（植物学专业论文）长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学.pdf

摘要 摘要 青藏高原地区是我国植物物种多样性和特有性最高的地区，且作为东亚植 物区系的一个现代分化中心受世人瞩目。长花马先蒿是青藏高原高山草甸的广 布种，其地理分布格局的形成与高原的隆升和气候变迁有着密切关系。因此， 对长花马先蒿进行谱系生物地理学研究，有助于探讨青藏高原地区物种快速分 化的机制和群体建立过程。 本研究对长花马先蒿1 1 个居群、1 8 8 个个体的叶绿体d n at r n t 一卿矛区进 行了序列分析，发现该片段的长度变异范围为1 4 4 1 - 1 4 7 2 b p 。对位排列后的矩阵 ( 含外类群) 长1 5 3 4 b p ，内类群中含3 3 个碱基替换和1 7 个插入缺失，可分为 2 0 种单倍型。1 1 个地理居群的总核苷酸多态性( 万) 为0 0 0 4 6 8 ，单倍型多态 性( 蹦) 为0 8 5 3 ，居群间的遗传变异( 屉) 高达8 8 2 ，说明长花马先蒿具 有很高的遗传多样性，且居群间发生了强烈遗传分化。 系统发育和遗传多样性分析发现长花马先蒿的2 0 种叶绿体单倍型可归于四 个地理单元川西高海拔地区、川北地区、云南德钦地区及川藏地区。进一 步分析发现：4 个地理单元间存在着显著的遗传分化，说明长花马先蒿具有明显 的谱系地理分布格局。其中川西高海拔地区的四种主导单倍型构成了系统发育 树最基部的一支，而以川西地区为中心、向南扩展至云南的两个居群所包含的 几种单倍型均属于比较进化的类型。单倍型的网络关系( n e t w o r k ) 显示出西藏、 青海、云南及四川北部的一些单倍型间遗传差异很小，亲缘关系很近。上述结 果表明：长花马先蒿群体在冰期后的重新扩张过程主要表现为由南往北的递进 式扩散，第四纪冰期气候的反复波动导致了该物种居群随生境变化而不断扩张 或收缩，形成了现今的分布格局。初步推测川西地区很可能曾是长花马先蒿在第 四纪冰期时的重要避难所，瓶颈效应和奠基者效应对其遗传多样性分布格局有 重要影响。 关键词：青藏高原；长花马先蒿；打川一纪府；单倍型；谱系生物地理学 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 a b s tr a c t t h eq i n g h a i t i b e tp l a t e a uh a sa ne x t r e m e l yd i v e r s ef l o r aw i t ht h eh i g h e s tl e v e l s o fe n d e m i s mi nc h i n a ，a n di ti sa l s oo n eo fp l a n td i v e r s i t yc e n t e r so ft h ew o r l d p e d i c u l a r i sl o n g i f l o r ai sad o m i n a n tp l a n ti nt h ea l p i n em e a d o wo ft h eq i n g h a i t i b e t p l a t e a u ，w h o s ed i s t r i b u t i o nm a yh a v eac l o s er e l a t i o n s h i pw i t ht h eu p l i f to ft h e h i m a l a y a sa n dc o r r e s p o n d i n gc l i m a t ec h a n g e t h e r e f o r e ，t h ep h y l o g e o g r a p h i c a ls t u d y o fpl o n g i f l o r aw o u l db eh e l p f u lt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s m su n d e r l i n gp l a n t r a d i a t i o ni nt h eq i n g h a i - t i b e tp l a t e a u i nt h ep r e s e n ts t u d y , w es e q u e n c e dt h ec h l o r o p l a s tt r n t - t r n fr e g i o no f18 8 i n d i v i d u a l sc o l l e c t e df r o m11p o p u l a t i o n so fp l o n g i f l o r a ，a n dat o t a lo f2 0c p d n a h a p l o t y p e sw e r ei d e n t i f i e db a s e do n3 3n e o c l o t i d em u t a t i o n sa n d17i n d e l s t h et o t a l n u c l e o t i d ed i v e r s i t y ( 石夕a n dh a p l o t y p ed i v e r s i t y ( h d ) a r eo 0 0 4 6 8a n do 8 5 3 ， r e s p e c t i v e l y a m o v aa n a l y s i s r e v e a l e dar e m a r k a b l ed i f f e r e n t i a t i o n a m o n g p o p u l a t i o n s ( r r = o 8 8 2 ) ，w h i c hc o u l db em a i n l ya t t r i b u t e dt ob o t t l e n e c ke f f e c t sa n d g e n e t i cd r i f t ，b e s i d e st h em a t e r n a li n h e r i t a n c eo fc h l o r o p l a s td n a p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so ft h e2 0c h l o r o t y p e ss h o w e dt h a tt h ef o u rd o m i n a n t h a p l o t y p e sf r o mt h ew e s t e r ns i c h u a np r o v i n c e ( c x ) f o r m e dar o b u s tm o n o p h y l e t i c c l a d e ( b o o t s t r a pv a l u e = l0 0 ) s i s t e rt oa l lt h eo t h e rc l a d e s ，i m p l y i n gt h a tt h e yc o u l d b ea n c e s t r a lt y p e sa n dh a v ee x p e r i e n c e df o u n d e re f f e c td u r i n gt h e i rr e c o l o n i z a t i o no f t h eh i 曲p l a t e a u o nt h eo t h e rh a n d ，t h el o wl e v e lo fd i f f e r e n t i a t i o na m o n gh a p l o t y p e s f r o mt i b e t , y u n n a n ，q i n g h a ia n dn o r t h e ms i c h u a nr e v e a l e di nt h en e t w o r ka n a l y s i s s u g g e s t st h a tt h o s eh a p l o t y p e sm a y b en e w l yd e r i v e d t h e r e f o r e p 1 0 n g i f l o r ac o u l d h a v es u r v i v e di nt h ew e s t e r ns i c h u a np r o v i n c ed u r i n gt h eg l a c i e ra g e sa n dt h e n e x p a n d e di t sd i s t r i b u t i o ni ns o u t h w e s t e r nc h i n a ，e s p e c i a l l yt h eq i n g h a i t i b e tp l a t e a u k e yw o r d s ：q i n g h a i t i b e tp l a t e a u ；p e d i c u l a r i sl o n g i f l o r a ；t r n t - t r n f ；h a p l o t y p e ； p h y l o g e o g r a p h y l l 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名： 寸叼 加7 年莎月7 之e l 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：可碍刁 刀唧年参月 第一章植物谱系生物地理学研究概述 第一章植物谱系生物地理学研究概述 1 1 谱系生物地理学概况 谱系地理学( p h y l o g e o g r a p h y ) 是以生物地理学为基础，通过分子手段，将居 群遗传变异与宏观地理分布及历史生物地理学相结合，阐述物种现代居群分布 形成的历史原因以及遗传多样性分布式样的- - f - 学科( a v i s e1 9 8 7 ，1 9 9 4 ) 。作为 生物地理学的一个分支，谱系生物地理学可以解释现有种群的分布状况，探究其 分布的成因，阐述其进化历程，分析区域类群在时间和空间上的发展变化，从而 重建生物区系的历史( a v i s e1 9 9 6 ，1 9 9 8 ) 。 1 2 谱系生物地理学研究历史 2 0 世纪7 0 年代中期，d n a 序列水平的变异在种内系统发育关系研究方 面的优势开始被人们所认识，并逐步被用于分析物种的地理分布格局及其形成 的历史过程( a v i s ee ta 1 1 9 7 9 ) 。a v i s e 等( 1 9 8 7 ) 基于多种动物种内群体间的 m t d n a 的研究结果，提出了谱系生物地理学( p h y l o g e o g r a p h y ) 。具体内容如下： 1 ) 大多数物种都是由地理种群组成的，这些地理种群在系统树上都占有不同的 分枝，这种系统分支的地理格局称为谱系地理种群结构( p h y l o g e o g r a p h i c p o p u l a t i o ns t r u c t u r e ) ：2 ) 具有有限谱系种群结构的物种，在其历史发展过程当中 发生过扩散，而且所占有的分布区不存在基因交流的障碍：3 ) 种内单系群 ( m o n o p h y l e t i cg r o u p ) 之间谱系间隔明显，这是由于基因流的长期中断而引起 的。 传统的谱系生物地理学研究主要基于等位酶、r a p d 、r f l p 等技术。2 0 世纪 9 0 年代以来，分子实验技术飞速发展。传统技术逐渐被操作简便、结果直观的 d n a 测序技术所取代( d as i l v a ，1 9 9 3 ；t a l b o t ，1 9 9 6 ) ，其融入了分子遗传学、群体 遗传学、系统发育学、行为学和历史生物地理学等学科的内容，将种内水平上的 微进化( m i c r o e v o l u t i o n ) 和种及种上水平的大进化( m a c r o e v o l u t i o n ) 有机结合起 来。 随着p c r 技术的发展及测序成本的降低，人们可以对更多的类群进行d n a 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 直接测序分析，从而可以从更精细的尺度探讨群体遗传结构变异及其历史进化 过程。同时，种群遗传学理论和数据分析方法的快速发展也大大推动了谱系生 物地理学的发展，使其日臻完善。 近年来，应用谱系生物地理学来研究第四纪剧烈变化的气候对生物地理分 布、遗传结构和进化历史的影响取得了一系列重要研究进展( s o l t i se ta 1 1 9 9 7 ： t a b e d e te ta 1 19 9 8 ：c o m e s & k a d e r e i t19 9 8 ：a v i s e2 0 0 0 ：h e w i t t2 0 0 0 ，2 0 0 4 ) 。 其中尤其对欧洲和北美的物种有比较详细地研究。d u m o l i n 1 a p e g u e 等( 1 9 9 7 ) 和f e r r i s 等( 1 9 9 8 ) 通过检测欧洲栎属植物c p d n a ( c h l o r o p l a s td n a ) 单倍型 分布，明确指出第四纪冰期欧洲存在三个栎属植物避难所，即伊比利亚半岛， 意大利和巴尔干半岛。间冰期，栎属植物从这三个避难所沿不同的迁移路线向 北迁移。s c h n o s w e t t e r 等( 2 0 0 5 ) 根据阿尔卑斯山地区1 2 种植物的谱系生物地 理学研究，发现这些植物在阿尔卑斯山地区的西南部、南部、东部和北部边界 以及中部地区均存在冰期避难所。北美的几个相似的避难所地区主要位于阿巴 拉契亚山脉的东南和南部以及太平洋西北海岸( s o l t i se ta 1 1 9 9 7 ；a v i s e2 0 0 0 ； m i t t o ne ta 1 2 0 0 0 ；h e w i t t2 0 0 4 ；j a r a m i l l o c o r r e ae ta 1 2 0 0 4 ；g o d b o u te ta 1 2 0 0 5 ) 。根据e p d n a 单倍型研究结果，仙女木( d r y a si n t e g r i f o l i a ) 冰期时在北 极有白令地区和北极高纬度地区两个避难所。现今分布于北极大部分地区、落 基山脉以及北美西北部大陆架部分的仙女木主要来自白令地区避难所，而北极 高纬度地区避难所在仙女木冰期后的扩散中作用不大( t r e m b l a y s c h o e n 1 9 9 9 ) 。我国在谱系生物地理学研究方面取得了一定进展，对杉木属 c u n n i n g h a m i a ( l ue ta 1 2 0 01 ) 、青冈c y c l o b a l a n o p s i sg l a u c a ( h u a n ge ta 1 2 0 0 2 ) 、 绣球茜d u n n i as i n e n s i s ( g ee ta 1 2 0 0 2 ) 、祁连圆柏j u n i p e r s u s p r z e w a l s k i i ( z h a n ge t a 1 2 0 0 5 ) 、刺桫椤a l s o p h i l as p i n u l o s a ( s u e ta 1 2 0 0 5 ) 、银杏g i n k g ob i l o b a ( s h e n e ta 1 2 0 0 5 ) ，银杉c a t h a y aa r g y r o p h y l l a ( 王红卫2 0 0 6 ) 等植物的研究，都不同程 度地揭示了第四纪气候变化对植物分布区的影响。然而，我国植物种类繁多， 植物区系成分及来源十分复杂，要探讨地质历史及气候变化对我图植物区系历 史形成的影响，必须对更多代表性类群，尤其是对生物多样性热点地区( 如横 断山一喜马拉雅地区) 的植物类群进行深入细致的谱系生物地理学研究。 2 第_ 章青藏高原的地质历史和植物| 又：系演化 第二章青藏高原的地质历史和植物区系演化 青藏高原( 北纬2 5 。 - 4 0 。，东经7 4 。1 0 4 。) 是世界上最高的高原，平 均海拔高度在4 0 0 0 米以上。它的东部是横断山脉，西南部是喜马拉雅山脉，北 部为昆仑山脉。目前拥有高等植物7 7 0 0 多种，其中约有6 0 0 余种为青藏高原所 特有( 琼次仁e ta 1 2 0 0 2 ) 。因此，该地区是东亚植物区系及世界高山植物区系最 丰富的区域，是全球著名的生物多样性热点地区之一，是中国喜马拉雅区系成 分和北温带许多重要类群的分布和分化中心及新特有类群的起源中心。杜鹃属 ( r h o d o d e n d r o n ) 、报春花属m 甜，口) 、马先蒿属( p e d i e u l a r i s ) 、龙胆属 ( g e n t i a n a ) 、紫堇属( c o r y d a l i s ) 和风毛菊属( s a u s s u r e a ) 等在该区域快速辐射分 化，为研究植物进化和新物种起源过程提供了良好条件。因此，青藏高原地区 是解决现代北温带植物区系及部分被子植物起源演化的关键地区。这一区域在 地质历史上经历了印度板块与欧亚板块的碰撞、古地中海退却、喜马拉雅及青 藏高原的隆起及第四纪冰期等一系列重大事件，逐步演化形成了现有的植物区 系。因此在研究植物区系演变和分布区格局形成等生物地理学问题时，具有十 分重要的地位。 2 1 青藏高原的地质历史 青藏高原地区的地质历史可以追溯到距今4 - 5 亿年前的奥陶纪，其后青藏 地区各部分曾有过不同原因的地壳升降，或为海水淹没，或为陆地。2 8 亿年前 ( 早二叠纪) ，现在的青藏高原地区仍是波涛汹涌的辽阔海洋。这片海域横贯现 在欧亚大陆的南部地区，与北非、南欧、西亚和东南亚的海域相连，称为“特 提斯海”或“古地中海 ，当时特提斯海地区的气候温暖，成为海洋动植物发 育繁盛的地域。其南北两侧是已被分裂开的原始古陆( 也称泛大陆) ，南边称冈 瓦纳大陆，包括现在的南美洲、非洲、澳大利亚、南极洲和南亚次大陆；北边 的大陆称为欧亚大陆，也称劳亚大陆，包括现在的欧洲、亚洲和北美洲。始新 世时期，印度次大陆从非洲大陆游离出来( 潘保田，李吉均1 9 9 6 ；d e t t m a ne t a 1 2 0 0 3 ：l e p a g e2 0 0 3 ；s p i c e re ta 1 2 0 0 3 ) ，与欧亚板块开始碰撞。但此后 喜马拉雅一青藏高原并未随之强烈隆起，而是经历了一个漫长的抬升与夷平过 长花马先蒿的群体遗传变异和牛物地理学 程，长期处于较低的海拔高度( 1 - - - 2k m ) ( p a ne ta 1 1 9 9 8 ) 。直到中新世， 青藏高原才开始发生了剧烈隆升( d e t t m a ne ta 1 2 0 0 3 ：l e p a g e2 0 0 3 ：s p i c e r e ta 1 2 0 0 3 ) 。 2 2 青藏高原的植物区系演化历史 在漫长的地质历史变化过程中，青藏高原地区的生态环境发生了巨大的变 化。部分低海拔、喜湿热的植物类群逐渐向高海拔迁移，并适应了新的环境， 同时一些难以适应的物种逐渐被淘汰。随着喜马拉雅山的不断抬升，气候逐渐 变得寒冷，又兼冰期的到来，给北方的植物类群以入侵的有利条件，有些种类 向南入侵较远，并在喜马拉雅山以南一定海拔高度定居下来，经隔离适应，逐 渐形成喜马拉雅山南麓高山地区的特有种类。冰期过后，面临着间冰期的到来， 温度逐渐回升，原来耐寒的北方类群一部分向北回迁，一部分由于受高山的阻 挡，在原地向海拔较高的山地迁移，这一部分和原来的类群混生在一起，又经 过长期的适应与进化，形成了现今的高山植物类群。由于青藏高原复杂的生态 环境，生物类群分布受到很大的限制，很多种的分布区十分狭窄，各种环境均 有其特有种类，使得青藏高原的生物多样性极其丰富。许多类群在横断山区和 东喜马拉雅复杂而优越的环境条件中得到了进一步发展甚至形成分化中心( 吴 征镒1 9 8 8 ) 。 4 第三章长花马先蒿的研究背景及研究意义 第三章长花马先蒿的研究背景及研究意义 3 1马先蒿属的基本概况 马先蒿属( p e d i c u l a r i sl ) 是列当科( o r o b a n c h a c e a e ) 最大的一个属，也 是被子植物的大属之一( 钟补求1 9 6 3 ) ，为多年生或一年生( 稀二年生) 半寄 生性草本植物。全属约5 0 0 余种，主要分布在北半球，极少数超越赤道，多数种 类生长在寒带及高山环境，适应于寒冷、湿润的气候( 钟补求1 9 6 3 ：m i l l2 0 0 1 ) 。 其中一些是具广泛地理间断的环北极种，但是大多数种类集中分布在横断山一 喜马拉雅地区( l i1 9 4 8 ；m a c i o r1 9 8 8 ；m i l l2 0 0 1 ) 。我国分布着大约3 5 0 种，占 该属全球种类的一半以上( y a n g e ta 1 1 9 9 8 ；m i l l2 0 0 1 ) 。 马先蒿属是有花植物中花冠形态变异最为复杂的属之一，也是研究辐射分 化和物种形成的最佳试材，对于研究植物的进化、物种形成及生物地理学具有 重要意义。该属植物一般都由熊蜂完成授粉( w a n ga n dl i1 9 9 8 ；m a c i o re ta 1 2 0 0 1 ) 。熊蜂对不同类型的花冠具有完全不同的传粉方式，传粉者的选择压力可 能是决定花冠多样化的重要因素之一( m a c i o r ，1 9 8 8 ，1 9 9 1 ；王红和李德铢，1 9 9 8 ； m a c i o r 等，2 0 0 1 ) 。 马先蒿属下系统非常混乱，迄今为止该属属下分类系统不下l o 个( s t e v e n 1 8 2 3 ；b u n g e1 8 4 1 ，1 8 4 6 ，1 8 4 9 ；b e n t h a m1 8 4 6 ；m a x i m o w i c z1 8 7 8 ，1 8 8 8 ；p r a i n1 8 9 0 ； b o n a f i 1 9 1 0 ，1 9 1 8 ；l i m p r i c h t1 9 2 4 ；h u r u s a w a1 9 4 7 ，1 9 4 8 a ，b ，c ，1 9 4 9 a ，b ；李惠林 1 9 4 8 ，1 9 4 9 ；钟补求1 9 5 5 ，1 9 5 6 a ，b ，1 9 6 1 ，1 9 6 3 ) 。近年来，国内外学者对马先蒿 属进行了分子系统发育研究。基于叶绿体基因及n r d n ai t s 构建的基因树和经 典的分类系统很不一致，而不同基因树也有相互矛盾之处( y a n ge ta 1 2 0 0 3 ：r e e r 2 0 0 5 ) 。推测马先蒿植物的进化历史十分复杂。青藏高原地区马先蒿属植物由 周边地区多次迁移而来，并在本地经历了快速的辐射分化( y a n ge ta 1 2 0 0 3 ) 。 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 3 2 长花马先蒿的基本概况 长花马先蒿( p e d i c u l a r i sl o n g i f l o r a ) 属于马先蒿属长花系( s e r l o n g i f l o r a e ) 。 该系有近2 0 种马先蒿，主要分布于中国西南部一喜马拉雅地区，集中分布于横 断山区。仅中国马先蒿( pc h i n e n s i s ) 和长花马先蒿( pl o n g i f l o r a ) 的分布区延 伸至中国华北地区或蒙古国及俄罗斯境内，且在该地域零星分布。该系显著的 特点是具有细长的花冠管，其传粉机制一直倍受关注。长花马先蒿是长花系中 分布最广、海拔跨度最大的种类。其分布范围西至喜马拉雅中西部，北达俄罗 斯的贝加尔湖地区，常见于海拔2 7 0 0 - - 5 3 0 0 m 的高山沼泽地或草甸及林缘湿地。 3 3 本研究主要探讨的问题 青藏高原作为全球独特的地理单元，其形成的特有的生态环境、植物区系、 物种进化过程以及物种对环境的适应方式等问题值得我们去深入研究。马先蒿 属为探讨横断山区物种起源分化及其与青藏高原隆升关系提供了良好试材，长 花马先蒿的广泛分布使其具有研究代表性。 前人对马先蒿属的植物系统发育关系已经做了大量的相关工作，但是无法 从精细水平揭示该属植物迁移、扩散及分化过程。分析种内群体遗传变异及群 体遗传结构有助于揭示物种形成和分化的过程。除李文丽( 2 0 0 5 ) 初步研究了 分布于云南的大王马先蒿的居群遗传结构和夏婧( 2 0 0 6 ) 对邓氏马先蒿云南和 四川两个居群的遗传多样性做了i s s r 分析外，我国尚未有其他有关该属植物居 群遗传多样性的研究报道，要弄清楚我国西南横断山区马先蒿属植物的分化机 制，还需要对涵盖不同生活史类型、不同分布范围以及不同繁育系统的该属植 物进行详细的居群生物学研究。本文作为其中的一小部分，选择长花马先蒿为 研究对象，分析该种的遗传变异及群体遗传结构，初步探讨群体迁移、扩散及 建立过程。 长花马先蒿的生长要求寒冷、湿润的环境。气候耐受性是植物分布过程中 的一个关键因素，常被用于推断植物的分布区( p i t h e r2 0 0 3 ) 。自新生代开始以 来，全球性的气候变冷和旧世界内部陆地结构的巨大变化使原有的生态系统破 6 第三章长花马先蒿的研究背景和研究意义 碎化( c o w l i n ge ta 1 19 9 6 ；h e w i t t2 0 0 0 ；k r i j g s m a n2 0 0 2 ；s p i c e re ta 1 2 0 0 3 ；z a c h o s c ta 1 2 0 0 3 ) ，因此从长花马先蒿的遗传地理格局出发，进一步分析青藏高原的抬 升及其气候效应对长花马先蒿的迁移和分布产生的影响，对于理解喜马拉雅地 区的植物区系形成和交流以及青藏高原一横断山地区生物多样性来源具有重要 意义。 随着谱系生物地理学的快速发展，人们已经对环北极、欧洲、北美等热点 地区生物的起源、迁移和进化作了大量的研究和分析，而对于青藏高原这一重 要的物种和类群的分化中心，此类的相关工作比较少。我们拟通过长花马先蒿 的谱系生物地理学研究探讨青藏高原地区物种起源、扩散和分化的模式等，同 时为古气候和地质历史研究提供生物学证据。 长花马先蒿的居群遗传变异与牛物地理学 第四章长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 4 1 研究思路 居群遗传多样性是指居群内所有个体之间遗传变异的总和，可以体现在不 同的层次上，如形态学上的多样性、染色体水平上的多样性、等位酶的多样性 以及d n a 水平上的多样性等。一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取 决于种内遗传变异的大小，也依赖于遗传变异的居群结构，居群遗传结构上的 差异是居群遗传多样性的重要体现。 植物细胞的遗传系统中存在叶绿体、线粒体和细胞核三个基因组，它们在 遗传进化等方面都具有各自的特点( g r a y1 9 9 9 ；m a c k e n z i e & m c i n t o s h1 9 9 9 ； p a l m e r2 0 0 0 ) 。目前细胞质基因在植物群体遗传、网状进化和生物地理学研究方 面应用非常广泛( s e n j oe ta 1 1 9 9 9 ；s p e f i s e ne ta 1 2 0 0 1 ；va c h e r 6e ta 1 2 0 0 4 ) 。 植物叶绿体d n a ( c pd n a ) 在一些非编码区域存在相对较高的核苷酸置换率 ( t a b e r l e t e ta 1 1 9 9 1 ) ，在种间和种内都拥有较高的遗传变异( n e w t o ne ta 1 1 9 9 9 ) ， 是迄今用于分子系统学和谱系地理学研究最多的一类基因组。目前，针对叶绿 体基因非编码区发展了一批应用广泛的通用引物( t a b e r l e te t a l 1 9 9 1 ；h a m i l t o n 1 9 9 9 ) 。对c p d n a 序列变异的研究，除了可以建立物种之间的亲缘关系( 王玉金， 刘建全，2 0 0 4 ；王玉金等，2 0 0 4 ) 之外，还能在一些种内鉴别出多种单倍型 ( h a p l o t y p e ) ( t r e m b l a y & s c h o e n1 9 9 9 ) 。对这些单倍型的地理分布式样与亲缘关 系的理解，可以用来探讨物种居群的形成历史、居群问的基因流状况、气候变 化所导致植物居群破碎化的时空模式和迁移路线( n e w t o ne ta 1 1 9 9 9 ；c a r o ne t a 1 2 0 0 0 ；p e t i te ta 1 2 0 0 3 ) 等问题。 总而言之，叶绿体基因( c p d n a ) 因其单亲遗传、重组率低、结构保守以及 序列水平进化速率较快等特点( j o h n s o n p a l m e r1 9 8 9 ；g o v i n d a r a j ue ta 1 1 9 8 9 ； d a l l y & s e c o n d19 9 0 ；r e b o u d & z e y l19 9 4 ；v i j v e r b e r g & b a c h m a n n19 9 9 ；k e l c h n e r 2 0 0 0 ；g o r e m y k i ne ta 1 2 0 0 3 ；k e l c he ta 1 2 0 0 4 ) ，被广泛应用于植物分子系统学与 第四章长花马先蒿的居群遗传变异i 孑生物地理学 谱系生物地理学研究中( n e w t o ne ta 1 1 9 9 9 ；o l m s t e a d & p a l m e r1 9 9 4 ；h e w i t t2 0 0 1 ； s h a we ta 1 2 0 0 5 ；k o c he ta 1 2 0 0 6 ) 。特别是一些基因间区较编码区有更高的碱基 突变率，是探讨科级以下低级分类群间系统发育关系及居群遗传结构变异非常 理想的分子标记( d e p a m p h i l i se ta 1 1 9 9 7 ；s a n ge ta 1 1 9 9 7 ；v i j v e r b e r g & b a c h m a n n 1 9 9 9 ；y a n ge ta 1 2 0 0 2 b ) 。 本文通过初步筛选，选择c p d n at r n t t r n f 区( 含砌t 一加l 基因间区、t r n l 基因及棚l 砌f 基因间区) 作为分子标记，分析不同地区长花马先蒿群体的遗传 变异及分布格局，结合地质及古气候资料，探讨长花马先蒿在青藏高原的生物 地理格局形成、物种分化及群体建立过程。 4 2 1 实验材料 4 2 实验材料与方法 在查阅大量标本的基础上，于2 0 0 5 年- - 2 0 0 6 年在青藏高原地区对长花马先 蒿做了野外调查，同时进行居群取样。每个居群内取样个体之间至少间隔5 0m ， 其中含云南2 个居群、四川6 个居群、西藏2 个居群和青海1 个居群，共采集 1 1 个居群。每一居群的样本量为1 0 到2 8 ，共1 8 8 个个体( 表4 - 1 ) 。标本的鉴 定根据中国植物志6 8 卷及英文版中国植物志1 8 卷。凭证标本存放在中国科学 院植物研究所标本馆( p e ) 。根据马先蒿属的分子系统学研究结果( r e er 2 0 0 5 ) ， 选择马先蒿属的两个种p e d i c u l a r i sc h i n e n s i s 和ps 驷h o n a n t h a 为外类群。 9 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 表4 - 1 材料来源 l o 第四章长花马先蒿的居群遗传遗传变异与生物地理学 4 2 2 分子标记的筛选 本文筛选的叶绿体基因的分子标记见表4 2 ，分别为t r n f m t r n s 、r p l l 6 f r 和t r n t - t r n f 区。最后发现其中t r n t - t r n f 在长花马先蒿群体间存在一定的碱基差 异，具有较好的分辨率。 表4 2 本文筛选的叶绿体基因分子标记 表示在本义中根据长花马先蒿自身序列，引物做了适当修改。 4 2 3 实验方法 4 2 3 1 d n a 的提取 从经硅胶干燥的叶片中提取总d n a ，提取方法为改进的c t a b 法( r o g e r s b e n d i c h1 9 8 8 ) 。具体步骤如下： 1 ) 在2 m l 的e p p e n d o f f ( e p ) 管中加入9 0 0ulc t a b 提取液和6 ul 巯基乙 醇，6 5 c 水浴预热备用。 2 ) 将适量的叶片材料放入研钵中加入少许石英砂和p v p ，液氮冷冻研磨至 粉末状，酌量加入预热的提取液中，混匀，6 5 * c 水浴锅中振荡4 5 6 0 分钟( 注 意颠倒混匀几次) 。 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 3 ) 向混合液中加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻颠倒1 0 分钟使之 混匀。 4 ) 1 2 0 0 0 r p m ，i o c ，离心5 分钟。 5 ) 用剪过的枪头小心移出上清至新的1 - 5i l l le p 管中。 6 ) 重复步骤3 ) 、4 ) 、5 ) 一次。 7 ) 加入等体积的预冷( - 2 0 c ) 异丙醇，摇匀，- 2 0 c 放置半个小时以上。 8 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 c 离心5 分钟，弃上清。 9 ) 加入1 5 0 - 2 0 0 l al7 5 乙醇，洗涤沉淀( 将沉淀摇起) 。 1 0 ) 1 0 0 0 0 r p m ，4 c ，离心4 分钟。 1 1 ) 重复步骤9 ) 和1 0 ) 卜2 次。 1 2 ) 自然风干沉淀后，加入适量l x t e 溶解d n a 。 1 1 ) 0 8 琼脂糖胶检测总d n a 浓度。 4 2 3 2 序列扩增 目的片段扩增通过多聚酶链式反应( p c r ) 在p t c 1 0 0 ( m jr e s e a r c hi n c u s a ) 上进行。p c r 反应体系为2 5 u l ，含5 - 5 0 n gd n a 模板，5 p m o l 正反向引物，0 2 r e t o o l d n t p ，1 5 r e t o o lm g c l 2 ，0 7 5 ut a qd n a 聚合酶。p c r 反应程序为：9 4 c 变性2 分钟一9 4 变性2 0 秒，5 2 。c - 5 5 。c 退火2 0 秒，7 2 c 延伸2 分钟3 0 秒，3 6 个循 环一7 2 延伸1 0 分钟。每个基因片段的扩增根据其特点，退火温度、扩增时间 等稍有调整。 4 2 3 3p c r 产物纯化 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳分离，割取目的条带，使用鼎国d n a 片段 快速纯化回收试剂盒过柱纯化，纯化程序依据试剂盒操作指南进行。 第四章长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 4 2 3 4 测序反应 4 2 3 4 1 测序反应体系( 5ul ) 纯化产物直接采用b i g d y et e r m i n a t o rc y c l es e q u e n c i n gr e a d yr e a c t i o nk i t v 3 0 ( a p p l i e db i o s y s t e m s ，u s a ) 测序。体系为：1 5 此b i 酣y em i x ，引物2 5 p m o l ， 模板1 5 2 5 n g ，不够5 | ll 用水补足。 4 2 3 4 2 测序反应程序 9 4 c1 5 s ，5 2 5 84 c1 5 s ，5 8 。cl m i n3 0 s ，3 0 个循环( 退火温度依据所测 序列的引物的最适退火温度不同而变动) 。 4 2 3 4 3 测序反应产物纯化 测序反应产物转入含2 5ul 无水乙醇醋酸钠( 3 m ) = ( 2 4 ：1 ) 的溶液中。 一2 0 放置5 分钟。 4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟。 小心去净上清液，加入1 5 0pl7 0 的乙醇洗涤沉淀。 4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，去上清液。 避光风干。 4 2 3 4 4 测序 纯化好的产物在m e g a b a c e l 0 0 0 ( a m e r s h a mp h a m a r c i a ) d n a 测序仪进 长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 行序列测定。 4 2 4 数据分析 所测得序列首先用c l u s t a l x ( t h o m p s o ne ta 1 1 9 9 7 ) 进行排列，然后用 b i o e d i t ( h a l l1 9 9 9 ) 软件手工进行校正。 d n a 多态性可用多种方法度量( n e i1 9 8 7 ) 。样品中不同( 多态) 序列的数目 ( k ) 是一种简单的核酸水平的多态性衡量，这种估测依赖样本大小，具有等位 酶标记中等位基因数目相同的统计学特性。核酸水平更适宜的度量是基因( g e n e ) 或单倍型( h a p l o t y p e ) 多样性( h 或h d ) ( n e i & t a j i m a1 9 8 1 ) 。核苷酸多态性用9 w ( w a t t e r s o n1 9 7 5 ) 和( n e ia n dl i1 9 7 9 ) 估计，单倍型多态性用h d ( n e ia n dl i 1 9 7 9 ) 估计。使用d n a s p4 1 0 分别估计了序列间每对碱基的平均差异7 c 和单倍型 多态性h d ( n e i1 9 8 7 ) 。 t a j i m a sd ( 1 9 8 9 ) 检验检测的是分离位点的数目( 0 ) 和核苷酸多样性( 兀) 之间 的关系。f u 和l i ( 1 9 9 3 ) 的d 牢、胁检验检测总的多态位点数与单碱基突变之间 的差异，这些检验可能比t a j i m a 的检验弱( s i m o n s e ne ta 1 1 9 9 5 ) 。由于地区间 遗传差异显著，我们从地区群体水平上进行t a j i m a sd ( t a j i m a1 9 8 9 ) 、f ua n dl i s d 书和f 宰( f u & l i1 9 9 3 ) q b 性检测( d n a s p 4 1 0 ) ，以判断c p d n a 加汀一加小区在 这1 1 个居群内是否符合中性进化模式。 固定指数是由w r i g h t 提出的用于测量某一群体内基因型频率偏离h a r d y - w e i n b e r g 平衡的一组参数，包括f i s , f i r 和风其中舟用以测量群体间的遗传 分化程度。根据长花马先蒿取样的地理信息及单倍型变异位点的相似度，在进 行群体结构分析中把1 1 个群体划分为4 个地区( g r o u p s ) 。分别为德钦地区( d q ) ， 包括云南的一个居群b m ；川北地区( c b ) ，包括了四川北部两个居群松 潘( s p ) 和红原( h y ) ；川西高原的高海拔山区( c x ) ，包括了无名山和理塘海 子山两个高海拔居群；川藏地区( c z ) 包括川西的康定( k d ) ，理塘浪打山( l d s ) ， 西藏的林芝( l z ) 、亚东( y d ) ，云南的中甸( z d ) 及青海的达日( d r ) 。( 简称 川藏地区) 。应用a r l e q u i n2 0 0 0 ( s c h n e i d e re ta 1 2 0 0 0 ) 的a m o v a ( a n a l y s i so f m o l e c u l a rv a r i a n c e ) 对四个地区和地区内群体进行等级分析。a m o v a 分别估测了 地区间( a m o n gg r o u p s ) 、地区内群体间( a m o n gp o p u l a t i o n sw i t h i ng r o u p s ) 和 1 4 第p n q 章长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学 群体内( 、i t h i np o p u l a t i o n s ) 差异对总变异的影响，重复1 0 0 0 次得到屉的显著 性统计值。 序列应用n e t w o r k4 0 ( b a n d e l te ta 1 19 9 9 ) 软件，选择m e d i a n - j o i n i n g 模型 ( b a n d e l te ta 1 1 9 9 9 ) 通过共祖模拟，构建了长花马先蒿单倍型