射特征及其分析应用 u v 一3 0 1 0 紫外可见分光光度计( 日立公司) ；旋涡混合器( 海门市其林贝儿仪器制 造有限公司) ；酸度计p h s 一3 c ( 上海大中分析仪器厂) 。d n a 储备溶液：将鱼精d n a ( f s d n a ，上海生物化学研究所) 直接溶于适量水中配成，并保存于0 4 冰箱中， 操作液浓度为5 0 0m g 几：h c h s t 3 3 2 5 8 ：准确称取0 0 1 2 5gh o e c h s t 3 3 2 5 8 ( f l u k a a g ) ，溶于5 0 热水，用二次水稀释到2 5 0m l ，浓度为1 o 1 0 m 0 1 l ；使用 b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液控制溶液的酸度。其他试剂均为分析纯。 泌 图1h o e c h s t 3 3 2 5 8 的分子结构 f i g 1 m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fh o e c h s t3 3 2 5 8 2 2 2 实验步骤 ( 1 ) r l s 的测定 向1 0 o i l l l 比色管中加入一定体积的f s d n a 和1 om 1 的b r ( p h7 6 6 ) 缓冲 溶液，漩涡混合后再加入适量的1 0 1 0 m 0 1 几的h 0 e c h s t 3 3 2 5 8 。最后用二次水稀 释至刻度，混匀后于荧光光度计上在无，= 丸的条件下进行同步扫描获得r l s 光谱， 扫描范围在2 2 0 一7 0 0n m ，在3 8 5 0n m 处测定r l s 强度，荧光分光光度计的激发和 发射狭缝始终保持在5 on m 。三维光谱是在f 一4 5 0 0 荧光分光光度计上获得。 ( 2 ) d n a 片段的变性处理 将鱼精d n a ( d s d n a ) 在沸水中煮沸1 5 分钟，然后在冰水混合物中迅速冷却， 1 5 分钟后，经过变性处理后鱼精d n a 片段被打开为单链的变性d n a ( s s d n a ) 片段 阻 h e z 西南大学硕士毕业论文第二章双苯甲亚胺与d n a 作用的共振光散射特征及其分析应用 2 3 结果与讨论 2 3 1 光谱特征 图2 为h o e c h s t 3 3 2 5 8 ( a ) 及其与d n a 作用后( b ) 的三维光谱图。从图中可 以看出，在无，= 以直线上的2 9 2 n m 和3 8 5 册处有两个特征散射峰( 即a 和b ) 。此 外，还存在c ( 厶= 3 2 5 0n f i l ，厶= 4 6 5 o 册) 和d ( 九。= 2 4 0 0n m ，以= 4 8 0 0n m ) 两个峰，其中c 为荧光发射峰，d 为半频峰。加入d n a 后其荧光( c ，) 和散射( a ，b 。) 强度都增强，但散射增强程度明显高于荧光增强程度；图中还说明荧光信号与散 射信号没有发生重叠，据此，可以建立灵敏的d n a 共振光散射测定法。 图2( a ) h o e c h s t 3 3 2 5 8 的三维图谱( b ) d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 的三维图谱。 f i g2 t h r e e d i m e n s i o n a le m i s s i o ns p e c t r ao fh o e c h s t 3 3 2 5 8 ( a ) a n dt h em i x t u r eo fd n a w i t hh o e c h s t 3 3 2 5 8 ( b ) p i ，7 6 6 ；浓度( c o n c e n t r a t i o n ) ：1 o 1 0 一m o l l h o e c h s t 3 3 2 5 8 ， 1 0 “g m lf s d n a ， 图3 是f s d n a 与h 3 3 2 5 8 作用的共振光散射光谱图。从图3 的f s d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 作用的光散射光谱图可以看出，单独的f s d n a 溶液或h 0 e c h s t 3 3 2 5 8 溶液在测定条件 下的r l s 信号十分微弱。但当h o e c h s t 3 3 2 5 8 与f s d n a 作用后，由于体系的折光指数发 生变化，导致体系的r l s 强度增加，在2 9 2 n m 和3 8 5 n i n 处出现增强的特征散射峰，且 r l s 强度随d n a 浓度的增加而增强，由于最大散射峰位于3 8 5 n i i l 处出现增强的特征散 射峰，且r l s 强度随d n a 浓度的增加而增强，由于最大散射峰位于3 8 5 n m 处。 6 两南大学硕十毕业论文第二章双苯甲亚胺与d n a 作用的共振光散射特征及其分析应用 w a v e i e n g t h ，n m 图3d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 作用的共振光散射光谱图 f i g 3 t h er l ss p e c t r ao fd n aw i t hh o e c h s t 3 3 2 5 8 p h = 7 6 6 ；1 h o e c h s t 3 3 2 5 8 ：2 d n a ：3 5 h o e c h s t d n a 浓度： h o e c h s t 3 3 2 5 8 ：1 0 1 0 。6 m 0 1 几，e x c e p tf o r1 i n e2 ( w i t h o u ta n yh o e c h s t 3 3 2 5 8 ) d n a ( “g m l ) ：1 o ；2 1 o ；3 0 2 ； 4 o 6 ；5 1 o 内嵌图：s s d n a ：1 op g m l ，d s d n a ：1 0p g m l 因此，选择此波长作为测定波长。此外，实验还表明，在相同条件下，单链 d n a ( s s d n a ) 与h 0 e c h s t 3 3 2 5 8 作用后r l s 强度的增强程度明显大于双链d n a ( d s d n a ) ( 图3 中的内嵌图) 。这可能是一条双链d n a 变性后，解链成两条单链d n a ，两者 通过静电作用形成的h o e c h s t 3 3 2 5 8 一d n a 复合物粒子数目更多，而散射强度与体系 中单位体积的粒子数目成正比，所以相同浓度d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 作用时其单链 的散射强度比双链的强。 图4 是d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 作用的吸收光谱图，从图4 中可看出，d n a 的加 入会使h o e c h s t 3 3 2 5 8 在3 4 0 n m 处的吸收峰发生减色和红移的效应，据l o n gec 的研究结果，减色效应、红移现象是物质与d n a 发生嵌入作用的标志。+ 。同时， 从单链d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 产生减色效应且减色效应比双链d n a 弱，说明两者之 间同时也存在静电作用，因为单链d 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 之阃不可能有嵌入作用， 其减色效应来自于两者之间静电作用的结果。 西南人学硕十毕业论文 第二章双苯甲亚胺与d n a 作用的共振光散射特征及其分析应用 认，；坚 2 。0z 幻3 0 0 3 5 04 0 04 5 0 z ，n m 图4h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 作用的分子吸收光谱 f i g4t h eu vs p e c t r ao fd n aw i t hh c l l s t 3 3 2 5 8p h = 7 6 6 ：浓度：1 2 o g l ls s d n a ： 2 2 o g m ld s d n a ；3 1 0 1 0 m o l lh o e c h s t 3 3 2 5 8 ：4 3 + 2 0 扯g m ls s d n a ；5 3 + 2 o u g m ld s d n a 2 3 2 实验条件的优化 图5 p h 对r l s 的影响 f i g5 e f f e c t so fp ho nr l si n t e n s i t yd s d n a ； 1 o 斗g m l ，h o e c h s t 3 3 2 5 8 ： 1 0 1 0 一5 m o l l 图5 表明，随着p h 的增加，h o e c h s t 3 3 2 5 8 的散射强度变化不大，但h o e c h s t 3 3 2 5 8 8 西南人学硕十毕业论文第二章般苯甲哑胺与d n a 作片j 的共振光散射特征及其分析应用 与d n a 作用后，其散射强度随p h 的增加而增强，且在p h 7 o o 一7 7 0 范围内达到 最大，继续增加p h ，散射强度又降低了。这是因为p h 对体系的影响在一定程度上 体现了核酸的构象变化“1 ，随着酸度的变化，核酸的状态将发生变化，导致超 出该p h 范围后r l s 强度降低。实验选用p h7 6 6 作为反应体系的最佳酸度。 i 砌cs 订e 1 1 9 “1 0 o l ，l 图6 离子强度对r l s 的影响 f i g 6d e p e n d e n c eo fi o n i cs t r e n g t h0 nr l si n t e n s i t y 浓度：d n a ：1 0 “g m l h o e c h s t 3 3 2 5 8 ：1 0 l o 0 l l 从图6 可看出，离子强度对该体系影响较大。随离子强度的增强，散射强度 减弱。这可能是由于n a 十与d n a 结构上的磷酸根之间的屏蔽作用，减弱了 h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 的作用所致。 实验表明，h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 作用1 0 分钟后，体系的散射强度达到最大， 且能稳定l 小时，相比荧光法具有一定的优势 7 。 2 3 3 共存物质的影响 表l 表明了金属离子、碳水化合物、及核苷酸对h o e c h s t 3 3 2 5 8 与f s d n a 作用 的影响，从表中可以看出生物体液中普通的金属离子如c a 2 + 、m 9 2 + 等在稍高浓度 ( 1 o 1 0 4 m o l l ) 的条件下不干扰测定，这是由于他们是硬离子，与n a + 一样 仅与d n a 上的磷酸根结合，稳定了w a t s o n c r i c k 双螺旋结构1 。交界离子c 0 2 + 、 c r 3 + 即可与磷酸根作用，又可与碱基作用，其允许量相对较低。 9 硝南大学硕士毕业论文 第二章双苯甲亚胺与d n a 作用的共振光散射特征及其分析应用 表1 共存物质对d n a 的干扰 t a b l e1i n t e r f e r e n c eo ff o r e i s ns u b s t a n c e 共存物质浓度 改变值共存物质浓度改变值 f o r e i g n c o n c e n t r a t i o nc h a n g e f o r e i g n c o n c e n t r a t i o nc h a n g e s u b s t a n c e ( l o 喝m 0 1 l )o f ( ) s u b s t a n c e( 1 0 呻o l l )( ) b a ( i i ) ， c r ( i i i ) ， c a ( i i ) ， z n ( i i ) ， a 1 ( i i i ) p b ( i i ) ， m g ( i i ) ， c l 。 c 1 c 1 n 0 3 。 n 0 3 f 广 9 o乳糖 6 o麦芽糖 一7 1 蔗糖 2 4腺苷酸 9 0鸟苷酸 7 o 葡萄糖 7 0b s a 木 1 0o 7 1 08 0 1 0o 3 2 05 o 1 0 1 0 l o5 o 0 2 7 o c o ( i i ) ，c 1 2 05 o n a ( i ) ，c 1 。 1 0 0 3 5 2 3 4 标准曲线和合成样品的分析 按操作过程的优化条件，对一定量的h o e c h s t 3 3 2 5 8 ，研究了光散射强度与d n a 加入量之间关系，结果如表2 所示。根据表2 的共存物质干扰特性，合成了两个 不同组分的样品，测定结果见表3 。 表2 分析参数 t a b l e2a n a l y t i c a lp a r 锄e t e r so ft h ed e t e r m i n a t i o n 回归方程 h o e c h s t 3 3 2 5 8l i n e a r d e t e c t i o c o n r r e l a t i o n ( m o l l )r a n g e ( m g l ) l i n e rr e g r e s s i o n e q u a ti o n nl i i tc o e f f i c i e n t ( “g m 1 ) ( r ) 2 1 0 0 1 2 o4 仁1 5 7 9 9 十1 2 5 9 1 5 c 0 0 3 0 9 9 4 3 表3 合成样品分析结果 1 0 猢 加 垂耄 如 。 瑚 两南大学硕士毕业论文 第二章双苯甲弧胺与d n a 作用的拭振光散射特征及其分析应用 t a b l e3a n a l y t i c a lr e s u l t sf o rs y n t h e t i cs a m p l e s f s d n a 1 0 0腺苷酸，鸟苷酸 f s d n a1 0 0c o 外，z n 升，c a p 1 0 5 1 o o 1 0 1 5 1 0 9 33 1 9 5 2 1 0 5 33 7 c 0 2 + 2 1 0 - 5m 0 1 lz n 2 + 4 1 0 吨m 0 1 lc a 斗2 1 0 一m o l l 2 4 结论 用共振光散射技术研究了h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 的作用，证实了两者之间除嵌 入作用外，还有静电作用：因此，光散射技术也可作为研究有机小分子与生物大 分子作用的手段。三维光谱表明体系的荧光信号对散射信号不产生干扰，利用体 系增强的光散射信号能够灵敏的检测d n a 。 两南大学硕十毕业论文第三章h o e c h s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法测定d n a 第三章h o e c h s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法测定 d n a 3 1 引言 核酸定量分析在生命科学，临床医学，以及食品检验中有着重要的作用。目前 有很多种测定核酸含量的方法，如使用较广的探针技术法、吸光光度法、荧光光度 法、共振光散射法以及新发展起来的电化学发光法，毛细管电泳法等“4 1 。荧光光度 法和共振光光度法是新发展起来的、高灵敏度的核酸测定方法，但是这两种分析 法通常都只采用一种信号。对于有散射光信号与荧光信号共存的体系，我们希望 能够充分利用两种信号，提高检测灵敏度和检测范围，同时能够更好的抵抗外界 干扰。因此，对于同时具有散射和荧光信号的生物微粒，可以通过测定一定波长 下不同的光学信号的比值，建立散射荧光比率分析法。已有研究表明：在同等条 件下，双波长比率法比单波长的检测法具有更好的灵敏度和更强的抗干扰能力 5 一旧 。 本文主要是用荧光染料一双苯甲亚胺( h o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 作为荧光探针，来检测其 与f s d n a 的作用机理和f s d n a 的含量。在p h4 5 6 的介质中，h o c c h s t 3 3 2 5 8 有很 强的荧光效应，并且在3 5 2 n m 处有最大激发，在5 0 0 姗处有最大发射。在一定离 子浓度下，加入少量f s d n a 后，发现散射逐渐加强而荧光逐渐被淬灭。通常，有 机小分子与核酸的作用分三类：一是有机分子嵌入d n a 双链的碱基对之间“1 ， 其次是有机小分子结合在核酸的的大沟或小沟区域“”1 ，还有一类是有机分子在 核酸表面进行长距组装“2 “3 。常用的荧光探针有溴化乙锭及其二聚体或类二聚体 衍生物、h o e c h s t 3 3 2 5 8 等，它们主要是嵌入核酸的碱基对。由于在p h4 5 6 的介 质中h o e c h s t 3 3 2 5 8 带部分正电荷，能够和带负电的核酸结合起来形成更大的粒子， 大大增加了散射强度。 3 2 主要仪器与试剂 f 一4 5 0 0 荧光分光光度计( 日立公司) ；u v 一3 0 1 0 紫外吸收仪( 日立公司) ；p h s 一3 c 酸度计( 上海大中分析仪器厂) ；漩涡混合器( 海门市其林贝儿仪器制造有限公司) 。 f s d n a 储备液，浓度为5 0 雌m r 工作溶液浓度为5 u gm r ，o 一4 低温保存。 h o e c h s t 3 3 2 5 8 储备液浓度为5 0 u gm l ，保存于4 的冰箱中，工作溶液浓度为5 g l ，使用前用储备液稀释。p h 4 5 6 的b r i t t o nr o b i n s o n ( b r ) 缓冲溶液用来控 制体系的酸度，o 0 5m o l1 1n a c l 控制溶液的离子强度。 1 2 西南大学硕：l 毕业论文 第三章h o e c h s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法测定d n a 各试剂均为分析纯，用二次去离子水配制溶液。 3 2 1 实验方法 在比色管中依次加入7 0 0 p 1h o e c h s t 3 3 2 5 8 工作溶液，1 0 0 0 “1b r 缓冲溶液( p h 4 5 6 ) ，2 5 0 ln a c l ( 1 0 m o l1 1 ) ，一定量的f s d n a 标准溶液，定容至5 m 1 ，漩涡 混合均匀后测量其发射光谱。固定荧光分光光度计的激发荧光波长在3 5 0 n m ，在 2 2 0 n m 到7 0 0 n m 范围扫描其发射光谱，荧光分光光度计的激发和发射狭缝为5 n m ， 光电倍增管的电压为7 0 0 v 。 3 3 结果与讨论 3 3 1 光谱特征 x 兰 c ，) c a ) c w a v e i e n a t h n l m ) 图1 单独h o e c h s t 3 3 2 5 8 与体系的散射荧光图普 f i g 1l i g h ts c a n e r i n ga n dn u o r e s c e i l c e 锄i s s i o ns p e c t r ao f h o e c h s t 3 3 2 5 8 i nt h ea b s e n c e a l l dp r e s e n c eo f d i f h 舶tc o n c e n t r a t i o no f f s d n a p h4 5 6 ；九e x ，3 5 0 m ；。m 8 ，1 5 腭i i i l 。；。q a ，o ，o 2 5 ，o 5 ，o 7 5 ，1 o ，1 2 5 ，1 5 嵋 m 1 一gm l 图1 显示了单独的h o e c h s t 3 3 2 5 8 和在f s d n a 存在时的散射和荧光的变化。单 独的h o e c h s t 3 3 2 5 8 在3 5 0 n m 激发时，在3 5 2 n m 处只有一个很弱的散射峰，而在 5 0 0 r 吼处有一个很强的特征荧光发射峰。当加入f d 1 q a 后，在p h 4 5 6 的介质中， 其与阳离子染料h o e c h s t 3 3 2 5 8 通过静电作用形成大的离子缔和物，在3 5 2 n m 处的 散射峰明显增强，而使染料在5 0 0 n m 处的特征荧光发射峰被淬灭。在一定浓度范 硼南入学硕+ 毕业论文 第二章h o e c i l s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法测定d n a 围内，随着f s d n a 浓度的增大，散射强度增强，荧光强度降低，其散射增强值与 荧光淬灭值的比率与f s d n a 浓度呈一定的线性关系。 图2 是单独染料和体系的吸收光谱。从图可见，随着f d n a 加入浓度的增加， 导致h o e c h s t 3 3 2 5 8 出现减色效应，同时在3 6 4 n m 处出现等吸收点。据l o n ge c 的研究结果，减色效应、红移现象和等吸收点是物质与d n a 发生嵌入作用的标志 【1 5 。这也同时表明h o e c h s t 3 3 2 5 8 与f j d n a 发生了静电结合，形成了离子缔合物， 也证实了早期报道的在弱酸性条件下d n a 淬灭h o e c h s t 3 3 2 5 8 荧光的机制，确实 为静态淬灭“。 w a v e i e n g t h ( n m ) 图2 单独染料和体系的吸收光谱 f i g2 a b s o r b a n c es p e c 仃ao f 丘eh 0 e c h s t3 3 2 5 8 锄di n 吐坭p r e s c l l c eo f f s 】) n a - c h 咖0 3 2 s 8 ，1 5p g i i i l 。1 ；c 鲫q ( 劬m u p t 0d o w l l ) ，o ，o 2 5 ，o 5 ，0 7 5 ，1 o ，1 2 5 ，1 5 p gm 1 ；p h4 5 6 3 3 2 比率分析法的定量基础 基于h o 。c h s t3 3 2 5 8 与一定浓度d n a 结合后，经3 5 0 m 激发，在2 2 0 衄到 7 0 0 n m 范围内扫描得到的发射图谱中，始终可以观察到在3 5 2 姗处产生的共振光 散射强度增强，而在5 0 0 1 1 | i i l 处的荧光猝灭。由此我们在该体系中建立了散射荧光 比率法，这里： 胄；= j f ( 1 ) r o = 舻i ( 2 ) 其差值r = r i 求o 。 其中而，凡分别表示单独h o e c h s t3 3 2 5 8 在3 5 2 姗处的共振光散射强度和 5 0 0 眦处的荧光强度：，f 分别表示在体系中分别加入不同浓度的f s d n a 后在 3 5 2 m 处的共振光散射强度和5 0 0 咖处的荧光强度。实验及合成样的测定结果表 1 4 oc叮ciioo 西南人学硕士毕业论文 第三章h o e c h s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法溯定d n a 明，改方法具有较高的灵敏度和更宽的检测范围，可用于d n a 的定量分析。 3 3 3 实验条件的优化 图3 酸度对体系的影响 f i g 3 i n n u e n c eo f p h o n 圮r a t i o o f t h ee 血锄c e 煳t o f r e s o n 柚c e l i g l l ts c a t t e r i n g t 0 m eq u e n c h i n go f n u o r e s c e n c ei nm ep h 瑚g e2 8 7 - 6 0 9 c l i s 0 3 2 5 8 ，1 鹇m 1 _ 1 在p h2 8 7 6 0 9 范围内考察了酸度对体系置琅。值即r 值的影响。如图5 所示， 随着酸度的减小，五值先增大后减小，这主要是因为在不同酸性条件下，盘d n a 猝灭h o e c h s t 3 3 2 5 8 荧光的程度存在较大差异引起的。在p h 4 5 6 时体系的r 值最大。 因此，体系的酸度控制在4 5 6 。 i o n i cs t r e n g t h ( m o l | 。) 图4 离子强度优化 f i g 4 i n f l u e n c eo f i o n i cs 呦g 血o l lm es y s t 锄c h 咄啪3 2 5 b ，1 肛gm i - l ，c 蚶n a ，l 腭i i l l 。1 ； p h 4 5 6 在h o e c h s t3 3 2 5 8 和f s d n a 体系实验中，选择合适的盐浓度是很重要的。一定 浓度的盐浓度可以增强体系抵抗外界干扰的能力。图6 考察了离子强度对体系 1s 蓦 西南人学硕士毕业论文 第三章h o e c h s t 3 3 2 5 8 散射荧光比率法测定d n a 是r o 值的影响，从实验结果看，在一定盐浓度范围内，不同离子浓度对体系的r i r o 改变量不同，随着n a c l 浓度的增大，其胄i 擅。值急剧减小，表明